DE2261695A1

DE2261695A1 - PARTICLE SORTING DEVICE

Info

Publication number: DE2261695A1
Application number: DE19722261695
Authority: DE
Inventors: James Ross Coulter; Mack Jett Fulwyler; John Allan Steinkamp
Original assignee: US Atomic Energy Commission (AEC)
Current assignee: US Atomic Energy Commission (AEC)
Priority date: 1971-12-23
Filing date: 1972-12-16
Publication date: 1973-06-28
Also published as: BE793185A; DE2261695C2; CA971913A; AU468637B2; NL7216901A; FR2164898A1; US3710933A; GB1380756A; SE388278B; JPS5613266B2; FR2164898B1; AU5020272A; NO138305B; NO138305C; JPS4874292A

Description

United States Atomic Energy Commission, Washington, D.C, U.S.A.United States Atomic Energy Commission, Washington, D.C, U.S.A.

Teilchensortiervorrichtung.Particle sorting device.

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur automatischen Analyse und Sortierung kleiner Teilchen, und zwar insbesondere auf eine Vorrichtung, in welcher das Volumen, die Form und die Fluoreszenz biologischer Zellen in Suspension in einem kontinuierlich fließenden Strömungsmittel schnell und automatisch gemessen und analysiert werden, um festzustellen, ob die Zellen normal oder abnormal erscheinen, wobei die als abnormal identifizierten Zellen körperlich von den normalen Zellen getrennt werden. Auf dem Gebiet der Zytologie wird es mehr und mehr erforderlich, eine automatische Zellanalyse und Zelldifferentiation vorzusehen. Derzeit erfolgt die Untersuchung zytologischen Materials, beispielsweise zur Feststellung krebsartiger oder bösartiger Zellen,durch zwei oder mehr Stufen von Untersuchungen. Anfangs werden die Zellproben visuell durch einen Betrachter voruntersucht, um die abnormale Zellen enthaltenden Proben herauszusuchen. Diese Proben werden dann für eine spätere Untersuchung durch einen ausgebildeten Zytotechnologen oder Pathologen zur Seite gestellt, der dann ein end-The invention relates to a device for automatic Analysis and sorting of small particles, in particular on a device in which the volume, the shape and the fluorescence of biological cells in suspension in a continuously flowing fluid rapidly and automatically measured and analyzed to determine if the Cells appear normal or abnormal, with the cells identified as abnormal being physically separated from normal cells will. In the field of cytology there is more and more more required, automatic cell analysis and cell differentiation to be provided. Cytological material is currently being examined, for example to identify cancerous or malignant cells, through two or more stages of Investigations. Initially, the cell samples are visually pre-examined by an observer to identify the abnormal cells Pick samples. These samples are then used for later examination by a trained cytotechnologist or a pathologist, who then

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gültiges Urteil darüber fällt, ob die Zellen tatsächlich krebsartig sind. Obwohl dieses Verfahren derzeit zufriedenstellend funktioniert, hat es doch eine Reihe von Nachteilen. Zum einen ist es sehr zeitaufwendig und erfordert viel der Technikerzeit, so daß es auch kostspielig ist; ferner liefert es keine quantitativen Ergebnisse, da das benutzte Kriterium der Abnormalität weitgehend subjektiv ist. Wegen der Zeit und Kosten kann das bekannte Verfahren auch nicht ohne weiteres bei großen Zahlen verwendet werden, überdies sind viele, möglicherweise die meisten dem medizinischen Labor vorgelegten Zellproben normal. Beispielsweise haben bei der zytologischen Prüfung auf Uteruskrebs 98% der untersuchten Frauen keinen Krebs. Die Folge davon ist, daß - insbesondere wenn größere Bevölkerungsgruppen auf Krebs untersucht werden - der Aufmerksamkeitspegel und das Interesse derjenigen abgesenkt wird, die die Voruntersuchung durchführen. Dies hat mit der Zeit zur Folge, daß ein Test weniger quantitativ und teurer wird, da der Personalwechsel ansteigt.Valid judgment is made as to whether the cells are actually cancerous are. Although this method currently works satisfactorily, it has a number of disadvantages. For one is it is very time consuming and requires much technician time so that it is also costly; furthermore, it does not provide quantitative information Results since the abnormality criterion used is largely subjective. Because of the time and expense involved, it can be known Nor are procedures readily used with large numbers; moreover, many, possibly most, are medical Cell samples submitted to laboratory normal. For example, in the cytological examination for uterine cancer, 98% of those examined have Women don't have cancer. The consequence of this is that - especially when large populations are screened for cancer - the level of alertness and interest of those carrying out the preliminary examination are lowered. This has with the consequence of time is that a test becomes less quantitative and more expensive as the turnover increases.

Viele dieser Nachteile können durch die Anwendung von Strömungssystemverfahren bei der Zellanalyse zur Durchführung der Voruntersuchung überwunden werden. Die Strömungssystemanalyse gestattet die Beobachtung einzelner Zellen, wenn diese in einer Suspension nacheinander durch ein kleines Untersuchungs- oder Feststellungsvolumen fließen. Große Anzahlen von Zellen können in kurzen Zeitperioden beobachtet werden, und schnelle automatische Voruntersuchungsverfahren sind möglich. Die Lichtabsorption, die Fluoreszenz, die Streuung oder das Volumen der beobachteten Teilchen sind übliche Parameter. Die Literatur erhebt verschiedentlich den Anspruch, daß diese Parameter quantitativ beobachtet wurden; dabei besteht eine Hauptschwierigkeit darin, daß ein einziger Parameter häufig nicht ausreicht, um quantitativ zwischen normalen und abnormalen Zellen zu differenzieren oder zu unterscheiden. Die Mehrparameteranalyse erhöht die Fähigkeit, zwischen unterschiedlichen Zellarten zu unterscheiden. Weil die Mehrzahl der untersuchten Zellen normal ist, sind solche Mittel äußerst erwünscht, die die abnormalen Zellen aus den normalen Zellen aussortieren, so daß die für eine spätere Untersuchung erzeugte ProbeMany of these drawbacks can be addressed through the use of fluid system techniques be overcome in the cell analysis to carry out the preliminary examination. The flow system analysis permitted the observation of individual cells as they flow through a small volume of examination or detection one after the other in a suspension. Large numbers of cells can be created in short periods of time are observed, and rapid automatic screening procedures are possible. The absorption of light, the fluorescence, the scattering or the volume of the observed particles are common parameters. The literature raises variously the claim that these parameters have been observed quantitatively; One of the main difficulties is that a single The parameter is often insufficient to quantitatively differentiate or differentiate between normal and abnormal cells. The multi-parameter analysis increases the ability to differentiate between different cell types. Because the majority of cells examined is normal, agents that sort the abnormal cells out of the normal cells are highly desirable, so that the sample generated for later investigation

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ein Übergewicht von als abnormal betrachteten Zellen enthält. Diese verschiedenen Erwägungen sowie der augenblickliche Stand der Technik sind im einzelnen im Teil A der folgenden Literaturstelle beschrieben:"Automated Cytology: A Symposium by Correspondence", Acta Cytologica, Vol. 15, Nr. 1-3 (1971). Im US Patent 3 380 584 hat einer der Erfinder der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung beschrieben, mit der kleine, in einem Strömungsmittel suspendierte Teilchen sortiert werden können. Das Sortieren erfolgt gemäß einem ausgewählten Parameter, der beispielsweise die Größe, das Volumen, das Vorhandensein von Radioaktivität, die Farbe, die Fluoreszenz, die Lichtabsorption oder irgendeine.andere Quantität, sein kann, die in eine elektrische Quantität überführbar ist. Die Teilchentrennvorrichtung gemäß US Patent 3 380 584 basiert jedoch auf der Messung eines einzelnen Parameters und nicht auf einer Mehrparametermessung.contains an excess of cells considered abnormal. These Various considerations as well as the current state of the art are detailed in Part A of the following reference "Automated Cytology: A Symposium by Correspondence", Acta Cytologica, Vol. 15, No. 1-3 (1971). U.S. Patent 3,380,584 one of the inventors of the present invention described a device by which small particles suspended in a fluid Particles can be sorted. The sorting takes place according to a selected parameter, for example the size, the Volume, the presence of radioactivity, the color, the fluorescence, the light absorption or any other quantity, which can be converted into an electrical quantity. However, the particle separation device of US Patent 3,380,584 is based on the measurement of a single parameter and not on a multi-parameter measurement.

Es ist nur eine Vorrichtung zum Sortieren abnormaler Zellen aus großen Populationen normaler Zellen auf der Basis der Mehrparameteranalyse bekannt. Kamentsky und Melamed beschreiben in "Science", Band 156, Seite 1364 (1967) eine spektrofotometrische Zellensortiervorrichtung, welche die.Zellen mit vorbestimmten optischen Eigenschaften körperlich von großen in Suspension befindlichen Zellpopulationen trennt. Das Sortieren erfolgt auf der Basis mehrfacher optischer Messungen, wobei das Trennsystem die Strömungsmittelschaltprinzipien benutzt, die ungefähr 1964 bei der Computer-Konstruktion benutzt wurden (Fluidics). Dieser spektrofotometrische Zellsortierer arbeitet verhältnismäßig langsam und ist nicht in der Lage, eine Probe zu erzeugen, die in erster Linie aus Zellen besteht, welche weiteruntersucht werden sollen. Beispielsweise ist es mit dieser Zeilsortiervorrichtung selbst bei größtem Bemühen nicht möglich, Endkonzentrationen der ausgewählten (d.h. gegenüber vorgegebenen Normen der Normalität abnormalen) Zellen von ungefähr 1:5 aus Anfangskonzentrationen im Bereich von 1:10 000 zu erzeugen.It is just a device for sorting abnormal cells from large populations of normal cells based on the multi-parameter analysis known. Kamentsky and Melamed describe in "Science", Volume 156, page 1364 (1967) a spectrophotometric Cell sorting device, which die.Zellen with predetermined optical properties physically separates them from large populations of cells in suspension. Sorting takes place on the Based on multiple optical measurements, with the separation system using the fluid switching principles that were introduced around 1964 at Computer construction were used (Fluidics). This spectrophotometric Cell sorter works relatively slowly and is unable to generate a sample in the first place consists of cells that should be examined further. For example, it is with this line sorting device itself It is not possible, with the greatest of efforts, to determine the final concentrations of the selected (i.e. abnormal compared to given norms of normality) Generate cells of approximately 1: 5 from initial concentrations in the range of 1:10,000.

Es ist bekannt, daß die Leistungsfähigkeit von Zellvolumenabfühlinstrumenten nach dem Prinzip des Coulter-Zählers - in dem eineIt is known that the performance of cell volume sensing instruments on the principle of the Coulter counter - in the one

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Zelle die Impedanz einer engen öffnung ändert, wenn sie durch eine öffnung läuft - verbessert werden kann, wenn die Zellsuspension von einer Koaxialströmung aus zellfreier Flüssigkeit umgeben wird, wenn sie durch die öffnung läuft. Beispielsweise beschreiben Merrill et al. in Rev. Sei. Instru., Band 42, Seite 1157 (1971) einen Zellvolumenanalysator. mit Koaxialströmung der Zellsuspension innerhalb einer Umhüllung aus zellfreier Lösung durch die Abfühlöffnung. Diese Vorrichtung ist jedoch keine Zellensortiervorrichtung und arbeitet als Ein-Parameteranalysator. Obwohl Merrill et al vorschlagen, daß diese Vorrichtung auch zur Mehr-Parameteranalyse benutzt werden kann, ist jedoch dem Stand der Technik kein Hinweis zu entnehmen, daß dies tatsächlich geschehen ist.Cell changes the impedance of a narrow opening when it runs through an opening - this can be improved if the cell suspension is surrounded by a coaxial flow of cell-free liquid when it runs through the opening. For example, Merrill et al. in Rev. Sci. Instru., Vol. 42, page 1157 (1971) describe a cell volume analyzer. with coaxial flow of the cell suspension within an envelope of cell-free solution through the sensing opening. However, this device is not a cell sorting device and operates as a one-parameter analyzer. Although Merrill et al suggest that this device can also be used for multi-parameter analysis, there is no indication in the prior art that this actually happened.

Die Erfindung sieht unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-StrÖmungssystems und elektronischer und optischer .Abfühlung eine Vorrichtung vor, die zur schnellen und automatischen Analyse und Sortierung kleiner Teilchen dient, und zwar auf der Basis bestimmter vorgewählter Charakteristiken (Eigenschaften) oder Kombinationen dieser Eigenschaften. Diese Vorrichtung ist eine Weiterentwicklung der in US Patent 3 380 584 gezeigten Vorrichtung und gestattet die Teilchentrennung auf der Grundlage der Mehr-Parameteranalyse.'Die Vorrichtung ist insbesondere bei der Analyse und Sortierung biologischer Zellen verwendbar.The invention sees using a high velocity flow system and electronic and optical .Sensing a device that enables rapid and automatic analysis and sorting of small particles is used on the basis of certain preselected characteristics (properties) or Combinations of these properties. This device is a further development of the device shown in US Pat. No. 3,380,584 and allows the particle separation on the basis of the multi-parameter analysis. The device is particularly in the Analysis and sorting of biological cells can be used.

