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BESCHREIBUNG
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Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Herstellung von Ionenaustauschern
für die Adsorption von endo- und exogenen Giften aus Blut und insbesondere auf ein
Verfahren zur Herstellung von Sorbentien zum Adsorbieren von freiem Hämoglobin.
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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Sorbentien können
zur Beseitigung der hämolytischen Zustände beliebiger Ätiologie verwendet werden.
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Es ist ein Verfahren zur Bindung von biologisch wirksamen Stoffen,
z.B. von Enzymen und Proteinen/Fillippusson H., Hornly W. E., Biochem. J. 120, 215
(1970)/ zwecks Sacharosenzersetzung bekannt. Das Verfahren besteht in der Nitrierung
von Polystyrol mit Salpetersäure lösung in konzentrierter Schwefelsäure bei einer
Temperatur von Oo C, in der Reduktion mit 6 zeiger Na2S203-Lösung in 2n-KOH und
in
der Diazotierung mit NaNO2-Lösung in 0,6 n-HCl. Durch die Behandlung
des erhaltenen diazotierten Polystyrolamins mit ß-Fructofuranosidase in Gegenwart
von Protein wurden fixierte Fermente erhalten, dabei betrug die Bindung von Protein
höchstens 0,5+1 Gew0%.
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Jedoch führt die geringe Hydrophilie der auf diese Weise erhaltenen
Copolymere teilweise zu einer gewissen Protein denaturierung und sichert nur eine
geringe Sorption des Pro teins - in der Größenordnung von 10 bis 60 mggg. Eine geringe
Stabilität der Diazoverbindung in für das Gebiet der ßtabilität von Proteinlösungen
kennzeichnenden schwach sauren Medien gestattet nicht, große Mengen der Proteinkomponente
auf dem Polymer zu fixieren0 Außerdem sind die auf diese Weise erhaltenen Sorbentien
in den Sorptionsprozessen für freies Hämoglobin aus Blut dank einer hohen Hydrophobie
wenig aktiv.
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Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Beseitigung der
genannten Nachteile.
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Der Erfindung wurde die Aufgabe zugrundegelegt, ein Verfahren zu
entwickeln, das gestattet, aktive Sorbentien zum Adsorbieren von freiem Hämoglobin
zu erhalten.
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Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein Verfahren zur Herstellung
eines Sorbens zum wEsorbieren von freiem Hämoglobin. vorgeschlagen wird, in welchem
erfindungsgemaß der Aminogruppen und Sulfo- bzw. Phosphorsäuregruppen enthaltende
Ausgangspolyampholyt nach der Diazotierung mit Blutserumalbumin oder haptoglobin
bei einer Temperatur bis
4000 umgesetzt und anschließend das erhaltene
Sorbens vom Protein freigewaschen wird.
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Um bedeutende Mengen der Proteinkomponenten zu fixieren, empfiehlt
es sich, als Ausgangspolyampholyte Polyampholyte mit einer spezifischen Obef1pche
mindestens von 10 m2/g einzusetzen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird wie folgt durchgeführt. Es werden
Sorbentien zur Hämosorption durch die Bindung von albumin oder Hämoglobin-Haptaglobinantagonisten
-auf der Oberfläche der diazotierten Polyampholyte synthetisiert, die gleichzeitig
aromatische Aminogruppen und Sulfo-oder Phosphonsäuregruppen enthalten.
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Die Verwendung von Polyampholyten in der Diazotierungsreaktion gestattet
es; einen höheren Umwandlungsgrad nach Diazogruppen (3,5 bis 4,0 mMol/g) zu erreichen
sowie die Stabilität von Diazogruppen zu erhöhen. Die auf Polyampholyten erhaltenen
Diazogruppen sind beim Ausbleiben von Protein bei einer Temperatur von OOC in 0,14
n-UaCl-Lösung durch das Vorliegen von Sulfo- und Phosphorsäuregruppen stabil, dabei
besitzen die sich bildenden Diazoverbindungen eine beständige Salzform. Zur gleichen
Zeit ergibt die Reaktion mit Protein unter Zugabe der Proteinlösung zu dem nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen diazotierten Polyampholyt einen höheren
Umwandlungsgrad im Vergleich zu dem bekannten Verfahren dank einer höheren Hydrophilie
der Polyampholyte. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wert
den
Sorbentien erhalten, die 250 bis 800 mg/g gebundene Proteine enthalten.
