JPS6080764A - Method and device for identifying microparticle - Google Patents
Method and device for identifying microparticleInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は細胞、細胞内の高分子等の生体粒子又は有機高
分子等の微小粒子を識別(区分又は選別)する方法およ
び該方法を実施する装置に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Technical Field The present invention relates to a method for identifying (sorting or sorting) cells, biological particles such as intracellular macromolecules, or microparticles such as organic macromolecules, and an apparatus for carrying out the method.
更に詳しくは連続的に流動している懸濁液中の微小粒子
にレーザー光等の強光線のA’ルス光を照射してその粒
子から螢光や燐光等≠#を発光せしめその特定波長毎の
発光強度の時間変化又は発光スペクトルの時間変化を迅
速かつ自動的に測定、演算して微小粒子を識別する方法
およびその装置に関する。More specifically, microparticles in a continuously flowing suspension are irradiated with strong A' las light such as laser light, causing the particles to emit fluorescence, phosphorescence, etc. The present invention relates to a method and an apparatus for identifying microparticles by quickly and automatically measuring and calculating temporal changes in the emission intensity or emission spectrum of a particle.
従来技術
細胞学の分野においては、細胞の自動分析および分別の
要求が増大しつつある。現在、細胞標本のスクリーニン
グ、例えばガン細胞又は悪性細胞の発見は主として2種
またはそれ以上の方法によってなされている。先ず最初
に細胞サンプルは視覚的にスクリーニングされて、異常
細胞を含有していると思われる細胞サンプルが捜し出さ
れる。BACKGROUND OF THE INVENTION In the field of cytology, there is an increasing demand for automated analysis and sorting of cells. Currently, screening of cell specimens, such as the detection of cancer cells or malignant cells, is mainly done by two or more methods. First, the cell sample is visually screened to look for cell samples that are suspected of containing abnormal cells.
これらの細胞サンプルは保管され細胞検査技師又は病理
学者等の専門家によってその細胞が真にガン細胞である
か否かの判断を下す。このような方法は現在のところ適
切に行なわれてはいるが、多くの欠点を有している。す
なわち手間がかかシ、非常な熟練を要するために高価な
ものとなり更に異常性の判断の基準は大部分主観的なも
のであるため定量的でない。又、時間と費用のために、
この方法を美大な数のサンプルに対して適用することは
困難である。These cell samples are stored and experts such as cytotechnologists or pathologists determine whether the cells are truly cancer cells or not. Although such methods currently work well, they have a number of drawbacks. In other words, it is time-consuming and expensive because it requires great skill, and the criteria for determining abnormality are mostly subjective and therefore not quantitative. Also, due to time and cost,
It is difficult to apply this method to a large number of samples.
流動システム分析法は、生体微小粒子の分析の場合、フ
ローサイトメトリ(Flow Cytometry)と
称されるが、この流動システム分析法と称される方法は
、以上の欠点を幾分でも克服することのできる可能性を
もっている方法である。70−ザイトメトリーは、細胞
懸濁液から光学的、電気的信号を検出し、細胞の性質、
構造を解明する方法である。これに基づくフローサイト
メーター(Flow Cy’tometer )は、小
さな検出容量内を高速で流れる細胞懸濁液に光を照射し
、細胞からの光学信号や電気信号を検出し解析する装置
である。In the case of analysis of biological microparticles, the flow system analysis method is called flow cytometry, and this method has the advantage of overcoming some of the above drawbacks. This is a method that has the potential to work. 70-Zytometry detects optical and electrical signals from cell suspensions to determine cell properties,
This is a method to elucidate the structure. A flow cytometer based on this is a device that irradiates light onto a cell suspension flowing at high speed within a small detection volume to detect and analyze optical and electrical signals from the cells.