Bei einem Ausführungsbeispiel der Vorrichtung, die zum Sortieren abnormaler (bösartiger) Zellen aus normalen Zellen verwendbar ist, wird Zellularvolumen, Kleinwinkellichtstreuung und Fluoreszenz für jede Zelle gemessen und mit vorgegebenen Standards (Normen) verglichen, wobei die diesen Standards nicht entsprechenden Zellen von den diesen Standards entsprechenden Zellen getrennt werden. Mit einem geeigneten Fluoreszenzfarbstoff gefärbte Zellproben werden verdünnt und in einer physiologischen Salzlösung suspendiert und in eine Strömungskammer auf der Achse eines sich bewegenden Stromes der Salzlösung eingeführt, wobei letztere als eine Umhüllung wirkt, um den Zellstrom auf die Mittelachse des Systems zu beschränken. Innerhalb der Kammer fließen die Zellen der Reihe nach durch eine öffnung, die als ein Coulter-Volumen-In one embodiment of the apparatus useful for sorting abnormal (malignant) cells from normal cells, cellular volume, small-angle light scattering and fluorescence is measured for each cell and using specified standards (norms) compared, the cells not corresponding to these standards being separated from the cells corresponding to these standards will. Cell samples stained with a suitable fluorescent dye are diluted and placed in a physiological saline solution suspended and introduced into a flow chamber on the axis of a moving stream of saline solution, the latter as an enclosure acts to confine cell flow to the central axis of the system. The cells flow inside the chamber in turn through an opening, which is called a Coulter volume

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fühler dient und wo das Zellvolumen elektronisch gemessen wird. Als nächstes durchschneiden die in Suspension in der Salzlösung strömenden Zellen einen Argon-Ionenlaserstrahl. Die einzelnen Zellen streuen das Licht und der an die Zellen gebundene Farbstoff wird zur Fluoreszenz angeregt. Das gestreute Licht liefert eine quantitative Information über Zellengröße und Form, während die Fluoreszenz eine quantitative Messung aller Zellbestandteile liefert, an die ein fluoreszierender Farbstoff gebunden ist, beispielsweise kann der DNA-Gehalt angegeben werden. Die Kleinwinkellichtstreuung wird in Vorwärtsrichtung gemessen und die Fluoreszenz senkrecht zum Zellstrom und Laserstrahl. Nach dem Durchlaufen des Laserstrahls spritzt die Zellsuspension durch eine koaxial ausgerichtete Düse am Austrittsende der Strömungskammer nach aussen in die Luft. Ein mechanisch mit der Strömungskammer gekoppelter piezoelektrischer Kristall wird zur Erzeugung gleichförmiger Tröpfchen verwendet, und zwar durch- regelmäßig Zerstreuung des austretenden Flüssigkeitsstrahls. Die meisten Zellen werden in wirksamer Weise in einzelne Tröpfchen getrennt, obwohl nicht alle Tröpfchen Zellen enthalten, und obwohl gewisse Tröpfchen zwei oder mehr Zellen enthalten können. Ausgewählte Zellen enthaltende Tröpfchen werden elektrisch aufgeladen und sodann durch ein statisches elektrisches Feld in ein gesondertes Gefäß abgelenkt. Ein Oszilloskop überwacht einzelne Signalimpulse„ während ein Mehrkanal-Impulshöhenanalysator, ein Drucker und ein Zeichner Impulsamplitudenverteilungen erzeugen und aufzeichnen, welche das Zellvolumen, die Lichtstreuung und die Fluoreszenz oder Kombinationen aus diesen Eigenschaften darstellen. Ein durch einen Einkanal-Impulshöhenanalysator getriggerter (ausgelöster), eine veränderbare Verzögerung aufweisender Impulsgenerator erzeugt Tröpfchenladeimpulse, die verzögert sind, um zu gestatten, daß die sortierte Zelle von der Abfühlzone zum Punkt der Tröpfchenformung und Ladung läuft.sensor and where the cell volume is measured electronically. Next, the cells flowing in suspension in the saline solution cut through an argon ion laser beam. The single ones Cells scatter the light and the dye bound to the cells is stimulated to fluoresce. The scattered light delivers quantitative information about cell size and shape, while fluorescence a quantitative measurement of all cell components supplies to which a fluorescent dye is bound, for example the DNA content can be specified. The small angle light scattering is measured in the forward direction and the fluorescence perpendicular to the cell stream and laser beam. After the laser beam has passed through, the cell suspension injects coaxially through a aligned nozzle at the outlet end of the flow chamber outside in the air. A piezoelectric crystal mechanically coupled to the flow chamber becomes more uniform to produce Droplets used, namely by regularly dispersing the exiting liquid jet. Most of the cells are effectively separated into individual droplets, although not all droplets contain cells, and although some do Droplets can contain two or more cells. Droplets containing selected cells become electrically charged and then deflected into a separate vessel by a static electric field. An oscilloscope monitors individual signal pulses " while a multichannel pulse height analyzer, printer and draftsman generate and record pulse amplitude distributions, which represent the cell volume, the light scattering and the fluorescence or combinations of these properties. One through a single-channel pulse height analyzer triggered (triggered), a variable delay pulse generator generates droplet charging pulses which are delayed to allow that the sorted cell travels from the sensing zone to the point of droplet formation and charge.

Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich insbesondere auch aus den Unteransprüchen.Preferred embodiments of the invention emerge in particular also from the subclaims.

Weitere Vorteile, Ziele und Einzelheiten der Erfindung ergebenFurther advantages, objects and details of the invention result

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sich aus der Beschreibung von Ausführungsbeispielen an Hand der Zeichnung; in der Zeichnung zeigt:from the description of exemplary embodiments with reference to the drawing; in the drawing shows:

Fig. 1 ein Blockschaltbild, welches darstellt, wie die erfindungsgemäße Vorrichtung in einem Krebsuntersuchungsprogramm verwendet werden kann;Fig. 1 is a block diagram showing how the inventive Device can be used in a cancer screening program;

Fig. 2 eine vereinfachte Ansicht der erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei die Strömungskammer und die Lade- und Ablenkplatten dargestellt sind, die zur Teilchensortierung benutzt werden;2 shows a simplified view of the device according to the invention, showing the flow chamber and loading and baffle plates used for particle sorting;

Fig. 3 eine vergrößerte,vereinfachte geschnittene Ansicht des Abfühlteils der Strömungskammer;Fig. 3 is an enlarged, simplified sectional view of the Sensing portion of the flow chamber;

Fig. 4 eine ins einzelne gehende Querschnittsansicht der Strömungskammer, die bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung verwendbar ist;4 is a detailed cross-sectional view of the flow chamber; which is useful in a preferred embodiment of the invention;

Fig. 5 ein Blockdiagramm der optischen und elektrischen Elemente eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der Erfindung;Figure 5 is a block diagram of the optical and electrical elements of a preferred embodiment of the invention;

Fig. 6 einen Teil eines logischen und Schalt-Blockdiagramms für die in Fig. 5 angedeutete Mehr-Parameter-Signalverarbeitungseinheit; FIG. 6 shows part of a logic and circuit block diagram for the multi-parameter signal processing unit indicated in FIG. 5; FIG.

Fig. 7 eine Fortsetzung des Diagramms der Fig. 6.FIG. 7 is a continuation of the diagram in FIG. 6.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann ohne weiteres zur schnellen und automatischen Mehr-Parameteranalyse und zum Sortieren verschiedener Arten von Teilchen verwendet werden. Die Größe der zu analysierenden Teilchen ist durch die Größe der Coulter-Volumenfühlöffnung beschränkt. Ferner müssen die durch die erfindungsgemäße Vorrichtung zu analysierenden und zu sortierenden Teilchen einer Analyse auf der Basis ihrer physikalischen und chemischen Eigenschaften zugänglich sein.The device according to the invention can easily be used for fast and automatic multi-parameter analysis and for sorting different types of particles can be used. The size of the particles to be analyzed is determined by the size of the Coulter volume sensing orifice limited. Furthermore, the to be analyzed and sorted by the device according to the invention Particles must be accessible for analysis on the basis of their physical and chemical properties.

Die hier gezeigten Figuren beziehen Sich auf ein Ausführungsbeispiel der Erfindung, welches zur Analyse und Sortierung ab- The figures shown here relate to an embodiment of the invention, which is used for analysis and sorting

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normaler Zellen aus normalen Zellen verwendbar ist, und zwar in einem zytologischen Untersuchungsprogramm zur Bestimmung zervikalen Krebses. Das Schema ist in Fig. 1 dargestellt. Zunächst werden die Zellproben für die StrömungsSystemanalyse auf- oder vorbereitet, und zwar durch geeignete Verdünnung, Behandlung zur Vermeidung von Klumpen, Einfärben mit Fluoreszenzfarbstoffen; usw.; Diese Aufbereitung erfolgt entsprechend der speziellen Art der zu verwendenden automatischen Analyse. In diesem speziellen Aufbau werden die folgenden Zellparameter gemessen: Zellenvolumen, Kleinwinkellichtstreuung und Fluoreszenz. Die Fluoreszenzmessungen hängen von der Anwendung biochemischer spezifischer Farbstoffe ab. Die zur Durchführung dieser speziellen Messungen vorgesehenen Abfühl- oder Meßvorrichtungen sind miteinander kompatibel und auch mit der elektronischen Sortierung der Zellen. Das angewandte elektronische Sortierverfahren gleicht dem in dem US Patent 3 380 584 beschriebenen Verfahren. Wenn jede Zelle analysiert ist, wird ein Signal von jeder Abfühl- oder Meßvorrichtung an eine Mehr-Parameter-Signalverarbeitungseinheit geliefert und dort verarbeitet und mit vorgegebenen Kriterien der Abnormalität verglichen. Während sich somit die Zelle noch immer in der Nachbarschaft der Meßzone befindet, werden die von den Meßvorrichtungen abgegebenen, die gemessenen Zelleigenschaften darstellenden Signale in Verhältnisse, überlappungsfoereiche, usw. verarbeitet, die abnormale Zellen am wirkungsvollsten beschreiben. Die verarbeiteten Signale werden elektronisch mit spezifizierten Standardwerten (Normen) verglichen, wobei die entsprechende Zelle entweder als normal, abnormal oder zweifelhaft eingestuft wird. Die nach Erhalt der Signale zur Signalverarbeitung und Sortierungsentscheidung erforderliche Zeit liegt in der Größenordnung von 25 Mikrosekunden. Wenn eine Zelle als abnormal oder zweifelhaft klassifiziert wird, entsteht ein Signal, welches bewirkt, daß ein diese Zelle enthaltendes Tröpfchen von den normale Zellen enthaltenden Tröpfchen abgelenkt wird. Die Analyseresultate für diese Zelle können gesondert von den Daten für normale Zellen der Probe gespeichert werden. Die aussortierten abnormalen oder zweifelhaften Zellen werden zusätzlich eingefärbt und für die visuelle Untersuchung durch einen Zytologen bereitgehalten. Zur Unterstützungnormal cells from normal cells can be used, specifically in a cytological examination program for determining cervical cells Cancer. The scheme is shown in FIG. First, the cell samples for the flow system analysis are on or prepared by suitable dilution, treatment to avoid lumps, coloring with fluorescent dyes; etc.; This preparation is carried out according to the specific type of automatic analysis to be used. In this particular setup the following cell parameters are measured: cell volume, small-angle light scattering and fluorescence. The fluorescence measurements depend on the application of specific biochemical dyes. The sensing or measuring devices provided for making these particular measurements are compatible with one another, as are with the electronic sorting of cells. The electronic sorting method used is similar to that in the US patent 3 380 584 described procedure. When each cell is analyzed, a signal from each sensing or measuring device is sent to a Multi-parameter signal processing unit supplied and processed there and compared with predetermined criteria of the abnormality. While the cell is still in the neighborhood is located in the measuring zone, the signals emitted by the measuring devices and representing the measured cell properties are shown in Ratios, areas of overlap, etc. processed that are abnormal Describe cells most effectively. The processed signals are electronic with specified standard values (Norms) are compared, with the corresponding cell classified as either normal, abnormal or doubtful. The upon receipt the time required for signal processing and sorting decision signals is on the order of 25 microseconds. When a cell is classified as abnormal or doubtful, a signal is generated that causes it to Cell-containing droplet is deflected from the normal cell-containing droplets. The analysis results for this cell can be stored separately from the data for normal cells of the sample will. The sorted out abnormal or dubious ones Cells are also colored and kept ready for visual examination by a cytologist. For support

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bei der Auswertung der sortierten Zellen sind für den Zytologen Verteilungen der verschiedenen gemessenen ZeI!eigenschaften oder Kombinationen der Eigenschaften der gesamten Probe oder nur der zu prüfenden abnormalen Zellen von der Datenverarbeitungsspeichervorrichtung verfügbar. Die erfindungsgemäße Vorrichtung erzeugt sowohl Ausdrucke als auch eine Oszilloskopanzeige der Daten.When evaluating the sorted cells, distributions of the various measured cell properties or combinations of the properties of the entire sample or only the abnormal cells to be tested are available to the cytologist from the data processing storage device. The apparatus of the invention produces both printouts and an oscilloscope display of the data.

