DE2412890A1 - Purpuromycin-verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung, mikroorganismus zur durchfuehrung des verfahrens und arzneimittel - Google Patents

Description

DIPL.-CHEM. DR. VOLKER VOSSlUS

PATENTANWALT

MONOHEN 86,

F-HONE:'./40 75

CABLEADDRGSS: BENZOLPATENT MÖNCHEN TELEX 5-23453 VOPAT D

u.Z.: K 694 (Vo/kä) Case: Lp 496

GRUPPO LEPETIT S.P.A. Mailand, Italien

18. März 1974

¹¹ Purpuromycin-Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung, Mikroorganismus, zur Durchführung des Verfahrens und Arznei· ' mittel "

Priorität: 19. März 1973, Großbritannien, Nr. 13 123/73

Die Erfindung betrifft die als Purpuromycin der Formel Ia

OH 0

(Ia)

OOCH

und die als Isopurpuromycin der Formel Ib

QH OH

HO

CH-CH ² OH

(Ib)

COOCH.

bezeichnete Verbindung,/
/ das Tetraacetylpurpuromycin und das Pentaacetylisopurpuro-

mycin sowie' Mgnoacyl-Derivate des Purpuromycins der allgemei-

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2412390

nen Formel Ic

OOCH

in der R den Acylrest einer aliphatischen Mono- oder Dicarbonsäure mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, die gegebenenfalls olefinisch ungesättigt oder durch eine Hydroxylgruppe substituiert ist, und ihre Keto-Enol-Tautomeren. Vorzugsweise ist R die Gruppe CO-CH₂-CH₂-COOH, CO-CH=CH-COOH oder CO-CH₂OH.

Die Purpuromycin-Verbindungen der Erfindung sind purpur-rote kristalline Verbindungen mit charakteristischem Schmelzpunkt und charakteristischen Absorptionsspektren' im ultraroten, ultravioletten und sichtbaren Spektralbereich. Aufgrund dieser Parameter, der NMR-Spektren und Massenspektren sowie der Ergebnisse der Elementaranalyse, der pKa-Werte und der Redox-Potentialwerte wurde Purpuromycin die Formel Ia zuerkannt. Isopurpuromycin der Formel Ib stellt ein Isomeres des Purpuromycins dar, das aus diesem durch Behandlung unter mild-alkalischen Bedingungen erhalten wird. Das Tetraacetyl-Derivat des Purpuromycins wird nachstehend als Acetylderivat II und das Pentaacetylderivat des Isopurpuromycins als Acetylderivat I bezeichnet.

In Figur 1 ist das Absorptionsspektrum des Purpuromycins im ultravioletten und sichtbaren Spektralbereich, in Figur 2 das IR-Absorptionsspektrum und in Figur 3 das Massenspektrum des Purpuromycins wiedergegeben.

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Die vorstehend wiedergegebenen Formeln Ia und Ib stellen nur eine der vier möglichen tautomeren Formen des 5,8-Dihydroxy-1,4-naphthochinonsystems (Naphthazarin) dar. R.E. Moore et al., J. Org. Chem. Bd. 31 (1966), S. 3272 wies darauf hin, daß dieses Ringsystem durch ein sich'rasch einstellendes Keto-Enol-Tautomerieqleichgewicht gekennzeichnet/
/. ist, das die gleichzeitige Existenz benzoider und chinoider Eigenschaften in den Ringen A und B zur Folge hat. Die vier möglichen tautomeren Formen können folgende Partialstruktur aufweisen:

OH ο

OH

Der unterschiedliche Beitrag der verschiedenen Tautomeren zur effektiven Struktur hängt von mehreren Faktoren ab, beispielsweise der speziellen Art der Substituenten am Naphthalinring, dem physikalischen Zustand, der Temperatur und dem zur Lösung oder Umkristallisation verwendeten Lösungsmittel. Die verschiedenen Tautomeren können auch chemischen Veränderungen mit unter schiedlichen Reaktionsgeschwindigkeiten unterliegen, so daß das Reaktionsprodukt nicht der Verteilung der Tautomeren in der Aus gangsverbindung entsprechen kann. -

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Die Formeln Ia und Ib sollen sämtliche möglichen Keto-Enol-Tautomeren umfassen und kennzeichnen.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel Ia_f Ib, des Acetylderivats II und des Acetylderivats I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man (a) den Mikroorganismus Actinoplanes ianthinogenes. nov. sp. A/1668 ( ATCC Nr. 21884) unter submers aeroben Bedingungen in üblichen Nährmedien, die assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthalten, und unter üblichen Temperatur- und pH-Bedingungen züchtet und das Purpuromycin aus der

(b)

Kulturbrühe isoliert und/gegebenenfalls durch Umsetzen in mildalkalischem Medium unter Erhitzen in Isopurpuromycjn überführt

(C)

oder/gegebenenfalls das erhaltene Purpuromycin in mild-alkalischem Medium mit einem Acetylierungsmittel umsetzt und das gebildete Gemisch von Acetylderivat II und Acetylderivat I durch Chromatographie in die Komponenten trennt.