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Im Prinzip kann das Verfahren auch auf Kationenaustauschern, vorzugsweise
auf sulfo- bzw. phosphorhaltigen Kationenaustauschern unter vorläufiger Herstellung
von Polyampholyten, deren Nitrierung und darauffolgender Reduktion verwirklicht
werden.
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Das Verfahren kann unter Bindung verschiedener Proteine - Albumin
oder Haptoglobin durchgefUhrt werden. Die Bindung von Haptoglobin, das den Antagonisten
des freien Hämoglobins darstellt, sichert im Vergleich zu Albumin eine um das 6fache
größere Aufnahm nach dem freien Hämoglobin.
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Das hufrechtorhalten einer hohen Spezifik des gebundenen Haptoglobins
zur Sorption des freien Hämoglobins gestattet zu behaupten, daß die Veränderung
der nativen HaptoglobinstruKtur bei der chemischen Bindung nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren unbedeutend ist.
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Als kusgangspolyampholyte können die der gelförmigen und makroporösen
Struktur verwendet worden. wenn aber Ionenaustauscher geringer Porosität mit einer
Oberfläche von höchstens 10 m2/g eingesetzt werden, gelingt es nicht, darauf bedeutende
Mengen der Proteinkomponenten zu fixieren.
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Beim Durchlassen von hämolysiertem Blut mit einer Geschwindigkeit
von 75 ml/min während 2 Stunden durch eine Kolonne von 5 cm2 Durchmesser und 7 cm
Höhe mit 19 g Sorbens, das das chemisch gebundene Haptoglobin enthält, betrug die
Kolonnenaufnahmefähigkeit 1,4 bis 1,8 g freien
Hämoglobins pro Kolonnen
sogar beim Ausbleiben des freien Hämoglobins am Kolonnenaustritt, d.h. bei deren
unvoller Skttigung. Die Hämoperfusion in der Kolonne von 200 ml Inhalt gestattet,
bei demselben Regime ca. 9 g freien Hämoglobins zu adsorbieren, was die Gesamtmenge
des freien Hämoglobins im Blut bei pathologischen Zuständen übertrifft, die mit
dem 1,.-ben unvereinbar sind (ca. 2 g/l).
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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren synthetisierten Ionenaustauscher
kannen zur Behandlung akuter hämolytischer Zustände verwendet werden, die durch
die Erhöhung des freien Hämoglobinspiegels gekennzeichnet werden, solcher, wie das
durch ausgedehnte Zesquetschung der Gewebe unter hrythrozytenzerstörung gekennzeichnete
Syndrom, ausgedehnte Brandwun, den,eine inkompatible Bluttransfusion, hämolytische
Krankheiten der Neugeborenen oder exogene Vergiftungen mit hämolytischen Giften
(z.B. mit Essigsäure).
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Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Sorbens kann als
Hämoglobinfalle" am Austritt der Apparate für den künstlichen Blubkreislauf eingesetzt
werden, die Hämolysokoeffizienten von 0,14 bis 1,09 freien Hämoglobins zu 100 1
des mit der Vorrichtung umgepumpten Bluts ergeben (höher, als der kritische Wert
von 0,1). Die Normalgeschwindigkeit der Hämolyse, die durch den Organismus kompensiert
wird, beträgt gegen 7,35 g freien Hämoglobins für 24 Stunden für den Menschen von
70 kg Körpergewicht. Das Sorbens gestattet, den freien Hämoglobinspiegel bei akuten
hämolytischen Zuständen bis zur Norm herabzusetzen und die Arbeits
dauer
der Systeme für den künstlichen Blutkreislauf zu verlängern, die die teilweise Hämolyse
sichern.
