DE2551026A1

DE2551026A1 - Verfahren zur analyse von kleinstkoerpern

Info

Publication number: DE2551026A1
Application number: DE19752551026
Authority: DE
Inventors: William Adolph Curby
Original assignee: Lahey Clinic Foundation Inc
Current assignee: Lahey Clinic Foundation Inc
Priority date: 1974-05-28
Filing date: 1975-11-13
Publication date: 1977-07-28
Also published as: AU8644975A; GB1498717A; FR2331012A1; AU502126B2; US3919050A; FR2331012B1; DE2551026C3; DE2551026B2

Description

Verfahren zur Analyse von Kleinstkörpern.

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Analyse der Dimensionseigenschaften von Körpern mit einer Grosse im Mikrometerbereich und darunter und betrifft insbesondere die Analyse von Kleinstkörpern oder -teilchen unter Verwendung eines Fühlers, der beim Erfassen jedes Teilchens einen elektrischen Impuls abgibt.

Schon über ein Jahrzehnt wird nach brauchbaren mikrobiologischen und bakteriologischen Analyseverfahren gesucht, die mit Instrumenten automatisch oder halbautomatisch durchgeführt werden können. Gemäss verschiedenen Vorschlägen hierzu wurden relativ erfolgreich hochauflösende optische Abtastinstrumente zur Nachahmung des menschlichen Auges eingesetzt. Diese Instrumente sind im allgemeinen relativ kompliziert und können nur von besonders ausgebildetem Personal bedient werden. Zur Durchführung schneller Analysen in hoher Anzahl mit entsprechend schneller Datenausgabe sind sie nicht geeignet. Es gibt auch andere Vorschläge für wirkungsvolle und gleichzeitig preiswerte Analyseverfahren, wobei jedoch in den allermeisten Fällen Verfahrensweisen angewendet werden, welche die Vorschläge für die Routine-Durchführung von Screening-Tests, Untersuchungen oder Analysen in den meisten Laboratorien ungeeignet erscheinen lassen.

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Andere Lösungsversuche des Problems mit deutlich besserem Erfolg beruhen auf der Computer-Analyse des Ausgangs von Fühler- oder Abtastgeräten, z.B. von einem Durchflußsystem, dessen Fühlerausgang an eine Rechenanlage angeschlossen ist. Bei Durchflußsystemen befindet sich der Probekörper oder das Probeteilchen in Suspension in einem flüssigen Medium. Das Medium mit der Flüssigkeit lässt man durch die Fühleinrichtung hindurchfliessen, um die gewünschten Daten daraus zu erhalten. Mit Durchfluß systemen zur Bearbeitung von Untersuchungsproben lassen sich die Geschwindigkeit und die Nützlichkeit automatischer und halbautomatischer Analyseverfahren am vorteilhaftesten ausnutzen.

Der Erfinder des Gegenstandes vorliegender Anmeldung hat ein Analyseverfahren vorgeschlagen, bei welchem ein Durchflußsystem verwendet wird und die Fühleinrichtung mit einem Mehrkanal-Analysesystem gekoppelt ist. Dieses Verfahren warde erfolgreich für die Untersuchung und das Studium von Bakterien, und Fischblut, Algen, inertem Staub, ozeanischen Sedementen, Flüssigkeitstropfen und dgl. eingesetzt. Für dieses Verfahren, das im übrigen in der US-PS 3 804 720 beschrieben ist, deren Offenbarungsgehalt ausdrücklich auch zum Inhalt der vorliegenden Anmeldung gemacht wird, wird ein bestimmter Fühler, z.B. ein optisches Teilchen-Densilaometer oder -reflektometer oder ein Fühler verwendet, der nach dem Coulter-Prinzip arbeitet. Dem Fühler ist betriebsmässig eine mehrkanalige Analysier-Datenverarbeitungseinrichtung, analoge oder digitale Aufzeichnungseinrichtungen und Schnittstellen-Schaltungen dafür zugeordnet. Alternativ kann der Sensor auch direkt mit einer geeigneten Aufzeichnungseinrichtung, z.B. einer Magnetbandeinheit oder einem anderen geeigneten Datenspeichergerät gekoppelt sein. Hierbei können die gespeicherten Daten anschliessend in das mehrkanalige Analysiergerät eingegeben werden oder es kann eine Umlauftechnik mit einer Schleife variabler Schwelle angewandt werden.

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Bei dieser Erfindung können Teilchen-Fühler oder Fühlimpulserzeuger, die auf optischem oder elektrischem Wege arbeiten, eingesetzt werden. Elektrische Einrichtungen sind beispielsweise solche, die nach dem bekannten Coulter-Prinzip arbeiten, das beispielsweise in den US-Patenten 2 656 508 und 2 869 078 beschrieben ist, deren Offenbarungsgehalt hiermit ausdrücklich auch zum Inhalt der vorliegenden Anmeldung gemacht wird. In-Verbindung mit der Erfindung wird auch eine optische Fühleinrichtung beschrieben, jedoch liegt zur Erleichterung der Erläuterung der Erfindung die Betonung auf einem System, das mit einem Coulter-Zähler arbeitet. Natürlich soll durch die genannte Betonung keinerlei Beschränkung hinsichtlich des Types der für die Erfindung verwendbaren Teilchen-Fühleinrichtungen ausgedrückt sein.

Bei dem Coulter-Fühlprinzip wird ein Teilchen, das sich in Suspension in einem Elektrolyt befindet, durch ein elektrisches Feld geleitet, dessen Dimensionen in Beziehung zu demjenigen des Teilchens stehen. Hierbei tritt eine momentane Änderung der elektrischen Impedanz bzw. des elektrischen Wi-· derstandes im folgenden kurz Impedanz genannt, des Elektrolyten im Umkreis des Feldes auf. Diese Impedanzänderung lenkt einen Teil der Anregungsenergie in die zugeordnete elektrische Schaltung, wo sie zum Entstehen eines elektrischen Signales führt. Durch Zählung der erzeugten Signale kann eine Zählung der Anzahl der durch die Öffnung hindurchgegangenen Teilchen erhalten werden. Wenn die Amplituden der Signale unterschieden werden, können auch Teilchen-Untersuchungen durchgeführt werden. Die Erfindung ist vornehmlich auf die Analyse der Gestalt des Signales derart ausgerichtet, dass auch Daten, die zu anderen Eigenschaften der Teilchen in Beziehung stehen, erhalten werden können.

Bei dem Teilchen-Analysiergerät vom Coulter-Typ wird das zur Teilchenerkennung benutzte Feld im einem undurchlässigen, zylindrischen Kanal oder einer Öffnung zwischen zwei Flüssigkeitsvorräten erzeugt, in welchen sich die zu untersuchenden

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Teilchen in Suspension befinden. Die- elektrische Anregungsenergie wird mittels eingetauchter Elektroden in die Flüssigkeitsvorräte oder -körper eingeleitet, wobei die Öffnung in einer Isolier-Wand zwischen beiden Vorräten ausgebildet ist. Die Flüssigkeit, in welcher sich die Teilchen in Suspension befinden, lässt man durch die Öffnung hindurchfliessen. Hierbei entstehen elektrische Signale jedesmal, wenn ein durch die Öffnung hindurchgehendes Teilchen eine momentane Impedanzänderung erzeugt. Das elektrische Feld ist in der als Fühlzone dienenden Öffnung konzentriert, wobei das Feld normalerweise einen elektrischen Strom umfasst, der zusammen mit dem physischen Strom der Suspension durch die Öffnung fliesst. Ersichtlich verdrängt ein durch die Fühlzone hindurchgehendes Teilchen Elektrolyt im Ausmass seines eigenen Volumens; hierdurch wird die Impedanz zwischen den Elektroden erhöht und dadurch ein elektrisches Signal erzeugt. Das Ansprechverhalten hängt im wesentlichen von der freiliegenden Querschnittsfläche des Teilchens und den Öffnungseigenschaften, wie Durchmesser und Länge, sowie von der Verweilzeit und dem Weg der Teilchen durch die Öffnung und dgl. ab und ist gewöhnlich von den dielektrischen Eigenschaften der Teilchen unabhängig. (Der Einfluss einer festen Ladung der Teilchen ist bei normalen Ionenstärken im allgemeinen vernachlässigbar klein.) Es ist ebenfalls bekannt, dass poröse Zonen in den Teilchen häufig zu einer Verringerung des scheinbaren Volumens eines elektrisch abgefühlten Teilchens führen, z.B. im Falle bestimmter Bakterien. Dieses Phänomen lässt sich mit "elektrischer Transparanz" umschreiben. Bei dem im Zusammenhang der Erfindung verwendeten Teilchenfühler wird die elektrisch leitfähige Flüssigkeitssuspension aufgrund eines Druckunterschiedes durch das elektrische Feld in der Öffnung gezogen, welche in der Wand eines elektrisch isolierenden Gefässes angeordnet ist, das eine Elektrode enthält. Die andere Elektrode ist in einem grösseren Gefäss angebracht, welches die Probe enthält, welche zum Zwecke der Untersuchung durch das elektrische Feld geleitet werden soll.