Im allgemeinen wird der Mikroorganismus in einem wäßrigen Nährmedium in einem Schüttelkolben vorkultiviert, bis sich in der Kulturbrühe eine erhebliche Menge an Purpuromycin gebildet hat. Sodann, wird diese Kultur zum Beimpfen von Fermentern verwendet, die ein Nährmedium enthalten. Die Züchtung wird bei 25 bis 35⁰C unter aeroben Bedingungen solange fortgesetzt, bis sich eine ausreichende Menge an Purpuromycin in der Kulturbrühe angereichert hat. Während dieser Zeit werden nach der Agar-Diffusionsmethode mikrobiologische Untersuchungen durchgeführt, um die Purpuromycinkonzentration zu bestimmen. Als Testorganismus wird Staphylococcus aureus benutzt. ,

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Das Purpuromycin kann aus der Kulturbrühe in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, die mit dem wäßrigen Medium nicht mischbar sind, isoliert werden. Der organische Extrakt wird eingedampft und mit Petroläther versetzt. Das ausgefällte rohe Purpuromycin wird durch Waschen mit Methanol und durch Chromatographie an Kiese]-gel mit Chloroform bzw. einem Gemisch aus Chloroform und Methanol als Laufmittel gereinigt. Das Eluat wird eingedampft und das Purpuromycin aus Chloroform, das eine geringe Menge Methanol enthält, umkristallisiert.

Durch 2 bis 3-stündiges Erhitzen von Purpuromycin auf etwa 100 C in· einem schwach basischen Lösungsmittel, wie Pyridin, wird es zum Isopurpuromycin isomerisiert.

Durch etwa 1-stündiges Erhitzen von Purpuromycin auf Temperaturen von vorzugsweise 60 bis 80⁰C in Pyridin mit Essigsäureanhy- .-drid werden zwei Verbindungen erhalten, die durch Chromatographie an Kieselgel und mit Chloroform als Laufmittel voneinander getrennt werden können. Die erste eluierte Verbindung kann durch Umkristallisation aus Aceton oder Dimethylsulfoxid in Gegenwart einer geringen Menge Wasser weiter gereinigt werden. Diese Verbindung wird als Acetylderivat I bezeichnet, und sie entspricht einem Pentaacetylderivat des Isopurpuromycins der Formel Ib oder einer ihrer tautomeren Formen. Die fünf Hydroxylgruppen des Moleküls sind acetyliert. Die zweite eluierte Verbindung wird als Acetylderivat II bezeichnet. Nach Umkristallisation aus Aceton erhält man ein Tetraacetylderivat des Purpuromycins, d.h. der Verbindung der Formel Ia oder einer ihrer tautomeren Formen, in ·.

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der die vier Hydroxylgruppen acetyliert sind. Während der in Pyridin durchgeführten Acetylierung erfolgt offensichtlich eine teilweise Isomerisierung des Purpuromycins zum Isopurpuromycin.

Die Erfindung betrifft auch die Herstellung der Monoacyl-Derivate des Purpuromycins der allgemeinen Formel Ic, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Purpuromycin mit einem Säureanhydrid oder Säurechlorid einer aliphatischen Mono- oder Dicarbonsäure mit 2 Ms 4 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls olefinisch ungesättigt oder durch eine Hydroxylgruppe substituiert ist, in etwa äquiraolarem Mengenverhältnis bei Temperaturen von etwa O bis etwa 30⁰C umsetzt. Vorzugsweise wird als Acylierungsmittel ein Säureanhydrid oder -Chlorid der. Bernstein-, Malein- oder Glykolsäure verwendet. Vorzugsweise wird die Umsetzung in Gegenwart eines Säureacceptors, insbesondere Pyridin,durchgeführt. Bei dieser bei niedrigen Temperaturen durchgeführten Acylierung erfolgt überraschenderweise keine Isomerisierung und es bildet sich selektiv das Monoacylderivat des Purpuromycins der Formel Ic, Physikalisch-chemische Daten deuten darauf hin, daß bei der Acylierung die alkoholische Hydroxylgruppe verestert wird.

Die Verbindungen der Erfindung sind wertvolle Arzneistoffe mit antibiotischer Aktivität gegenüber gram-positiven und gram-negativen Bakterien und Pilzen. Die Verbindungen sind besonders aktiv gegenüber Staphylococcus aureus, Streptococcus hemolyticus und Diplococcus pneumoniae in Dosen von 0,005 bis 0,1 y/ml. In Tabelle I ist die antibiotische Aktivität des Purpuromycins gegenüber verschiedenen pathogenen Mikroorganismen zusammengefaßt! ^

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Tabelle I

Mikroorganismus Minimale Hemmkonzentration, ___, _: y/ml

Staphylococcus aureus.ATCC 6528 0,005

Staphylococcus aureus Tour 0,01

Streptococcus hemolyticus C 203 * 0,02 Diplococcus pneumoniae UC 41 ' 0,02

Staphylococcus aureus Tour mit . _?

