DE2413322A1 - Verfahren zur synthese von peptiden - Google Patents

Description

• Titel: Verfahren zur Synthese von Peptiden Anwendungsgebiet: Chemische Erzeugung von Peptiden und Proteinen, insbesondere von Peptidhormonen durch stufenweise, wiederholende Verlängerung mit den entsprechenden gescllützten Aminosäuren.
• Zweck: Bei der Synthese von Peptiden durch schrittweisen Aufbau aus den entsprechenden Aminosäuren ist es erforderlich, nach einem Kupplungsschritt angefallene Nebenprodukte, überschüssige Reagenzien und nicht umgestztes Ausganspeptid vom gewünschten Peptid abzutrenne. Dabei bereitet insbesondere die Trennung von nicht umgestztem Ausganspepeptid und dem uu- eine iüninosäure verlängerten Syntheseprodukt Schwierigkeiten, die mit zunehmender Kettenlänge immer größer werden, da sich daim die beiden Peptide in ihren Eigenschaften meist nur wenig unterscheiden.
• Der Zweck des Verfahrens ist, die Separierung von nicht umgesetztem Ausganspeptid und dem um eine Amine säure verlängerten Syntheseprodukt auf jeder Kupplungsstufe zu vereinfachen.
• Stand der Technik: Die bisher beschriebenen Verfahren zur Peptidsyntehese lassen sic in folgende Gruppen einteilen (1): a) sogenannte konventionelle Verfahren: Alle Reaktionspartner befinden sich in flüssiger Phase, eine Reinisolierung des gewünschten Syntheseprodukts auf jeder Kupplung 5 stufe bereitet daher entsprechende Schwierigkeiten.
• b) Träger-Peptidsynthese (2) Die wachsende Peptidkette ist während der stufenweisen Kettenverlängertung stets an einem polymeren Träger gebunden. Erleichtert wird dadurch die Abtrennung der im Überschuß eingesetzten geschützten Aminosauren. während einer Kupplung nicht umgesetztes Peptid kann erst nach peendeter Synthese der gesamten Peptidkette abgetrennt werden. Als Folge davon ergibt sicu das häufig unlösbare Problem, aus dem so erhaltenen Peptidgemisch das gewünschte Produkt zu isolieren.
• e) Polymer-Reagen-Technik (3) ifier wird ein an ein Polymer gebundenes Aktivierungsreagenz verwendet. Hierdurch wird ebenfalls die Abtrennung der im überschuß eingesetzten geschützten Aminosäure erleichtert.
• Gegenüber dem unter b) beschriebenen Verfahren besteht bei der Polymer-Reagenz-Technik allerdings die Möglichkeit, nicht umgesetztes Peptid von dem um eine Aminosäure verlängerten Peptid auf jeder Kupplungsstufe wie bei der konventionellen Peptiosynthese zu trennen. Die wachsende Peptidkette ist bei diesem Verfahren zu keinem Zeitpunkt der Synthese an den Träger gebunden.
• (1) E. Wünsch, Angew. Chem. 83, 773 (1971) (2) R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963) M. M. Shemyakin, Yu. A. Ovchinnikov, A.A. Kiryushkin, Tetrahedron Letters 1965, 2323 R.L. Letsinger, M. L. Kornet, J. Am. Chem. Soc. 85, 3045 (1963) E. Bayer, H. Hagenmaier, M. Mutter, Angew. Chem. 83, 883 (1971) (3) M. Fridkin, A. Patchornik, E, Katchalski, J. Am. Chem. Soc.
