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Einrichtung zur Zellenkultur
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(Zusatz zu P 24 25 746.3-41) Die vorliegende Erfindung betrifft eine
Einrichtung zur Zellenkultur nach Patent (-anmeldung P) 24 25 746.
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Eine solche Einrichtung ist durch die DT-OS 24 25 746 bekannt geworden.
Sie enthält eine Inkubatorkammer, in der sich eine Anzahl von schlauchartigen Zellenbehältern
befindet, die jeweils unter Zwischenlage von Abstandshalterstreifen spiralenförmig
auf spulen- oder haspelartige Halterungen aufgewickelt sind, welche ihrerseits auf
drehbar gelagerten und mit einer Antriebsvorrichtung verbundenen Stäben ruhen, durch
die die Halterungen mit den aufgewickelten Zellenbehältern begrenzt, z.B. um etwa
3600, gedreht werden können. Die schlauchartigen Zellenbehälter sind jeweils über
eine Zufuhrleitung und eine Abflußleitung, die flexibel sind, und eine lösbare Anschlußvorrichtung
mit einem Zufuhr- bzw. Abflußverteiler eines Nährmediumkreislaufes verbunden, so
daß das Nährmedium durch die Zellenbehälter zirkuliert werden kann.
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Der Zufuhrleitung jedes Zellenbehälters ist eine Umwälzpumpe, insbesondere
eine Schlauch- oder Peristaltikpumpe zugeordnet, so daß die einzelnen Zellenbehälter
unabhängig von den anderen in den Kreislauf des Nährmediums eingeschaltet und aus
diesem entfernt werden können. Der Abflußverteiler ist über eine ein Ventil enthaltende
Verbindungsleitung mit dem
Zufuhrverteiler verbunden, und das Ventil
ist durch einen mit dem Nährmedium im Kreislauf in Verbindung stehenden Fühler,
insbesondere einem pH-Fühler, verbunden, um bei Bedarf verbrauchtes Nährmedium durch
frisches Nährmedium ersetzen zu können. Der Flüssigkeitsfühler steuert ferner die
Zufuhr von Gas, insbesondere C02, in die Inkubatorkammer, außerdem können Gaskühler,
wie 002 und 02-Fühler zur Steuerung der Gasatmosphäre in der Inkubatorkammer vorgesehen
sein. Bezüglich weiterer Einzelheiten wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf
die DT-OS 24 25 746 verwiesen.
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Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Einrichtung
der oben genannten Art hinsichtlich einer Erleichterung und Vereinfachung der Bedienung,
Wartung und Reinigung weiterzubilden.
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Diese Aufgabe wird durch eine Einrichtung mit den kennzeichnenden
Merkmalen des Patentanspruchs 1 gelöst.
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Die Unteransprüche betreffen Weiterbildungen und vorteilhafte Ausgestaltungen
einer solchen Einrichtung.
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Bei der Einrichtung gemäß der Erfindung läßt sich das Gestell, an
dem alle mit Nährmedium in Beruhrung kommenden Teile der Einrichtung angebracht
sind, zum Einsetzen oder Entnehmen von Zellenbehältern, zur Uberwachung, Wartung,
Reinigung oder Sterilisation bequem aus der Inkubatorkammer entnehmen, und das ganze
Gestell mit den an ihm angebrachten Teilen kann in einen Autoklaven zur Sterilisation
überführt werden.
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Im folgenden wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung unter Bezugnahme
auf die Zeichnung näher erläutert, dabei werden auch noch weitere Merkmale und Vorteile
der Erfindung zur Sprache kommen.
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Es zeigen: Fig. 1 eine vereinfachte perspektivische Ansicht einer
AusfUhrungs
rm der Erfindung mit einer Inkubatorkammer und herausgezogen dargestelltem Gestell;
Fig. 2 eine schematische Vorderansicht der Gestellanordnung der Einrichtung gemäß
Fig. 1 und Fig. 3 eine schematische Seitenansicht der Gestellanordnung gemäß Fig.
2.
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Bei der vorliegenden Einrichtung zur Zellenkultur sind die Komponenten,
die mit Nährmedium in Berührung kommen, an einem Gestell 250 angebracht, das bequem
in eine zugehörige Inkubatorkammer 10' eingesetzt und aus dieser entnommen werden
kann. Das Gestell 250 enthält einen rechteckigen Rahmen mit einem Boden 252, Seitenwänden
254, 256 und einer Deckenwand 258. Zwischen den Seitenwänden 254 und 256 erstrecken
sich vier Sätze von Stäben 12', 14', die durch nicht dargestellte Lager an den Seitenwänden
254 und 256 drehbar gelagert sind. Die Stäbe 12' durchsetzen jeweils die Wand 256
und sind mit einem Kettenrad 260 versehen. Um die Kettenräder 260 ist eine Antriebskette
262 geführt, so daß die vier Stäbe 12' gleichzeitig angetrieben werden können. Von
dem unteren und vorderen Kettenrad 260 springt ein federbelastetes Teil 264 einer
Antriebskupplung seitlich nach außen vor.