10 % Rinderserum

Clostridium perfringens ISS 30543 0,05

Proteus vulgaris X 19 H ATCC 881 1

Escherichia coli SIiF 12140 " 0,5

Candida albicans SKF 2270 0,5

Trichophyton mentagrophytes SKF 17^zi 10 0,2

Mycobacterium tub. H37Rv ATCC 9360 50

Mycoplasma gallisepticum H 21 C.Z.B. 5

Die anderen Verbindungen der Erfindung zeigen etwa die gleiche antibiotische Aktivität. Beispielsweise wurde folgende minimale Hemmkonzentration in Mäusen gegenüber Staphylococcus aureus ATCC 6538 festgestellt.

Acetyl-Derivat I 0,05 y/ml

Acetyl-Derivat II 0,1 y/ml

Purpuromycin-hydrogenmaleat 0,01 y/ml

Purpuromycin-hydrogensuccinat 0,1 y/ml.

Die Verbindungen sind auch gegenüber pathogenen Keimen wirksam, die gegenüber anderen in weitem Umfang verwendeten Antibiotika resistent sind. In Tabelle II ist die minimale Heminkonzentration von Purpuromycin gegenüber Staphylococcus-aureus-Stämmen zusammengefaßt, die gegenüber verschiedenen Antibiotika resistent

sind.
L

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Tabelle II

Stamm minimale Hemmkonzentration, y/ml

anderer Antibiotika des Purpu-

rpniycins. Staphylococcus aureus ATCC

6538 resistent gegen

Penicillin Penicillin 100 " 0,005

Staphylococcus aureus ATCC

6538 resistent gegen

Streptomycin Streptomycin 100 0,005

Staphylococcus aureus ATCC

6538 resistent gegen

Tetracycline Tetracyclin 100 0,005

Staphylococcus aureus ATCC

6538 resistent gegen

Novobiocin Novobiocin 100 0,001

Staphylococcus aureus ATCC

6538 resistent gegen Neomycin Neomycin 20 0,002

Staphylococcus aureus ATCC

6538 resistent gegen

Erythromycin .Erythromycin 50 0,002

Staphylococcus aureus ATCC

6538 resistent gegen

Chloramphenicol Chloramphenicol 50 0,001

Staphylococcus aureus ATCC

6538 resistent gegen Cephorin Cephaloridin 100 0,003 Staphylococcus aureus ATCC

6538 resistent gegen

Streptothricin Streptothricin 50 0,005

Staphylococcus aureus ATCC

6538 resistent gegen

Bacitracin Bacitracin 20 0,002

Staphylococcus aureus ATCC

6538 resistent gegen Oleando-

mycin Oleandomycin 20 0,005

Staphylococcus aureus ATCC

6538 resistent gegen Rifamycin

SV Rifamycin SV 100 0,005

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^Γ -9- 2412390

Purpuromycin zeigt auch eine interessante Aktivität in vivo gegenüber lyiaphoider Leukämie L-1210 in Mäusen bei Dosen von 400 rag/kg. Eine weitere bemerkenswerte Eigenschaft der Verbindungen der Erfindung ist ihre niedrige akute Toxizität, da die LD,-Q-¥erte bei oraler Verabfolgung an Mäuse im allgemeinen oberhalb 1000 mg/kg liegen.

Die Erfindung betrifft somit auch Arzneimittel, die Purpuromycin, Isopurpuromycin, das Tetraacetylpurpuromycin, das Pentaacetylisopurpuromycin oder ein Monoacyl-Derivat des Purpuromycins der allgemeinen Formel Ic und übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstof-

fe.enthalten. Schließlich betrifft die Erfindung auch Actinoplanes ianthinogenes nov. sp. ATCC 21884 zur Durchführung des Verfahrens zur Herstellung von Purpuromycin.

Nachstehend wird dieser Mikroorganismus näher beschrieben. Nach einigen Wochen Wachstum auf Hafermehl-Agar besitzen die Kolonien einen Durchmesser von 0,5 bis 0,8 cm mit unregelmäßiger Kontur. Die Oberfläche ist undurchsichtig und schwach rauh bis gerunzelt. Der Stamm wächst gut auf verschiedenen Nährböden; das Substratmycel ist violett gefärbt. Auf Hafermehl-Agar wird ein schwach diffundierbares violettes Pigment erzeugt. Luftmycel fehlt immer. Unter dem Mikroskop zeigt das vegetative Mycel verzweigte Hyphen mit einem Durchmesser von etwa 1 u. ■ Sporangien bilden sich reichlich nur auf Hafermehl-Agar und Czapek-Glucose-Agar. Die Sporangien sind kugelig mit unregelmäßiger Oberfläche. Ihr Durchmesser beträgt 4,0 bis 10.0 u. Nach dem Aufbrechen der Wandung des Sporangiums werden die " ,

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förmigen Sporangien entlassen. Die nahezu Kugel/ Sporen sind beweglich

(1,4 bis 1,8 u Durchmesser).

