DE2435988B2 - Verfahren zur bestimmung von plasminogen - Google Patents

Description

e^ZcTden Katalysator nicht aktivierbares

e) sar^{und schließlich} miteinander vermischt und die Gerinnungsze.t des Ansatzes mißt.

Aktivator über die P.asminb,,-

2. Verfahren nach Anspruch U dadurch gekenn-

Jjistege _Pi_asminogengehalts vorgeschlagen, in

^_{1 di}e Fibrinbildung in einem antiplasm.ntreien ^„plasma "ach Akti_;ierung des Plasm-gens

einen Katalysator, der

Vahrfns liegt jedoch in der

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine verdünnte, menschliches Plasminogen enthaltende Körperflüssigkeit zu einem Gemisch aus

^ _{b daher ein Inte}resse. das vorgeschlagene

_{γ f hren zu} verbessern. .

_{wurde nun gefunden}, daß die Plasm.nogenbe_stimmUng wesentlich vereinfacht werden kann, wenn

-s:

4. Verfahren nach einem der Ansprüche ! bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Katalysator Streptokinase ist.

SS

_kannten Plasminogengehalt. .

_{Dje Erfjndung bezie}ht sich demnach auf ein Vcr_{fahren ZU}r Bestimmung von Plasminogen in mensch-

flüssigkeit pro ml 250 bis 5000 Einheiten Streptokinase (nach Christensen) zugesetzt werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als durch den Katalysator nicht aktivierbares Plasminogen ein Piasminogen von Wiederkäuern verwendet wird.

_{eJne verdunntef} Humanplasminogen enthaltende Körperflüssigkeit,

_{b) einen} Katalysator, J". "^^S⁸⁶¹¹ '" Humanplasm.nogen-Akt.vator umwandelt,

^ ^ Fibrinogen,

_{d) ejn durch den} Katalysator nicht aktivierbares Plasminogen und schließlich

e) Thrombin

6o miteinander vermischt und die Gerinnungszeit des

Ansatzes mißt. .

Das Verfahren eignet sich insbesondere tür die lie-

,hromboembolisch Erkrankten od_er be, Pal.entcn m,l elobaler Gerinnungsslörung.

sjoflwechsd

render Streptokokken, der Streptokinase, einen Komplex zu bilden vermag, der eine ähnliche enzymatische Wirkung wie die körpereigenen Aktivatoren des Plasminogen* hat. Demgegenüber wird tierisches Plasminogen, insbesondere Plasminogen von Wiederkäuern, z. B. Rinderplasminogen durch Streptokinase nicht aktiviert. Der Human-Plasminogen-Streptokinase-Komplex katalysiert die Umwandlung von menschlichem und tierischem Plasminogen zu Plasmin.

Beim vorliegenden Verfahren wird nun ein Katalysator, z. B. die Streptokinase, verwendet, der einerseits Humanplasminogen in Humanplasminogen-Aktivator umzuwandeln vermag, und andererseits ein zugesetztes, phylogenetisch dem menschlichen nicht verwandtes Plasminogen meist nicht direkt, sondern nur über eine aktivierte Zwischenstufe in Plasmin überführt. Vom Plasmin ist bekannt, daß es eine sehr wirksame Proteinase darstellt, die unter anderem Fibrinogen abzubauen vermag. In einem Gerinnungsansatz erweist sich die Gerinnungszeit um so stärker verzögert, je stärker das Fibrinogen durch vorhandenes Plasmin degradiert wurde.

Nach dem Vorhergesagten kann in dem Verfahren statt Streptokinase auch jede andere katalytisch wirksame Substanz Anwendung finden, die in der Lage ist. die gesamte vorhandene Plasminogenmenge in Aktivator zu überführen.