Das hier beschriebene spezielle Ausführungsbeispiel betrifft die Mehrparameteranalyse des Volumens, der Fluoreszenz und der Kleinwinke !lichtstreuung individueller Zellen; dem Fachmann ist aber klar, daß die hier dargestellten Analyse- und Sortierverfahren bzw. Vorrichtungen auch bei anderen Arten der Hochgeschwindigkeitsabfühlung oder Messung verwendbar sind, und daß die elektronischen und mechanischen Bauteile des Ausführungsbeispiels ohne weiteres so abgeändert werden können, daß auch die Messung anderer Parameter möglich ist. Beispielsweise kann mit der hier beschriebenen Strömungskammer die KleinwinkellichtstreuungsHiessung durch Meßvorrichtungen ersetzt werden, welche die Lichtabsorption oder Fluoreszenz bei einer weiteren Wellenlänge feststellen.The specific embodiment described here relates to the multi-parameter analysis of the volume, the fluorescence and the small-angle light scattering of individual cells; however, it is clear to the person skilled in the art that the analysis and sorting methods or devices shown here can also be used with other types of high-speed sensing or measurement, and that the electronic and mechanical components of the exemplary embodiment can easily be modified so that other parameters can also be measured is possible. For example, with the flow chamber described here, the small-angle light scattering can be replaced by measuring devices which determine the light absorption or fluorescence at a further wavelength.

Beschreibung des bevorzugten Ausführungsbeispiels.Description of the preferred embodiment.

In den Fig. 2 und 3 ist das Grundströmungssystem und die Abfühl- oder Meßzone der erfindungsgemäßen Vorrichtung dargestellt. Eine in geeigneter Weise vorbereitete Zellenprobe wird als kontinuierlich fließende Suspension in die Strömungskammer 3 eingeführt, und zwar durch ein von einem unter Druck stehenden Reservoir 72 kommenden Probeneintrittsrohr 1. Innerhalb der Kammer 3 ist das Rohr 1 zentriert und erstreckt sich teilweise durch ein größeres Rohr 19, welches sich zu einer an dessen unteren Ende befindlichen Düse 22 hin verjüngt. Eine kontinuierliche Strömung einer zellenfreien Flüssigkeit - die als ümhÜllungsflüssigkeit bekannt ist - wird in das Rohr 19 eingeführt, und zwar durch ein Hülleneingangsrohr 18, welches mit einem unter Druck stehenden Reservoir 70 in Verbindung steht; die Hüllflüssigkeit fließt dabei koaxial - vergleiche das Bezugszeichen 20 - um das2 and 3 show the basic flow system and the sensing or measuring zone of the device according to the invention . A suitably prepared cell sample is introduced into the flow chamber 3 as a continuously flowing suspension through a sample inlet tube 1 coming from a pressurized reservoir 72. The tube 1 is centered within the chamber 3 and extends partially through a larger tube 19 , which tapers towards a nozzle 22 located at its lower end. A continuous flow of cell-free liquid - known as enveloping fluid - is introduced into tube 19 through a shell inlet tube 18 which communicates with a pressurized reservoir 70; the sheath liquid flows coaxially - compare the reference number 20 - around the

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Rohr 1 herum. Wenn der Zellenstrom aus dem Rohr 1 austritt, wird er in seinem Durchmesser 17 vermindert, da er die Geschwindigkeit der Hüllflüssigkeit erhält. Die relativen Geschwindigkeiten und Strömungsraten werden durch ein Differentialdruck-Regulatorsystem bestimmt. Es ist erforderlich, daß die Koaxialströmung der Hüllflüssigkeit und der in der Suspension befindlichen Zellen im wesentlichen laminar verläuft, so daß Turbulenzwirkungen vermieden werden, wenn die Hüllflüssigkeit und Zellsuspension durch die Volumenabfühl- oder Meßöffnung 21 in Düse 22 laufen. Das Druckdifferential zwischen der Hüllflüssigkeit 20 und der Zellströmung ist derart eingestellt, daß ein Zellstrom 28 durch die öffnung 21 tritt, welche einen solchen Durchmesser besitzt, daß die meisten Zellen einzeln hindurchtreten. Die Öffnung dient als eine Coulter-Volumenmeßöffnung, in der die Impedanz entsprechend dem Volumen der hindurchlaufenden Zelle geändert wird. Die laminar strömende Hüllflüssigkeit steuert nicht nur die Größe des durch die öffnung 21 gehenden Zellstroms, sondern dient auch zur Zentrierung innerhalb der Öffnung, so daß die die Volumenmessung beinflußenden Kantenwirkungen des elektrischen Feldes wesentlich reduziert werden.Pipe 1 around. When the cell flow emerges from the tube 1, it is reduced in its diameter 17, since it increases the speed the envelope liquid receives. The relative velocities and flow rates are controlled by a differential pressure regulator system certainly. It is necessary that the coaxial flow of the sheath liquid and the cells in the suspension runs essentially laminar, so that turbulence effects are avoided when the shell liquid and cell suspension through the volume sensing or measuring port 21 run in nozzle 22. The pressure differential between the envelope liquid 20 and the cell flow is set in such a way that a cell stream 28 passes through the opening 21 which has such a diameter that most of the cells pass through one at a time. The opening serves as a Coulter volume measuring opening in which the impedance is changed according to the volume of the cell passing through. The laminar flowing envelope liquid not only controls the Size of the cell current passing through the opening 21, but also serves for centering within the opening, so that the Volume measurement influencing edge effects of the electric field are significantly reduced.

Nach Verlassen der öffnung 21 schneidet der Zellstrom 28 einen Strahl 4 von intensivem Licht. Die Strömungskammer 3 ist ferner mit einer Einlaßöffnung 35 ausgestattet, durch welche dieser Strahl auf den Zellstrom fokussiert werden kann, öffnungen 36 {von denen eine in Fig. 2 nicht gezeigt ist) dienen als Auslässe für die Fluoreszenz 9 und die Lichtstreuung 11, die infolge des Zusammenwirkens 16 des Lichtes mit einer einzelnen Zelle erzeugt , werden, wenn die Zellen der Reihe nach im Zellstrom 28 fließen. Der Lichtstrahl 4 schneidet den Zellstrom 28 unter einem Winkel von annähernd 90°. Fluoreszenz wird in allen Richtungen abgestrahlt, aber nur in einem Konus 9 gemessen, der sich unter rechten Winkeln zur Schnittebene des Zellenstroms 28 und Lichtstrahls 4 erstreckt. Diese 90° Winkel sind insofern kritisch, als sie die erforderlichen optischen Messungen vereinfachen.After leaving the opening 21, the cell stream 28 intersects one Ray 4 of intense light. The flow chamber 3 is also equipped with an inlet opening 35 through which this beam can be focused on the cell stream, openings 36 {one of which is not shown in FIG. 2) serve as outlets for the fluorescence 9 and the light scattering 11 which occur as a result of the Interaction 16 of the light with a single cell generated when the cells flow in sequence in the cell stream 28. The light beam 4 intersects the cell stream 28 at an angle of approximately 90 °. Fluorescence is emitted in all directions, but measured only in a cone 9 which is at right angles to the plane of intersection of the cell stream 28 and light beam 4 extends. These 90 ° angles are critical in that they simplify the optical measurements required.

Der Zellstrom 28 wird aus der Strömungskammer 3 durch die Aus-The cell stream 28 is extracted from the flow chamber 3 through the outlet

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trittsdüse 26 herausgespritzt. Es ist dabei wesentlich, daß die öffnung 21 ordnungsgemäß mit der Düse 26 ausgerichtet ist. Eine Fehlausrichtung kann wegen der Turbulenz die optischen Messungen stören, und kann die genaue Zeitsteuerung beeinflussen, gemäß welcher die einer speziellen Zelle zugeordneten Messungen in ein Sortiersignal übersetzt werden, weil nämlich die Zellen ihren gleichen Aufeinanderfolgeabstand innerhalb des Zellstromes 28 verlieren. Es ist auch erforderlich, daß der Zellenstrom und seine umgebende Umhüllungsflüssigkeit die Strömungskammer 3 mit einer hinreichend hohen Geschwindigkeit zur Bildung eines Strahles 10 verlassen. Wegen des mit der öffnung 21 verbundenen Druckabfalls ist eine zusätzliche Hüllflüssigkeitsquelleerforderlich, um einen ausreichenden Druck in der Zone 30 für die Ausbildung eines angemessenen Strahls 10 zu erzeugen. Diese zweite Hüllflüssigkeitseingabe 25 erfolgt über ein mit dem Hülleingangsrohr 12 verbundenes Rohr 54. Das Rohr 12 ist seinerseits mit einem unter Druck stehenden Hüllflüssigkeitsreservoir 71 verbunden. Die Eingabe 25 erfolgt hinreichend weit vom Zellstrom 28 entfernt, so daß abgesehen von der Steigerung der Geschwindigkeit durch die Düse 26 keine andere Wirkung auf den Zellfluß ausgeübt wird. Der Hüllflüssigkeitseingang hat den zusätzlichen Vorteil, daß auf diese Weise die Strömungskammer zur Entfernung angesammelter Gase durchgespült werden kann. Da die Volumenmessung die Verwendung eines elektrischen Stromes einschließt, besteht bei den in der Strömungskammer 3 vorhandenen Flüssigkeiten eine elektrolytische Dissoziationstendenz. Die Abmessungen der Strömungskammer sind hinreichend groß, so daß infolge einer derartigen Dissoziation entstehende Gasblasen in der Strömungskammer nach oben steigen können, wo sie zeitweise gespeichert werden, ohne die optische oder elektrische Messung zu stören. Jedoch ist das Vorhandensein gewisser Mittel zweckmäßig, um periodisch alle angesammelten Gase aus dem System herauszuspülen. Dies erreicht man in einfacher Weise durch das Eingangsrohr 12. Wenn ein Spülvorgang erforderlich ist, wird ein Ventil im Spülausgangsrohr geöffnet und zusätzliche Hüllflüssigkeit wird durch Einlaßrohr 12 der Strömungskammer 3 zugeführt.outlet nozzle 26 sprayed out. It is essential that the opening 21 is properly aligned with the nozzle 26. One Misalignment can interfere with the optical measurements due to turbulence and can affect the precise timing according to which the measurements assigned to a specific cell into a sorting signal be translated because the cells lose their equal successive spacing within the cell stream 28. It is also necessary that the cell flow and its surrounding enveloping liquid, the flow chamber 3 with a sufficient leave high speed to form a jet 10. Because of the pressure drop associated with the opening 21, there is an additional pressure drop Sheath fluid source required to provide sufficient pressure in zone 30 for the formation of an adequate Generate beam 10. This second envelope liquid input 25 takes place via a tube 54 connected to the envelope inlet tube 12. The tube 12 is in turn provided with a pressurized sheath fluid reservoir 71 connected. The input 25 is made far enough away from the cell stream 28, so that apart from the Increasing the speed through the nozzle 26 has no other effect on the cell flow. The envelope fluid inlet has the additional advantage that in this way the flow chamber can be flushed through to remove accumulated gases. Since the volume measurement includes the use of an electric current, there is in the case of those in the flow chamber 3 Liquids have an electrolytic dissociation tendency. The dimensions of the flow chamber are sufficiently large, so that as a result such a dissociation resulting gas bubbles can rise in the flow chamber, where they are temporarily stored without disturbing the optical or electrical measurement. However, the presence of certain means is expedient to periodically purge any accumulated gases from the system. This is achieved in a simple manner through the inlet pipe 12. If a When flushing operation is required, a valve in the flush outlet tube is opened and additional sheath fluid is introduced through inlet tube 12 the flow chamber 3 is supplied.