これによれば多数の細胞を短時間に観察して正常細胞と
異常細胞を識別することができ、従って自動的な細胞の
スクリーニングを迅速に行なうことができる可能性があ
る〇
照射光としては連続のレーザ光が通常用いられ、細胞を
観察するために使用されるi4ラメ−ターは、例えば細
胞の大きさのみのように単一のものでは不十分であるこ
とが知られておシ、今日ではこの外、細胞の光吸収・螢
光・光散乱あるいはそれらの組合せがパラメーターとし
て用いられるようになってきている。ここに、パラメー
ターが例えば細胞の大きさであるというのは、正常細胞
と異常+tlE胞とで細胞の大きさが異なる場合に、細
胞の大きさを観察して、正常のものと異常のものとを識
別することをいう。細胞の大きざの比較だけでは正常の
ものと異常のものとが識別できないような種類の細胞の
場合には、他の識別できるようなパラメーターが使用さ
れるわけである。しかして、多くのパラメーターを使用
することによってスクリーニングの精度が上ることとな
る。According to this method, it is possible to distinguish between normal cells and abnormal cells by observing a large number of cells in a short time, and therefore it is possible to quickly perform automatic cell screening.〇The irradiation light is continuous. It is known that a single i4 meter, such as the size of a cell, is insufficient for observing cells. In addition to these, cellular light absorption, fluorescence, light scattering, or a combination thereof has come to be used as a parameter. Here, the parameter is, for example, cell size, because if the cell size is different between normal cells and abnormal + tlE cells, the cell size can be observed and the cells can be distinguished from normal and abnormal. It means to identify. In the case of cell types for which it is impossible to distinguish between normal and abnormal cells by comparing cell size alone, other parameters are used that allow for differentiation. Therefore, the accuracy of screening increases by using many parameters.
更に、細胞からの光学信号、電気信号を検出、区分する
にとどまらず、信号解析により細胞のグループ分け、例
えば正常細胞のグループと異常細胞のグループへのグル
ープ分け、のできるように振り分ける機能をもつ装置も
セルソーター(Ce l 1Sortor )と呼ばれ
実用化されている。Furthermore, it not only detects and classifies optical and electrical signals from cells, but also has the function of dividing cells into groups, such as normal cells and abnormal cells, by signal analysis. The device is also called a cell sorter and has been put into practical use.
以上のフローサイトメトリーおよびセルソーターについ
ては、例えば電子技術総合研究所業報第44巻第3号(
1980年)に野口によって報告され、セルソーターに
ついては特公昭46−27118号、特公昭56−13
266号公報にも記載されている。Regarding the above flow cytometry and cell sorter, for example, Electronic Technology Research Institute Business Bulletin Vol. 44 No. 3 (
Noguchi reported the cell sorter in 1980), and the cell sorter was published in Special Publication No. 46-27118 and Special Publication No. 56-13.
It is also described in Publication No. 266.
フローサイトメーターを用いる流動システム分析法は、
顕微鏡下又は試料セルにおける細胞分析とは異なり細胞
を流しながら、特定の性質をもつ細胞を、短時間に、大
量に識別でき、従って統計的処理を可能にした点ですぐ
れている。しかし、まだ細胞の形態に関する情報、分子
生物学的情報又は分子化学的情報等の細胞の異常に直接
結びっきうる高価値の情報によって識別するようなパラ
メーターはなかった。このような高価値の情報は、細胞
の異常の原因に直接係るものであるため、パラメーター
の増加に基づきスクリーニングの精度向上による臨床的
有用性が増すだけでなく、基礎医学への有用性が生れる
こととなる。The flow system analysis method using a flow cytometer is
Unlike cell analysis under a microscope or in a sample cell, this method is superior in that it allows a large number of cells with specific properties to be identified in a short period of time while flowing the cells, and therefore enables statistical processing. However, there has not yet been a parameter that can be identified using high-value information that can be directly linked to cell abnormalities, such as information on cell morphology, molecular biology, or molecular chemistry. Such high-value information is directly related to the causes of cell abnormalities, so it not only increases clinical utility by improving screening accuracy based on increased parameters, but also has utility for basic medicine. It will be.
本発明者は、流動システム分析法本来の優れた機能に前
記高価値の情報によって微小粒子を識別できるような新
だなパラメーターを付加することについて探究を行った
。The present inventors have investigated the possibility of adding new parameters that can identify microparticles using the above-mentioned high-value information to the original excellent functions of the flow system analysis method.