• 90, 2953 (1968) Th. Wieland, Ch. Birr, Chimia 21, 581, (1967) G. Manecke, E. haake, Naturwissenschaftenschaften 55, 343 (1968) G.P. Pause, D.A. Laufer, 2nd ke. Peptide Symp., Cleveland, Ohio (4) Su -Sun Zwang, JACS 95, 1328 (1973) A. M. Felix, R. B. Merrifield, JACS 92, 1385 (1970) Aufgabe: Dem erfundenen Verfahren liegt die Aufgabe zu Grunde, in einer stufenweisen Synthese eine Peptidkette aus den entsprechenden Aminosäuren so aufzubauen, daß auf jeder Stufe die nicht umgesetzte, nicht um eine Aminosäure verlängerte Peptidkette leichter als in den bisherigen Verfahren von der umgesetzten, um eine Aminosäure verlangerten Peptidkette getrennt werden kann, Lösung: Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß in einer stufenweisen Synthese an einem Ende die zu verlängernde, in Lösung vorliegende Peptidkette jeweils mit der entsprechenden nächsten Aminosäure gekuppelt wird, die an der nicht an der Kupplung teilnehmenden Funktion über eine selektiv spaltbare Gruppierung mit einem unlöslichen Träger verbunden ist. Mit stattgefundener Kupplungsreaktion ist die um die entsprechende Aminosäure verlängerte Peptidkette am festen Träger gebunden, während die nicht verlängerte Peptidkette in der Lösung bleibt und durch Auswaschen entfernt wird. Nach der sich anschließenden Abspaltung der trägergebundenen Schutzgruppe liegt dann die verlängerte Peptidkette zusammen mit im Überschuß eingesetzter Aminosäure in Lösung vor.
• Um die Abtrennung der Aminosäure von der Peptidkette zu erleichtern, kann die zu verlängernde Peptidkette als Schutzgruppe für die Carboxyl- bzw. Aminofunktion, je nachdem in welcher Richtung die Kettenverlängerung verlaufen soll, eine lösliche polymere Gruppe tragen. Nach Abtrennung der Aminosäure liegt die verlängerte Peptidkette wieder als lösliches Produkt vor und kann mit der entsprechenden nächsten trägergebundenen Aminosäure umgesetzt werden. Die wachsende Peptidkette wird also im erfundenen stufenweisen Verfahren durch abwechselndes Anknüpfen an iiiid Abspaiten von einer festen Träger auf jeder Stufe der Kettonverlängerung durch einfaches Answaschen gereinigt. Die waschsede Peptidkette befindet sich daher alternierend in fester und flüssiger Phase.
• Hierzu brauchbar selektiv abspaltbare Gruppierungen, über die die Anminosäuren an einem löslichen Träger gebunden sind. sind zuL Teil schon in der Literatur beschrieben (2,4), jedoch iltii'er zu dem Zweck, als Basis für die stufenmweise Synthese einer für die Dauer sämtlicher Kupplunsstufen mit dem gleichen Träger vorknäpften Peptidkette zu dienen. Sie wurden jedoch bisher nicht dazu benutzt, als Bausteinen und Aminosäurederivate für die oben beschriebene alternierende Fest-Flüsig-Phasenmethode zur stufenweisen Synthese zu dienen. Auf Grund der meist relativ greßen Stabilität der genannten, in der Literatur beschriebenen abspaltbaren Gruppierungen gegeüber den in der Peptidchemie vorwendeten Abspaltungsreagenzien und der, im Hinblick auf die anderen in der Peptidchemie verwendeten Schutzgruppen für Drittfunktionen, geringen Selektivität, sind diese für das erfundene beschriebene Verfahren der stufenweisen Synthese von Peptiden in den meisten Fällen nur wenig geeignet. Für die Ausführung des beschriebenen Verfahrens wurde folgende, für die Synthese der geannten, über eine selektiv spaltbare Gruppierung mit einem festen Träger verbundenen Aminosäuren geeignete Ausgangsverbindung erfunden: Quarz R1: H, Alkyl-(C1-C4), Alkenyl-, Aryl-.
• R2 : Alkyl-(C1-C4), Alkenyl, Aryl-, Nitroaryl-, Halogenaryl-.