Mit der Strömungskammer 3 ist durch eine Kupplungsstange 32 eineWith the flow chamber 3 is through a coupling rod 32

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Vibrationsvorrichtung 31 gekuppelt. Die der Strömungskammer 3 aufgeprägten Vibrationen (Schwingungen) erzeugen sehr kleine Störungen oder. Aufblähungen 29 am Strahl 10. Durch Erzeugung dieser Störungen mit einer richtigen durch den Strahldurchmesser und die Geschwindigkeit bestimmten Frequenz, wachsen diese in der Amplitude durch die Oberflächenspannung, bis der Strahl 10 in Tröpfchen 13 aufgeteilt wird, die gleichen Abstand und Größe besitzen. Auf diese Weise werden die in Suspension befindlichen Zellen in Plussxgkeitströpfchen getrennt. Die Art und Weise, wie die Vibrationsmittel 31 mit der Strömungskammer 3 gekoppelt sind, ist nicht kritisch, mit der Ausnahme, daß die Vibrationsfrequenz relativ konstant gehalten werden muß. Typischerweise verwendet man einen piezoelektrischen Kristall als Vibrations- oder Schwingungsquelle, wobei aber auch andere Mittel verwendbar sind.Vibrating device 31 coupled. The impressed on the flow chamber 3 Vibrations (oscillations) produce very small disturbances or. Bloat 29 on the beam 10. By generating this Disturbances with a correct frequency determined by the beam diameter and the speed, these increase in amplitude by the surface tension, until the jet 10 is divided into droplets 13 which have the same spacing and size. In this way, the cells in suspension are separated into positive droplets. The way the vibrating means 31 are coupled to the flow chamber 3 is not critical, with the exception that the vibration frequency is relative must be kept constant. Typically a piezoelectric crystal is used as a vibration or oscillation source, but other means can also be used.

Die auf diese Weise erzeugten Tröpfchen 13 laufen zwischen den Aufladungselektroden 5 hindurch, wo diejenigen Tröpfchen aufgeladen werden, die aufgrund der Analyse des Volumens, der Lichtstreuung und der Fluoreszenz jeder Zelle abnormale Zellen enthalten sollen. Die normale Zellen enthaltenden Tröpfchen werden nicht aufgeladen. Diese spezielle Reihenfolge ist deshalb vorgesehen, weil man annimmt, daß die meisten Tröpfchen normale Zellen enthalten, so daß es am einfachsten ist, nur die abnormale Zellen enthaltenden Tröpfchen aufzuladen. Es ist jedoch auch möglich, das genau umgekehrte Verfahren zu benutzen. Sodann laufen die Tröpfchen durch ein elektrostatisches Feld zwischen den Ablenkplatten 8. Unter dem Einfluß dieses Feldes werden die aufgeladenen Teilchen 14 in andere Gefäße 7 abgelenkt, als die ungeladenen Teilchen 15.The droplets 13 generated in this way pass between the charging electrodes 5, where those droplets are charged containing abnormal cells based on the analysis of the volume, light scatter and fluorescence of each cell should. The droplets containing normal cells are not charged. This special order is therefore intended because it is believed that most droplets contain normal cells, so it is easiest to only see the abnormal cells to charge containing droplets. However, it is also possible to use the exact reverse procedure. Then they run Droplets due to an electrostatic field between the baffles 8. Under the influence of this field, the charged ones become Particles 14 deflected into different vessels 7 than the uncharged particles 15.

Fig. 4 ist ein ins Einzelne gehender Querschnitt einer zur Anwendung bei der vorliegenden Erfindung geeigneten Strömungskammer. Die in Suspension befindlichen Teilchen fließen in die Kammer durch Rohr 1 hinein. Dieses Rohr dient auch als eine Elektrode für die Coulter-Volumenmeßeinrichtung und kann aus irgendeinem geeigneten leitenden Material bestehen. Im bevorzugten Ausführungsbeispiel besteht dieses Rohr aus einer Platin-Rodlum-Legierung, um Figure 4 is a detailed cross-section of one for use flow chamber suitable for the present invention. The suspended particles flow into the chamber through pipe 1. This tube also serves as an electrode for the Coulter volumetric meter and can be made of any suitable conductive material. In the preferred embodiment, this tube consists of a platinum rodlum alloy to

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Korrosionsprobleme zu vermeiden, die sich durch die Verwendung einer physiologischen Salzlösung ergeben, die sowohl als Trägerflüssigkeit für die biologischen Zellen und auch als Hüllflüssigkeit zur Umgebung der Trägerflüssigkeit benutzt wird. Das Rohr 1 ist mittels eines Führungssterns 16 koaxial innerhalb eines grösseren Rohres 19 ausgerichtet und mit einer Düse 47 versehen. Diese Düse kann aus Platin bestehen, aber es ist nicht erforderlich, daß dies der Fall ist. Ein nicht korrodierender Werkstoff, wie beispielsweise ein geeigneter Kunststoff, kann ebenso gut verwendet werden. Der Führungsstern 46 und die Düse 47 können kombiniert und aus dem gleichen Werkstoff ausgebildet sein. Das Rohr 19 endet in einer Düse 22, in der die Coulter-Volumenmeßöffnung 21 angeordnet ist. Das Rohr 19 kann aus irgendeinem nicht leitenden Werkstoff, wie beispielsweise Glas, bestehen. Im bevorzugten Ausführungsbeispiel befindet sich die Volumenmeßöffnung 21 in einem Saphireinsatz 34, der mit einem Glasrohr 19 verbunden ist. Saphir wird benutzt, weil er ohne weiteres verfügbar ist, jedoch kann der Einsatz 34 auch aus irgendeinem anderen geeigneten, nicht leitenden Material bestehen, in dem eine geeignete öffnung ausgebildet werden kann.To avoid corrosion problems resulting from the use of a physiological saline solution, both as a carrier liquid is used for the biological cells and also as a sheath liquid for the environment of the carrier liquid. The pipe 1 is aligned coaxially within a larger tube 19 by means of a guide star 16 and is provided with a nozzle 47. These The nozzle can be made of platinum, but it is not required that it be. A non-corrosive material like for example a suitable plastic can be used just as well will. The guide star 46 and the nozzle 47 can be combined and made of the same material. The pipe 19 ends in a nozzle 22 in which the Coulter volume measuring opening 21 is arranged. The tube 19 can be of any non-conductive type Material, such as glass, exist. In the preferred embodiment the volume measuring opening 21 is located in a sapphire insert 34 which is connected to a glass tube 19. sapphire is used because it is readily available, but the insert 34 may not be of any other suitable type consist of conductive material in which a suitable opening is formed can be.

Durch ein Einlaßrohr 18 wird die Hüllflüssigkeit in Rohr 19 eingeführt. Die Hüllflüssigkeit tritt auch in Küvette 23 durch Einlaßrohr 12 und Spülrohr 54 ein. Das Spülrohr 54 dient auch als die zweite Elektrode für die Coulter-Volumenmeßvorrichtung, so daß die beiden Rohre 54 und 12 aus einem geeigneten leitenden Werkstoff bestehen müssen. Im bevorzugten Ausführungsbeispiel besteht Rohr 12 aus Platin und Rohr 54 aus einer Platin-Rodium-Legierung. Das mit der Innenzone 30 der Küvette 23 verbundene Spülauslaßrohr 2 führt sämtliche in der Zone 30 erzeugten Gase ab. Im bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Auslaßrohr 2 mit einem Ventil versehen; jedoch kann, wenn gewünscht, die Hüllflüssigkeit kontinuierlich vom Spülrohr 54 durch Küvette 23 und heraus durch das Auslaßrohr geführt werden.The sheath liquid is introduced into tube 19 through an inlet tube 18. The sheath liquid also enters cuvette 23 through inlet tube 12 and flush tube 54. The flush pipe 54 also serves as the second electrode for the Coulter volumetric device, so that the two tubes 54 and 12 are made of a suitable conductive material must pass. In the preferred embodiment, tube 12 is made of platinum and tube 54 is made of a platinum-rodium alloy. That The flushing outlet pipe 2 connected to the inner zone 30 of the cuvette 23 discharges all of the gases generated in the zone 30. Im preferred Embodiment, the outlet pipe 2 is provided with a valve; however, if desired, the sheath liquid can be continuous from flush pipe 54 through cuvette 23 and out through the outlet pipe.

Die Küvette 23 ist oben offen und kann aus irgendeinem Material bestehen, das ein Isolator ist und für Licht bei denjenigen Wellenlängen durchsichtig ist, die im Lichtstrahl 4 benutzt werden. ImThe cuvette 23 is open at the top and can be made of any material that is an insulator and for light at those wavelengths is transparent, which are used in the light beam 4. in the

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bevorzugten Ausführungsbeispiel besteht die Küvette 23 aus Quarz, und "zwar in erster Linie deshalb, weil eine Quarzküvette der gewünschten Größe ohne weiteres im Handel verfügbar ist. In der Basis der Küvette 23 ist eine Öffnung 58 mittig angeordnet, durch welche sich eine Düse 26 erstreckt. Um die Wandeinflüsse auf die Geschwindigkeit der durch die Düse 26 ausgestossenen Zellen kleinzuhalten, erstreckt sich die Düse 26 nahezu bis zur Ebene A-A, in der die optischen Messungen an den einzelnen Zellen ausgeführt werden. Diese Erstreckung gestattet auch eine einfachere Ausrichtung der Volumenmeßöffnung 21 mit der Öffnung 59 in Düse 26.In the preferred embodiment, the cuvette 23 is made of quartz, primarily because a quartz cuvette is the desired Size is readily available in stores. In the base of the cuvette 23 an opening 58 is arranged centrally through which a nozzle 26 extends. In order to keep the wall influences on the speed of the cells ejected through the nozzle 26 small, The nozzle 26 extends almost to the plane A-A, in which the optical measurements are carried out on the individual cells will. This extension also allows a simpler alignment of the volume measuring opening 21 with the opening 59 in the nozzle 26.

Die Küvette 23 ist von einem Mantel 24 aus Metall umgeben. Der Mantel 24 schützt die Küvette 23 und schirmt die Coulter-Volumenmeßeinrichtung gegenüber äußerem elektronischen Rauschen ab. An der Basis des Mantels 24 befindet sich eine Dichtungsendplatte 56 und eine Düsenhalteplatte 57. Die Endplatte 56 weist in ihrer Mitte eine kreisförmige Öffnung 60 auf, durch welche sich der langgezogene Teil der Düse 26 erstreckt. Die Düse 26 ist in die Mittelöffnung 61 der Endplatte 57 fest eingeschraubt.The cuvette 23 is surrounded by a jacket 24 made of metal. The jacket 24 protects the cuvette 23 and shields the Coulter volume measuring device against external electronic noise. A sealing end plate 56 is located at the base of the shell 24 and a nozzle retainer plate 57. The end plate 56 has a circular opening 60 in its center through which the elongated part of the nozzle 26 extends. The nozzle 26 is in the Central opening 61 of the end plate 57 is screwed tightly.

Am oberen Teil des Mantels 24 befindet sich eine Anziehschraube 55, in welche eine Verschlußkappe 52 eingeschraubt ist. -Die Küvette ist abdichtend von Mantel 24 und Kappe 52 umschlossen, und zwar mittels eines in einer Vertiefung 62 der Endplatte 56 angeordneten O-Rings 48 und einer benachbart zur Kappe 52 vorgesehenen Dichtung 51. Die Verschlußkappe 52 erstreckt sich teilweise in die Küvette 23 zur Bildung einer Vertiefung 63 hinein. An der Basis an der Vertiefung 63 ist eine Kreisöffnung 64 mittig angeordnet, durch welche sich Rohr 19 erstreckt. Ein winkelförmiges einstellbares Dichtungs-Stopfbüchsenteil 44 ist in Vertiefung 63 einschraubbar, bis es mit der Oberseite der Abdeckkappe 52 eben liegt. Das Teil 44 weist in seinem Inneren in der Mitte eine konische abgestumpfte Vertiefung 65 auf, wobei eine Lippe 66 nahe dem oberen Ende vorgesehen ist. Die Vertiefung 65 besitzt eine Kreisöffnung 67 mittig in seiner Basis, durch welche das Röhr 19 verläuft.On the upper part of the jacket 24 there is a tightening screw 55, into which a cap 52 is screwed. -The cuvette is sealingly enclosed by jacket 24 and cap 52, namely by means of an O-ring 48 arranged in a recess 62 of the end plate 56 and a seal provided adjacent to the cap 52 51. The closure cap 52 extends partially into the cuvette 23 to form a recess 63. At the base A circular opening 64 is arranged in the middle of the recess 63, through which the tube 19 extends. An angular adjustable Sealing and stuffing box part 44 can be screwed into recess 63 until it is level with the top of cover cap 52 lies. The part 44 has in its interior in the center a conical truncated recess 65, with a lip 66 near the upper end is provided. The recess 65 has a circular opening 67 in the center of its base, through which the tube 19 runs.

3098 26/0 886 .3098 26/0 886.