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Natürlich müssen die Parameter der Fühleröffnung sorgfältig ausgewählt werden, damit die Teilchenanalyse mit optimalem Erfolg durchgeführt werden kann. Der Durchmesser der Öffnung darf relativ zur Grosse der Teilchen nicht zu gross sein, da das resultierende Signal beim Passieren eines Teilchens sonst in die Nähe des elektrischen Rauschens des Systems kommt. Andererseits sollte der Durchmesser der Öffnung nicht zu klein sein, da dadurch sowohl die Flüssigkeitsströmung behindert wird, was einen höheren Druckunterschied für eine bestimmte Strömungsgeschwindigkeit erfordert als auch die Gefahr besteht, dass die Öffnung durch Fremdstoffe in der Suspension verstopft wird.

Neben dem Durchmesser ist die Länge des Kanales bzw. der "Tunnel"-Öffnung ein wichtiger Parameter. Die Öffnungen werden im allgemeinen als entweder "lange" oder "kurze" Öffnungen unterschieden. Als lange Öffnung wird eine solche bezeichnet, bei welcher die Länge des Kanales grosser als der Durchmesser ist, während bei einer kurzen Öffnung die Länge derselben so gross wie oder kleiner als der Durchmes- " ser ist. Üblicherweise wird eine in Strömungsrichtung zu kurze Öffnung im allgemeinen nicht angestrebt, da es bei einer solchen Auslegung schwierig ist, gleichmässige elektrische Felder in der Fühlzone zu erzeugen; hingegen können bei der erfindungsgemässen Teilchen-Analysemethode wegen ihrer hohen Empfindlichkeit und empirischen Natur kurze oder sogar messerkantenartige Öffnungen mit Erfolg zur Analyse von Teilchen-Mengen oder -Populationen eingesetzt werden.

Es ist bekannt, dass mit langen Tunnel-Öffnungen im allgemeinen dann bessere Ergebnisse als mit kurzen Tunneln erzielt werden, wenn es um Grössenmessungen geht, bei denen die Bandbreiten der zugeordneten Verstärker entsprechend ausgewählt sind. Mit langen Tunneln erhält man deswegen im allgemeinen bessere Grösseninformationen, weil die grössere Tunnellänge die Eintritts- und Austrittseffekte reduziert und dadurch zu einem gleichmässigeren Feld führt, bei dem eine

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gleichmässigere Stromverteilung für alle Teilchenwege durch die Öffnung gegeben ist. Je langer der Tunnel ist, desto besser ist das Feld im Mittelpunkt nahezu gleichförmig. Am Eingang und am Ausgang des Tunnels ist die Stromdichte an den Kanten der Öffnung grosser und an der Achse entsprechend kleiner. Diese Feldverteilung beruht auf dem Umstand, dass Stromwege, die nicht längs der Achse verlaufen, sowohl von den Seiten der Öffnung her als auch gerade von vorne beliefert werden. Die geringere Stromdichte auf der Achse am Eingang und am Ausgang führt zu einem niedrigeren Anfangssignal als für Teilchen, die über andere Stromwege in die Öffnung ein- und aus der Öffnung austreten.

Es ist auch bekannt, dass die Strömungsgeschwindigkeit des Elektrolyten und damit die Geschwindigkeit der Teilchen auf einem axialen Tunnel-Weg etwas grosser als auf anderen, daneben verlaufenden Wegen ist. Nach den bekannten hydrodynamischen Gesetzen ist der Strömungswiderstand an der Tunnel-Achse ein Minimum, da dort die Strömung von einem Strömungsmantel umgeben ist, der praktisch die gleiche Geschwindigkeit hat.

In der Praxis müssen daher bestimmte Tunnel-Betriebseisich

genschaften beachtet werden, die/in den elektrischen Ausgangssignalen widerspiegeln, welche beim Hindurchgehen einer Teilchen-Suspension durch die Fühl-Öffnung eines elektrischen Teilchen-Analysiergerätes, wie z.B. eines Coulter-Zählers, entstehen. Da die physikalische Länge des Tunnels konstant ist und auch die Strömungsgeschwindigkeit der Suspension als konstantbleibend angesehen werden kann, sollte man eigentlich annehmen können, dass alle elektrischen Ausgangsimpulse, die durch im Tunnel abgetastete Teilchen gleicher Grosse erzeugt werden, die gleiche Amplitude und Dauer haben. Dass dies nicht richtig ist, ist seit einiger Zeit bekannt. Es beruht auf der oben diskutierten Erkenntnis, dass an der axialen Mittellinie des Tunnels die Strömungsgeschwindigkeit ein Maximum und die

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Stroradichteverteilung am gleichmässigsten ist. Aufgrund dieser hydrodynamischen und elektrischen Gesetzmässigkeiten und aufgrund der Eintritts- und Austrittseffekte besitzt ein Teilchen, das den Tunnel auf einem winklig zur Achse verlaufenden Weg oder auf einem zwar koaxial mit der Achse, aber von dieser weg versetzten Weg durchläuft, nicht die gleiche Reisegeschwindigkeit durch die Fühlzone und erzeugt kein gleich starkes Signal wie ein identisches Teilchen, dass in den Tunnel an der axialen Mittellinie eintritt und seinen Weg längs dieser beibehält. Entsprechend hat der Ausgangsimpuls des Detektors weder die gleiche Amplitude, noch das gleiche Profil und die gleiche Dauer. Bei dem erfindungsgemässen Verfahren hingegen sind die benutzten Analysedaten in noch zu erläuternder Weise empirisch festgehalten, so dass die erwähnten Abweichungen der Fühlimpulse innerhalb des Genauigkeitsbereiches bleiben, der zur Erzielung aussagekräftiger Feststellungen über die Untersuchungsproben notwendig ist.

Der Coulter-Teilchenfühler hat bezüglich der messberen Teilchengrösse keine theoretische Untergrenze. In der Praxis· ergeben sich Begrenzungen aus verschiedenen Umständen, zu denen die Wahl der Öffnungsdimensionen, die Reinheit des Elektrolyten, in welchem sich die Teilchen in Suspension befinden, und der elektrische Rauschpegel bei der Verstärkung der vom Sensor erzeugten Impulse gehören. Beispielsweise hat sich nach Feststellungen des Erfinders zur Beobachtung von Bakterien aus Körperflüssigkeiten eine Öffnung mit einem Durchmesser zwischen 10/um und 200yumals geeignet erwiesen, wenn die zu beobachtenden Teilchen einen scheinbaren Durchmesser zwischen 0,1 um und 50/umbesitzen. Vorzugsweise wird mit einer Öffnungsgrösse zwischen 30wm und 100A¹¹¹¹ für die Routineüberwachung von Teilchen mit einem scheinbaren Durchmesser von 0,2/umbis 2Cmm gearbeitet.