• R3: Halogen, Azid, Aryloxy-, Nitroaryloxy-, Trihalogenaryoxy-, Pentahalogenaryloxy-, Außerdem die durch die Umsetzung von ( A ) mit Aminosäuren hergestellten, über eine selektiv spaltbare Gruppierung mit einem festen Träger verbundenen Aminosäurederivate 4: am α-Stickstoffatom gebundener Aminosäurerest Für die Ausführung des erfundenen Verfahrens wurden zum erstenmal Polyäthylglycolmonoäther wie z. B. Polyäthylenglycolmonstearyläther als Carboxylschutzgruppe in der Peptidsynthese verwendet. Der Verlauf der schrittwiesen Synthese eines Peptides ist schematisch auf Seite 6 dargestellt.
• Erzielbare Vorteile: Der erzielbare Vorteil besteht darin, daß gleichzeitig mit der Kupplunsreaktion das um eine Aminosäure zu verlängernde Peptid aus der flüssigen in die feste Phase überführt und damit autowati sch vom nicht umgesetzten Produkt getrennt wird0 Dadurch wird eine bei der konventionellen Peptidsynthese mit wachsender Peptidkette iwinier schwieriger realisierbare Aufgabe durch ein einfaches, automatisierbares Verfahren gelöst. Das Verfahren bietet außerdem den Vorteil, daß es mit allen Verfahren der konventionellen Peptidsynthese auf jeder Synthesestufe kombiniert werden kamm.
• Der erzielbare Vorteil gegenüber den bisherigen Verfahren der schrittweisen Peptidsyifthese, bei denen unlösliche oder lösliche polymere Träger für die wachsende Peptidkette verwendet werden, liegt darin, daß bei der erfundenen Verfahren der bei einer Kupplungsreaktion erzielte Umsatz mit der nächsten Aminosäure keine Rolle mehr spielt für die Reiniioit des Sytheseprodukts. Während sich bei den bisherigen Verfahren bei einem Umsatz unter 100,00% Peptide aus unvollständigen Umsetzungen akkumulieren im Laufe der Synthese, werden diese Peptide beim beschriebenen Verfahren durch einfaches Auswaschen auf jeder Stufe abgetrennt. Da 100%ige Umsäte praktisch kaum erreichbar sind, ist dieser Vorteil Reaktionschema 1: R5, Rn: Seitenketten der entsprechenden Aminosäureen m: 1, 2, 3,..... usw.
• X: aktivierende Grunne V: CArboxyl-Schutzgrunne : fester Träger von entscheidender Bedeutung.
• Außerdem ist das erfundene Verfahren unter Verwendung der erfundenen trägergebundenen Schutzgruppe mit allen in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen für Drittfunkt ionen vereinbar. Der erzielbare Vorteil des ertundenen Verfahrens liegt daher gegenüber den bisherigen Verfahren mit polymeren Trägern auch darin, daß keine Einschränkung bezüglich der Schutzgruppenwahl besteht.
• Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß auch eine unvollständige Freisetzung der funktionellen Gruppe, an der die Kettenverlängerung stattfindet, im Gegensatz zu den bisherigen Verfahren nicht zu Fehlsequenzen füiiren kann.
• Anwendungsbeispiele: 1. Darstellung von trägergebundenen, selektiv abspaltbaren Aminosäuren, beschrieben am Beispiel von i-(Polystyrylphenyl)-1-phenyl-methyloxycarbonyl-L-alanin.
• a) (1-(Polystyryl-phenyl)-1-phenyl-methyl)-phenyl-carbonat.
• 50 g des nach bekannten, in der Literatur beschriebenen 1-(Polystyryl-phenyl)-1-phenyl-carbinols mit einem Gehalt von 1,70 mMol/g alkoholischer Hydroxylgruppen werden in 350 ml Methylenchlorid suspendiert, mit 14,0 ml Pyridin versetzt und auf -5°C abgekühlt. Unter Rühren werden 17,7 ml (0,14 Mol) Chlorameisensäurephenylester in 50 ml Methylenchlorid bei -5°C zugesetzt. Gegen Ende der Zugabe ist das Reaktionsgemisch von breiartiger Konsistenz und muß, je nach verwendetem Polystyrol-Trägermaterial, mit weiterem Methylenchlorid verdünnt werden, Nach dem Rühren über Nacht bei 0°C wird auf wenig Eis gegossen, abfiltriert und das Harz je zweimal mit Dioxan, Äthanol, Methylenchlorid, Äthanol und Äther gewaschen und getrocknet. Im Infrarot-Spektrum ist die Alkohol-Bande verschwunden, dagegen treten neue-Banden bei 1760 cm und 1150 - 1350 cm aut.