Um das obere Ende des Rohres 19 herum ist ein Dichtkragen 43 angeordnet und befestigt. Oberhalb des Abdichtkragens 43 und des Rohres 19 befindet sich ein Rohrverbindungs- und Positionierungsstück 41. Das Positionierungsstück 41 weist einen hindurchgehenden Kanal 68 auf, durch den das Rohr 1 in das Rohr 19 eintritt; es ist koaxial mit dem oberen Teil des Rohrs 19 ausgerichtet. Hüllflüssigkeitseinlaßrohr 18 tritt auch in das Positionierstück 41 ein, und durch Kanal 69 gelangt Hüllflüssigkeit in das Rohr 19. Die Einlaßrohre 1 und 18 sind durch ein Abschirmrohr 40 umgeben, welches das Eintreten von elektrischem Rauschen in die Strömungskammer durch Rohr 1 oder Rohr 18 vermeidet. Das Abschirmrohr 40 und das Positionierstück 41 werden in ihrer Lage am oberen Ende des Rohres 19 durch eine Druckverbindungskappe 42 gehalten, die auf den Abdichtring 43 aufschraubbar ist. Ein O-Ring 50 erzeugt eine Abdichtung zwischen Kragen 43 und Positionierstück 41. Bei eingesetztem Rohr 19 sind die Vertiefungen 65 und 67 von der Küvette 23 durch O-Ringe 70 abgedichtet. Die Dichtung dieser 0-Ringe kann durch Ein- oder Ausschrauben.des Dichtungsstopfbüchsenteils 44 gegenüber der Verschlußkappe 52 eingestellt werden; auf diese Weise kann das Rohr 19 je nach Wunsch in die Küvette 23 hineinbewegt oder aus ihr herausgezogen werden. Mit gleichem Abstand sind um das Dichtungsstopfbüchsenteil 44 vier Einstell-Festlegungsschrauben 45 angeordnet, wobei allerdings in Fig. 4 nur eine dieser Schrauben dargestellt ist. Diese Festlegungsschrauben 45 bilden ein zweckmäßiges Mittel zum Ausrichten der öffnung 21 am Ende des Rohres 19 mit der öffnung 59 in Düse 26. Wie bereits oben beschrieben, ist es für die richtige Arbeitsweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung notwendig, daß diese beiden öffnungen genau ausgerichtet sind.A sealing collar 43 is arranged around the upper end of the tube 19 and attached. A pipe connection and positioning piece 41 is located above the sealing collar 43 and the pipe 19. The positioning piece 41 has a through-going one Channel 68 through which the pipe 1 enters the pipe 19; it is coaxially aligned with the top of the tube 19. Sheath fluid inlet tube 18 also enters the positioning piece 41, and sheath fluid enters the tube 19 through channel 69. The inlet pipes 1 and 18 are surrounded by a shield pipe 40 which prevents electrical noise from entering the flow chamber by pipe 1 or pipe 18 avoids. The shield tube 40 and the positioning piece 41 are in their position at the top of the tube 19 is held by a pressure connection cap 42 which can be screwed onto the sealing ring 43. An O-ring 50 is created a seal between collar 43 and positioning piece 41. When the tube 19 is inserted, the recesses 65 and 67 are from the Cell 23 sealed by O-rings 70. The seal of these 0-rings can be done by screwing in or unscrewing the gland part 44 can be adjusted with respect to the closure cap 52; in this way the tube 19 can be placed in the cuvette 23 as desired be moved in or out of it. Equally spaced around the packing gland part 44 are four adjustment fixing screws 45, although only one of these screws is shown in FIG. 4. These fixing screws 45 form a useful means for aligning the Opening 21 at the end of the tube 19 with the opening 59 in the nozzle 26. As already described above, it is necessary for the correct operation of the device according to the invention that these two openings are precisely aligned.

In Fig. 5 ist ein Blockschaltbild der elektrischen und optischen Elemente eines Ausführungsbeispiels der Erfindung dargestellt, die zur schnellen und automatischen Analyse und zum Sortieren abnormaler Zellen aus normalen Zellen zweckmäßig sind. Ein mit der Strömungskammer gekoppelter piezoelektrischer Kristall dient als Vibrations- oder Schwingungsquelle zur Erzeugung von Tröpfchen mit der gewünschten Frequenz. Die in diesem Ausführühgsbeispiel ver-In Fig. 5 is a block diagram of the electrical and optical elements of an embodiment of the invention is shown, the are useful for rapid and automatic analysis and sorting of abnormal cells from normal cells. One with the Flow chamber coupled piezoelectric crystal serves as the Vibration or oscillation source for generating droplets with the desired frequency. The in this exemplary embodiment

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wendete Lichtquelle ist ein Argon-Ionen-Laser, der in geeigneter Weise fokussiert ist, um den Zellenstrom in der Strömungskainitier zu durchschneiden. Der in die Strömungskammer eintretende Lichtstrahl hat normalerweise einen elliptischen Querschnitt, um bei der Analyse der Zellstruktur mittels der resultierenden Lichtstreuung und Fluoreszenz unterstützend zu wirken. Der Laserstrahl ist optisch derart geformt, daß er einen elliptischen Querschnitt am Schnittpunkt von Laserstrahl und Zellenstrom besitzt. Der elliptische Querschnitt erleichtert die Arbeitsweise (Ausrichtung), vergrößert die Signalstärke bei verbesserter Auflösung und gestattet die Kennzeichnung der Zellstruktur (Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis) und die Doppelstückfeststellung. Doppelstücke sind zwei Zellen, die durch die Strömungskammer in Berührung miteinander hindurchlaufen. Für die Volumenmeßvorrichtung erscheinen sie als eine unnormal große Zelle. Um nicht falsche Daten von den Meßvorrichtungen zu erhalten, muß daher irgendwie Vorbeuge getroffen werden.The light source used is an argon ion laser which is appropriately focused to control the flow of cells in the flow to cut through. The light beam entering the flow chamber is normally elliptical in cross-section to at to support the analysis of the cell structure by means of the resulting light scattering and fluorescence. The laser beam is optically shaped in such a way that it has an elliptical cross-section at the intersection of the laser beam and the cell stream. Of the elliptical cross-section facilitates the operation (alignment), increases the signal strength with improved resolution and allows the identification of the cell structure (nucleus-to-cytoplasm ratio) and the double piece locking. Double pieces are two cells that are in contact with each other through the flow chamber walk through. Appear for the volume measuring device her as an abnormally large cell. In order not to receive incorrect data from the measuring devices, it is therefore necessary to take some precautionary measures will.

Ein Argon-Ionen-Laser wird als Lichtquelle deshalb verwendet, weil Krebszellen normalerweise wesentlich mehr DNA enthalten, als normale Zellen, und die Fluoreszenz eines erregten biochemisch an das DNA in der Zelle gebundenen Feulgen-Farbstoffs ist eine quantitative Anzeige für das in der Zelle vorhandene DNA. Der Argon-Ionen-Laser emittiert Licht mit einer Wellenlänge, die zur Erregung dieses Farbstoffs für Fluoreszenz geeignet ist. Die von der Strömungskammer infolge des Zusammenwirkens des Lichtstrahls mit den Zellen kommenden Fluoreszenzimpulse werden durch ein ,Linsensystem auf ein Stecknadelloch und sodann auf eine Fotovervielfacherröhre fokussiert. Das Signal dieser Fotovervielfacherröhre wird verstärkt und einer Mehrparameter-Signalverarbeitungseinheit eingespeist.An argon-ion laser is used as a light source because cancer cells usually contain much more DNA, than normal cells, and the fluorescence of an excited Feulgen dye biochemically bound to the DNA in the cell is one quantitative display of the DNA present in the cell. The argon ion laser emits light with a wavelength that is suitable for exciting this dye for fluorescence. That of the flow chamber as a result of the interaction of the light beam Fluorescence pulses coming with the cells are transmitted through a lens system to a pinhole and then to a Photomultiplier tube focused. The signal from this photomultiplier tube is amplified and a multi-parameter signal processing unit fed in.

Aus der Theorie■ergibt sich, daß die Kleinwinkellichtstreuung (bei Winkel zwischen 0,5 und 2,0°) durch sphärische Teilchen von 5-20 Mikron Durchmesser nahezu proportional dem Volumen ist. Da die meisten Säugetierzellen Durchmesser in diesem Bereich besitzen, ist die Lichtstreuung ein erfolgversprechendes MittelFrom the theory it follows that the small-angle light scattering (at angles between 0.5 and 2.0 °) by spherical particles 5-20 microns in diameter is almost proportional to the volume. As most mammalian cells diameter in this area light scattering is a promising means

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zum Erhalt von Größen- und Struktur-Informationen für einzelne Zellen bei hoher Geschwindigkeit. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird zwischen 0,5 und 2,0° durch die Zellen gestreutes Licht durch ein Sammellinsensystem auf eine Fotodiode geleitet. Um weniger als 0,5 gestreutes Licht wird in eine Strahlenvernichtungsvorrichtung geleitet. Auf diese Weise wird die Fotodiode nicht durch solches Licht überlastet, welches nicht mit dem Zellstrom zusammengewirkt hat. Das Fotodiodensignal wird verstärkt und auch in die Mehrparameter-Signalverarbeitungseinheit eingespeist. to obtain size and structure information for individual cells at high speed. In the preferred embodiment, the cells scatter between 0.5 and 2.0 degrees Light directed through a collecting lens system onto a photodiode. Light scattered by less than 0.5 is fed into a radiation annihilation device directed. In this way, the photodiode is not overloaded by such light, which is not with the cell current has worked together. The photodiode signal is amplified and also fed into the multi-parameter signal processing unit.

Das durch das Durchlaufen einzelner Zellen durch die Coiilter-Volumenmeßöffnung erzeugte Signal hat den Vorteil» daß es bereits seiner Art nach elektrisch ist, so daß es lediglich verstärkt und in die Mehrparameter-Signalverarbeitungseinheit eingespeist werden braucht.This is achieved by the passage of individual cells through the coiilter volume measuring opening The signal generated has the advantage that it is already electrical in its nature, so that it only amplifies and fed into the multi-parameter signal processing unit.

Wie der Name bereits andeutet, verarbeitet die Mehrparameter-Signalverarbeitungseinheit diese Eingangssignale, vergleicht sie mit bestimmten vorgegebenen Standards und erzeugt dann drei Arten von Ausgangssignalen. Ein Signal wird einem Mehrkanal-Impulshöhenanalysator zugeführt, der seinerseits digitale Ausdrucke, eine Impulshohenanalysatoranzexge und Histogramme der Daten erzeugt, die von der Mehrparameter-Signalverarbeitung erhalten wurden. Die Signale von der Verarbeitungseinheit können auch direkt durch eine Oszilliskopanzeige überwacht werden. Schließlich wird eine Ausgangsgröße der Verarbeitungseinheit durch einen Einkanal-Analysator geleitet, und durch Trenn-Logikvorrichtungen und einen Tröpfchenladegenerator, um Tröpfchenladeimpulse zu erfceugen, die zur Trennung ausgewählter Zellen aus dem Zells.trom dienen.Es ist offensichtlich, daß Zeitverzögerungsmittel In Verbindung mit der Mehrparameter-Signalverarbeitungseinheit verwendet werden, um sämtliche Abfühl- oder Meßsignale mit einer speziellen Zelle zu koordinieren.As the name suggests, the multi-parameter signal processing unit processes these input signals, compares them to certain predetermined standards and then generates three types of output signals. A signal is sent to a multichannel pulse height analyzer which in turn generates digital printouts, a pulse height analyzer display and histograms of the data, obtained from the multi-parameter signal processing. The signals from the processing unit can also be sent directly can be monitored by an oscilliscope display. Finally, an output of the processing unit is obtained by a single-channel analyzer and through separation logic devices and a droplet charge generator to generate droplet charge pulses which serve to separate selected cells from the cell stream. It is apparent that time delay means are used in conjunction with the multiparameter signal processing unit to to coordinate all sensing or measurement signals with a special cell.

Die von der Mehrparameter-Verarbeitungseinheit empfangenen Signale können auf verschiedenen Wegen verarbeitet werden, um ihre Abhängigkeit von der gemessenen Eigenschaft zu modifizieren.The signals received by the multi-parameter processing unit can be processed in various ways to modify their dependence on the property being measured.