Bei der bevorzugten Analysemethode- und Vorrichtung nach der Erfindung ist der Ausgang des Fühlers über geeignete

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Anpassungs- und Vereinfachungsschaltungen an einen Impulshöhenanalysierer angeschlossen, der eine Einrichtung zur Korrelation der Impulshöhe mit einer entsprechenden Kanalzahl besitzt. Ausserdem ist eine Einrichtung zur tabularischen Zusammenstellung der Anzahl der Impulse vorgesehen, welche auf einen bestimmten Kanal entfällt, sowie zur Wiedergabe der gespeicherten Daten in Form ausgedruckter Kopien. Es können ausserdem Einrichtungen zur Umwandlung der Daten in analoger Form zum Zwecke der X-Y-Wiedergabe auf einem Oszilloskop oder mittels eines X-Y-Plotters vorgesehen sein.

Ein geeigneter Impulshöhenanalysierer ist der Typ RIDL-34-20 der Firma Radiation Instrument Development Laboratory, die jetzt zur Firma Searle Analytic, Inc., Des Plains, Illinois gehört. Dieser Analysierer umfasst zweihunder Kanäle. Es können jedoch andere Analysierer mit einer grösseren oder kleineren Anzahl von Kanälen benutzt werden. Der Analysierer RIDL-34-20 kann zusammen mit einem Oszilloskop 120 B der Hewlett-Packard Co., San Diego, Californien als Monitor benutzt werden und umfasst eine Magnetband-Ausgabe, einen Lokalisierer und Abtast-Wiederholer, eine Impedanz-Anpassungsschaltung, einen Impulsamplitudenanalysierer und integrator, einen Analog/Digital-Umsetzer, eine Kernspeichereinheit mit 4 χ 10 bit und eine 200-kanalige Kathodenstrahlanzeige. Ein X-Y-Plotter vom Typ Mosley 7035» ebenfalls von der Firma Hewlett-Packard, liefert eine analoge Ausgabe.

Bei dem Analyseverfahren des Erfinders gemäss US-PS 3 804 720 wird die Erfindungsaufgabe durch Analyse der Gesamtzählung und der Grössenverteilung der untersuchten teilchenförmigen Masse gelöst.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das vorgeschlagene Verfahren gemäss US-PS 3 804 720 noch weiter so auszubauen, dass auch spezielle Studien, wie z.B. die Analyse von Blutzellen mit signifikantem Erfolg durchgeführt werden können.

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Diese Aufgabe ist mit der im Anspruch 1 und bezüglich vorteilhafter Ausgestaltungen in Unteransprüchen gekennzeichneten Erfindung gelöst.

Die Erfindung beruht auf der Idee, dass Wert und Nutzen der Untersuchungen stark vergrössert werden, wenn eine Analyse der Impulsgestalt oder -form zur Lieferung aussagekräftiger Information in Bezug auf die Gestaltänderungen der einzelnen Teilchen selber eingesetzt wird.

Im folgenden ist die Erfindung mit weiteren vorteilhaften Einzelheiten anhand schematisch dargestellter Ausführungsbeispiele näher erläutert. In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 ein Funktions-Blockdiagramm zur Analyse von Mikroteilchen nach der Erfindung;

Fig. 2 ein Funktions-Blockdiagramm der Analysiereinrichtung nach der Erfindung, das genauere Einzelheiten des Systems nach Fig. 1 zeigt;

Fig. 3 eine graphische Darstellung X-Y-Anzeige digitaler Ausgangsdaten einer Ausführungsform der Erfindung;

Fig. 4 eine graphische Darstellung einer X-Y-Anzeige analoger Ausgangsdaten einer Ausführungsform der Erfindung;

Fig. 5 eine graphische Darstellung einer Eichkurve für Geräte nach der Erfindung;

Fig. 6 eine graphische Darstellung einer Wellenform elektrischer Impulse, die bei der Erfindung auftreten;

Fig. 7 eine graphische Darstellung einer Wellenform eines elektrischen Primärimpulses, aus der die Zeit zur Triggerung von Sekundärimpulsen gemäss der Erfindung hervorgeht;

Fig. 8 eine graphische Darstellung einer Wellenform eines elektrischen Primärimpulses, aus der die Zeit der Triggerung von Sekundärimpulsen gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung hervorgeht;

Fig. 9 eine graphische Darstellung von Wellenformen von erfindungsgemäss abgeleiteten, elektrischen Primärimpulsen und der Gestalt der zugehörigen Teilchen;

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Fig. 10 eine graphische Darstellung der Wellenformen einer Gesamtzählung einer Teilchenbevolkerung und der Grössenverteilungskurven, die erfindungsgemäss hergeleitet wurden;

Fig. 11 eine graphische Darstellung der Wellenform der erfindungsgemäss hergeleiteten Verteilungskurven für normale Fundulus heteroclitus-Blutzellen;

Fig. 12 eine Fig. 11 ähnliche graphische Darstellung, welche Fundulus heteroclitus-Blutzellen zeigt, die für 24 Stunden in mit Cadmium verunreinigtem Wasser gehalten wurden;

Fig. 13 eine Schemadarstellung der optischen Fühleinrichtung nach der Erfindung;

Fig. 14 eine Schemadarstellung einer weiteren Ausführungsform einer optischen Fühleinrichtung nach der Erfindung.

Für die Zwecke der weiteren Beschreibung der Erfindung sollen unter dem Begriff "Impulsgestaltanalyse" verschiedene Analysiermethoden verstanden, zu denen z.B. die Impulsprofilierung oder -formung und die Profilintegration gehören. Ferner sei darauf hingewiesen, dass Einzelheiten des Verfahrens und der Vorrichtung nach der Erfindung, die hier nicht erläutert sind, in der bereits zitierten US-PS des Erfinders gefunden werden können. Um ferner die Erläuterung der Erfindung zu vereinfachen und Wiederholungen zu vermeiden, werden als Fühler solche aufgeführt, die nach dem Coulter-Prinzip der differentiellen Leitfähigkeit arbeiten oder von Detektoren verkörpert sind, die nach optischen Prinzipien arbeiten und Laser- sowie Xenonlampen-Lichtquellen benutzen. Wie bereits erwähnt wurde, ist die Verlegung des Schwerpunktes auf die genannten Fühler nicht als Beschränkung auf einen bestimmten Fühler-Typ zu verstehen, der für die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens geeignet ist. Elektrische Ausgangsimpulse als Grundlage für die Durchführung der Erfindung können auch mit anderen optischen und elektrischen Fühlern erzeugt werden, die hier nicht beschrieben sind.

Gemäss Fig. 1 wird ein elektrolytisches Medium, welches zu analysierende Teilchen oder Körper 10 enthält, durch eine

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Fühler- oder Dektoreinheit 12 hindurchgeleitet. Der Fühler 12 hat eine geeignete Ausbildung, wobei erfolgreiche Erfahrung mit einem Fühler vorliegt, der nach dem Coulter-Prinzip arbeitet und ein Manometer-Element umfasst, mit welchem eine genau ausgemessene Menge der Probenflüssigkeit durch die Fühleröffnung des Teilchen-Zählers gesaugt werden kann. Die leitfähige Flüssigkeit, welche die zu untersuchenden Teilchen trägt, wird durch eine Öffnung geleitet, durch welche ein elektrischer Strom fliesst. Jedesmal, wenn ein Teilchen die Öffnung passiert, ändert sich die Flussdichte des Stromes in der Öffnung und erzeugt dadurch eine Potentialänderung an der Öffnung. Die Potentialänderung wird mittels eines geeigneten Verstärkers 14 verstärkt und verschiedene Parameter der Potentialänderung bzw. des entsprechenden Impulses werden in einen mehrkanaligen Analysierer 16 gemessen, dessen Ausgang ge-, eigneten Datenverarbeitungseinrichtungen 18 zur Anzeige, zur Aufzeichnung und dgl. zugeführt wird.