• Ausbeute: 59,9 g Gewichtszunahme 9,9 g - 96,5 zeiger Umsatz der Alkohol-Gruppen b) 1-(Polystyryl-phenyl)-1-phenyl-methyloxycarbonyl-L-alanin 5 g (1-(Polystyryl-phenyl)-1-phenyl-methyl)-phenylcarbonat werden bei 50 0C drei Stunden mit 20 nSlol des Trimethylbenzylammoniumsalzes von L-Alanin in 40 ml Dimethylformamid gerlrt. Dann wird je zweimal mit 5 %iger Trimethylbenzylammoniumhydroxyid-Lösung in Dimethylformamid, Dimethylformamid, Dioxan, Äthanol, Dioxan, Methylenchlorid, 10 %iger Essigsäure in Methylenchlorid, Methylenchlorid, Äthanol und Äther gewaschen und im Vakuum bei Zimmertemperatur getrocknet.
• Beladung (Aminosäureanalyse nach Acidolyse): 1,31 SIol Aminosäure pro i g Aminosäurederivat Reaktionsschema 2: 2. Darstellung von trägergebundenen, selektiv abspaltbaren Aminosäuren, beschrieben am Beispiel von 1-(Silikatsilyl-phenyl)-1-phenyl-methyloxycarbonyl-L-glycin.
• a) Poröse Glasperlen werden nach bekannten, in der Literatur beschriebenen Methoden phenyliert, benzoyliert und zum entsprechenden Alkohol reduziert und zwar derart, daß die Zugabe des entsprechenden Lösungsmittels grundsätzlich erst nach 15-stündigem Entgasen bei 80°C im Rochvakuum erfolgt. Darauf wird die Reaktion bei Normaldurck durchgeführt und nach gründlichem Waschen das modifizierte Glas 24 Stunden im Hochvakuum bei 50°C getrocknet. Die Beladung wird durch Elementaranalyse bestimmt und beträgt 0.0 - 0.12 mMol/g.
• 50 g des 1-(Silikat-silyl-phenyl)-1-phenyl-carbinols werden nach 15-stündigem Entgasen in 200 nil Methylenchlorid mit 2 ml Pyridin und 2,5 ml (16 mMol) Chlorameisensäurephenylester in 5 ml Methylenchlorid bei - zur unter Rühren versetzt und über Nacht gerührt.
• Die Aufarbeitung erfolgt wie unter la) beschrieben.
• b) 10 g (1-(Silikat-silyl-phenyl)- 1-phenyl-methyl)-phenyl-carbonat werden nach 15-stündigem Entgasen bei 10°C mit einer Lösung von 2 mMol des Trimethylbenzylammoniumsalzes von Glyein in 15 ml Dimethylformamid versetzt und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Nach dem Waschen (wie in lb) wird im Vakuum bei Zimmertemperatur getrocknet.
• beladung (Aminosäureanalyse nach Acidolyse): 0.09 nEol Aminosäure pro 1 g Aminosäurederivat (Siche Reaktionsschema 2) 3. Darstellung von trägergebundenen, selektiv abspaltbaren Aminosäuren, beschrieben am Beispiel von (2-(Copolymer-phenyl)-isopropyl)-carbonyl-L-valin.
• a) Das nach bekannten, in der Literatur beschriebenen Methoden hergestellte Copolymer aus Acrylsäureme thylester und p-Vinylphenyl-dimethyl-carbinol mit einem Gehalt von 1.0 mMol/ g alkoholischer Hydroxylgruppen wird wie unter 1. beschrichen in Methylenchlorid zum entsprechenden Phenylearbonat und mit dem Trimethylbenzylammoniumsalz des L-Val ins zum Amine säurederivat umgesetzt.
• Beladung (Aminosäureanalyse nach Acidolyse): 0,80 mMol Aminosäure pro 1 g Aminosäurederivat.
