DE2504802B2

DE2504802B2 - Fluoreszenzmikrophotometer zum Arbeiten mit senkrechter Reflexion

Info

Publication number: DE2504802B2
Application number: DE2504802A
Authority: DE
Inventors: Ken Tama Tokio Yonekubo (Japan)
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1974-02-06
Filing date: 1975-02-05
Publication date: 1980-05-08
Also published as: JPS50109781A; US3950649A; DE2504802A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Fluoreszenzmikrophotometer zum Arbeiten in senkrechter Reflexion gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Solche gattungsgemäßen Fluoreszenzmikrophotometer sind beispielsweise aus dem Sonderdruck aus den ZEISS-Informationen Nr. 81: Ein Mikroskopfluorometer und der Firmenschrift Liste 512-123 der Ernst Leitz GmbH, Wetzlar: Fluoreszenzmikroskopie, zum Beispiel Seite 21, bekannt. Bei diesen bekannten Fluoreszenzmikrophotometern befindet sich zwischen der mit Kondensor versehenen Erregerlichtquelle und dem dichroitischen Spiegel bezüglich der Festlegung des optischen Strahlengangs lediglich eine Leuchtfeldblende. Diese Leuchtfeldblende gestattet zwar, die Größe des beleuchteten Probenausschnittes einzustellen; sie gestattet jedoch nicht, die Intensität des auf die Probe gelangenden Erregerlichies einzustellen. Wenn viel Erregerlicht auf die Probe fällt, führt dies zu einem Verblassen der Probe, wodurch die durch das Erregerlicht hervorgerufene Fluoreszenz nicht linear wird. Dies kann zu Meßfehlern führen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Fluoreszenzmikrophotometer zum Arbeiten in senkrechter Reflexion zu schaffen, bei dem sich das Verblassen der Probe weitgehend vermeiden läßt.

Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.

Bei dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzmikrophotometer ist es mit Hilfe der Aperturblende 3 möglich, die Intensität des auf die Probe fallenden Erregerlichies einzustellen, wodurch in einfacher Weise vermieden werden kann, daß zuviel Erregerlicht auf die Probe gelangt und diese in der Folge davon schnell verblaßt.

Zum Stand der Technik sei ergänzend auf die ZEISS-Mitteilungen 4, 1967, Seite 261, verwiesen. Darin ist ein Auflicht-Mikroskop für Reflexionsmessungen dargestellt, das, was dort allerdings nicht beschrieben ist, nach Ergänzung mit entsprechenden Filtern möglicherweise als ein Auflicht-Fluoreszenzmikrophotometer verwendbar ist. Der ßclcuchtungsstrahlcngung dieses bekannten Mikroskops enthalt zusätzlich /u den beim Erfindungsgegenstand vorgesehenen Bauteilen eine /weite llilfslinse /wischen einer l.eiichlblende und dem Objektiv, wobei die Leuchtblende dem kleinen Loch des Erfindungsgegenstandes entspricht.

Zur Korrektur chromatischer Abbildungsfehler wurden früher bei Fluoreszenzmikrophotometern Linsensysterne zwischen dem dichroitischen Spiegel und dem Loch verwendet, die ähnlich der zweiten Hilfslinse der genannten ZEISS-Mitteilungen 4 angeordnet waren. Solche chromatischen Abbildungsfehler entstehen dadurch, daß die spektrale Verteilung des Erregerlichtes

ίο im Maximum im allgemeinen bei einer gegebenen Wellenlänge im Bereich zwischen 350 nm bis 550 nm aufweist. Der Wellenlängenunterschied zwischen dem Erregerlicht und dem Fluoreszenzlicht ist im allgemeinen größer als 30 nm. Zusätzlich ist das Fluoreszenzlicht

ti im wesentlichen monochromatisch. Dieser Wellenlängenunterschied verursacht Schwierigkeiten, wenn im optischen System zwischen dem kleinen Loch und der Blende chromatische Aberration auftritt. Das Bild des Loches könnte dann nicht genau auf der Probe entworfen werden, wenn das Bild der Fluoreszenzlicht emittierenden Stelle der Probe am Ort der Blende entworfen werden soll. Dies führt zum Auftreten von Streulicht und dazu, daß die Probe nicht gleichmäßig mit Erregerlicht beleuchtet wird, so daß die Meßgenauigkeit abnimmt. Wenn dagegen das Bild des Loches auf der Probenoberfläche entworfen wird, entsteht das genaue Bild der Fluoreszenzlicht emittierenden Stelle der Probe nicht am Ort der Blende, wodurch die Meßgenauigkeit abnimmt. Ein zur Korrektur der

ίο chromatischen Aberration verwendetes, ähnlich der zweiten Hilfslinse der oben genannten ZEISS-Mitteilungen 4, angeordnetes Linsensystem muß jedoch eine Doppellinse sein, die aus einer Flintglaslinse und einer Kronglaslinse zusammengesetzt ist, wobei die sich

li gegenüberliegenden, zusammenpassenden Flächen zusammengekittet sind, so daß das Linsensystem im Aufbau verhältnismäßig kompliziert ist. Zusätzlich werden das Flintglas und das Kittmittel bei Beleuchtung mit Erregerlicht selbstleuchtend und erzeugen Fluoreszenz, wodurch Streulicht entsteht und die Meßgenauigkeit abnimmt.

Beim Erfindungsgegenstand wird der beschriebene, durch chromatische Aberration verursachte Meßfehler vermieden.