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Beispielsweise kann ein zum Zellvolumen (r ) proportionales Signal so verarbeitet werden, daß es linear proportional zum ZeIl-For example, a signal proportional to the cell volume (r) can be used processed in such a way that it is linearly proportional to the cell

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radius (r) oder zur Fläche (r ) ist. Weil für jede Meßvorrichtung und für jede Zelle nur ein Datenelement erzeugt wird, ist die zu verarbeitende Datenmenge klein und die an die Elektronik gestellten Erfordernisse sind nicht groß. Durch Verwendung eines zweidimensionalen Impulshöhenanalysators kann eine Zweiparameter-Frequenzverteilung der Zellen erhalten werden. Eine Drei- oder Mehrparameteranalyse erfordert die Datenkapazität eines /kleinen Computers. Als Alternative zur Speicherung sämtlicher Information können dem Analyseschema logische Beschränkungen auferlegt werden, auf welche Weise die Elektronikanforderungen verringert werden. Wenn beispielsweise die Fluoreszenzverteilung sämtlicher Zellen innerhalb eines bestimmten Volumenbereichs gewünscht wird, so kann man dies dadurch erhalten, daß man die Fluoreszenz nur derjenigen Zellen analysiert, die ein Volumensignal entsprechend dem gewünschten Bereich erzeugen. In gleicher Weise kann das Volumen von Zellen innerhalb eines bestimmten Fluoreszenzbereichs erhalten werden. Wenn biologisch nützliche Information erzeugt wird, ist die Analyse auf der Basis von drei oder mehr derartigen logischen Erfordernissen möglich.2
radius (r) or to area (r). Because only one data element is generated for each measuring device and for each cell, the amount of data to be processed is small and the requirements placed on the electronics are not great. By using a two-dimensional pulse height analyzer, a two-parameter frequency distribution of the cells can be obtained. A three- or multi-parameter analysis requires the data capacity of a / small computer. As an alternative to storing all of the information, logical constraints can be placed on the analysis scheme as to how the electronics requirements are reduced. For example, if the fluorescence distribution of all cells within a certain volume area is desired, this can be obtained by analyzing the fluorescence only of those cells which generate a volume signal corresponding to the desired area. In the same way, the volume of cells can be obtained within a certain fluorescence range. When biologically useful information is generated, analysis is possible on the basis of three or more such logical requirements.

Alternativ können die verarbeiteten Signals von mehreren Meßvorrichtungen kombiniert werden als Verhältnisse(oder Summen , Differenzen, usw.) und die Frequenzverteilung der Kombination kann unter einer Population bestimmt werden. Beispielsweise kann durch Verwendung einer RNA-spezifischen Fluoreszenzeinfärbung und durch Meßvorrichtungen für Fluoreszenz und Volumen ein Verhältnis aus den verarbeiteten Signalen gebildet werden, um eine Verteilung der RNA-Dichte unter einer Population von Zellen zu erhalten. In gleicher Weise ergibt sich eine Art Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnis durch Verwendung eines Kern-spezifischen Fluoreszenzfärbemittels, um eine Messung des Kernvolumens und eine Gesamtzellenvolumenmessung durch Streulicht oder die Coulter-Meßvorrichtung zu ergeben.·Alternatively, the processed signals can be from multiple measuring devices can be combined as ratios (or sums, differences, etc.) and the frequency distribution of the combination can be determined under a population. For example, by using an RNA-specific fluorescence staining and by measuring devices for fluorescence and volume a ratio of the processed signals are formed to one Obtain distribution of RNA density among a population of cells. In the same way, there is a kind of nucleus-to-cytoplasm ratio by using a nucleus-specific fluorescent stain to make a measurement of nucleus volume and to give a total cell volume measurement by scattered light or the Coulter measuring device.

/ nftfiß/ nftfiss

Ein logisches und Schalt-Blockdiagrairwi füx eine Mehrparameter-Signalverarbeitungseinheit, die zur Analyse und Sortierung abnormaler Zellen aus normalen Zellen zweckmäßig ist, ist in den Fig. 6 und 7 dargestellt. Die Mehrparameter-Signalverarbeitungseinheit ist die zentrale elektronische Verarbeitungseinheit für Einparameteranalyse, Verhältnisberechnung, Serien- oder Reihen-A logic and switching block diagram for a multi-parameter signal processing unit, which is useful for analyzing and sorting abnormal cells from normal cells is in the 6 and 7 shown. The multi-parameter signal processing unit is the central electronic processing unit for Single parameter analysis, ratio calculation, series or series

.1.1

analyse und darauffolgende Zellsortierung. Grundsätzlich dient die Signalverarbeitungseinheit als eine zentrale analoge elektronische Berechnungszwischeneinheit (Interface) zwischen den Meßvorrichtungen, der Mehrkanal-Impulshöhenanalysiervorrichtung und der Zellen-Trennsteuerung (Einkanal-Analysator; Trennlogik; Tröpfchenladegenerator). Die Signalverarbeitungseinheit erzeugt auch x- und y-Ausgänge für einen Zweiparameter-Impulshöhenanalysator. Verstärkte Signalimpulse (0,4 bis 8,0 Volt) von der Coulter- oder Zellvolumen (CV)-, der Lichtstreuung (LS)- und der Fluoreszenz (FL)-Meßvorrichtung werden direkt in die Verarbeitungseinheit eingespeist. Die Einheit hat gesonderte Eingänge für die Volumen-,Lichtstreuungs- und Fluoreszenz-Signale. Wenn gewünscht, kann ein Fluoreszenz-Signal mit einer zweiten Wellenlänge, beispielsweise rot, an die Stelle des Lichtstreuungseingangssignals gesetzt werden oder ein Großwinkel-Lichtstreuungssignal kann an die Stelle des Fluoreszenzeingangs-Signals gesetzt werden.analysis and subsequent cell sorting. Basically serves the signal processing unit as a central analog electronic intermediate calculation unit (interface) between the Measuring devices, the multi-channel pulse height analyzer and the cell separation controller (single-channel analyzer; separation logic; Droplet charge generator). The signal processing unit also generates x and y outputs for a two parameter pulse height analyzer. Amplified signal pulses (0.4 to 8.0 volts) from the Coulter or cell volume (CV) -, the light scattering (LS) - and the fluorescence (FL) measuring device are fed directly into the processing unit. The unit has separate entrances for the volume, light scatter and fluorescence signals. If desired, a fluorescence signal with a second wavelength, for example red, can be substituted for the light scatter input signal or a large angle light scatter signal can be substituted for the fluorescence input signal.

Die Signalverarbeitungseinheit dient als eine gesteuerte-Signal-Spitze-Meß- und Halt-Vorrichtung, die sowohl zur Einzelverarbeitung und zur Dualverarbeitung der Meßsignale (Abfühlsignale) geeignet ist. Die Verarbeitungseinheit ist in drei Abschnitte eingeteilt: Eingangsbedingungen, Signalverarbeitung und Ausgangsführung, Der Eingangsbedingungsabschnitt (er ist in Fig. 6 dargestellt) besteht aus Betriebsarten- und CV-FL/LS-Verzögerungswählschaltern. Der acht Stellungen aufweisende Betriebsartenschalter gestattet die Einparameter-Zellanalyse, d.h. CV, LS und FL, und die Zweiparameter-Analyse von Zellen, d.h. CV und FL, CV und kein FL, CV und LS, LS und FL und schließlich LS und kein FL. Da das Coulter-Volumensignal sowohl vor den Lichtstreuungs- als auch den Fluoreszenzsignalen ankommt, wird ein variabler (0 bis 190 Mikrosekunden, in Stufen von 10 MikroSekunden) CV-FL/LS-Ver-The signal processing unit serves as a controlled signal peak measuring and stop device which is suitable for both single processing and dual processing of the measurement signals (sensing signals) is. The processing unit is divided into three sections: input conditions, signal processing and output routing, The input condition section (shown in Fig. 6) consists of mode and CV FL / LS delay select switches. The eight position mode switch allows single parameter cell analysis, i.e. CV, LS and FL, and two parameter analysis of cells i.e. CV and FL, CV and no FL, CV and LS, LS and FL and finally LS and no FL. Since that Coulter volume signal arrives before both the light scatter and fluorescence signals, a variable (0 to 190 Microseconds, in steps of 10 microseconds) CV-FL / LS-Ver

_ j y —_ y y -

zögerungsschalter verwendet, um die richtige CV zu FL/LS Signalverzögerung einzustellen. Diese Verzögerung liegt in der Größenordnung von 170 Mikrosekunden. Die Verzögerung braucht nur bei der Zweiparameteranalysebetriebsart verwendet ,werden, wenn das Coulter-Volumen analysiert werden muß.Delay switch used to set the correct CV to FL / LS signal delay to adjust. This delay is on the order of 170 microseconds. The delay only needs when of the two-parameter analysis mode are used when the Coulter volume needs to be analyzed.

Der Signalverarbeitungsabschnitt besteht aus Verhältnis- und Serie (Eingang und Analyse)-Analysewählschaltern (vergleiche Fig. 7). Ein sechs Stellungen aufweisender Verhältniswählschalter gestattet die Berechnung folgender Verhältnisse: CV/FL, CV/LS, FL/CV, FL/LS, LS/CV und LS/FL. Es ist unbedingt erforderlich, daß der Betriebsarten- und Verhältniswählschalter übereinstimmen, beispielsweise befindet sich der Betriebsartenwähler in der LS und FL-Stellung und der Verhältniswähler befindet sich entweder in der LS/FL oder in der FL/LS-Verhältnisstellung. Es ist auch wichtig, daß die CV zu FL/LS-Signalverzögerung verwendet wird, wenn CV enthaltende Verhältnisse berechnet werden. Der Serien- oder sequentielle Analyseahschnitt besteht aus Eingabe- und Analysewählschaltern (jeder mit vier Stellungen). Der Serieanalyse-Eingabewählschalter wählt entweder CV, FL, LS oder Verhältnissignale, die einem externen Einkanal-Impulshöhenanalysator (Serie SCA) zugeführt werden. Wenn die Signalamplitude in eine am SCA-Fenster voreingestellte variable Breite (0,4 bis 8,0 Volt) fällt, wird ein SCA-Triggerimpuls erzeugt und an die Signalverarbeitungseinheit zurückgeführt, wodurch das Serieana- ^J lyse-Analyselineargatter getastet wird, so daß entweder das CV, FL, LS oder Verhältnis-Signal analysiert wird, wie dies durch den Serieanalyse-Analysewählschalter bestimmt ist. Sowohl die Serieanalyseeingangs- als auch die Analyse-Wählstellungen (CV, FL, LS und Verhältnis) müssen - wenn immer erforderlich - mit der Betriebsart, der CV-Fl/LS-Verzögerung und den Verhältniswählschaltern übereinstimmen, und zwar beispielsweise Serieanalyseeingang-CV, Serieanalyseanalysierung-FL, Betriebsart-CV und FL, CV-FL/LS-VerzÖgerung'-v' 180 ^sek und Verhältnis-Aus.The signal processing section consists of ratio and series (input and analysis) analysis select switches (see Fig. 7). A six position ratio dial allows the calculation of the following ratios: CV / FL, CV / LS, FL / CV, FL / LS, LS / CV, and LS / FL. It is imperative that the mode and ratio selector switches match, for example the mode selector is in the LS and FL position and the ratio selector is either in the LS / FL or the FL / LS ratio position. It is also important that the CV to FL / LS signal delay be used when calculating ratios containing CV. The serial or sequential analysis section consists of input and analysis selection switches (each with four positions). The series analysis input selector switch selects either CV, FL, LS or ratio signals to be fed to an external single channel pulse height analyzer (SCA series). If the signal amplitude falls within a preset at SCA window variable width (0.4 to 8.0 volts), a SCA-trigger pulse is generated and fed back to the signal processing unit, whereby the Serieana- ^J lysis analysis linear gate is scanned, so that either the CV, FL, LS, or ratio signal is analyzed as determined by the series analysis analysis selector. Both the series analysis input and analysis selection positions (CV, FL, LS and ratio) must - whenever necessary - match the operating mode, the CV FL / LS delay and the ratio selection switches, for example series analysis input CV, series analysis -FL, mode-CV and FL, CV-FL / LS-delay'-v '180 ^ sec and ratio-off.

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Der Ausgangsführungsabschnitt (vergleiche Hg. 7) besteht aus einem Pulshöhenanalysator (PHA)-Eingang, einem Separator- oder Trenneingang und aus Zweiparameteranalysatoreingangswählschaltern. Der PHA-Eingang kann einzelne Parameter (CV, LS oder FL), Verhältnisse, Serieanalyseeingang und Analyseparameter zur externen Weiterführung an einen Mehrkanal-Impulshöhenanalysator auswählen, wohingegen der Separator-Eingangswähler einzelne Parameter, Verhältnisse oder Serieanalyse-Analysatorsignale der Separatorsteuerung zuführen kann. Der Zweiparameterimpulshöhenanalysatorwählschalter erzeugt folgende Ausgangsgrößen: CV -FL , CV -LS ,The exit guide section (see Ed. 7) consists of a pulse height analyzer (PHA) input, a separator or isolation input, and two-parameter analyzer input selectors. The PHA input can control individual parameters (CV, LS or FL), ratios, Select serial analysis input and analysis parameters for external continuation to a multi-channel pulse height analyzer, whereas the separator input selector individual parameters, ratios or can feed series analysis analyzer signals to the separator control. The two parameter pulse height analyzer selector switch generates the following output variables: CV -FL, CV -LS,

LS -FL , CV -Verhältnis , FL -Verhältnis und LS -Verhältnis , xyx yx y χ yLS-FL, CV-ratio, FL-ratio and LS-ratio, xyx yx y χ y

wobei sich die Indizes χ und y auf die χ und y Achsen des Zweiparameter-PHA beziehen. Durch Vertauschen der χ und y Achseneingänge können die obigen Größen umgekehrt werden.where the indices χ and y refer to the χ and y axes of the two-parameter PHA relate. By swapping the χ and y axis inputs, the above values can be reversed.