Der Ausgang von der Fühlereinheit 12 hat die Form von Impulsen, dessen Amplituden oder Höhen zur Grosse der Teil- · chen proportional sind und deren Dauer eine Funktion des Öffnungsdurchmessers und der Tunnellänge, der Strömungsgeschwindigkeit und ähnlicher Eigenschaften der Fühleinheit sind. Die Fühleinheit 12 kann daher als eine Einrichtung zur Erzeugung von Primärimpulsen angesehen werden, deren Ausgang mittels der Impulsformeinrichtung eines Sekundärimpuls-Generators 20, vgl. Fig. 2, so bearbeitet wird, dass Ausgangsimpulse fester Breite oder Dauer entstehen, deren Höhe oder Amplitude zur Zeit der Triggerung der Sekundärimpulse der Amplitude der durch die Teilchen, welche durch die Fühleinheit hindurchgehen, erzeugten Primärimpulse proportional ist. Die Sekundärimpulse werden zur Verarbeitung einem Umsetzer 22 zugeleitet, welcher den Impuslhöhen proportionale Kanalnummer-Adressen zuweist. Dieser Ausgang ist über eine Schnittstelle gekuppelt und wird in einer Impulshöhen-Analysiereinrichtung 28 des mehrkanaligen Analysierers 16 gemessen. Der Ausgang wird zu einer Datenspeichereinheit 24 geleitet, in welcher jedem Impuls eine Stelle oder ein Kanal auf einer Achse, die

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seine X-Achse angesehen werden kann, zugewiesen wird. Diese Achse ist in eine geeignete Anzahl von Kanälen, beim Ausführungsbeispiel z.B. in 200 Kanäle unterteilt, wobei jeder Kanal Impulse einer bestimmten Amplitude aufnimmt. Jedesmal, wenn ein Impuls der gleichen Höhe gemessen wird, wird dem betreffenden Kanal eine weitere Zählung zuaddiert. Die Gesamtzählungen (P ) der Impulse von jeweils einer bestimmten Amplitude, die jeweils einem der 200 Kanäle zugewiesen sind, werden in Tabellenform zusammengestellt. Am Ende eines Untersuchung sdurchgang es oder jederzeit während des Untersuchungsdurchganges besteht eine Zugriffsmöglichkeit zu den in die Speichereinrichtung eingegebenen Daten, so dass eine Ausgabe der in den Kanälen zusammengestellten Impulse jederzeit zur Verfugung steht. Der Impulshöhenanalysierer 28 verarbeitet die Daten vom mehrkanaligen Analysierer 16 und sein Ausgang wird in analoge Form umgesetzt, damit er für eine X-Y-Anzeige auf dem Bildschirm eines Monitors 30 oder auf dem Papier eines Plotters 32 verwendbar ist. Die in analoger Form aufgezeichneten Daten haben eine Ordinate, welche eine der Gesamtzählung in einem Kanal proportionale Gleichspannung ist, und eine Abzisse, welche eine der Kanalnummer proportionale Gleichspannung ist. Die Speichereinheit 24 kann einen digitalen Ausgang zu einem digitalen Band-Aufzeichnungsgerät 34 abgeben, wenn ein dezimaler Ausdruck gewünscht wird. Die Daten können auch auf Magnetband oder in der Speicherbank eines zeitanteiligen Computers aufgezeichnet werden.

Beim Betrieb des erfindungsgemässen Systems wird jedesmal, wenn ein Teilchen durch die Fühleinheit 12 hindurchwandert, anr Ausgang ein Spannungsimpuls erzeugt. Durch geeignete Steuerung des Stromes der Flüssigkeit, in welchem sich die Teilchen in Suspension befinden, derart, dass im Fühler eine bestimmte konstante Strömungsgeschwindigkeit herrscht, wird erreicht, dass beim Hindurchgehen einer Anzahl kugelförmiger Teilchen durch den Fühler eine Serie von Spannungsimpulsen entsteht, die eine Dauer von ungefähr 20/Usec haben und eine der Teilchengrösse proportionaler Amplitude besitzen.

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Unter der Annahme, dass ein mehrkanaliger Analysierer mit einem 100-kanaligen Speicher benutzt wird, würde die digitale Aufzeichnung eines Probenlaufes einer Anzahl kugelförmiger Teilchen das in Fig. 3 gezeigte Aussehen haben. In Fig. 3 enthält die X-Achse der Darstellung die Kanäle, auf welche die Teilchen nach ihrer Grosse tabellarisch aufgeteilt sind, wobei die Grosse, unter Zugrundelegung des Teilchendurchmessers, von links nach rechts zunimmt. Die Anzahl der Teilchen, die entsprechend der Grosse tabularisch zusammengestellt sind, ist jeweils auf der Y-Achse festgehalten und durch einen Block in dem Kanal dargestellt, der der betreffenden Teilchengrösse zugewiesen ist. Da unterschiedliche Teilchengrössen zu unterschiedlichen Potentialänderungen an der Öffnung führen, wird bei einer analogen D_arstellung des gleichen Probenlaufes der resultierende Ausgang des Analysierers zu einer kumulativen Häufigkeitskurve summiert, welche eine zeichnerische Darstellung der Anzahl der Teilchen in einem bestimmten Kanal, d.h. einer bestimmten Grosse, über dem zunehmenden Volumen der Teilchen ist. Der analoge Ausgang des 100-kanaligen Speichers würde als eine Spannung auf der X-Achse wiedergegeben, welche der Zahl der in jedem Kanal gespeicherten Impulse proportional ist und von Kanal 1 auf der Y-Achse der Darstellung gemäss Fig. 4 ausgeht. Da eine 1:1-Beziehung zu den vom Fühler erzeugten Impulsen besteht, liefert die X-Achsen-Ausgabe eine genaue Darstellung der gezählten Teilchen, wenn bestimmte Bedingungen eingehalten werden. Wie es von Fühlsystemen dieser Art bekannt ist, ähndert sich der absolute Maßstab der X-Achse in Abhängigkeit von den Werten der in das System eingegebenen Steuerparameter. Für jeden speziellen, im System eingestellten Betriebszustand wird eine Eichkurve hergestellt, wie sie in Fig. 5 gezeigt ist, und zwar unter Verwendung geeigneter Kügelchen bekannter Grosse als Standard. Es wurde gefunden, dass Polystyrol- und Polyvinyltoluen-Schaum-Kügelchen, welche für diesen Zweck von der Firma Dow Chemical Company, Bioproducts Division, Midland, Michigan, USA, hergestellt werden, den Anforderungen in geeigneter V/eise genügen.

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Zum Zwecke des Vergleichs sind die Kurven auf der Grundlage des Teilchendurchmessers und nicht nach dem Teilchenvolumen geeicht. Gewünschtenfalls kann auch eine Eichung auf ' der Grundlage des Teilchenvolumens vorgenommen werden.

Gesamtzählungen können aus den X-Y-Aufzeichnungen unter Verwendung des folgenden Ausdrucks erhalten werden:

^xmax

P = S 7 P_v · x

^xmin

Hierin bedeuten: P = die Teilchen-Gesamtzählung,

P = die Teilchenzählung pro x-Inkrement ^x (Δ) und

S = den im Gerät eingestellten Maßstabsfaktor.

Das x-Inkrement wird normalerweise als die Breite eines Kanales angenommen, wobei dann für verdünnte Lösungen die Integrationskonstante als 1 angenommen werden kann. Die Festlegung von X-.y, und x_mov geschieht nach Massgabe des interessierenden Bereiches mit x_m4„ > O und x_w„„ < n, wobei η der Kanal-Kapazität des Speichersystems gleicht.