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Auf jedes Paar von Stäben 12', 14' sind fünf auswechselbare, sterilisierbare
Zellenkulturanordnungen 50' aufsetzbar, welche gemäß den Fig. 1 bis 3 der DT-OS
25 37 537 ausgebildet sein können. Ein erster Satz aus fünf Peristaltik- oder Schlauchpumpen
16' für die Zellenbehälter der oberen zehn Zellenkulturanordnungen 50' ist an einem
Rahmen 266 befestigt, wahrend ein zweiter Satz aus funf Peristaltik- oder Schlauchpumpen
16' für die unteren zehn Zellenbehälter auf dem Boden 252 befestigt ist. Vor dem
Rahmen 266 befindet sich eine erste Verteileranordnung 270, die durch Bügel 272
gehaltert ist, und am Boden 252 ist durch Bügel 278 eine zweite Verteileranordnung
276 befestigt. Jeder Verteiler hat zehn Paare von Kupplungen 280 für Verteilerröhren
oder -schläuche 138', 140', die sich in den Verteileranordnungen 270 und 274
befinden
und an die Einlaß- und Abflußschläuche 74' bzw. 76' von den entsprechenden Zellenkulturanordnungen
50' lösbar angebracht werden können. Die Verteileranordnungen enthalten jeweils
Ventile 162' und 170' und sind mit einem gemeinsamen pH-Fühler 20' und einem gemeinsamen
Ventil 22' verbunden.
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Die Schlauchpumpen 16' sind jeweils so ausgebildet, daß zwei Einlaß-
oder Zufuhrschläuche 74' um den Pumpenkäfig geschlungen und dementsprechend zwei
Zellenbehälter 52' gespeist werden können. Das herausnehmbare Gestell 250 enthält
ferner einen gemeinsamen Antrieb für die zehn Pumpen 16'. Jedes Pumpengehäuse ist
mit einem Kettenrad 290 versehen, und die Kettenräder sind durch eine gemeinsame
Antriebskette 292 verbunden. Eine Welle 294 eines Pumpenkäfigs erstreckt sich nach
hinten durch ein Lager 296 und trägt ein Kettenrad 298 sowie eine nach hinten vorspringende
Kupplung 300. Über das Kettenrad 298 ist eine Antriebskette 302 geführt, die nach
unten über ein Kettenrad 304 läuft, das mit einer Hilfsantriebswelle 306 verbunden
ist, die die Käfige des unteren Satzes von fünf Pumpen 16' über einen Antriebsmechanismus
308 antreibt. An der Seitenwand 256 des Gestells 250 sind ferner eine pH-Fühlerküvette
166' und eine Elektrode 196' befestigt. Der Boden 252 des Gestells 250 ist mit Rollen
310 versehen, mit denen das die Zellenkulturanordnungen 50' enthaltende Gestell
bequem in die Inkubatorkammer 10' und aus dieser heraus gefahren werden kann.
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Die eine Seite der Inkubatorkammer ist, wie Fig. 1 zeigt, durch eine
Tür 312 verschließbar. E8 ist ferner eine durchsichtige Hilfstüre 314 vorgesehen,
durch die das Innere des Inkubators 10' betrachtet werden kann ohne die kontrollierte
Atmosphäre in-der Inkubatorkammer zu stören.
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Das Ventil 22 ist in der Stirnseite der einen Seitenwand des Inkubators
angeordnet, es hat ein Gehäuse 200' mit Vertiefungen 202', von denen Leitungsabschnitte
24', 30', 34' und 160' von Hand lösbar angeordnet sind. Ein Kabel 210' vom
pH-Fühler
20' ist ebenfalls lösbar in einer Ausnehmung 202' beim Gehäuse 200' des Ventils
22' befestigt. An der Rückseite des Inkubators 10' ist ein Pumpenantrieb 320 angebracht,
der eine Welle 322 aufweist, die durch die Wand der Inkubatorkammer reicht und über
ein Kupplungsteil 324 mit der Kupplung 300 verbunden werden kann. Ein entsprechender
Antrieb 326 ist an einer Seitenwand des Inkubators angebracht, er hat eine Welle
228 und ein Kupplungsteil 330, das mit dem Kupplungsteil 264 kuppelbar ist. Es sind
ferner Kanäle und Zuführungsleitungen (nicht dargestellt) vorgesehen, durch die
Gase zur Aufrechterhaltung einer gewünschten Atmosphäre im Inkubator in diesen eingeleitet
werden können und Signale zu einem Steuer- oder Regelgerät übertragen werden können.
Das die beschriebenen Anordnungen tragende Gestell 250 ist als Einheit aus dem Inkubator
10' entnehmbar und erleichtert die Sterilisation der mit Nährmittel in Berührung
kommenden Komponenten als Einheit, z.B.
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der Zellenkulturanordnungen 50', des pH-Fühlers 20' und eines Sammelbehälters
36'. Das entnehmbare Gestell erleichtert ferner das Einsetzen der Zellenkulturanordnungen
auf die als Halterungen dienenden Stäbe 12' und 14, die Wartung und die Beschickung
der Zellenbehälter 52' mit Zellen.