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Zum besseren Verständnis des Wesens der vorliegenden Erfindung werden
folgende Beispiele angeführt.
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Beispiel 1 10 g makroporösen Copolymers von Styrol mit 20 Gew.% Divinylbenzol,
erhalten in Gegenwart von 80 Vol.% Isookt-an als inertes Lösungsmittel, werden mit
Phosphortrichlorid in Gegenwart von Ammoniumtrichlorid phosphoryliert,hydroly sichert,
aufeinanderfolgend mit 3%iger wäßriger NaOH-Lösung, mit Wasser und 3%iger HCl-Lösung
gewaschen, getrocknet und mit 80 ml Gemisch von 93%iger Salpetersäure und 95%iger
Schwefelsäure in einem Verhältnis von 1:2 übergossen Man läßt das Reaktionsgemisch
bei Zimmertemperatur während 24 Stunden stehen. Das Produkt wird mit Wasser gewaschen
mit dem Gemisch, das aus 110 g SnCl2.2H20 in 340 ml konzentrierter Salzsäure besteht,
während 10 Stunden bei einer Temperatur von 1000C reduziert. Nach der Reduktion
beträgt die Aminogruppenmenge 4 mVal/g, die Menge der Phosphor säuregruppen - 3,2
mVal/g.
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Das erhaltene Produkt wird bei einer Temperatur von OOC der Lösung
zugegeben, die 38 g NaN02 in 200 ml 6n-Salzsäure enthält. Man läßt das Reaktionsgemisch
bei einer Temperatur von höchstens 500 während 4 Stunden stehen. Der erhaltene diazotierte
Polyampholyt mit einer spezifischen Oberfläche von 40 m2/g wird mit auf eine Temperatur
von
OOC abgekühlter 0,14 n-NaCl-Lösung bei einem pH-Wert von 8,0
gewaschen. Die Menge der Diazogruppen beträgt 4 bis 3,5n(l/g.
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Der Lösung mit einer Haptoglobinkonzentration von 8 mg wird der diazotierte
Polyampholyt hinzugesetzt. Die reaktion wird während 2 Stunden bei einer Temperatur
von 20 0C durchgeführt. Nachher erhöht man die Temperatur auf 306C und läßt das
Gemisch noch 2 Stunden bis zum Aufhören der Entwicklung von Stickstoffbläschen stehen.
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Der erhaltene Polyampholyt wird mit destilliertem Wasser gewaschen.
Die gebundene Haptoglobinmenge beträgt 0,8 g/g Ionenaustauscher. Das erhaltene Sorbens
adsorbiert aus dem hämolysierten Blut bei 20min Perfusion 1,5 g freien Hämoglobins
je 1 g Svrbens bei einer Geschwindigkeit der Blutströmung von 40 ml/min durch die
Kolonne von 5 ml Inhalt mit 3 g Ionenaustauscher.
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Beispiel 2 10 g Copolymer von Styrol mit 30 Gew.% Divinylbenzol,
erhalten in Gegenwart von 100 Vol.% Isooktan, verden mit Schwefelsäure in Gegenwart
von A1013 als Katalysator sulfuriert und mit Wasser gewaschen. Das statische Austauschvermögen
nach 0,1 n-NaOH beträgt 4,2 mVal/g. Das getrocknete Sorbens wird analog dem Beispiel
1 mit 80 ml Gemisch aus 930iger Salpetersäure und 95'ger Schwefelsäure in einem
Verhältnis von 1s2 bei Zimmertemperatur während 12 Stunden nitriert, mit Wasser
gewaschen und mit dem Gemisch reduziert, das aus 110 g SnC12.2H20 in 340 ml konzentrierter
Salzsäure besteht. Die Reduktion wird bei einer Temperatur
von
10000 während 10 Stunden durchgeführt. Die Aminogruppen menge beträgt 3,2 mVal/g.
Der erhaltene Polyampholyt mit einer spezifischen Oberfläche von 40 m2/g wird der
Losung zugegeben, die 38 g NaN02 in 100 ml der auf eine Temperatur von 00C abgekühlten
6n-Salzsäure enthält. Die Reaktion füArt man bei einer Temperatur von höchstens
50C während 4 Stunden durch.