In Tabelle III sind die Wuchsformen des Mikroorganismus auf verschiedenen Standard-Nährböden zusammengefaßt, die vin Shirling und Gottlieb (Intern. J. Syst. Bac't., Bd. 16 (1966), S. 313 bis 340) sowie

von Waksman (The Actinomycetes, Bd. II, The

Williams and Wilkins Co., I96I) empfohlen wurden. Die bei einigen Nährböden angegebenen Zahlen beziehen sich auf die von Shirling und Gottlieb angegebenen Zahlen. Die Wuchsformen wurden nach 6 bis 14-tägiger Inkubation bei 30⁰C bestimmt.

Tabelle III

Nährboden Wuchsformen

Medium Nr. 2 (Hefeextrakt-Malz- reiches Wachstum, runzelige

Agar) Oberfläche, hell bernsteinfar

ben mit violetten Zonen

Medium Nr. 3 (Hafermehl-Agar) mäßiges Wachstum; krustige

Oberfläche, hell-violett

Medium Nr. 4 (anorgan. Salze- reiches Wachstum; glattflä-Stärke-Agar chig, tief orangefarben mit

violetten Zonen

Medium Nr. 5 (Glycerin-Asparagin- reiches Wachstum; grobgranu-Agar) lierte Oberfläche, bernstein

farben mit violetten Zonen

Medium Nr. 6 (Pepton-Hefeextrakt- spärliches Wachstum, glattflä-Eisen-Agar) chig, undurchsichtig, tief-

braun

Medium Nr. 7 (Tyrosin-Agar) mäßiges Wachstum; grobgranulierte Oberfläche, undurchsichtig, bernsteinfarben bis hellbraun

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Tabelle III - Fortsetzung

Nährboden VJachstumseigenschaften

Hafermehl-Agar (nacli

¥aksman)

Hickey und Tresner's Agar Czapeck-Glucose-Agar Gluco se-Asparagin-Agar Nähragar

Kartoffel-Agar Bennett's Agar Calciummalat-Agar Mage rmi1ch-Agar

Czapeck-Agar Ei alburnin-2-\gar

Pepton-Glucose-Agar Agar

Loeffler-Serum -Nährboden Kartoffelnährboden Gelatinenährboden Cellulose-Agar reiches Wachstum; runzelige Oberfläche, orange mit violetten Zonen; blass-violettes Pigment

mäßiges Wachstum; krustige Oberfläche, hellbraun

spärlichen Wachstum; dünnes Mycel undurchsichtig, hyalin

reiches Wachstum; krustige Oberfläche, hell-orange mit violetten Zonen

spärliches Wachstum, dünnes Mycel orange bis braun

mäßiges Wachstum; krustige Oberfläche, violett

reiches Wachstum; runzelige Oberfläche, hellbraun mit violetter Oberfläche

.sehr spärliches Wachstum; dünnes Mycel, hell-orange

reaches Wachstum; runzelige Oberfläche, violett -mit orangefarbenen Rändern

mäßiges Wachstumτ krustige Oberfläche, " undurchsichtig, hyalin

mäßiges Y/achstum; krustige Oberfläche, undurchsichtig, hyalin

mäßiges Wachstum, tief orangefarben

sehr spärliches Wachstum, dünnes Mycel, hyalin

mäßiges V/achstum, grobgranulierte Oberfläche, orange mit violetten Zonen

mäßiges Wachstum; runzelige Oberfläche, tief orangefarben

spärliches Wachstum; krustige Oberfläche, hell-violett

sehr spärliches Wachstum: dünnes Mycel, hyalin

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Die günstigste Temperatur zur Entwicklung der Kolonien liegt im Bereich von etwa 20 bis 45⁰C. Das Temperaturoptimum liegt bei etwa 28 bis etwa 37⁰C.

In Tabelle IV ist die Verwertung von Kohlenstoffquellen, bestimmt nach der Methode von Pridham und Gottlieb, J. Bact., Bd. (1948), S. 107, zusammengefaßt.

Tabelle IV

Kohlenstoffquelle Verwertung

Inosit

Fructose +

Rhamnose +

Mannit +

Xylose +

Raffinose

Arabinose +

Cellulose

Sucrose +

Glucose +

Mannose +

Lactose

Sailein +

In Tabelle V sind die physiologischen Eigenschaften des Mikroorganismus zusammengefaßt.

_J 409843/1153

- 13 -	Versuch	Lackmusmilch	Peptonisierung	positiv
Tabelle V	Stärkehydrolyse	Cellulosezersetzung	schwach positiv
	H2S-Bildung	pigmentbildende Vfirkung	negativ
Tyrosinase-Reaktion		positiv
Casein-Hydrolyse		schwach positiv
Solubilisation von Calciummalat		positiv
Nitrat-Reduktion		positiv
Verflüssigung von Gelatine	negativ
Koagulation ·
negativ
negativ
positiv

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel

Herstellung und Isolierung von Purpurom^cin Zunächst wird von Actinoplanes ianthinogenes nov.sp.A/1668 (ATCC 21884) in Erlenmeyer-Kolben unter aeroben Bedingungen eine Vorkultur hergestellt, bis sich in der Kulturflüssigkeit ein erhebliches Ausmaß an antibiotischer Aktivität nachweisen läßt. Ein Nährmedium für eine'Schüttelkultur kann beispielsweise folgende Zusammensetzung haben.

