DE2435988A1

DE2435988A1 - Verfahren zur bestimmung von plasminogen

Info

Publication number: DE2435988A1
Application number: DE2435988A
Authority: DE
Inventors: Norbert Dr Heimburger; Hermann Erich Dr Karges
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1974-07-26
Filing date: 1974-07-26
Publication date: 1976-02-05
Also published as: IE41277L; DE2435988B2; AT349152B; NL7508671A; CH617013A5; IE41277B1; DK340375A; FR2280086A1; LU73056A1; US4033824A; FR2280086B1; GB1516355A; IT1041783B; ATA577175A; BE831796A

Description

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BEIIRINGVv⁷ERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg(Lahn)

Aktenzeichen: Hoe 74/b 015 - Ma 198

Datum: 24. Juli 1974

Verfahren zur Bestimmung von Plasminogen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur analytischen Bestimmung von Humanplasminogen durch Messung der Gerinnungszeit in einer Probe.

Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Bestimmung von Plasminogen in menschlichen Blut- und Körperflüssigkeiten. Die Kenntnis des Plasminogengchalts ist besonders wichtig bei Patienten, die unter einer fibroroLyti sehen oder antifibrinolytischen Therapie stehen, ferner bei thromboembolisch Erkrankten oder bei Patienten mit globaler Gerinnungsstörung.

Zur Bestimmung des Plasminogengehalts einer Plasma- oder Serurnprobe steht eine Reihe von Methoden zur Verfügung, die auf unterschiedlichen Prinzipien beruhen, unterschiedlich empfindlich oder störanfällig sind und für die Bestimmung mehr oder weniger Zeitaufwand erfordern. Die biologischen Tests unterscheiden sich prinzipiell darin, dass in einem Falle das Plasminogen der Probe in Plasmin umgewandelt und beispielsweise in der Fibrinplatten-Technik nacli Astrup bestimmt wird. Im anderen Falle wird das Plasminogen mit Hilfe eines Katalysators, der Plasminogen in einen Plasminogon-Aktivator umwandelt, z.B. Streptokinase als Aktivator bestimmt, beispielsweise in der Clot-

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Lysis-Methode nach Christensen, mit der der gebildete Aktivator über die Piasminbildung gemessen werden kann.

In einer älteren Patentanmeldung wurde ein Verfahren zur Messung des Plasminogengehalts vorgeschlagen, in dem die Fibrinbildung in einem antiplasminfreien Probenplasma nach Aktivierung des Plasminogens unter Beifügung von Thrombin verzögert und der Plasminogengehalt durch die Bestimmung der Verzögerung der Gerinnungszeit festgelegt wird. Ein wesentlicher Nachteil dieses Verfahrens liegt jedoch in der Notwendigkeit, die Antiplasmin-Aktivität des Patientenplasraas mit Isoamylalkohol entfernen zu müssen. Dadurch ist seine Anwendung für die routinemässige Plasminogenbestimmung in klinischen Laboratorien relativ aufwendig und auch nicht schneller als beispielsv/eise die Clot-Lysis-Kethode.

Es bestand daher ein Interesse, das vorgeschlagene Verfahren zu verbessern.

Es wurde nun gefunden, dass die Plasminogenbestimmung wesentlich vereinfacht werden kann, wenn das Plasminogen in einer Probe, z.B. in verdünntem Plasma oder Serum mit Hilfe eines Katalysators in einen Plasminogen-Aktivator umgewandelt wird und die Menge des Aktivators in einem Testsystem bestimmt wird, das ein Plasminogen im Überschuss enthält, welches durch den Katalysator nicht aktiviert v/ird. Die Gerinnungszeit des Testansatzes mit Thrombin wird dabei zur Meßgrösse für den unbekannten Plasminogengehalt.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Bestimmung von Plasminogen in menschlichen Körperflüssigkeiten durch Messung der Gerinnungszeit einer fibrinogcnhaltigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass man

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a) eine verdünnte, menschliches Plasminogen enthaltende Körperflüssigkeit,

b) einen Katalysator, der Humanplasminogen in Humanpiasminogen-Aktivator umwandelt,

c) Fibrinogen,

d) ein durch den Katalysator nicht aktivierbares Plasminogen und schliesslich

e) Thrombin

miteinander vermischt, die Gerinnungszeit des Ansatzes bestimmt und die Gerinnungszeit mit der Plasminogenmenge in Besiehung setzt.

Das Verfahren eignet sich insbesondere für die Bestimmung von Plasminogen im Plasma, Serum oder anderen Körperflüssigkeiten von menschlichen Probanden.