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Der erhaltene Polyampholyt wird mit 0,14 n-NaCl-Lösung bei einer Temperatur
von OOC und einem pH-Wert von 8 gewaschen.
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Die Menge der Diazogruppen beträgt 3 mVal/g.
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Der Lösung mit einer Haptoglobinkonzentration von 10 mg/ ml wird
der diazotierte Polyampholyt hinzugesetzt. Die Reaktion führt man während 2 Stunden
bei einer Temperatur von 2000 und während der nächsten 2 Stunden bi einer Temperatur
von 30°C bis zum Aufhören der Entwicklung von Stickstoffbläschen durch. Der erhaltene
Polyampholyt wird mit Wasser gewaschen. Die Menge des gebundenen Haptoglobins beträgt
0,8 g/g.
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Das Sorbens adsorbiert aus dem hämolysierten Blut unter den in Beispiel
1 beschriebenen Bedingungen 0,8 g freien Hämoglobins je 1 g Sorbens. Es wurde keine
Veränderung des Niveaus der Blutzellen - der Thrombozyte, Leukozyte und Erythrozyte
nachgewiesen.
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Beispiel 3 Der nach dem Beispiel 1 erhaltene diazotierte Polyampholyt
wird mit 0,14 n-NaCl-Lösung bei einem pH-Wert von 8 und einer Temperatur von OOC
gewaschen und filtriert.
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Der Albuminlösung mit einer Konzentration von 10 mg/ml
wird
bei 4000 während 2 Stunden der diazotierte Polyampholyt hinzugesetzt. Der Polyampholyt
mit dem chemisch gebundenen Albumin wird mit Wasser gewaschen, bis das überschüssige
Albumin entfernt wird. Die Menge des auf Polyampholyt gebundenen Albumin beträgt
0,2 bis 0,3 g/g. Der Polyampholyt zerstört Thrombozyte nicht und ruft deren Aggregation
im Hämosorptionspr/ozeß nicht. Die Kaliumsorption beträgt 0,5 mVal/g. Die Ammoniumsorption
beträgt 0,1 mVal/g.
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Beispiel 4 Der nach dem Beispiel 2 erhaltene diazotierte Polyampholyt
wird der Albuminlösung mit einer Konzentration von 10 mg/ ml hinzugesetzt. Die Reaktion
führt man während 3 Stunden bei einer Temperatur von 2000 und während der nächsten
3 Stunden bei einer Temperatur von 3000 durch. Der Gehalt am gebundenen Albumin
beträgt 250 mg/g. Nach dem Durchwaschen analog dem Beispiel 2 mit 0,14 n-NaCl-Lösung
zerstört das Sorbens beim langwierigen Kontakt mit dem Blut die Blutkörperchen nicht.
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So betrug der Thrombozytenspiegel nach der Perfusion ohne Pumpe während
30 min mit einer Geschwindigkeit von 50 ml/min 180000 in 1 mm3 beim Ausgangsspiegel
von 200000 in 1 mm3. Das 4ggregationsprozent von Thrombozyten veränderte sich nicht.
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Der Leukozyten- und Erythrozytenspiegel blieb praktisch unveränderlich.
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Beispiel 5.
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Der analog dem Beispiel 2 erhaltene und gewaschene diazotierte Polyampholyt
wird der auf 50C abgekühlten Haptoglobinlösung mit einer Konzentration von 10 m/ml
zugesetzt
und das Gemisch wird bei dieser Temperatur während 12
Stunden stehengelassen. Die Menge des gebundenen Haptoglobins beträgt 0,4 g/g. Das
Sorbens adsorbiert aus dem hämolysierten Plasma bei 20 min Perfusion unter den Bedingungen
des Beispiels 1 0,6 g freien Hämoglobins Je 1 g Sorbens.