In der vorangegangenen Beschreibung wurde also die Analyse eines Probenlaufes nach Massgabe der Gesamtzählung und Grössenverteilung der Teilchen darin beschreiben. Zur Bestimmung anderer physikalischer Eigenschaften der analysierten Teilchen, insbesondere in Bezug auf Organismen und Zellen, ist es notwendig, dass eine Teilchen/Impuls-Gestalt-Analyse durchgeführt wird. Das erfindungsgemässe Analysierverfahren beschreibt einen Prozess zur Durchführung einer solchen Impulsgestalt oder -form-

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Analyse unter Verwendung im wesentlichen des gleichen Gerätes, das auch für den Gesamtzählungs- und Grössenverteilungs-Prozess benutzt wird.

Zur Erzielung optimaler Ergebnisse ist es bei einer Impulshöhenanalyse unter Verwendung eines Fühlers vom Coulter-Typ notwendig, dass die Strömungsgeschwindigkeit der die Teilchen tragenden Flüssigkeit durch die Fühlzone absolut genau festliegt. Bei konstanter Strömungsgeschwindigkeit und bei einer geeigneten Form der Öffnung ist die Dauer der Impulse, die durch Kugeln gleicher Grosse erzeugt werden, jeweils gleich. Bei der in Geräten dieses Typs üblichen Strömungsgeschwindigkeit werden Impulse von näherungsweise 20/usec Dauer, gemessen von Fusspunkt zu Fusspunkt, erzeugt, wenn Kugeln mit einem Durchmesser von 1ui durch eine Fühleröffnung von 30yum hindurchgehen, deren Tunnellänge ungefähr 40/um beträgt. Die Geometrie und die Strömungseigenschaften sind so, dass Impulse der gleichen Grössenordnung durch Kugeln mit einem Durchmesser von 2,7/um erzeugt werden, die durch eine Öffnung von 100/Ummit der gleichen Tunnel-Länge von 40/um hindurchgehen.

Die Primärimpulse 36, vergleiche Fig. 6, liefern der Fühleinheit 12 bei Erfassung von durch die Fühlzone hindurchgehenden kugelförmigen Teilchen erzeugt werden, haben eine zweiseitige Symmetrie mit einem Spitzenwert bei ungefähr 10/Usec. Gemäss der Erfindung wird der Sekundärimpuls-Generator 20 normalerweise so eingestellt, dass er die Erzeugung eines Rechteckimpulses 38 auslöst oder triggert, der eine Dauer oder Breite von 1 /Usec hat und eine Amplitude besitzt, welche der Spannung des vom Fühler erzeugten Primärimpulses 36 genau zum Zeitpunkt der Triggerung des Sekundärimpulses linear proportional ist. Beim Beispiel gemäss Fig. 6 wurde der Sekundärimpuls 37 bei 8 /usec in den Primärimpuls getriggert. Bei diesem Gerät nimmt die Impulsdauer mit zunehmendem Kugeldurchmesser zu, jedoch mit einer wesentlich kleineren Grosse als die Impulsamplitude bei den normalerweise für

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Routine-Analysen eingestellten Verstärkungen.

Zur Erläuterung einer Ausführungsform einer Impulsform-Analyse nach der Erfindung wird auf Fig. 7 Bezug genommen. Fig. 7 zeigt einen Primärimpuls 40 derart, wie er normalerweise durch eine Fühleinheit 12 erzeugt wird, wenn Proben menschlicher Erythrozyten, die in einer 0,9-%igen (Gewicht in Volumen), teilchenfreien Saline gelöst sind, durch eine 100 /U-Öffnung des Fühlers hindurchgeleitet werden. Bei dem Probenlauf entsteht eine Impulsreihe, die aus einer Menge oder Gesamtheit von Impulsen besteht, die sich nur sehr wenig voneinander unterscheiden. Bei Einstellung des Sekundärimpulsgenerators 20 derart, dass bei 8 yusec in die Impulse eingetriggert wird (DM = 8/usec) werden Sekundärimpulse 42 erzeugt, deren Amplituden der Fühler-Spannung am Punkt ⁿaⁿ proportional sind. Wenn der Verzögerungstrigger des Sekundärimpulsgenerators für eine Erzeugung von Sekundärimpulsen 25/Usec nach Beginn des Primärimpulses eingestellt ist, werden Sekundärimpulse 44 erzeugt, deren Spannung der Primärimpulsspannung am Punkt "b" proportional ist.

Bei einer Triggerung des Sekundärimpulsgenerators zu mehreren Zeitpunkten des Primärimpulses entsteht eine Sekundärimpulsreihe, die zur Bestimmung verschiedener Eigenschaften, z.B. der Gestalt, des Primärimpulses, Fig. 8, benutzt werden kann, woraus sich wiederum Dimensions-Information über das den Primärimpuls auslösende Teilchen ergibt. Wie gezeigt, führt beispielsweise die Triggerung des Sekundärimpulsgenerators in Zeitabständen von beispielsweise 5/Usec bezogen auf den Primärimpuls 46 zur Erzeugung einer Sekundär impulsreihe 48, bei der die Impulsamplituden der Fühlerspannung an den mit 50 bezeichneten Punkten proportional sind. Die zeichnerische Darstellung, bei der die Pulse einander überlagert sind, dient nur zur Erleichterung der Erläuterung und soll keine bestimmte Ausgabe-Anzeige wiedergeben. Die Sekundärimpulse können zur Profilierung der Primärimpulse

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dienen; es kann auch die Fläche unter jedem Sekundärimpuls integriert und dann summiert werden, so dass Information über verschiedene Eigenschaften der abgetasteten Teilchen erhalten wird. Unabhängig von dem verwendeten Fühler gibt die Impulsform oder -gestalt, die beim Hindurchgehen eines Teilchens durch die Fühleinrichtung erzeugt wird, Information über dieses Teilchen wieder. Durch Messung der Amplitude des Impulses in Zeitabständen während der Dauer des Impulses können Erkenntnisse über die Gestalt des Impulses gewonnen werden. Wenn die Zeitabstände kürze** gemacht v/erden, wird die Kenntnis über die Amplitude des Impulses als Funktion der Zeit vergrössert. Anhand von Fig. 8 ist ersichtlich, dass bei einer Aufzeichnung der Spannungen, welche die Impulsamplitude wiedergeben, in zeitlicher Folge auf einem Magnetband oder in analoger oder digitaler Form in einem geeigneten Speichersystem eines Computers das Profil des Impulses rekonstruiert werden kann. Zur Rekonstruierung werden die sequentiell gespeicherten Impulse einem X-Y-Plotter zugeführt oder die gespeicherten Informationen wiederholt auf den Y-Eingang eines Oszilloskops gegeben, wobei die X-Ablenkung bei jedem neuen Beginn des Wiederholungsi-Zjrklus' der gespeicherten Information getriggert wird. Bisher wurde die Beziehung zwischen dem Impulsamplitudenprofil und der Grosse und der Gestalt der Teilchen erläutert. Es gibt Fälle, bei denen Information über das Volumen von Teilchen mit irregulärer Gestalt und Grosse von Interesse ist. Wenn die sekundären, auf die Amplitude bezogenen Impulse sequentiell vorliegen, können sie ersichtlicherweise akkumuliert v/erden und dadurch ein Maß für die Fläche unter der Impulskurve gemäss der Simpsonschen Integrationsregel liefern. Dies geschieht durch Akkumulierung der summierten Amplitudenspannungen in einem geeigneten Opterationsverstärkersystem, z.B. dem Typ 3A8 der Firma Tektronix, Inc., Beaverton, Oregon, USA. Eine Summierung der Teilchenvolumina kann im Operationsverstärker gespeichert werden. Der Ausgang des Verstärkers kann unter Verwendung von Teilchen bekannten Volumens und bekannter Gestalt geeicht werden. Indem man die akkumulierte Gestalt-Volumen-

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Zahl durch die Anzahl der Teilchen, welche die abgetasteten Impulse erzeugt haben, teilt, kann man einen mittleren Zellenvolumen-Wert bestimmen, und zwar unabhängig von Schwankungen der Teilchengrösse- und gestalt in der Probe.