他方、レーザの技術分野において、今日短パルス列可同
調レーザの技術が確立しつつある。近年色素溶液をレー
ザの媒質とする色素レーザ等の出現によって、紫外から
赤外におよぶ広い範囲にわたり任意の波長に同調可能な
レーザ光が得られるようになシ、更にこの可同調レーザ
によって非常に短かい時間軸のパルス光が得られるよう
になった。On the other hand, in the field of laser technology, the technology of short pulse train tunable lasers is now being established. In recent years, with the advent of dye lasers that use a dye solution as a laser medium, it has become possible to obtain laser light that can be tuned to any wavelength over a wide range from ultraviolet to infrared. Pulsed light with a short time axis can now be obtained.
このような短パルス光を得る方法としてモード同期法が
ある。モード同期を達成させるには種々の方法があるが
最も広く容易に用いられている方法は、シンクロナスモ
ード同期法である。この方法では色素レーザを励起する
励起光源として例えばモード同期アルゴンイオンレーザ
の短パルス光を用い、そのパルス列の周期に対応して色
素レーザの共振器長を設定することによって色素レーザ
の利得を周期的に変調して超短パルス列光を発生させる
方法である。A mode locking method is a method for obtaining such short pulse light. There are various methods for achieving mode locking, but the most widely and easily used method is the synchronous mode locking method. In this method, short pulse light from a mode-locked argon ion laser, for example, is used as the excitation light source to excite the dye laser, and the gain of the dye laser is adjusted periodically by setting the cavity length of the dye laser corresponding to the period of the pulse train. This method generates an ultrashort pulse train of light by modulating the
このモード同期法を用いることによりノ母ルス幅τが数
ナノ秒(io−9秒)から数ピコ秒(10−12秒)の
オーダーの高出力、単色性、指向性の可同調短パルス列
レーザ光を得ることができる。その周期はキャビティダ
ンプ法によって数ミリ秒乃至数ナノ秒の範囲で可変にで
きる。By using this mode-locking method, a high-power, monochromatic, directional, tunable short pulse train laser with a pulse width τ on the order of several nanoseconds (io-9 seconds) to several picoseconds (10-12 seconds) can be produced. You can get light. The period can be varied in the range of several milliseconds to several nanoseconds by the cavity dump method.
これらのレーザ光はレーザ共振器内に用いられている光
学素子がプリー−スター角で設定されているためにおよ
び励起レーザ光が直線偏光であるために出力も直線偏光
であるのが一般的である。The output of these laser beams is generally linearly polarized because the optical elements used in the laser resonator are set at the Priester angle and the excitation laser beam is linearly polarized. be.
このような高速で変化する光を物質に照射して物質を発
光させる場合、その発光の時間変化も相当に高速である
から、その発光の時間変化の観測側も高度の時間精度を
もたなければならない。When a substance emits light by irradiating it with light that changes at such a high speed, the time change of the light emission is also quite fast, so the observer of the time change of the light emission must also have a high degree of temporal precision. Must be.
その変化時間領域がサブナノ秒よシ長い場合には、被測
定光の時間変化をフォトダイオードや光電子増倍管等の
光電検出器で受けて電気的な信号に変換して、その電気
パルス信号を必要に応じ信号処理、例えばオッシロスコ
ープに入力してブラウン管上に描かせる方法がちる。If the time range of the change is longer than sub-nanoseconds, the time change of the light to be measured is received by a photoelectric detector such as a photodiode or photomultiplier tube, converted into an electrical signal, and the electrical pulse signal is converted into an electrical pulse signal. If necessary, there are ways to process the signal, such as inputting it to an oscilloscope and drawing it on a cathode ray tube.
しかしピコ秒又はサブピコ秒の超高速時間領域のパルス
光の測定では、これらの光電検出器ではその応答速度ま
たは感度の点で問題となるので流しとりカメラ(ストリ
ークカメラ)が用いられる。However, when measuring pulsed light in the ultra-high-speed time domain of picoseconds or sub-picoseconds, these photoelectric detectors have problems in response speed or sensitivity, so a streak camera is used.
なかでも微弱で繰返しかつ超高速の発光の時間変化を測
定するにはシンクロナススキャンストリークカメラ法が
適当である。ストリークカメラは、被測定光の受光部か
らの光電子を加速、偏向することにより、時間変化が電
子の結像螢光面上の空間位置の変化となるようにした装
置である。Among these, the synchronous scan streak camera method is suitable for measuring the temporal changes in weak, repetitive, and ultra-high-speed light emission. A streak camera is a device that accelerates and deflects photoelectrons from a light-receiving section of the light to be measured so that a change in time corresponds to a change in the spatial position of the electrons on the imaging phosphor surface.