Fleischextrakt Hefeextrakt Stärke

Calciumcarbonat Leitungswasser auf

g/Liter

3,0

10,0

25,0

4,0

1000 ml

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.. 14 - 2412390

Die Kolben werden etwa 24 Stunden bei etwa 28 bis 30°C geschüttelt. Anschließend v/erden jeweils 1 Liter der Vorkulturen zum Beimpfen von Fermentern verwendet, die jeweils 10 Liter des folgenden Nährmediums enthalten:

g/10 Liter

Fleischextrakt 40

Pepton - 40

Hefeextrakt . 10

Natriumchlorid ' ' 25

Sojabohnenmehl 100

Glucose 500

Calciumcarbonat 50

Leitungswasser auf 10 Liter

Die Ansätze v/erden aerob bei 28 bis 30⁰C inkubiert und gerührt. In Zeitabständen wird die antibiotische Aktivität mikrobiologisch nach dem Agar-Diffusionstest mit Staphylococcus aureus als Testorganismus bestimmt. Die maximale antibiotische Aktivität wird nach etwa 96- bis 120-stündiger Fermentation erreicht.

Anschließend wird die Kulturbrühe mit 8prozentiger Salzsäure auf einen pH-^T/,^rert von 3,5 eingestellt und hierauf mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird auf ein kleines Volumen eingedampft. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und das Filtrat mit Petroläther versetzt. Hierbei wird eine weitere Fällung des Rohprodukts erhalten. Die erste Fällung wird mit Methanol gewaschen« Die zweite Fällung wird nach dem Waschen mit Methanol mit der ersten Fällung vereinigt. Anschließend wird

das Rohprodukt durch Säulenchromatographie gereinigt. L -J

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Λ5 -

2412390 ^π

Zur Gewinnung des reinen Purpuromyeins wird, das amorphe Rohprodukt in einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (95 : 5) gelöst. Die Lösung wird mit einer geringen Menge Kieselgel versetzt und zur Trockene eingedampft. Der feste Rückstand wird auf eine Kieselgelsäule gegeben, die mit 0,5 η KH₂PO^ Lösung abgepuffert ist. Es wird mit Chloroform und mit bis

2 Prozent Methanol enthaltendem Chloroform eluiert. Nach dem Eindampfen des Eluats erhält man/-

/ ein Produkt, das aus dem gleichen Lösungsmittelsystero urn-

kristallisiert wird. Das erhaltene Purpuromycin fällt in purpurroten Kristallen mit folgenden Eigenschaften an:

Ό Schmelzpunkt:

Zersetzung bei 212⁰C; die Verbindung schmilzt nicht bis 320°C.

2) Elenientaranal'/se:

C 57,90 %; H 3,38 %; 0 38,72 % (durch Differenz)

3) Absorption im ultravioletten und sichtbaren Spektralberoich Purpuromycin in.Chloroformlösung (anfänglich ist die Probe in Dioxan gelöst) zeigt folgende Maxima:

max (muj	E ■'"
	1 cm
312	448
353	240
368	216
480	(Schulter)
505	220
545	(Schulter)

Das Absorptionsspektrum ist in Figur 1 wiedergegeben. Das Spektrum wurde mit einem Perkin Eimer Spectrarecord 4000 A Qoektrograph aufgenommen.

L _J

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^Γ ' -^- 2412390

4) IR-Absorptionsspektrum

Die wichtigsten Absorptionsmaxima in Paraffinöl (Kujol) treten bei folgenden Zellenzahlen (cm~ ) auf:

3510, 3070, 1730, 1685, 1610, 1590, 1500, 1330, 1275, 1230, 1210, 1150, 1120, 1100, 1080, 1060, lOHO, 1010, 935, 370, 950, 930, 300, 890, 865, 830, 800, 790, 770, 750, 730.

Die.Maxima des Nujols bleiben unberücksichtigt. Das vollständige Absorptionsspektrum der Substanz ist in Figur 2 wiedergegeben. Das Absorptionsspektrum wurde mit einem Perkin Eimer Mod. 421 Spektrograph aufgenommen.

5) Massenspektrum

Das Massenspektrum bei 70 eV zeigt in diesem Fall nicht den Molekelpeak M+. Die wichtigsten Peaks sind bei folgenden m/e-Vierten aufgenommen:

520, 504, 492, 474, 462, 288, 286, 274, 264, 256, 245, 236, 228.

In Figur 3 ist das Massenspektrum von Purpurcmyein wiedergegeben. Das Spektrum wurde mit einem Hitachi Perkin-Elmer RMU-61. Massenspektrograj)h aufgenommen.