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Im Betrieb werden die Zellenkulturanordnungen 50' mit den Blanschen
der Spulen oder Haspeln auf die als Halterungen dienenden Stäbe 12' und 14' gesetzt,
die Zufuhrschläuche 74 werden um die Käfige der Schlauchpumpen gewickelt und arretiert,
wie es in der DT-OS 24 25 746, insbesondere in Verbindung mit Fig. 6 erläutert ist,
und die Zufuhr- und Abflußschläuche 74, 76 werden mit den Verteilern verbunden,
z.B. kraftschlüssig oder mit Verbindungsanordnungen, wie sie in der oben genannten
Offenlegungsschrift insbesondere in Verbindung mit den Fig.7 bis 9 beschrieben sind.
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Die Verteiler werden dann von einem Vorrat 32' mit Nährmedium gefüllt
(das entweder vor oder nach dem Anschließen der Zellenkulturanordnungen geschehen
kann), indem das Ventil 22' zum Schließen einer Verbindungsleitung 160' betätigt,
ein
Ventil 162' zum Öffnen eines Entlüftungskanals 176' geöffnet und der Zufuhrverteiler
mit dem Abflußverteiler über ein Ventil 170' verbunden werden. Das Nährmedium fließt
dann vom Vorrat 32' unter der Wirkung der Schwerkraft in die beiden Verteilerkammern
und füllt diese, wobei etwaige Luft und überschüssiges Nährmedium durch die Leitung
176' in das Sammelgefäß 36 ausströmen.
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Die Zellen oder Gewebe können zusammen mit etwas Nährmedium durch
einen der Anschlüsse an den Enden der Zellenbehälter in diese eingeführt werden,
oder eine Zellensuspension kann mittels einer Injektionsnadel durch die Wand des
Zellenbehälters injiziert werden. Die durch die Injektionsnadel erzeugte Öffnung
schließt sich bei der Entfernung der Nadel infolge der Elastizität des Materials,
aus dem der Zellenbehälter besteht, wieder von selbst. Während der Füllung der spiralförmig
aufgewickelten Kammern mit Nährmedium können die Spulen oder Haspeln, aus denen
die Zellenbehälter unter Zwischenlage eines Abstandshalterstreifens aufgewickelt
sind, langsam um etwa 3600 gedreht werden, um die Verdrängung von Gasen, die Verteilung
der Zellen und den Kontakt des Nährmediums mit den Zellen zu verbessern. Nachdem
die Zellen in die spiralförmigen Kammern eingeführt und in diesen verteilt worden
sind, beläßt man das System für eine gewisse Zeitspanne in Ruhe, um das Anhaften
der Zellen an den chemisch geätzten (aufgerauhten) Innenwänden der Zellenbehälter
zu erleichtern.
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Während des Zellenwachstums in den Zellenbehältern werden im Inkubator
die gewünschten Verhältnisse hinsichtlich Feuchtigkeit und Temperatur, typischerweise
370 a., aufrechterhalten, das Nährmedium wird durch die Pumpen 16 umgewälzt, der
pH-Wert des zirkulierenden Nährmediums und der Sauerstoffpartialdruck der Gasphase
werden überwacht und das pH des flüssigen Mediums wird über den Kohlendioxydpartialdruck
der Gasphase auf eine vorgegebene Größe, typischerweise
etwa 7,
geregelt. Die relativ große Länge der Zellenbehälter gewährleistet, daß sich durch
die gasdurchlässigen Wände der Zellenbehälter ein Gasgleichgewicht zwischen der
zirkulierenden Flüssigkeit und der Gasphase in der Inkubatorkammer einstellt.
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Das Ausgangssignal des pH-Fühlers 20' steuert Kohlendioxid-und Stickstoffregler
216 bzw. 220, wobei zusätzliches Kohlendioxid eingespeist wird, wenn der pH-Wert
steigt, während die Kohlendioxidzufuhr verringert wird, wenn der pH-Wert fällt.
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Sauerstoff und Stickstoff werden kontinuierlich mit niedrigen, kontrollierten
Strömungsgeschwindigkeiten zugeführt, um im Inkubator einen vorgegebenen Sauerstoffpartialdruck
aufrechtzuerhalten.
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Nach einer gewissen Zeitspanne kann es die Ansammlung von Stoffwechselprodukten,
wie Milchsäure, die von vielen wachsenden Zellen produziert wird, im zirkulierenden
Nährmedium unmöglich machen, den vorgegebenen pH-Wert durch Verringerung der Menge
an Kohlendioxid im Zellenbehälter bzw.
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Inkubator konstant zu halten. Wenn die Menge an Kohlendioxid unter
einen vorgegebenen Wert abfällt, schaltet das Ausgangssignal des Reglers 230 das
Ventil 22' um, so daß zumindest ein Teil des zirkulierenden Nährmediums durch die
Leitung 34 abgelassen und durch frisches, nicht durch Produkte des Zellstoffwechsels
verunreinigtes Nährmedium über die Zufuhrleitung 30' ersetst wird.
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