Es konnte mit dem vorliegenden Verfahren gezeigt werden, daß eine Beziehung zwischen der vorhandenen Plasminogenmenge und der in einem Gerinnungsansatz gemessenen Gerinnungszeit herzustellen ist. Dabei hat es sich als zweckmäßig erwiesen, die zu testenden Körperflüssigkeiten I : 5 bis 1 : 50 mit einem wäßrigen Medium, vorteilhaft mit einer isotonischen Salzlösung, die gegebenenfalls gepuffert sein kann, zu verdünnen. Die Menge an Katalysator soll gegenüber der Plasminogenmenge im Überschuß vorliegen. Im Falle von Streptokinase als Katalysator bedeutet das ein Molverhältnis Streptokinase zu Plasminogen > 1 :1. In normalerweise vorkommenden Meßbereichen ist es ausreichend, pro ml der verdünnten Körperflüssigkeit 250 bis 5000 Einheiten Streptokinase (nach Christensen) zuzusetzen oder ein entsprechendes Äquivalent einer anderen katalytisch wirksamen Substanz, die in der Lage ist, die gesamte vorhandene Plasminogenmenge in Aktivator zu überführen.

Ferner soll d.r Ansatz pro ml zweckmäßig 1 bis 100 mg Fibrinogen, ferner an nicht durch den Katalysator aktivierbarem Plasminogen entsprechend einer Menge von 1 bis 80 Einheiten (eine Einheit Plasminogen entspricht einem Plasminogengehalt von 1 ml normalen Rinderplasma) und schließlich 0,1 bis 10 Einheiten Thrombin enthalten. Dabei ist es für den Fachmann selbstverständlich, daß eine höhere Fibrinogenmenge eine geringere Thrombinmenge zur Gerinnung in der gleichen Zeiteinheit benötigt bzw. daß die Gerinnungszeit von der Fibrinogenmenge in umgekehrt proportionalem Verhältnis steht. Die Gerinnungszeit, die in dem Verfahren gemäß der Erfindung mit der Plasminogenmenge in Korrelation steht, kann zweckmäßigerweise mit Hilfe von dafür zur Verfügung stehenden Meßgeräten, sogenannten Koagulornetern, bestimmt werden, beispielsweise in einem Kugelkoagulometer.

Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die praktische Durchführung in der Weise vorzunehmen, daß man zu einer verdünnten, menschliches Plasminogen enthaltenden Körperflüssigkeit einen Katalysator, der Humanplasminogen in Humanplasminogen-Aktivator umwandelt, zusetzt, das Gemisch zu einer Lösung, die Fibrinogen und ein durch den Katalysator nicht aktävierbares Plasminogen enthält, zufügt, den Ansatz schließlich mit Thrombin zur Gerinnung bringt und die Gerinnungszeit bestimmt. Dies wird dann mit der Plasminogenmenge in Beziehung gesetzt. Man kann aber auch zweckmäßig so verfahren, daß man eine verdünnte, menschliches Plasminogen enthaltende Körperflüssigkeit zu einem Gemisch aus

a) einem Katalysator, der Humanplasminogen in H umanplasminogenaktivator umwandelt,

b) Fibrinogen und

c) einem durch den Katalysator nicht aktivierbaren Plasminogen zufügt, den Ansatz schließlich mit Thrombin zur Gerinnung bringt, die Gerinnungszeit bestimmt.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch das folgende Ausführungsbeispiel nun näher erläutert:

Erstellung der Eichkurve

In 10 Teströhrchen aus Polystyrol mit den Abmessungen 14,5 · 84 mm wird je eine Glaskugel (Durchmesser 2 mm) gegeben. In 5 der Röhrchen soll die Gerinniingszeit des Standardplasmas ohne Aktivierung durch Streptokinase durchgeführt werden. In den restlichen 5 Röhrchen wird die Gerinnungszeit nach Aktivierung mit Streptokinase bestimmt. Die Gerinnungszeiten werden jeweils in 5 verschiedenen Verdünnungen gemessen, wobei jeweils eine Kontrolle ohne Plasmaverdünnung vorgenommen wird. Das Plasma wird 1 : 20 mit 0,06 M Diäthylbarbiturat-Na-Acetat-HCl vorverdünnt und die weitere Verdünnung mit der gleichen Lösuna in der Weise vorgenommen, daß in den zu testenden" Röhrchen 100%, 50%, 25%, 12,5",, und 0% der Piasinaverdünnung vorliegt. In den Proben, die mit Streptokinase aktiviert werden, werden pro 2 ml Plasma-Vorverdünnung 0,1 ml einer Streptokinaselösung von 20 000 I. E. pro ml zugegeben und 30 see bei Raumtemperatur belassen.