6) Polarograph!sches Verhalten

Purpuromycin in 50prözentiger Dirnethylformamidlösung, abgepuffert auf einen pH-Zert von 9,8, zeigt ein Redox-Potential E 1/2 = - 0,645 V.

7) NMR-Srjektrum

Die wesentlichen charakteristischen Absorptionsmaxima in CDCl _v und CFvCOOD treten bei folgenden Freouenzon (ausfo-

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drückt in 6-Einheiten)auf:

CDCl₃: 11,13 (III); 12,11 (IH); 13_;O3 (IH); 7_?48 (IH,s); 7,30 (IH,s); 6,16 (III,s); 4.8 (IH,πι); 4,3 (IH); 3,96 (311,s) ; 3_;93 (3H,s); 3_;84 (IH ,d,J = ISHz); 3_;46 (IH ,d,J = ISHz); 2,7 (2H,n). CF₃COOD: 7_?75 (IH,s) ; 7_;57 (IH,s); 6_;48 (III,s); 5_;28 (IH,d,J 4.07 (3H,s); 3_;98 (3H,s).; 3_?88 (111,d ,J = ISHz) j 3_;58 (lH,d,J = 18Hz); 3_;O6 (IH ,d ,J = 16Hz) ; 2_;82 (lH,d,d,J=16Hz,4Hz).

3) Löslichkeit:

Gut löslich in wäßriger Natriumhydroxidlösung; mäßig löslich in wäßriger Natriumcarbonatlösung und Dimethylformamid,·

schwer löslich in wäßriger Natriumbicarbonatlösung, Äthylacetat, Dioxan, Essigsäure, Chloroform und Aceton; unlöslich in ivass.er, Methanol und Butanol. 9) Azidität

Spektrophotometrisch zeigt sich eine ionisierbare Funktion bei einem pKa-V.^Tert von 6,8 (in Wasser, das 5 Prozent Dimethylformamid enthält).

Auf Grund der Zahl der Wasserstoffatome im NMR-Spektrum und . der mikroanalytischen Daten kann Purpuromycin folgende Summenformel zuerkannt v/erden:

^C26^H18°13·
Sämtliche vorgenannten physikalisch-chemischen Parameter stützen die Strukturformel Ia.

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Beis-piel 2 Herstellung von Isopurpuromvcin

50 mg Purpuromycin werden in 6 ml wasserfreiem Pyridin suspendiert und 2 bis 3 Stunden auf 100⁰C erhitzt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch in Eiswasser eingegossen, die gebildete Fällung abfiltriert und mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (95 : 5) sowie mit Aceton gewaschen. Ausbeute 33 rag.

Isopurpuromycin ist eine purpurrote kristalline Substanz mit folgenden Eigenschaften:

1) Schmelzpunkt;

Isopurpuromycin schmilzt nicht bis zu einer Temperatur von 320⁰C.

2) Elementaranalyse:

C 56,51 %: H 3,41 %; 0 40,08 % (durch Differenz).

3) Absorption im ultravioletten und sichtbaren Spektralbereich Isopurpuromycin in Chloroformlösung (die Probe ist anfänglich in Dimethylformamid gelöst) zeigt folgende Maxima:

max (mu;:	E J'" :
	1cm
322	392
370	(Schulter)
440	(Schulter)
465	(Schulter)
490	213
530	170

4) IR-Absorptionsspektrum:

Die wichtigsten Absorptionsmaxima in Paraffinöl (Nujol) treten bei folgenden V/eilenzahlen (cm~ ) auf :

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^Γ · - 19 -

3570, 3360, 1725, 1670, 1610, 1520, 1400, 13Η0, 1250, 1215, 1160, 1150, 1110, 1100, 1090, 1070, 1050, 1035, 1000, 970, 920, 890, 840, 82Oi 800, 770, 710.

5) Massenspektrum:

Das Massenspektrum wird bei 70 eV erhalten. Die wichtigsten Peaks sind bei folgenden m/e-Werten aufgezeichnet: M₊ 538, 520, 504, 492, 474, 462, 288, 286, 274, 264, 256, 245, 236, 228.

6) NMR-Spektrum:

Die wesentlichen charakteristischen Absorptionsmaxima in CF_yCOOD treten bei folgenden Frequenzen (ausgedrückt in δ-Einheiten) auf:

CF₃COOD: 7,86 (lH.s); 7,65 (lH,s); 7_;28 (lH,s); 6,69 (ill,_s);. 5,8 ClH,m); 3,75 (6H,s); 3,6 (2H,m.). '

7) Löslichkeit:

schwer löslich in Dimethylformamid, Pyridin, CF^COOH; unlöslich in allen üblichen Lösungsmitteln und Wasser.

Beispiel 3

Herstellung der Acetylderivate von Purpuromycin und Isopurpuromvcin

300 mg kristallines Purpuromycin werden in 6 ml Pyridin suspendiert und mit 6 ml Essigsäureanhydrid versetzt. Die Suspension wird 1 Stunde auf 75°C erhitzt und anschließend in Eiswasser eingegossen. Die gebildete Fällung wird abfiltriert und das Rohprodukt an Kieselgel, abgepuffert mit 0,5 η KH,, PO^-Lösung chroinatographicrt. Als Lauf mittel wird Chloroform verwendet.