Mittels einer mehrstelligen, d.h. an mehreren Punkten v/irksamen Triggerverzögerung kann die Gestalt eines Teilchens interpretiert werden, wenn eine empirische Analyse der Gestalten oder Formen der Impulse in der untersuchten Sensor-Impulsreihe durchgeführt wird. Empirische Beobachtungen der Primärimpulsreihen oder -anordnungen sind durchgeführt worden, wobei mindestens drei im allgemeinen auftretende Impulsformen festgestellt wurden. Die Impulsformen und die wahrscheinlichen Teilchenformen oder -gestalten, die jeweils zu den Impulsen führen, sind in Fig. 9 dargestellt.

Wenn vom Teilchenfühler während des Durchlaufs einer Probe mit einer symmetrischen, äusserst einheitlichen Teilchen-Gesamtheit einheitliche Primärimpulse erzeugt werden, führt eine sich ergebende Änderung der Triggerung des Sekun- · darimpulsgenerators zu einer Grössenverschiebung im mehrkanaligen Analysierer, die eine Vergrösserung des Teilchendurchmessers bei Wiedergabe in einer X-Y-Darstellung wiederzugeben scheint. Wie in Fig. 10 dargestellt, ergibt sich eine scheinbare Vergrösserung des Durchmessers der Teilchen-Gesamtheit von Kurve 52 als Ergebnis einer 8/Usec-Triggerung in den Primärimpuls nach Kurve 52,,, welche durch eine 25/Usec-Triggerung erzeugt wird.

Es ist darauf hinzuweisen, dass die Vergrösserung des scheinbaren Durchmessers künstlich ist, da der Grössenindex eines Teilchens, sei er nun ein Durchmesser, ein Volumen, eine Querschnittsfläche oder jede andere Dimension, für welche eine Eichkurve erzeugt wurde, unter Verwendung eines Teilchen-Gesamtheits-Eich-Standards, für jede Triggerverzögerungseinstellung unterschiedlich ist. Daher sind bei den Kurven

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geinäss Fig. 10 alle Grössen-Eich-Daten einschliesslich derjenigen für die durch die 25/Usec-Triggerung erzeugten Kurve und alle X-Achsen-Maßstäbe relativ zum DM 8 /usec-E ichwert angegeben ("b" in Bezug auf "a" in Fig. 7 beispielsweise). Die Kurven 52 und 52,, sind durch eine symmetrische, in hohem Maße homegene Teilchen-Gesamtheit unter Verwendung der gleichen Steuerparameter und einer 25/Usec-Triggerung erzeugt. Eine halb-zufällig gemischte Teilchen-Gesamtheit führt zu einem im wesentlichen mit Kurve 54 identischen Ausgang.

In der Praxis ist der Bezug von Impuls-Verteilungen auf eine einzige Triggerverzögerung, wie z.B. der erwähnte DM 8/Usec-Eichwert nützlich, da die Verzögerungstriggerung Änderungen der Grössenindizes von Teilchen erzeugt, die zu charakteristischen komplexen Impulsformen führen, die sich in Verschiebungen der vom mehrkanaligen Analysierer gezeichneten Grössenverteilungen gegenüber demjenigen widerspiegeln, die von der Gesamtheit der gleichen Teilchen-Bestandteil-Mischung aufgrund induzierter echter Änderungen der Grössenindizes erzeugt werden. Bei der Erfindung basieren die Ana- · lysedaten auf Unterschieden gegenüber Normalen und, da die Normale empirisch katalogisiert sind, erfordert die Methode der Zweipunkt-Triggerung-Ausführungsform für ihre Wirksamkeit nur hohe Genauigkeit. Da empirische Kruven zur Durchführung der Analysemethode der Erfindung katalogisiert sind, sind also die zur Herleitung der Kurven benutzten Eichwerte innerhalb vernünftiger Grenzen nicht kritisch.

Die Technik, einfache und mehrfache Triggerungen von Sekundärimpulsen in Bezug auf einen Primärimpuls eines Teilchen-Fühlers zu benutzen, liefert nicht nur Information über das Teilchen oder den Körper, der abgetastet wurde, und den daraus resultierenden Primärimpuls, eine Information, die auf andere Weise schwer erhalten werden kann, sondern auch nützliche Information über Körper-Gesamtheiten oder -bevölkerungen. Beispielsweise ermöglicht die Mehrfachtriggerung von mehrfachen Sekundärimpulsen in den Fühler-Primärimpuls während

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eines Probenlaufes durch die Fühleinrichtung eine ganz bestimmte "Hand- oder Unterschrift", welche die Teilchen-Gesamtheit charakterisiert, die in einem einzigen Probendurchlauf durch den Fühler erhalten werden kann. Wenn die zur Verfügung stehenden Geräte nicht die Geschwindigkeit und Empfindlichkeit haben, die dem Erhalt mehrerer Sekundärimpulse während jedes Primärimpulses ermöglichen, ergibt auch eine Serie von Durchläufen der gleichen einzigen Probe durch das Gerät mit Triggerung der Sekundärimpulse bei jedem Durchlauf zu einer unterschiedlichen Zeit in den Primärimpuls eine ganz bestimmte Handschrift, welche die Teilchen-Gesamtheit charakterisiert.

Bei einer repräsentativen Ausführungsform der Technik dieser Erfindung in Anwendung auf eine mikrobiologische Analyse wurde eine Untersuchung normalen ganzen Blutes des Fisches Fundulus heteroclitus gemacht. Das Gerät war auf eine 8/Usec-Sekundärimpuls-Triggerverzögerung und eine 5 x 10 Verdünnung des Blutes in 0,9 ?oiger (Gewicht in Volumen), teilchenfreier Saline geeicht. Im Fühler wurde eine 100/U-Öffnung verwendet. Fig. 11 zeigt zwei Kurven 56 und 58, die das Resultat von Sekundärimpulstriggerungen von DM 8 bzw. DM 25 /usec sind. Die Unterschiede der Impulsverteilungen, die sich von den zwei verschiedenen Triggerzeiten ergeben, erzeugen zwei ganz bestimmte Kurven. Für ein Beispiel der Leistungsfähigkeit der Technik wird auf die Kurven 60 und 62 von Fig. 12 Bezug genommen. Diese Kurven wurden auch mit zwei Abtastungen der gleichen Probe erhalten. Die in Fig. 12 wiedergegebenen Daten wurden auch von einer Analyse des ganzen Blutes von Fundulus heteroclitus erhalten, bei denen Geräte-Parameter und Untersuchungsbedingungen identisch mit denjenigen waren, die zu den Daten der Fig. 11 geführt haben, mit der Ausnahme, dass die Kurven 60 und 62 vom Blut von Fischen abgeleitet sind, die für 24 Stunden in Wasser gehalten waren, das mit 20 : 1 000 000 Cadmium verunreinigt war. Ein Vergleich der Kurven nach Fig. 11 mit denen nach Fig. 12 macht den Umstand deutlich, dass die erfindungsgemässe Technik den Erhalt

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aussagekräftiger Daten mit einem Minimum an Testdurchgängen für jede untersuchte Probe ermöglicht. Die allgemeinen Formen oder Gestalten der Teilchen-Gesamtheit-Verteilung erhalten aufgrund der Mehrpunkt-Triggerung eine besondere Betonung, so dass die Charakterisierung der untersuchten Körper leicht zu erhalten ist.

Gemäss der vorangegangenen Beschreibung der Erfindung arbeitet der in Verbindung mit der Erfindung benutzte Teilchen-Fühler so, dass er einen Spannungsimpuls.als Ergebnis der Änderung eines Stromflusses in einer Öffnung durch das Untersuchungsteilchen erzeugt. Andere Ausführungsformen von Teilchen-Fühlern, die auf optischer Basis arbeiten und einen für das erfindungsgemässe Verfahren verwendbaren Spannungsimpuls erzeugen, sind in den Fig. 13 und 14 dargestellt.