Eine weitere Eigenart der Anordnung gemäß der genannten ZEISS-Mitteilungen 4 liegt im folgendem: Die Vergrößerung der zweiten Hilfslinse liegt in der Größenordnung von 0,3fach, so daß das kleine Loch sehr klein sein müßte, damit auf der Probe lediglich ein kleiner Fleck beleuchtet wird. Wenn beispielsweise der auf der Probe zu beleuchtende Fleck 2 nm groß sein soll und die Vergrößerung des Objektivs 40fach ist, müßte der Durchmesser des kleinen Loches 0,024 mm betragen. Ein solch kleines Loch wäre kaum herstellbar. Bei dem erfindungsgemäßen Fluoreszen2mikrophotometcr kann das kleine Loch oder besser die Leuclhtfeldblende relativ groß dimensioniert werden, weil die zweite Hilfslinse fehlt.

Beim Erfindungsgegenstand wird das kleine Loch

w) bzw. die Leuchtfeldblende genau auf der Oberfläche der Probe abgebildet, und die Fluoreszenzstrahlung aussendende Stelle der Probe wird genau auf der Blende abgebildet. Es ist somit möglich, die chromatische Aberration zwischen dem kleinen Loch und der Blende

h^r) zu iliminieren, ohne daß eine /weile llilfslinse zwischen das kleine Loch und den dichroitischen Spiegel eingeschoben wird.

Die Erfindung wird im folgenden anhand einer

schematischen Zeichnung erläutert.

Die Figur stellt ein Fluoreszenzmikrophotometer zum Arbeiten mit senkrechter Reflexion dar.

Das Mikrophotometer weist eine Lichtquelle 1 für Erregerlichi und eine Linse 2 auf, die ein Bild M der ι Lichtquelle 1 an einem Ort entwirft, an dem eine Aperturblende 3 angeordnet ist. Zwischen der Linse 2 und der Aperturblende 3 ist ein Durchlaßfilter 4 für Erregerlicht angeordnet. Nach hinten von der Aperturblende 3 entfernt angeordnet sind eine Zwischenlinse 5, ein kleines Loch 6 und ein dichroitischer Spiegel 7. Zwischen dem dichroitischen Spiegel 7 und einer zu untersuchenden Probe 9 ist ein Objektiv 8 angeordnet.

Die Zwischenlinse 5 dient dazu, das in der Aperturblende 3 entworfene Bild M der Lichtquelle durch das Loch 6 hindurch in der Lage des Brennpunkts Fauf der Rückseite des Objektivs 8 zu entwerfen. Das Loch 6 kann als eine Blende für das Beobachtungsfeld wirken. Das Objektiv 8 entwirft das Bild des Loches 6 durch den dichroitischen Spiegel 7 hindurch auf der oberen Oberfläche der Probe 9.

Der dichroitische Spiegel 7 reflektiert das Erregerlicht und läßt das Fluoreszenzlicht durch.

Gemäß der Figur nach oben sind vom dichroitischen Spiegel 7 ein Abschneidefilter 11 für das Erregerlicht, >^r. eine Blende 10 und eine photoelektrische Zelle 12 entfernt. Das Objektiv 8 dient auch dazu, ein Bild der Fluoreszenzlicht emittierenden Stelle der Probe 9 durch den dichroitischen Spiegel 7 an einem Ort zu entwerfen, an dem die Blende 10 angeordnet ist. Die photoelektrische Zelle 12 ist außerhalb des Tubus T eines Mikroskops angeordnet und erzeugt bei Einfang von Fluoreszenzlicht ein elektrisches Signal, das durch einen elektronischen Verstärker hindurch einem Galvanometer zugeführt wird, der in bekannter Weise Intensität der Fluoreszenz anzeigt. Der elektronische Verstärker und das Galvanometer sind der Einfachheit der Darstellung halber weggelassen.

Die Tatsache, daß das Objektiv 8 das Bild des Loches 6 auf der oberen Oberfläche der Probe 9 entwirft, bedeutet eine Vereinfachung des Mikrophotometers derart, daß es genügt, nur das Objektiv 8 zwischen dem Loch 6 und der Probe 9 anzuordnen.

Im allgemeinen ist das Objektiv 8 für den gesamten sichtbaren Bereich vom nahen Ultraviolett aus hochgradig korrigiert, so daß das Bild des Loches 6 genau in der oberen Oberfläche der Probe 9 entworfen wird und das Bild der Fluoreszenzlicht emittierenden Stelle der Probe 9 genau am Ort der Blende 10 entworfen wird. Zusätzlich schwächt das Objektiv 8 nicht den Durchlaß des Erregerlichtes, wenn das Objektiv mit Erregeriicht bestrahlt wird.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Fluoreszenzmikrophotometer zum Arbeiten in senkrechter Reflexion mit einer Lichtquelle für Erregerlicht, einem kleinen Loch, einem dichroitischen Spiegel, der das Erregerlicht reflektiert und Fluoreszenzlicht durchläßt, einem Objektiv, das ein Bild des vom dichroitischen Spiegel reflektierten kleinen Loches auf der Probe entwirft und ein Bild der fluoreszierenden Stelle der Probe durch den dichroitischen Spiegel hindurch am Ort einer Blende entwirft, und einer photoelektrischen Zelle zum Empfang des F'uoreszenzlichtes von der Blende, dadurch gekennzeichnet, daß an der Stelle, an der eine Linse (2) ein Bild (M) der Lichtquelle (1) entwirft, eine Aperturblende (3) angeordnet ist, und daß zwischen der AperUirblende (V) und dem kleinen Loch (6) eine Zwischenlinse (5) angeordnet ist, die ein Bild der Aperturblende (3) über den dichroitischen Spiegel (7) in der rückwärtigen Brennebene (F)des Objektivs (8) entwirft.