• Reaktionsschema 3: 4. Beispiel einer stufenweisen Synthese des Gelcitonim-M-(28-32) -Pentapeptids Glycyl-valyl-glycyl-alanyl-prolin nach dem erfindenen Verfahren a) unter Verwendung des Picelylesters als Carboxyl-Schutzgruppe und der Alitiviervulg und Kupplung mit Dicyclohexylcarbondiimid und 1-Hydroxybenzotriazol.
• 2 g 1-(Polystyryl-phenyl)-1-phenyl-methyloxycarbonyl-L-alanin mit einem Gehalt von 1,5 mMol Aminosäure/g werden 30 Minuten bei Zimmertemperatur mit 4 mMol Dicyclohexycarbondiimid und 4,5 mMol 1-Hydroxybenzotriazol in 15 ml Dime thylformamid aktiviert und darauf mit 2 mMol Prolinpicolyester (Aminokomponente) bei Zimmertemperatur umgesetzt. Die weitgehende Vollständigkeit der Kupplung wird mit Ninhydrin-Reagenz überpaift. Nach dem vollständigen Auswaschen aller Nebenprodukte und nicht umgesetzter Aminokompente mit geeigneten Lösungsmitteln (Dimethylformamid, Methylenchlorid), deren Entfernung auf die gleiche Weise mit Ninhydrin-Reagenz überprüft werden kann, wird der Dipeptidpicolylester und nicht verbrauchte Aminosäure mit 5 zeiger Trifluoressigsaure in Methylenchlorid vom Träger abgespalten und durch Auswaschen mit Dimethylformamid abgetrennt. Nach Einstellung auf etwa pH 2 wird die Aminosäure durch Gelpermeations-Chromatographie oder Ionenaustauschchromatographie entfernt. Darauf beginnt der nächste Cyclus durch Umsetzung mit der trägergebundenen, selektiv abspaltbaren Aminosäure Glycin. Nach Durchlaufen aller vier Cyclen wird die Carboxyl-Schutzgruppe durch alkalische Hydrolyse abgespalten. Man erhält das reine Pentapeptid.
• b) unter Verwendung von Polyäthylelnglykol-monostearyläther als Carboxylschutzgruppe und der Aktivierung und Kupplung mit Dicyclohexylcarbodiimid und Nitrophenol, 2 g 1-(Polystyrtyl-phenyl)-1-phlenyl-methyoloxycarbonyl-L-alanin mit einem Gehalt von 1.5 mMol Aminosäureig werden über Nacht bei 0°C mit 4 mbIol Dicyclohexylcarbodiimid und 4.0 nbIol p-Nitrophenol in 15 ml Dimethylformamid gerührt. Darauf wird abfiltriert, zweimal mit je 10 ml Dimethylformamid gewaschen und mit 6.0g (3 mMol) Prolin-(polyäthylenglycolmonostearyl-äther)-ester (Aminokomponente) in 20 ml Dimethylformamid versetzt und über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Die Vollständigkeit der Kupplung kann durch Ninhydrin-Test, aber auch durch Extinktionsmessung bei 314 nm (Extinktionsmaximum von p-Nitrophenol) verfolgt werden.
• Nach den vollständigen Auswaschen aller Nebenprodukte und überschüssiger Aminokomponente mit geeigneten Lösungsmitteln (Dimethylformamid, Methylenchlorid, Äthanol). deren Entfernung auf die gleiche Weise wie vorher überprüft werden kann, wird der Dipeptid-(polyäthylenglycolmonostearyl-äther) -ester und nicht verbrauchter Aminosäure-p-nitrophenylester mit 5 %iger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid abgespalten und durch Auswaschen mit Dimethylformamid vom Träger getrennt. Nach Einengen der Lösung wird der Rückstand in 20 ml Äthanol gelöst, auf - 20 0C abgekühlt und das auskristallisierte Dipeptid-(polyätherlenglycolmonostearyläther)-ester-trifluoracetat bei - 20 0C abzentrifugiert. Dies wird so lange wiederholt, bis kein Aminosäurenitrophelnylester mehr im Filtrat vorhanden ist. Darauf beginnt der nächste Cyclus durch Umsetzung mit der trägergebundenen, selektiv abspaltbaren Aminosäure Glycin. Nach Durchlaufen aller vier Cyclen wird die Carboxyl-Schutzgruppe durch alkalische IIydrolyse abgespalten. Man erhält das reine Pentapeptid.