Gemäss Fig. 13 umfasst der Teilchenfühler 70 eine Lichtquelle 72 geeigneter Ausbildung, z.B. eine Wolfram- oder Xenon-Lampe mit geeigneter Ansprechzeit und spektraler Charakteristik. Eine Fokussiereinrichtung, z.B. ein Präfokussier-Reflektor 74 und ein Fokussier-Reflektor 76 fokussieren das Licht 78 von der Quelle 72 durch einen geeigneten Begrenzungsschlitz 80 in ein transparentes Rohr 82, durch welches eine Flüssigkeit 84 fliesst, in welcher sich die Untersuchungsprobe 86 in Suspension befindet. Die Flüssigkeit 84 bzw. das Fluid 84 kann von jeder geeigneten Art sein einschliesslich eines gasförmigen Mediums oder eine bekannte Suspension, z.B. eine isotonische Natriumchlorid-Lösung, wobei zu gelten hat, dass die Steuerungseigenschaft des benutzten Fluids derart ist, dass es für die Wellenlängen des Lichtes von der Quelle 72 transparent ist, so dass das Fluid selber keine Zufallsund Störsignale während der Untersuchung beisteuert. Natürlich darf das benutzte Fluid auch keine unerwünschten physikalischen Änderungen an den in ihm in Suspension befindlichen Körpern hervorrufen. Die FUhIzone des Fühlers 70 im Rohr 82 befindet sich an und in der Zone, welche den Brennpunkt 85 des Lichtsrahles umgibt. Wenn der Fühler nach dem optischen

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Reflektionsprinzip arbeitet, ist ein geeigneter Photodetektor 88 mit einer entsprechenden Anbringung 90 und Kollimations-Schlitzen 92 und 94 vorgesehen, um einen elektrischen Ausgangsbzw. Primärimpuls zu erzeugen, der eine Funktion des Lichtes 96 ist, das von einem Teilchen, welches durch die Fühlzone 85 hindurchgeht, reflektiert wird. Die Ausgang3signale des Detektors 88 werden über geeignete Verbindungsleitungen 98 fortgeleitet, die zu einer Verarbeitungseinrichtung führen, wie z.B. dem Verstärker, dem mehrkanaligen Analysierer und dgl. des Analysegerätes nach der Erfindung gemäss den Fig. 1 und Die Ausgangs signale des Detektors 88 liegen in der Form von Primärimpulsen vor, dessen Höhen oder Amplituden eine Funktion der Grosse, der optischen Eigenschaften und dgl. der Teilchen sind.

Es können auch optische Fühleinrichtungen verwendet werden, die nach dem Refraktions- und Absorptions-Prinzip arbeiten, um Primärimpulse zu erzeugen, die für das erfindungsgemässe Verfahren verwendbar sind. Solche Einrichtungen sind in Fig. 13 gestrichelt dergestellt und können Elemente wie einen Photodetektor 100, eine Haube 102, Kollimationsschlitze 104 und 106 sowie eine Ausgangs-Schnittstelle bzw. einen Ausgangs-Anschluss 108 umfassen. Der Photodetektor 100 ist im Strahlengang des Lichtes hinter der Lichtquelle 72 so angeordnet, dass die durch die Fühlzone hindurchgehenden Untersuchungsteilchen das auf den Photodetektor auffallende Licht unterbrechen oder beugen und dadurch zu Ausgangsimpulsen führen. Eine Lichtfalle 110 geeigneter, bekannter Ausbildung ist vorgesehen, um Streulicht zu absorbieren und dessen Störeffekte dadurch auf ein Minimum herabzusetzen.

Bei der Ausführungsform gemäss Fig. 14 wird ein geeigneter Laser 112 als Lichtquelle im Teilchenfühler 170 verwendet. Der Ausgangsstrahl 114 des Lasers ist durch einen geeigneten Begrenzungsschlitz 80 in ein transparentes Rohr gerichtet, durch welchen ein Fluid 84 fliesst, in welchem

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sich Untersuchungsproben 86 in Suspension befinden. Das Fluid 84 ist von geeigneter Art und hat die gleichen Eigenschaften wie das in Verbindung mit der Ausführungsform nach Fig. 13 erläuterte Fluid. Die Fühlzone des Fühlers 170 befindet sich im Bereich 185 im Rohr 82, durch welchen der Laserstrahl 114 hindurchgeht. Wenn der Fühler nach dem optischen Reflektionsprinzip arbeitet, ist ein geeigneter Photodetektor 88 mit einer geeigneten Haube und Schlitzen 92 und 94 vorgesehen, um einen elektrischen Ausgangs- oder Primärimpuls zu erzeugen, der eine Funktion des Lichtes 196 ist, welches von einem Teilchen in der Fühlzone 185 reflektiert wird. Die Primärimpulse vom Detektor 88, welche das analysierte Teilchen charakterisieren, werden über eine Ausgangsleitung 98 einem Verarbeitungsgerät zugeführt, wie es zuvor als zur Durchführung der Erfindung geeignet erläutert wurde.

Optische Fühleinrichtungen nach dem Refraktionsprinzip, wie sie zuvor erläutert wurden, haben einen geeigneten Photodetektor 100, eine Haube 102, Schlitze 104 und 106 und einen Ausgangsanschluss 108, vgl. gestrichelte Darstellung in. Fig.14, Eine Lichtfalle 110 geeigneter Art ist zur Absorption von Streulicht vorgesehen, damit dessen nachteilige Effekte auf ein Minimum herabgesetzt werden. Im Betrieb unterbrechen oder beugen durch die Fühlzone 185 hindurchgehende Teilchen den auf den Photodetektor 100 auffallenden Laserstrahl 114, so dass sich durch die Erfindung verwertbare Ausgangsimpulse ergeben.

Um Weitschweifigkeiten bei der Erläuterung der Ausführungsformen der Erfindung gemäss den Fig. 13 und 14 zu vermeiden, bei denen optisch arbeitende Teilchenfühler zur Erzeugung eines elektrischen Primärimpulses am Ausgang verwendet werden, der mit dem erfindungsgemässen Verfahren weiterverarbeitet werden kann, wurde nicht versucht, sämtliche optischen, elektrischen und mechanischen Eigenschaften der verschiedenen Komponenten der Fühler 70 und 170 aufzuführen. Die Anforderungen an die verschiedenen optoelektronischen Bauelemente sind bekannt. So müssen z.B. bekanntlich bei

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Verwendung einer Xenon-Lampe, z.B. einer Xenon-Blitzlichtröhre, wie sie von der Siemens Corporation, Iselin, New Jersey, USA, hergestellt wird, als Lichtquelle 72, Photoemissionselemente oder Halbleiter-Photodetektoren verwendet werden, die eine geeignete Ansprech-Frequenz und -Zeit besitzen. Eine Anforderung, die bei jedem verwendeten Photodetektor erfüllt sein muss, besteht darin, dass sein Ansprechfrequenz grosser als 10 kHz ist. Beispielsweise sind als Photodetektoren 88 Phototransistoren niedriger Dichte geeignet, wie sie z.B. als Typ Motorola MRD 810 oder Clairex 3030 von der Firma Motorola Semiconductor Products Inc., Phoenix, Arizona und Clairex Electronics, Mount Vernon, New York, USA, auf den Markt gebracht werden. Ferner sind eine Vielzahl von Lasern, sowohl vom Gas- als auch vom Kristall-Typ kommerziell erhältlich, die für die oben erläuterten Fühler verwendet werden können. Als Beispiel eines bekannten Lasers, der hier geeignet ist, sei einer der Helium-Laser genannt, die von der Firma Hughes Aircraft Company, Culver City, California, USA hergestellt werden.