Für die nachstehend beschriebenen Gerinnungsansätze werden folgende Lösungen benötigt:

1. Rinderfibrinogenlösung mit 4 mg/ml Rinderfibrinogen,

2. Thrombinlösung mit 2 NIH Einheiten/ml Thrombin.

Im folgenden Testansatz ergeben sich die angeführten Gerinnungszeiten. Die in einer Doppelbestimmung erhaltenen Mittelwerte der Gerinnungszeiten werden auf einem Doppel-Logarithmenpapier aufgetragen, die als Eichkurve für die weiteren Bestimmungen verwendet werden kann.

Testansatz

0,4 ml Rinderfibrinogenlösung
-t- 0,2 ml Plasmaverdünnungen, nicht aktiviert

oder aktiviert
2 min inkubieren (37°C)

+ 0.1 ml Thrombin

Je nach der verwendeten Piasminverdünnung liefert ein solcher Ansatz folgende Gcrinnuneszeiten in see:

³lasma unaktiviert

100% bis 26,3/26,3 = 26,3" 50% bis 24,6/25,1 = 24,9" 25% bis 24,3/24,0 = 24,2"

12,5% bis 23,4/23,2 = 23,3" 0% bis 23,2/23,1 = 23,2"

Plasma aktiviert

100% bis 40,5/39,0 = 39,8" 50% bis 34.8/34,0 = 34,4" 25% bis 29,5/29,3 = 29,4"

12,5% bis 26,6/26,5 = 26,6" 0% bis 23.1/23,2 = 23,2"

Testung unbekannter Seren oder Plasmen

Die zu testenden Seren- oder Plasmenproben werden wie das Standard-Humanplasma 1 : 20 vorverdünnt. 2 ml dieser Serum- oder Plasmaverdünnung werden mit 0,1 ml Streptokinase (20 000 E/ml) versetzt und 30 see bei Raumtemperatur belassen. Danach wird die inkubierte Probe 1 +1 verdünnt in den Testansatz zur Bestimmung der Gerinnungszeit eingesetzt. Aus der resultierenden Gerinnungszeit von 37 see kann mit Hilfe der Eichkiirve (vgl. Abbildung) und einer primär getroffenen Annahme, daß Standard-Humanplasma 5000 E/ml Plasminogen enthält, die Menge des Plasminogens in der getesteten Probe z. B. mit 70%, dieses Werts entsprechend 3500 Einheilen Plasminogen/ml entnommen werden. Unter Berücksichtigung der eingangs vorgenommenen Verdünnung von 1 : 2 beträgt der Plasminogen-Gehalt der Probe 7000 E/ml. Die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn man die

ίο vorverdünnte Humanplasminogen enthaltende Körperflüssigkeit zu einer Mischung aus plasminogenhaltigcm Rinderfibrinogen mit 500 E/ml Streptokinase zusetzt, den Ansatz 2 min bei 37°C inkubiert und anschließend mit der angegebenen Thrombinlösung zur Gerinnung bringt.

Zeigt es sich beispielsweise, daß eine zu prüfende Körperflüssigkeit in dem Testsystem einen nicht bestimmbar hohen Plasminogenwert erbringen würde, wird sinnvollerweise die Probe entsprechend vorverdünnt und diese Verdünnung in der Bestimmung in Rechnung gesetzt.

Entsprechendes gilt bei zu niedrigem Plasminogengehalt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Plasminogen, in menschlichen Körperflüssigkeiten durch Messung der Gerinnungszeit einer f.br.nogenhalt.gen Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß man
_a) eine verdünnte Humanplasminogen enthalten-

£ΜΑ Humanplasminogen in i um.andelt,

Zur Bestimmung des Plasminogehalts einer Plasma- oder Serumprobe steht eine Re.he von Methoden zur Verfügung die auf unterschiedlichen Pnnz.p.en befhln unterschiedlich empfindlich oder störanfällig ruhen ^ „„,;„_„„„ _{mehr oder} weniger Zeitsin u ^ _biologischen jests "ntersche,-

auhvana ^.^ _{daß m einem F} „ _d

den^s ρ κ_ ^^ ^ _{plasmin d lt und}

beisSweise in der Fibrinplatten-Techn.k nach ^ _beätin^ ,ird Im ^

umwandelt.