Dem Verfahren liegt die Überlegung zugrunde, dass Humanplasminogen mit einigen biologischen Katalysatoren, beispielsweise dem Stoffwechselprodukt ß-hämolysJerender Streptokokken, der Streptokinase, einen Komplex zu bilden vermag, der eine ähnliche enzymatische Wirkung wie die körpereigenen Aktivatoren des Plasminogens hat. Demgegenüber wird tierisches Plasminogen, insbesondere Plasminogen von Wiederkäuern, z.B. Rinderplasminogcn durch Streptokinase nicht aktiviert. Der Human-Plasminogen-Streptokinase-Komplex katalysiert die Umwandlung von menschlichem und tierischem Plasminogen zu Plasmin.

Unter diesen Gesichtspunkten ist das V7esen des vorliegenden Verfahrens darin zu sehen, dass einerseits ein Katalysator verwendet wird, der Humanplasminogen in Humanplasminogen-Aktivator umzuwandeln vermag, z,B. die Streptokinase, dass dieser Katalysator jedoch andererseits ein zugesetztes, phylogerietiGch dem menschlichen nicht verwandtes Plasminogen

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meist nicht direkt, sondern nur über eine aktivierte Zwischenstufe in Plasmin überführt. Vom Plasmin ist bekannt, dass es eine sehr wirksame Proteinase darstellt, die u.a. Fibrinogen abzubauen vermag. In einem Gerinnungsansatz erweist sich die ■Gerinnungszeit um so stärker verzögert, je stärker das Fibrinogen durch vorhandenes Plasmin degradiert wurde.

Nach dem Vorhergesagten kann in dem Verfahren statt Streptokinase auch jede andere katalytisch v/irksame Substanz Anwendung finden, die in der Lage ist, die gesamte vorhandene Plasminogenmenge in Aktivator zu überführen»

Es konnte deshalb mit dem vorliegenden Verfahren gezeigt werden, dass eine Beziehung zwischen der vorhandenen Plasminogenmenge und der in einem Gerinnungsansatz gemessenen Gerinnungszeit herzustellen ist. Dabei hat es sich als zweckmässig erwiesen, die zu testenden Körperflüssigkeiten 1:5 bis 1:50 mit einem wässrigen Medium, vorteilhaft mit einer isotonischen Salzlösung, die ggf. gepuffert sein kann, zu verdünnen. Die Menge an Katalysator soll gegenüber der Plasminogenmenge im Überschuss vorliegen. Im Falle vo^Streptokinase als Katalysator bedeutet das ein Molverhältnis Streptokinase Plasminogen > 1:1. In normalerweise vorkommenden Messbereichen ist es ausreichend, pro ml der verdünnten Körperflüssigkeit 250-5000 Einheiten Streptokinase (nach Christensen) zuzusetzen oder ein entsprechendes Äquivalent einer anderen katalytisch wirksamen Substanz, die in der Lage ist, die gesamte vorhandene Plasminogenmenge in Aktivator zu überführen.

Ferner soll der Ansatz pro ml zweckmässig 1 - 100 mg Fibrinogen, an nicht durch den Katalysator aktivierbarem Plasminogen entsprechend einer Menge von 1-80 Einheiten (eine Einheit Plasminogen entspricht einem Plasminogengehalt von einem ml normalen Rinderplasma) und schliesslich 0,1 - 10 Einheiten Thrombin enthalten. Dabei ist es für den Fachmann selbstverständlich, dass eine höhere Fibrinogenmenge eine geringere

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Thrombinmenge zur Gerinnung in der gleichen Zeiteinheit benötigt bzw. dass die Gerinnungszeit von der Fibrinogenmenge in umgekehrt proportionalem Verhältnis steht. Die Gerinnungszeit, die in dem Verfahren gemäss der Erfindung mit der Plasminogenmenge in Korrelation steht, kann zweckmässigerweise mit Hilfe von dafür zur Verfügung stehenden Messgeräten, sogenannten Koagulometern, bestimmt werden, beispielseise in einem Kugelkoagulometer.

Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die. praktische Durchführung in.der Weise vorzunehmen, daß man zu einer verdünnten, menschliches Plasminogen enthaltenden Körperflüssigkeit einen Katalysator, der Iluiv.anplasminogen in Hurr.2nplasminogen-7iktivat.or umwandelt, zusetzt, das Gemisch zu einer Lösung, die Fibrinogen und ein durch den Katalysator nicht aktivierbares Plasminogen enthält, zufügt, den Ansatz schließlich mit Thrombin zur Gerinnung bringt, die Gerinnungszeit bestimmt und diese mit der Plasminogenmenge in Beziehung setzt, oder daß man eine verdünnte, menschliches Plasminogen enthaltende Körperflüssigkeit zu einem Gemisch aus

a) einem Katalysator, der Iluraanplasminogen in llunianplasrninogenaktivator umwandelt,

b) Fibrinogen und

c) einem durch den Katalysator nicht, aktivierbaren Plasminogen zufügt, den Ansatz schließlich mit Thrombin zur Gerinnung bringt, die Gerinnungszeit bestimmt und diese mit der Plasminogenmenge in Beziehung setzt.

Im klinischen Laboratorium werden Reagensansätze bevorzugt, mit deren" Hilfe die durchzuführenden Bsstimmungsruethoden vereinfacht werden können. Ein Reagens zur Bestimmung von Plasminogen könnte beispielsweise folgende Zusammensetzung haben, wobei spezielle Erfordex'nisso zu Anteilen oder mehrfachen der angegebenen Menge der jeweiligen Substanzen Anlaß geben könnten:

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" .- ■ " - 6'- . Ma 198

Reagens

1. Rinderfibrinogen 60 mg

2. Streptokinase 75.000 I.E. (nach Christensen)

3. Thrombin 60 NIH- Einheiten (National Inst.

of Health (NIH))

Dieser Testannatz kann gewünschtenfalls noch ergänzt werden durch:

4. schwach alkalische Pufferlösung beispielsweise
Diäthylbarbiturat-Na-/vcetät~HCl 0,06 M

5. Standard-Humanplasma ca. 1 ml

Mit Hilfe des vorgeschlagenen Testbesteckes kann nun sowohl die. Eichkurve für die Beziehung der Plasminogenip.onge und der Gorinnungnzeit erstellt als auch die Bestimmung des Plasrainogens von etwa 25 unbekannten Humanpiasrainogen enthaltenden Lösungen durchgeführt werden. Dies wird in der folgenden Versuchsbeschreibung wiedergegeben: ·."·."'

i¹

Erste],lung der Eichkurve

In 10 Teströhrchen aus Polystyrol mit den Abmessungen 14,5 χ 84 mm wird je .eine Glaskugel- (0 2 mm) gegeben. In 5 der Röhrchen soll die Gerinnungszei t des Standardplasiaas ohne Aktivierung durch Streptokinase durchgeführt werden. In den restlichen 5 Röhrchen wird die Gerinnungszeit nach Aktivierung mit Streptokinase bestimmt. Die Gerinnungszeiten werden jeweils in 5 verschiedenen Verdünnungen gemessen, wobei jeweils eine Kontrolle ohne Plasinaverdünnung vorgenommen wird. Das Plasma wird 1:20 mit 0,06 M Diäthylbcirbiturat-Na-Acetat-HCl vorverdünnt und die weitere Ver-

mit der Kleichen Lösung . , .,...,,

aunnuncj/iri der weise vorgenommen, daß m den zu testenden Rohrcnen 1OO}C, 50%, 25%, 12,5% und 0% der Plasraaverdünnung vorliegt. In den Probeii, die mit Streptokinase aktiviert werden, werden pro 2 ml Plasnsa-Vorverdünnung O,l ml einer Streptokinaselösung von 20.000 I.E. pro ml zugegeben und 30 Sekunden bei Raumtemper.atur belassen.

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Für die nachstehend beschriebenen Gerinnungsansätze werden folgende Lösungen benötigt:

1. Rinderfibrinogenlösung mit 4 mg/ml Rinder fibrinogen,

2. Thrombinlösung mit 2 NIH Einheiten/ml Thrombin.

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Ma

Im folgenden Testansatz ergeben sich die angeführten Gerinnungs-zeiten. Die in einer DoppelbeStimmung erhaltenen Mittelwerte der Gerinnungszeiten v/erden auf einem Doppe 1-Logarithmenpapie3? aufgetragen, die als Eichkurve für die weiteren Bestimmungen verwendet werden kann. '■ " .