4 09-843/1153

2 Λ 1 2 8 9 O _

Das erste Eluat wird als Acetylderivat I bezeichnet. Nach dem Eindampfen wird das Produkt aus Dimethylsulfoxid umkristallisiert, das geringe Mengen Wasser enthält.

Das zweite Eluat wird als Acetylderivat II bezeichnet und wird aus Aceton umkristallisiert. Die Eigenschaften der Verbindungen sind nachstehend angegeben:

Acetylderivat I
1 ) Schmelzpunkt: 195°C;

2) Elementaranalyse;

^C36^H28°18' ^{C H} ° ber.: 57,8 3,74
gef.: 57,32 3,76 38,92 (durch Differenz)

3) Absorption im ultravioletten und sichtbaren Spektralbereich: Das Acetylderivat I in Chloroformlösung zeigt folgende Maxima:

^ max (mu)	ß1 cn '
261	526
265	(Schulter)
285	297
297	292
335	(Schulter)
345	151
4) IR-AbporptionsSpektrum:
Die wichtigsten Absorptionsmaxima	in Paraffinöl (Nujol) tre-

ten bei folgenden V/ellenzahlen (cm~ ) auf: 1790, 1775, 171+0, 1710, 1670, 1590, 1550, 1340, 1305, 1275, 12G0,

1220, 1200, 1180, 1105, 1090, 1080, lOGO, 1030, 1015, 98O₃ 960, 940, 915, 890, 870, 860, 824, 805, 793, 773, 7G3, 720.

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5) Massenspektrum;

Das Massenspektrum wird bei 70 eV erhalten. Die wichtigsten Peaks sind bei folgenden m/e-Werten aufgezeichnet: M+ 748, 706, 664, 646, 622, 604, 580, 562, 520, 504, 492, 474, 462, 288, 286, 274, 264, 256, 245, 236, 228.

6) NMR-Spektrum;

Die wesentlichen charakteristischen Absorptionsmaxima in CDCl, treten bei folgenden Frequenzen (ausgedrückt in 6-Einheiten aufr

CDCl₃: 7,06 (lH,s)j 7_;5O (IH,s); 6,91 (lH,s) j 6_;6O (lll,s); 6.31 (lH,t,J=6_;5Hz); 3_;99 (6H,s); 3,36 (2H ,d ,J = G₇SHz) ; 2_;48 (3H,s); 2_;45 (6H,s); 2,42 (3H,s); 2,10 (3:i,s).

7) Löslichkeit:

Löslich in Äthylacetat,'Chloroform, Pyridin, Dimethylsulfoxid; schwer löslich in Aceton und Methanol; unlöslich in Wasser.

Aufgrund der vorstehenden physikalisch-chemischen Eigenschaften ist das Acetylderivat I das Pentaacetylderivat des Isopurpuromycins.

Acetylderivat II
¹) Schmelzpunkt: 254 bis 258⁰C;
2)'Elementaranalyse:

39,21 (durch Differenz); L J

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C34H26°17;	57	C	3	H
ber.:	57	,8	3	,69
gef.:	,12	,67

3) Absorption im ultravioletten und sichtbaren Spektralbereich: Das Acetylderivat II in Chloroformlösung (anfänglich liegt die Probe als Lösung in Dioxan vor) zeigt folgende Maxima:

E ]^% _cm:

262 (Schulter)

283 (Schulter)

292 523

307 - . (Schulter)

348 176

360 (Schulter)

4) IR-Absorptionsspektrum:

Die wichtigsten Absorptionsmaxima in Paraffinöl (Nujol) treten bei folgenden Wellenzahlen (cm" ) auf.

1770, 1755, 1740, 1680, 1650, 1625, 13H0, 1325, 1300, 1200, 1255

1235, 1210, 1190, 1160, 1135,-1115, 1083,. 1050, 1030, 1010, 395, 950, 920, 872, 845^823, 798, 770, 750, 705.

5) Massenspektrum:

Das Massenspektrum wird bei 70 eV erhalten. Die v/ichtigsten Peaks sind bei folgenden m/e-Werten aufgezeichnet: 11+ 706, 664_} 646, 622,' 604, 580, 552, 520, 504, 492, 474, 462, 288, 286, 274, 273, 264, 256, 250, 236, 228.

6) NMR-Spektrum:

Die wesentlichen charakteristischen Absorptionsmaxima in CDCl^ treten bei folgenden Frequenzen (ausgedrückt in δ-Ξϊη-heiten) auf:
CDCl : 7.65 (IR,s); 7,48 (lH,s); 6,2 ClH ,n); 6_;O3 (Hi₅S):

3_;99 (3II,s); 3_;89 C3H,s); 3,67 (III,d,J=IRII ); 3,45 (HI,d,J = 18H ); 2,75 C2Ii,m); 2^6 (311,s) j

L -J

2.35 CHU,s); 2,15 (311,s).

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^Γ ■ ■ -23- '

7) Löslichkeit;

löslich in Äthylacetat, Chloroform, Pyridin, Dimethylsulfoxid, Dioxan;

schwer löslich in Methanol und Aceton; unlöslich in Wasser.