Claims (7)

P a t e n t a n s p r ü c h e werden erhlben auf

1. Ein Verfahren zur stufenweisen Syntneses von Pept Propteinen, Proteinpartialsequenzen, insbesondere Pe hormonen aus den entsprechenden nden Aminosäurederivaten, gekennzeichnet dadurch, daß die in Lösung vorliegende, um eine Aminosäure zu verlägernde Peptidkette in Cyclus alternierend durch die Kupplungsreaktion an eine festen Träger gebunden und nach dem Auswaschen nicht verlängerter Peptidkteet und löslicher überschüs Reagenzien und Nebenprodukte durch Abspaltung der trägergebundenen Schutzgruppe als verlängerte Peptid wieder in Lösung gebracht wird.

2. Die Anwendung des in Anspruch 1. definierten Flüssig-Fest-Phase-Syntlleseprinzips auf die Synthese anderer makromolekularer naturstoffe und ihre Analoga wie Oligonucleotide, nucleinsäuren und Polysacharide.

3. Die Anwendung des alterniernden Flüssig-Fest-Phase-Syntheseprizips auf den umgekhrten Vorgang des schrittweisen Abbaus von makromolekularen Naturstoffen zur Swquenzaufkläurung mit Hilfe von an feste Träger rever gebundenen Derivatisiorungsroagonzion.

4. Aminosäurederivate, die für eine Synthes Peptiden nach Anspruch 1. geeignet sind, ind, gekennzeichnet dadurch, daß sie an der nicht an der Kuppl teilnebmenden Funktion über eine selektiv spal Gruppierung mit einem festen Träger verbunden sind.

5. Aminosäurederivate, die für eine Synthese von Peptiden nach Anspruch 1. geeignet sind, gekennz net dadurch, daß sie an der Aminofunktion über e selektiv spaltbare Gruppierung mit einem festen Träger verbunden sind und folgende allgemeine Formel aufweisen: Polymer, Copolymer, Glas, Quarz R¹: H, Alkyl- (C1- C4), Alkenyl-, Aryl-.

R²: Alkyl- (C1-C4), Alkenyl-, Aryl-, Nitroaryl-, Halogenaryl-.

R4: am -Stickstoffatom gebundener Aminosäurerest

6. Verbindungen, die für die Herstellung von Aminosäurederivaten nach Anspruch 5. geeignet sind, gekennzeichnet dadurch, daß an einen festen Träger eine für die Einführung einer Aminosäure geeignete Gruppierung vorhanden ist und folgende allgeneine Formel aufweisen: Polymer, Copolymer, Glas, Quarz R¹: H, Alkyl- (C1-C4), Alkenyl-, Aryl-.

R²: Alkyl- (C1-C4), Alkenyl-, Aryl-, Nitroaryl-, Italogenaryl-.

Halogen, Azid, Aryloxy-, Nitroaryloxy-, Trihalogenaryloxy-, Pentahalogenaryloxy-.

7. Verwendung von Aminosäurederivaten, die an der nicht an der Kupplungsreaktion teilnenmenden α-Amino- oder α-Carboxylfunktion über eine selektiv spaltbare Gruppierung an einen festen Träger gebunden sind, für eine Synthese von Peptiden nach Anspruch 1., gekennzeichnet dadurch, dafa sie als Bausteine für die Verlängerung der Peptidkette dienen.