's

Tcstansatζ

0,4 ml Rinderfibrinogenlösung +.0,2 ml Plasmaverdünnungen, nicht aktiviert oder

aktiviert 2 Min, inkubieren (37°C)

+0,1 ml Thrombin

Je nach der verwendeten Piasminverdünnung liefert ein solcher Ansatz folgende Gerinnungszeiten in Sekunden:

Piasina unaktiviert ■

100% - 26,3 / 26,3 = 26,3" '. '

5O% - 24,6/ 25,1 = 24,9"

25% ' - 24,3 / 24,0 = . 24,2"

12,5% - 23,4 / 23,2 = 23,3"

0% - 23,2 / 23,1 = 23,2"

Plasma aktiviert

100%	- 40,	5 /
5O%	- 34,	8 /
25%	- 29,	5 /
12,5%	- 26,	6 /
0%	- 23,	1 y
^f J*9,0
' 34,0
' 29,3
' 26,5
' 23,2

39,8" 34,4" 29,4" 26,6" 23,2"

Testung unbekannter Seren oder Plasmen

Die zu testenden Seren- oder Plasmenprobcn werden wie das Standard-IIuiiianplasma 1:20 vorverdünnt. 2 ml dieser Serum-- oder Plasmaverdünnung werden mit 0,1 ml Streptokinase (20.000 E/ml) versetzt

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und 30 Sek. bei Raumtemperatur· "belassen. Danach wird die inkubierte Probe 1+1 verdünnt in den Testansatz zur Bestimmung der Gerinnungszeit eingesetzt. Aus der resultierenden Gerinnungszeit von 37 Sek. kann mit Hilfe der Eichkurve (vgl. Abbildung 1) und einer primär getroffenen Annahme, daß Standard-flumanplasma 5.000 E/ml Plasminogen enthält, die Menge des Plasminogens in der getesteten Probe z.B. mit 70% dieses Viertes entsprechend 3.500 "Einheiten Plasminogen/nl entnommen werden. Unter Berücksichtigung der eingangs vorgenommenen Verdünnung von 1:2 beträgt der Plasminogen-Gehalt der Probe 7.000 E/ml. Die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn man die vorverdünnte Humanplasminogan enthaltende Körperflüssigkeit zu einer Mischung aus plasminogenhaltigern Rindcrfibrinogen mit 500 E/ml Streptokinase zu.setzt, den Ansatz 2 Min. bei 37 C inkubiert und anschließend mit der angegebenen Thrombinlösung zur Gerinnung bringt.

Zeigt es sich bei spielsv.'eise, daß eine zu prüfende Körperf lüssicfkeit in dem Testsystem einen nicht bestimmbar hohen Plasminogen-wert erbringen würde, wird sinnvollerwcise die Probe entsprechend vorverdünnt und diese Verdünnung in der Bestimmung in Rechnung gesetzt.

Entsprechendes;, gilt bei zu niedrigem Plasminogengehalt.

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Claims

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Patentansprüche

/ 1 J Verfahren zur analytischen Bestimmung von Humanplasminogen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine verdünnte Humanplasminogen enthaltende Flüssigkeit mit

a) einem Katalysator, der Humanplasminogen in Humanplasminogenaktivator umwandelt,

b) Fibrinogen,

c) einem durch den Katalysator nicht aktivierbaren Plasminogen und

d) Thrombin

mischt und die Gerinnungszeit des Ansatzes bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man zu einer verdünnten, menschliches Plasminogen enthaltenden Körperflüssigkeit einen Katalysator, der Humanplasminogen in Humanplasrninogenaktivator umwandelt, zusetzt, das Gemisch zu einer Lösung, die Fibrinogen und ein durch den Katalysator nicht aktivierbares Plasminogen enthält, zufügt, den Ansatz schliesslich mit Thrombin zur Gerinnung bringt, die Gerinnungszeit bestimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man eine verdünnte, menschliches Plasminogen .enthaltende Körperflüssigkeit zu einem Gemisch aus

a) einem Katalysator, der Humanplasminogen in Humanplasminogen-

aktivator umwandelt,

b) Fibrinogen und .

c) einem durch den Katalysator nicht aktivierbaren Plasminogen zufügt, den Ansatz schliesslich mit Thrombin zur Gerinnung bringt und die Gerinnungszeit bestimmt.

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4. Verfahren nach Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass der Katalysator Streptokinase ist.
5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass einer 1:5 bis 1:50 mit einer wässrigen Lösung vorver- ■ dünnten Körperflüssigkeit pro ml.250-5.000 Einheiten Streptokinase (nach Christensen) zugesetzt v/erden.
6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als durch den Katalysator nicht aktivierbares Plasminogen ein Plasminogen von Wiederkäuern verwendet wird.
7. Reagens zur Bestimmung von Plasminogen enthaltend

a) einen Katalysator, der Humanplasminogen in Humanplasrninogenaktivator umwandelt,

b) Fibrinogen,

c) ein durch den Katalysator nicht aktivierbares Plasminogen und

d) Thrombin.
8. Reagens zur Bestimmung von Plasminogen enthaltend Streptokinase, " Thrombin, Rinderfibrinogen und Rinderplasminogen.

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