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Beispiel 6 Einem gattungslosen Hund von 18 kg Körpergewicht wurde
steriles destilliertes Wasser intravenös tropfenweise eingeführt. Auf diese Weise
wurde die Konzentration des freien Hämoglobins auf 240 mg% gebracht. Danach wurden
dem Hund die Arteria femoralis und Vena femoralis unter lokale Anästhesie entblößt.
Nach dem Einführen ins Eanüle in diese Gefäße wurde an die letzteren das Perfusionssystem
angeschlossen, das aus der Kolonne, welche 50 g des nach dem Beispiel 3 erhaltenen
Sorbens enthält, der Luftfalle, der artEriellen und venösen Adern besteht. Das Blut
strömte aus der Arterie des Hundes mit einer Geschwindigkeit von 60 ml/min durch
die Kolonne, wo es, indem es unmittelbar mit den Sorbensgranula in Kontakt trat,
das freie Hämoglobin loswurde und durch die venöse Ader in den Organismus des Tiers
zurückkehrte.
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Bei 40 min Perfusion verminderte sich die Konzentration des freien
Hämoglobins von 240 mg% auf 34 mg% was 70% des freien Hämoglobins entspricht.
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Physiologische Blutparameter: Kennziffern des Säure-Basengleichgewichts,
das Niveau von Gesamtprotein, Glukose, Chlorion veränderten sich mit einer Wahrscheinlichkeit
von 7/ 0,95 nicht. Der nach dem Beispiel 3 erhaltene und mit
der
physiologischen Lösung gewaschene Ionenaustauscher sorbier te Kalium, Calcium und
Magnesium Der nach dem Beispiel 3 erhaltene und mit der Lockeschen Lösung gewaschene
Ionenaustauscher veränderte das Niveau der Kationenelektrolyte mit einer Wahrscheinlichkeit
von # 0,95 nicht. Es wurde keine Veränderung des Niveaus der Blutkörperchen am Kolonnenaustritt
im vergleich zur Ausgangskonzentration nachgewiesen.
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Das Aggregationsprozent von Thrombozyten sank von 40 flut 1O,%.
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Beispiel 7 Zum Modellieren der hämolytischen Krise infolge des me
chanischen Bluttraumas wurde ein Apparat für den künstlichen Blutkreislauf (AkB)
mit einer Rollenpumpe eingesetzt. Zu diesem Zweck wurde das Tier unter Morphin-ilexenalnarkose
intubiert und auf die geregelte atmung überführt. ES wurde die transsteriale Thorakotomie
durchgeführt und der AkB wurde an das rechte Herz ohr angeschlossen; gleichzeitig
wurde die Vena femoralis durchgeschnitten und daran wurde der Venenschluß von AkB
zugeschaltet.
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Parallel mit der Pumpe und dem Oxygenator wurde an die blutleitenden
Adern mit hilfe der Nebenschlüsse die Kolonne angeschlossen, die 20 g des nach dem
Beispiel 1 erhaltenen Sorbens enthielt. Die Geschwindigkeit der Blutströmung durch
die Kolonne betrug 60 ml/min.
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Die Veränderungsdynamik des freien Hämoglobinspiegels bei der AkE-Arbeit
mit der parallel angeschlossenen Kolonne mit dem Sorbens wird in der Tabelle 1 angeführt.
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Dauer der AkB-Arbeit, min 0 30 60 90 120 Konzentration des freien
Hämoglobins, mg% 0 130 170 150 80 In der Tabelle 2 wird die Veränderungsdynamik
des freien Hämoglobinspiegels im Kontrollvercuch (bei der AkB-Arbeit ohne Kolonne
mit dem Sorbens) angeführt.
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tabelle 2 Dauer der AkB-Arbeit, min 0 30 60 90 120 Konzentration
des freien Hämoglobine, mg% 0 230 280 320 480 Somit setzt die Zuschaltung der Kolonne
mit dem das chemisch gebundene Haptoglobin enthaltenden Sorbens parallel dem AkB
die Blutkonzentration des freien Hämoglobins wesentlich herab, wodurch die Bedingungen
für eine längere AkB-Arbeit bei komplizierten chirurgischen Eingriffen unter einer
langwierigen Herzensausschaltung geschaffen werden.