Reihenfolge des Arbeitsablaufs:Sequence of the workflow:

Die zu untersuchenden Zellpopulationen werden zunächst eingefärbt (fluoreszente Feulgen-Färbemittel, usw.)und in eine wässerige Suspension, wie beispielsweise eine normale Salzlösung, gebracht. Gebundene und ungebundene Zellen können gemessen werden. Bevor die Zellsuspension im Zellreservoir untergebracht wird, wird sie durch ein 60-70 Mikron Nylonmaschensieb gefiltert, um größere Verunreinigungen und Klumpen zu entfernen. Die Elektronik befindet sich dabei bereits in Bereitschaftsstellung, das System steht unter Druck und der Laser ist eingeschaltet. Vor den Zellmessungen wird das System ausgerichtet und eingestellt. Wenn das Sortieren der Zellen erforderlich ist, muß der den piezoelektrischen Kristall oder einen äquivalenten Wandler elektrisch antreibende Tröpfchengeneratoroszillatorverstärker eingeschaltet werden. Die Tröpfchenbildung wird durch Beleuchtung des austretenden Flüssigkeitsstrahls nahe der Strömungskammer mit einem stroboskopischen Licht oder einer äquivalenten Lichtquelle überprüft. Das Stroboskoplicht wird synchron mit der Oszillatorfrequenz aufgeblitzt. Die Tröpfchenausbildung kann dann unter Verwendung eines Mikroskops beobachtet werden. Für einen gegebenen Düsendurchmesser und eine gegebene Strömungsgeschwindigkeit kann die Tröpfchenausbildung durch Veränderung der an den piezoelektrischen Kristall angelegten SpannungThe cell populations to be examined are first colored (fluorescent Feulgen stains, etc.) and in an aqueous one Suspension, such as a normal saline solution. Bound and unbound cells can be measured. Before If the cell suspension is housed in the cell reservoir, it is filtered through a 60-70 micron nylon mesh screen to remove larger Remove impurities and lumps. The electronics are already in standby mode, the system is below Print and the laser is on. The system is aligned and adjusted before the cell measurements. When sorting of the cells is required, the droplet generator oscillator amplifier electrically driving the piezoelectric crystal or equivalent transducer is required be switched on. The droplet formation is achieved by illuminating the emerging jet of liquid checked near the flow chamber with a stroboscopic light or equivalent light source. The strobe light is flashed synchronously with the oscillator frequency. The droplet formation can then be observed using a microscope will. For a given nozzle diameter and a given flow rate, the droplet formation can be changed by changing the voltage applied to the piezoelectric crystal

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und Frequenz geändert werden. Typiscne Werte sind 15 Volt_ef£ (sinusförmig) bei 40 bis 50 kHz. Die Tröpfchenladeelektrode ist zu beiden Seiten des Punktes der Tröpfchenausbildung (Trennung) angeordnet, und zwar ungefähr 5/16 Zoll (5/16 χ 2,54 cm) unterhalb der Strömungskammer, um maximale Tröpfchenaufladung sicherzustellen. Typische Ladeimpulse haben 50 Volt bei 100 bis 200 MikrοSekunden. Die elektrostatischen Ablenkplatten sind 2-3 Zoll (5,08cm - 7,62cm) unterhalb der Strömungskammer angeordnet und weisen einen Abstand von 1/2 Zoll bis 3/4 Zoll auf. An die Ablenkplatten ist normalerweise ein Differential von 15kV Gleichspannung angelegt. Ein Probensammlungsbecher oder ein anderes geeignetes Sammlungssystem ist 8 bis 9 Zoll von der Strömungskammerausgangsseite leicht versetzt gegenüber dem (ungeladenen) Hauptstrahl angeordnet, so daß nur die (geladenen) abgelenkten Tröpfchen gesammelt werden. Wenn das Aussortieren von Zellen nicht erwünscht ist, dann kann.die obige Verfahrensweise wegelässen werden.and frequency can be changed. Typical values are 15 volts _e f £ (sinusoidal) at 40 to 50 kHz. The droplet charging electrode is positioned on either side of the point of droplet formation (separation) approximately 5/16 in. (5/16 χ 2.54 cm) below the flow chamber to ensure maximum droplet charging. Typical charging pulses are 50 volts at 100 to 200 microseconds. The electrostatic baffles are located 2-3 inches (5.08cm - 7.62cm) below the flow chamber and are 1/2 "to 3/4" apart. A 15kV DC differential is normally applied to the baffles. A sample collection cup or other suitable collection system is positioned 8 to 9 inches from the flow chamber exit side slightly offset from the main (uncharged) jet so that only the deflected (charged) droplets are collected. If the sorting out of cells is not desired, then the above procedure can be omitted.

Die suspendierten Zellen werden in einem unter Druck stehenden (23,4 psi, d.h. englischen Pfund pro Quadratzoll) Zellreservoir angeordnet. Die unter Druck stehende Hiallflüssigkeit Nr. 1 (24,0 psi) und die Hüllflüssigkeit Nr. 2 (20,0 psi) werden angestellt und man erreicht eine ordnungsgemäße Tröpfchenbildung, wenn Sortieren erwünscht ist. Die Hüllflüssigkeit Nr. 1 hat ohne Zellströmung eine Strömungsgeschwindigkeit von 0,3 Milliliter pro Minute. Die Strömungsgeschwindigkeit der Hüllflüssigkeit Nr. 2 ist annähernd 3,9 Milliliter pro Minute, Die Gesamtströmungsrate durch die 86 Mikron Durchmesser-Austrittsdüse ist somit 4,2 Milliliter pro Minute. Für einen typischen Zellstromdurchmesser von ungefähr 20 Mikron entspricht der Zellreservoirdrück von 23,4 psi einer Zellenströmungsgeschwindigkeit von ungefähr 0,08 ml/Min. Die Strömungsgeschwindigkeit des Zellstrojnes kann leicht von 0 bis 0,3 ml/Min (100%) eingestellt werden, und zwar durch Einstellung des Zellreservoirdrucks bezüglich des Reservoirdrucks (- 0,2 psi) für die Hülle Nr.2, wobei der Reservoirdruck für die Hülle Nr. 1 fest bleibt. Normalerweise bleibt der Druck für Hülle Nr. T relativ zum Druck für Hülle Nr. 2 fest, kann jedoch, wenn gewünscht, verändert werden. Erhöht man den Druck fürThe suspended cells are placed in a pressurized (23.4 psi) cell reservoir arranged. The # 1 pressurized hall fluid (24.0 psi) and Sheath Fluid # 2 (20.0 psi) are turned on and proper droplet formation is achieved when sorting is desired. The shell liquid no. 1 has no Cell flow a flow rate of 0.3 milliliters per minute. The flow velocity of the shell liquid no.2 is approximately 3.9 milliliters per minute. The total flow rate through the 86 micron diameter exit nozzle is thus 4.2 milliliters per minute. For a typical cell flow diameter of about 20 microns, the cell reservoir pressure of 23.4 psi corresponds to a cell flow rate of about 0.08 ml / min. The flow velocity of the cell stream can easily vary from 0 to 0.3 ml / min (100%) can be set by adjusting the cell reservoir pressure in relation to the reservoir pressure (- 0.2 psi) for shell # 2, with the reservoir pressure remaining fixed for shell # 1. Usually the pressure stays for Sleeve # T is fixed relative to the pressure for sleeve # 2, but can be changed if desired. If you increase the pressure for

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Hülle Nr. 1 relativ zu Hülle Nr. 2, so sirJ;t die Durchgangszeit für die Zellen durch die Strömungskairaner ab. Wenn das Proben-an/aus-Ventil eingeschaltet wird, laufen Zellen vom Zellreservoir über das Probeneinlaßrohr in die Strömungskairaner. Das Einlaßrohr dient als Coulter-Volumensignalelektrode. Vom Einlaßrohr laufen Zellen durch die Volumenineßöffnung (75 Mikron Durchmesser öffnung), wo das Zellvolumen gemessen wird. Es können auch Meßöffnungen mit anderen Größen verwendet werden. Eine teilchenfreie Hülle (Hülle Nr. 1) fließt koaxial um das Probeneinlaßrohr herum und dient zur mittigen Ausrichtung des Zellstroms, wenn er durch die Volumenmeßöffnung tritt, auf welche Weise die Auflösung der Zellvolumen- und Fluoreszenz-Lichtstreuraessungen verbessert wird. Typische Öffnungsgleichströme von der Volumensignalelektrode durch die öffnung können zwischen 0,05 und 1,0 mA eingestellt werden. Der Öffnungsstrom und der Verstärkungsfaktor können derart eingestellt werden, daß sich Volumensignalimpulse (0,4 bis 8,0 Volt) ergeben, die ihrerseits dem CV Eingang der Mehrparametersignalverarbeitungseinheit eingespeist werden. Die typische Volumensignalanstiegszeit beträgt ungefähr 20 Mikrosekunden, wobei die Impulsbreiten 40 Mikrosekunden sind.Shell # 1 relative to shell # 2, then sirJ; t the transit time for the cells through the flow kairaner. If that When the sample on / off valve is turned on, cells drain from the cell reservoir via the sample inlet tube into the flow kairaner. The inlet tube serves as a Coulter volume signal electrode. From the inlet pipe cells pass through the volume inlet (75 microns diameter opening), where the cell volume is measured. Measurement openings of other sizes can also be used. One particle-free envelope (envelope no. 1) flows coaxially around the sample inlet tube and serves to center the cell flow, when it passes through the volume measurement port, how the resolution of the cell volume and fluorescence light scatter measurements is improved. Typical opening direct currents from the volume signal electrode through the opening, between 0.05 and 1.0 mA can be set. The opening current and the gain factor can be set in such a way that volume signal pulses (0.4 to 8.0 volts), which in turn are fed into the CV input of the multi-parameter signal processing unit. the typical volume signal rise time is approximately 20 microseconds with the pulse widths being 40 microseconds.

Nach Erregung der Volumenmeßöffnung schneiden die Zellen den Laserstrahl und erzeugen dabei Lichtstreuung und Fluoreszenz. Typische Verzögerungszeiten zwischen» dem Beginn der Coulter-Volumenmessung und dem Fluoreszenz/Lichtstreu-Impuls liegen in der Größenordnung von 160 bis 180 Mikrosekunden. Die elektrooptisehen Fluoreszenz- und Lichtstreu-Impulse werden verstärkt »0,4 bis 8,0 Volt) und den entsprechenden Eingängen an der Signalverarbeitungseinheit zugeführt. Typische Anstiegszeiten liegen in der Größenordnung von 1 bis 2 Mikrosekunden, wobei die Impulsbreiten ungefähr 5 Mikrosekunden sind. Eine zweite teilchenfreie Hüllflüssigkeit (Hülle Nr. 2) aus einer normalen Salzlösung dient zur Verminderung der Wirkung des Druckabfalls, der durch die Coulter-Meßöffnung erzeugt wird.After excitation of the volume measuring opening, the cells cut the laser beam and generate light scattering and fluorescence. Typical delay times between »the start of the Coulter volume measurement and the fluorescence / light scattering pulse are on the order of 160 to 180 microseconds. The electrooptic Fluorescence and light scattering pulses are amplified (0.4 to 8.0 volts) and the corresponding inputs on the signal processing unit fed. Typical rise times are on the order of 1 to 2 microseconds with the pulse widths are approximately 5 microseconds. A second particle-free shell liquid (shell no. 2) made from a normal saline solution is used to reduce the effect of the pressure drop created by the Coulter orifice.

Wenn die Eigenschaften der Zelle gemessen sind, verläßt diese die Strömungskammer über die Austrittsdüse, und zwar in einemWhen the properties of the cell have been measured, it leaves the flow chamber via the outlet nozzle, all in one

Flüssigkeitstropfchen, der darauffolgend getrennt werden kann. Die angenäherte Verzögerungszeit zwischen der Zellmessung und der Tropfenausbildung liegt in der Größenordnung von 1400 Mikrosekunden. Liquid droplet that can then be separated. The approximate delay time between the cell measurement and the drop formation is on the order of 1400 microseconds.