Aufgrund dieser physikalisch-chemischen Eigenschaften ist das Acetylderivat II das Tetraacetylderivat des Purpwomycins.

Beispiel 4

Her εi teilung von Purpuromycin-hydro gensuc cinat 150 mg Purpuromycin und 33 mg Bernsteinsäureanhydrid v/erden in 3 ml· Pyridin 15 "bis 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird das Reaktionsgemisch in Eiswasser eingegossen und auf einen pH-Wert von 3,5 angesäuert. Die gebildeten Kristalle werden abgeschleudert, und der Überstand wird dekantiert. Die Kristalle werden an Kieselgel mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (98 : 2) als Laufmittel chromatographisch gereinigt. Das Eluat wird eingedampft. Ausbeute 37 mg. Die Verbindung schmilzt nicht bei einer Temperatur bis 26O°C. Elementaranalyse:

C30H22O16;	56	C	H
ber. :	55	,4	3,45
gef·. :	,82	3,58.

Das IR-Absorptionsspektrum und das NMR-Spektrum bestätigen die Veresterung der alkoholischen Hydroxylgruppe mit einer der beiden Carboxylgruppen der Bernsteinsäure. L

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Beispiel 5

Herstellung von Purpuromycin-hvdrogenmaleat

200 mg Purpuromycin und. 43 mg Maleinsäureanhydrid in 3 ml Pyridin werden 15 Ms 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch in Eiswasser eingegossen und auf einen pH-Wert von 3>5 eingestellt. Die Kristalle werden abgeschleudert, und der Überstand wird dekantiert. Das Produkt wird' an Kieselgel mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (95 : 5) als Laufmittel chromatographisch gereinigt. Ausbeute 40 mg der Titelverbindung vom F. 158°C. Elementaranalyse:

^C3O^H2O°16^{: C H}

ber.: 56,6 3,18

gef.: 56,05 3,27.

Das IR-Absorptionsspektrum und das WiFi-Spektrum bestätigen die Veresterung der alkoholischen Hydroxylgruppe mit einer der beiden Carboxylgruppen der Maleinsäure.

L " _J

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Claims (10)

Pate η t a η s ρ r U ehe

1.. Purpuromycin der Formel Ia O p„

(Ia)

COOCH

und Isopurpuromycin der Formel Ib CH

3V/'

(Ib)

OOCH,

2. Tetraacetylpurpuromycin.

3. Pentaacetylisopurpuromycin.

4. Monoacyl-Derivate des Purpuromycins der allgemeinen Formel Ic-

OH ο

(Ic)

COOCH,

in der R den Acylrest einer aliphatischen Mono- oder Dicarbonsäurc mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen" bedeutet, die gegebenen-

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falls olefinisch ungesättigt oder durch eine Hydroxylgruppe substituiert ist, und ihre Keto-Enol-Tautomeren.

5. Verbindungen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß R die Gruppe CO-CPI₂-CH₂-COOH, CO-CH=CE-COOH oder CO-CH₂OH ist.

6. ■ Verfahren zur Piers teilung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) Äctinoplanes ianthinogenes nov. sp. A/1668 (ATCC Nr. 21884) unter submersaeroben Bedingungen in üblichen Nähriaedi-en, die assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthalten, und unter üblichen Temperatur- und pH-Bedingungen züch-

(b)

tet und das Purpuromycin aus der Kulturbrühe isoliert und/gegebenenfalls durch Umsetzen in mild-alkalischem Medium unter Br-

- - Cc)

hitzen in Isopurpuromycin überführt oder/gegebenenfalls das er-

einem haltene Purpuromycin in mild-alkalischem Medium rait/Acetylierungsmittel umsetzt und das gebildete Gemisch von Tetraacetylpurpuromycin und Pentaacetylisopurpuromycin durch Chromatographie in die Komponenten trennt.

7. Verfahren zur Plerstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Purpuromycin mit einem Säureanhydrid oder Säurechlorid einer aliphatischen Mono- oder Dicarbonsäure mit 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls olefinisch ungesättigt oder durch eine Hydroxylgruppe substituiert ist, in etwa äquimolarem Mengenverhältnis bei Temperaturen von etwa 0 bis etwa 30⁰C umsetzt.

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8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Acylierungsmittel ein Säureanhydrid oder -chlorid der Bernstein-, Malein- oder Glykolsäure verwendet. - ■

9. Actinoplanes ianthinogenes nov.sp. A/1668 (ATCC Nr. 21884) zur Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 6 (a).

10. Arzneimittel, bestehend aus einer Verbindung gemäß Anspruch 1 bis 5 und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsstoffen.

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