Die Fühlzonen 85 und 185 der Fühler 70 und 170 können an die Photodetektoren 88 mittels bekannter, kommerziell erhältlicher Glasfaser-Optiken angekoppelt sein, z.B. mittels einer Lichtleitung oder eines optischen Wellenleiters mit geeigneten Eigenschaften; solche werden beispielsweise von der Firma E.J. duPont de Nemours & Co., Wilmington, Delaware oder der Firma Coring Glass Works, Coring, New York, USA, hergestellt. Bei einer solchen, nicht gezeigten Auslegung ist ein geeignetes Glas- oder Kunststoff-Faseroptik-Kabel mit seinem Eingangs ende freiliegend an der Fühlzone 85 oder 185 des Teilchenfühlers 70 oder 170 angeordnet und mit seinem Ausgangsende auf die photoempfindliche Fläche des Photodetektors 88 gerichtet.

Die Beschreibung der Erfindung kann wie folgt zusammengefasst werden: Es ist eine Methode zur Analysierung der

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Dimensionseigenschaften von Körpern wie Teilchen, Zellen, Organismen und dgl. mit einer Grosse im Mikrometerbereich und darunter angegeben, bei v/elcher eine Teilchendetektoreinrichtung zur Erzeugung eines elektrischen Primärimpulses als Funktion eines Dimensionsindex der Körper benutzt und anschliessend der Primärimpuls einer Sekundärimpulserzeugereinrichtung zugeführt wird, welche zu unterschiedlichen Zeitabständen während der Dauer des Primärimpulses oder während der Dauer einer von der gleichen Körperart erzeugten Anzahl von Primärimpulsen getriggert wird, so dass mehrere Sekundärimpulse erzeugt werden. Diese Sekundärimpulse, welche jeweils eine die relative amplitude des Primärimpulses zum Zeitpunkt der Triggerung wiedergebene Amplitude haben, werden für eine weitere Verwendung erzeugt, um die Gestalt des Primärimpulses wiederzugeben, so dass eine Charakterisierung der analysierten Körper auf diese Weise erhalten v/erden kann. Die Sekundärimpulse können nicht nur entweder zur Profilierung des Primärimpulses oder zur Flächenintegrierung desselben benutzt werden, sondern die Technik einer Triggerung von Sekundärimpulsen an mehreren Stellen ist auch für Analysemethoden bezüglich der Gesamtzählung biologischer Teilchen und einer Grössenverteilung insofern von Nutzen, als die "Handschrift" der untersuchten Teilchen-Gesamtheit bedeutungsvoll selbst dann betont wird, wenn nur ein einziger Unter suchungs-Durchgang angewendet wird.

/Ansprüche

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Analysierung von Körpern wie Teilchen, Zellen und Organismen mit einer Grosse im Mikrometerbereich und darunter zur Bestimmung verschiedener Eigenschaften, wie Grosse, Gestalt und Anzahl und zur Untersuchung der Dynamik des Zellenwachstums und der Änderungen und Änderungsgeschwin digkeiten von Grosse, Gestalt und Anzahl von Zellen in leben den Bevölkerungen von Organismen, dadurch gekennzeichnet , dass man eine gegebene Probe der Körper, die sich in einem Fluid in Suspension befindet, durch eine Teilchen-Detektoreinrichtung leitet, um einen Primär-Spannungsimpuls als Funktion von Dimensionseigenschaften jedes festgestellten Körpers zu erzeugen, dass man jeden Primärim-, puls einer Sekundärimpulserzeugereinrichtung zuführt, dass man eine Triggereinrichtung in der Sekundärimpulserzeugereinrichtung während der Dauer jedes Primärimpulses betätigt, um Sekundär-Spannungsimpulse zu erzeugen, deren Amplitude die relative Amplitude des zugeordneten Primärimpulses zum Zeitpunkt der Triggerung wiedergibt, und dass man die Amplitude der Sekundärimpulse anzeigt, wodurch die Anzeigen der Amplituden der Sekundärimpulse zur Wiedergabe der Gestalt des zugeordneten Primärimpulses zu den Zeitpunkten der Triggerung derart benutzt v/erden kann, dass die analysierten Körper charakterisiert werden können.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass ein Impulshöhenanalyslerer am Ausgang der Detektoreinrichtung verwendet wird, um Anzeigen der Gesamtzahl von Körpern und ihrer Grössenverteilung zu erhalten.

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ORIGINAL INSP
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , dass der von der Detektoreinrichtung erzeugte Primärirapuls eine Funktion der Grosse der Körper, des Durchmessers und der Länge der Öffnung, der Strömungsgeschwindigkeit der Fluid-Suspension und des Weges der Körper durch die Öffnung ist, wobei die Sekundärimpulse eine feste Dauer und einheitliche Gestalt haben.
4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet , dass die Fluid-Suspension mittels eines Druckunterschiedes durch die Öffnung gesaugt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , dass die gegebene Probe mindestens zweimal durch die Teilchendetektoreinrichtung geleitet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet , dass die gegebene Probe nacheinander in vorbestimmten Zeitabständen durch die Detektoreinrichtung geleitet wird, und dass die von den aufeinanderfolgenden Hindurchleitungen der Probe erhaltenen Anzeigen zur Feststellung von Änderungen der Körper darin miteinander verglichen werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , dass die Triggereinrichtung für eine mindestens zweimalige Triggerung während der Dauer · jedes Primärimpulses derart eingestellt ist, dass mindestens erste und zweite Sekundärimpulse für jeden zugeordneten Primärimpuls erzeugt werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , dass die Anzeigen der Amplituden der Sekundärimpulse verglichen werden, um dadurch eine Analyse der Gestalt des zugeordneten Primärimpulses zu erhalten, welche zur Charakterisierung der analysierten Körper verwendet werden kann.

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9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , dass die Triggereinrichtung für eine jnehrfache Triggerung in festen Zeitabständen eingestellt wird, und dass die mehreren Triggerungen eine Anzahl von Sekundärimpulsen erzeugen, welche zur Profilierung des zugeordneten Primärimpulses ausreichen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet , dass die Fläche unter jedem Sekundärimpuls integriert wird, und dass die Flächen der Sekundärimpulse zu jedem zugeordneten Primärimpuls anschliessend summiert werden, so dass das Volumen jedes abgetasteten Körpers erhalten werden kann.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet , dass die Teilchendetektoreinrichtung ein elektrischer Fühler ist,und dass die Fluid-Suspension elektrisch leitfähig ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dauurch gekennzei ch net, dass die Teilchenäetektoreinrichtung ein elektrisches Feld aufweist, welches durch Hindurchleiten eines Stromes zwischen zwei Elektroden erzeugt wird, die in der leitfähigen Fluid-Suspension mit gegenseitigem Abstand in elektrisch isolierenden Gefässen angeordnet sind, welche miteinander über eine Öffnung in Verbindung stehen.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet , dass die Teilchendetektoreinrichtung ein optoelektronischer Fühler ist, und dass die Fluid-Suspension ein Fluid aufweist, welches bei der Wellenlänge der im Fühler verwendeten Strahlung transparent ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , dass der Fühler eine Strahlungsquelle umfasst, welche Strahlung in eine Fühlzone abgibt, durch welche

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die gegebene Probe von Körpern hindurchgeleitet wird, und dass der Fühler eine Photodetektoreinrichtung umfasst, welche den Primärimpuls als Funktion der Wechselwirkung der Körper mit der Strahlung erzeugt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , dass die Strahlungsquelle ein Laser ist.
16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , dass die Strahlungsquelle eine Lampe mit inkohärentem Ausgang ist.
17· Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet , dass die Wechselwirkung der Körper mit der Strahlung eine optische Reflexion beinhaltet.
18. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch g e k e η η ζ ei c h η e t , dass die Wechselwirkung der Körper mit der Strahlung eine optische Beugung beinhaltet.
19· Verfahren nach A_nspruch 15, dadurch gekennzeichnet , dass die Wechselwirkung der Körper mit der Strahlung eine optische Absorption beinhaltet.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 19, dadurch gekennzeichnet , dass di^Zeit der Triggerung der Sekundärimpulse in dem Primärimpuls bei jedem aufeinanderfolgenden Hindurchleiten der Probe durch die Teilchendetektoreinrichtung verändert wird.

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