Die von den Volumen-, Lichtstreuungs- und Fluoreszenz-Meßvorrichtungen und Verstärkern kommenden Signale werden also zum Zwecke der darauffolgenden Analyse und Weiterführung in die Mehrparametersignalverarbeitungseinheit eingespeist. Die Verarbeitungseinheit dient als eine Zwischenstufe (Interface) zwischen dem Mehrkanalimpulshöhenanalysator, der Zellentrennlogik und dem Tröpfchenaufladgenerator/ sowie dem (in Fig. 5 nicht gezeigten) Zweiparameter-Impulshöhenanalysator. Die Signalverarbeitungseinheit muß in der richtigen Weise - wie oben erwähnt - aufgebaut sein, und zwar abhängig von den Anforderungen an jeden Versuchslauf. Those of the volume, light scattering and fluorescence measuring devices and amplifiers coming signals are so for the purpose of the subsequent analysis and continuation in the Multi-parameter signal processing unit fed. The processing unit serves as an intermediate stage (interface) between the multi-channel pulse height analyzer, the cell separation logic and the droplet charging generator / as well as the (not shown in Fig. 5) Two parameter pulse height analyzer. The signal processing unit must be set up in the right way - as mentioned above - depending on the requirements of each test run.

Bei einem typischen Versuch zur Analyse und zum Heraussortieren abnormaler Zellen aus einer gegebenen Populationsmischung, kann eine Anzahl unterschiedlicher Lösungsmöglichkeiten sinnvoll sein. Der Mehrkanalimpulshöhenanalysator würde als erstes zur Anzeige von Frequenzverteilungshistogrammen von einzelnen Parametern (Volumen, Lichtstreuung und Fluoreszenz), Verhältnissen von Parametern oder möglicherweise zur Serienanalyse von Parametern verwendet werden, wie beispielsweise der Analyse der Fluoreszenz für einen gegebenen Zellvolumenbereich, usw. Der Dual- oder Zwei-Parameteranalysator könnte auch zur Analyse verschiedener Zweiparameterfrequenzverteilungshistogramme benutzt werden, die erforderlich sein können. Es ist möglich, aus der Mehrkanal-PHA-Anzeige oder aus der Zweiparameter-PHA-Anzeige, oder aus beiden Anzeigen, Abnormalitäten aus verschiedenen Histogrammen herauszulesen, beispielsweise ein abnormal großes Kern-zu-Zellenvolumen-Verhältnis. Aus dieser Art Information kann der Zelltrennungslogik-Tröpfchenladegenerator in die Lage versetzt werden, um diese Zellen mit fraglichen Eigenschaften für eine mikroskopische Überprüfung und Identifikation auszusortieren. Der untere und obere Schwellpegel des Einkanalimpulshöhenanalysators (SCA) ist derart eingestellt, daß er Impulsamplituden (Verhältnisse, usw.) vonIn a typical attempt to analyze and sort out abnormal cells from a given population mix, a number of different possible solutions may be useful. The multichannel pulse height analyzer would be the first to display of frequency distribution histograms of individual parameters (volume, light scattering and fluorescence), ratios of parameters or possibly used for series analysis of parameters, such as the analysis of fluorescence for a given cell volume range, etc. The dual or two parameter analyzer could also be used to analyze various two-parameter frequency distribution histograms that may be required. It is possible from the multi-channel PHA display or from the two-parameter PHA display, or from both displays, reading abnormalities from different histograms, for example, an abnormally large nucleus to cell volume ratio. From this type of information the cell separation logic droplet charge generator can will be able to retrieve these cells with questionable properties for microscopic examination and sort out identification. The lower and upper threshold levels of the single channel pulse height analyzer (SCA) are such set that it has pulse amplitudes (ratios, etc.) of

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Zellen mit abnormalen Eigenschaften aufniitiiut. Der SCA löst den Tröpfchenladegenerator dann aus, der einen verzögerten (1400 Mikrosekunden) Tröpfchenladeimpuls (50 Volt Spitze bei 100 bis 200 Mikrosekunden) erzeugt. Wenn einmal die Abnormalitätseigenschaften erhalten sind,braucht es nicht mehr erforderlich sein, die abnormalen Zellen herauszusortieren, um sie dann unter einem Mikroskop zu überprüfen; vielmehr ist nur eine weitere Automatisierung des Analyseverfahrens erforderlich, um die schnelle Krankheitsdiagnose zu fördern.Cells with abnormal properties. The SCA solves the The droplet charge generator then emits a delayed (1400 microsecond) droplet charge pulse (50 volts peak at 100 to 200 Microseconds). Once the abnormality characteristics are preserved, it need no longer be the abnormal ones Sort out cells for examination under a microscope; rather, it is just another automation of the analytical process is required to aid in the rapid diagnosis of disease.

Die Optimale Arbeitsweise läge dann vor, wenn sämtliche Zellen einzeln durch die Volumenmeßöffnung und den Lichtstrahl laufen würden, und wenn nur eine Zelle in jedem Tröpfchen gefangen wäre. In der Praxis ist dies äußerst schwer zu erreichen. Die Zellen sind häufig im Zellstrom mit großem Abstand voneinander angeordnet, so daß zahlreiche Tröpfchen keine Zellen enthalten. Dies stellt jedoch kein besonderes Problem dar; wenn jedoch zwei Zellen sich regelrecht berühren (und somit ein Doppelstück bilden) oder so benachtbart zueinander angeordnet sind, daß die Meßvorrichtungen nicht zwischen ihnen unterscheiden können, dann zeigen die Meßdaten abnormale Zellen an und ein Sortiersignal wird geliefert. Wenn, was bei der normalen Population von Zellen wahrscheinlich ist, das Doppelstück lediglich aus zwei normalen Zellen besteht, so hat dies eine Verdünnung der Reinheit der sortierten Probe zur Folge. Große Aufmerksamkeit bei der Probenzubereitung kann das Vorhandensein von Doppelstücken wesentlich reduzieren, und die Verwendung von Diskriminationsverfahren vermindert fehlerhafte Sortiersignale infolge des Vorhandenseins solcher Doppelstücke oder dicht benachbarter Zellen; beides bringt jedoch einen erhöhten Zeit- und Kostenbedarf bei der Analyse und beim Sortieren mit sich. Aus pragmatischen Erwägungen ist es daher häufig zweckmäßig, einen bestimmten kleinen Prozentsatz von Doppelstücken und dicht benachbarten Zellen zu den abnormalen Zellen aussortieren zu lassen. Obwohl auf diese Weise die Reinheit der sortierten Probe vermindert wird, behindert dies jedoch nicht die Analyse der Probe zu stark. Typischerweise werden 90% oder mehr der Zellen einzeln in Tröpfchen isoliert. D.h. also, 90% oder mehr der Zellen enthaltenden Tröpfchen enthalten nur eine einzige Zelle.The optimal way of working would be if all cells would pass through the volumetric orifice and the light beam individually, and if only one cell were trapped in each droplet. In practice this is extremely difficult to achieve. The cells are often arranged in the cell stream with a large distance from each other, so that numerous droplets contain no cells. However, this is not a particular problem; however, if two cells are apart literally touch (and thus form a double piece) or are arranged adjacent to one another that the measuring devices cannot distinguish between them, the measurement data indicates abnormal cells and a sorting signal is provided. If, as is likely with the normal population of cells, the duplicate consists of just two normal cells, this results in a dilution of the purity of the sorted sample. This can take great care when preparing the sample Significantly reduce the presence of duplicates and reduce the use of discrimination methods erroneous sort signals due to the presence of such duplicates or closely spaced cells; however, both bring an increased time and cost requirement for analysis and sorting. It is therefore for pragmatic reasons often expedient to add a certain small percentage of duplicates and closely spaced cells to the abnormal cells to be sorted out. Although this reduces the purity of the sorted sample, it does not hinder it Analysis of the sample too strong. Typically 90% or more of the cells are isolated individually in droplets. I.e. 90% or more of the Droplets containing cells contain only a single cell.

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Claims

Device for quick analysis and sorting small Particles on the basis of selected properties or combinations of selected properties, identified through the following elements:

a) A flow chamber (3),

b) a high intensity light source (4),

c) means for introducing particles in suspension in a fluid into the flow chamber (3),

d) Multiple measuring or sensing means for determining preselected physical and chemical properties of the particles in the flow chamber (3) and for generating analog electrical / properties related Sizes,

e) Comparison means for comparing the analog electrical quantities with selected standard values for these properties or for combinations of these properties and for generating an electrical sorting signal if the sizes or the combinations of these sizes are outside the preselected standard values,

f) means for ejecting the fluid from the flow chamber (3),

g) means for periodically perturbing the beam for the purpose of Creation of uniformly sized droplets sufficiently small that essentially every particle is isolated in a single droplet,

h) adjacent to the jet path at the droplet separation or separation zone arranged electrical charging means (5),

i) electrical delay means, whereby the sorting signal activates the electrical charging means when a Particles with properties outside the preselected standard values are located in the droplet separation zone, where the charging means remain in their inactive state if the sorting signal is not received,

j) electrical deflection means (8) for deflecting the charged droplets into a separate vessel so as to separate them from the uncharged ones Separate droplets.

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2. Apparatus according to claim 1, d & Juich characterized in that the selected chemical and physical properties are small angle scattering, fluorescence and volume.

3. Apparatus according to claim 1, characterized in that the flow chamber has the following elements:

a) Means to move the particles along a narrow stream of the fluid with the flow passing through a first zone with a Coulter volume measuring orifice (21), in which is the measurement of the change in impedance produced by the passage of each particle, and where the current through a second zone, designated as an observation zone, is running, in which the current cuts a beam of light from the high intensity light source,

b) an access opening for the entry of the light beam into the observation zone,

c) Multiple observation openings for observation and measurement the optical properties of the particles, eventually the fluid passing through a nozzle at the base of the flow chamber is sprayed out,

4. Apparatus according to claim 3, characterized in that the high-intensity light source is a laser.

5. Apparatus according to claim 3, characterized by delay means for delaying the electrical analog signal which is transmitted by the passage of each particle through the volume measuring opening is generated, and to correlate it with the analog electrical signals emitted by the same particle through the optical measuring devices are produced,

6. Apparatus according to claim 5, characterized in that the optical measuring device or means comprise a photodiode and a photomultiplier tube.

7. Apparatus according to claim 3, characterized in that

the means which cause the particles to travel along a narrow stream of the fluid include the following elements-

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point:

a) A sample inlet tube for introducing the particles in suspension in the fluid into the flow chamber, wherein the sample inlet tube extends a substantial amount into the flow chamber,

b) a first sheath liquid inlet tube which is the sample inlet tube concentrically and extends somewhat beyond the sample inlet tube into the flow chamber, wherein the first sheath liquid inlet tube at

. its lower end has a nozzle in which the volume measuring opening is arranged, whereby said particles when leaving the sample inlet tube surrounded by a coaxial laminar flow of the sheath liquid , which latter has a sufficiently high speed to increase the flow of the particles in suspension to constrict a stream of a desired diameter and to surround the stream substantially coaxially when it is runs through the volume measuring opening.

8. Apparatus according to claim 7, characterized in that the observation zone is surrounded by a reservoir of the sheath liquid with the reservoir extending substantially above the observation zone.

9. Apparatus according to claim 8, characterized in that the reservoir is fed by a second sheath liquid inlet tube.

10. The device according to claim 9, characterized in that the second sheath liquid inlet tube is close to the base of the reservoir extends, the latter having a flushing opening at its upper end, through which in the Reservoir generated gases can be purged periodically or continuously.

11. The device according to claim 10, characterized in that the sample inlet tube serves as an electrode for the volume measuring port, and that the second sheath liquid inlet tube

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as the second electrode for -3ie Meßöffmmg dieot.

12. The device according to claim 9, characterized by means for controlling the pressures of the liquids that are in the Flow channels through the sample inlet tube, the first sheath liquid inlet tube and enter the second sheath liquid inlet tube.

13. Apparatus according to claim 12, characterized in that the pressures are controlled differentially.

14. The device according to claim 9, characterized in that the means for periodically perturbing the beam is a piezoelectric Have crystal, which is coupled to the flow channel and vibrates at the desired frequency.

15. The device according to claim 9, characterized in that the nozzle in the base of the flow chamber in the reservoir extends into, in the vicinity of the plane of the observation zone, wherein means are provided around the volume measuring opening align with the opening in the nozzle.

16. The device according to claim 15, characterized in that the alignment means have a plurality of adjusting screws, those evenly spaced around the first sheath fluid inlet are arranged around outside the flow chamber, whereby the first sheath liquid inlet tube is rotated about an axis which is partially disposed within the reservoir.

17. Device according to one or more of the preceding claims, characterized by generator means for generating a first electrical signal proportional to the volume of each cell, by measuring means for measuring the spread of the Laser light and to generate a second electrical signal proportional to the amount of scattering, through and fluorescent light measuring means for generating a third electrical signal proportional to the amount of the

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fluorescent light, by Mattel? to delay the first electrical signal and correlation this signal for each cell with the second and third signals generated by that same cell, and by comparison means, around these signals or combinations of these signals with predetermined ones, regarded as normal To compare value ranges and to generate an electrical sorting signal when one of the signals or combinations of the signals lie outside the predetermined range of values.