前述の短ノ々ルス列レーザー励起による過渡的な発光強
度の時間変化の測定がヘモグロビンの錯体等の光化学反
応物質でなされ、更に生体高分子への適用が提案され、
その局所構造の解析に有用であることが期待されている
が、まだその有用性をチェックするだめの試料セル中の
基礎研究にとどまっている。The above-mentioned measurement of the temporal change in the transient emission intensity due to short Norse train laser excitation was carried out using photochemically reactive substances such as hemoglobin complexes, and further application to biopolymers was proposed.
Although it is expected that this method will be useful for analyzing its local structure, it is still limited to basic research in sample cells that cannot be used to check its usefulness.
本発明者は、流動システム分析にこれを組込み、いわゆ
るオンラインで生体粒子又は有機高分子粒子等の微小粒
子の分子レベルの局所構造にまでたちかえってその違い
によって微小粒子の識別すなわち、微小粒子の区分の検
出を行うかまだはその区分に応じて微小粒子の選別を行
う可能性について探究を行った。The present inventor incorporated this into flow system analysis, and identified the local structure of microparticles such as biological particles or organic polymer particles at the molecular level based on the differences, that is, the classification of microparticles. We investigated the possibility of detecting microparticles or sorting them according to their classification.
発明の目的
本発明の目的は、照射用強光線として強パルス光を用い
、/4’ルス光の照射による特定波長毎の発光強度の時
間変化又は発光スペクトルの時間変化を測定するという
構想にもとづき、微小粒子の発光による識別を高価値の
識別情報によシ、大量のサンプルにつき迅速に高精度に
行うことのできる方法および装置を実現することにある
。Purpose of the Invention The purpose of the present invention is based on the idea of using strong pulsed light as a strong light beam for irradiation, and measuring the time change in the emission intensity or the time change in the emission spectrum for each specific wavelength by irradiation with /4' las light. The object of the present invention is to realize a method and apparatus that can quickly and accurately identify a large number of samples by using high-value identification information to identify microparticles by light emission.
発明の構成
本発明においては、基本的形態として、微小粒子の懸濁
液を実質的に前記粒子を1個ずつ間隔をもたせて含む粒
子流とし、前記粒子流に強光線を照射し、次いで強光線
を照射された前記粒子流を液滴となし、強光線照射によ
る粒子の発光の強度によって前記液滴中にある粒子を識
別する方法において、前記強光線として強パルス光を用
い、パルス光の照射による特定波長毎の発光強度の時間
変化又は発光スペクトルの時間変化によって微小粒子を
識別する方法、が提供される。Structure of the Invention In the present invention, as a basic form, a suspension of microparticles is formed into a particle stream containing substantially each of the particles at intervals, the particle stream is irradiated with strong light, and then an intense light beam is irradiated onto the particle stream. In a method in which the particle stream irradiated with a light beam is formed into a droplet, and particles in the droplet are identified by the intensity of light emission of the particles by irradiation with a strong light beam, strong pulsed light is used as the strong light beam, and the pulsed light is Provided is a method for identifying microparticles based on a time change in emission intensity or a time change in an emission spectrum for each specific wavelength due to irradiation.
また本発明においては、(1)流動チャンバー、(2)
微小粒子の懸濁液を前記流動チャンバーに送り込み実質
的に該粒子を1個ずつ間隔をもたせて含む粒子流とする
手段、(3)強パルス光を発生させる手段、(4)前記
流動チャンバーで前記強パルス光を前記粒子流に照射す
る手段、(5)前記粒子流を液滴とする手段、(6)前
記照射による粒子流の発光を分光する手段、および(7
)特定波長毎の発光強度の時間変化を計測する手段、を
具備する微小粒子を識別する装置、が提供される。Further, in the present invention, (1) a flow chamber, (2)
(3) means for generating intense pulsed light; (4) means for generating intense pulsed light in the flow chamber; means for irradiating the particle stream with the intense pulsed light; (5) means for converting the particle stream into droplets; (6) means for spectrally dispersing the emission of the particle stream due to the irradiation; and (7)
) A device for identifying microparticles is provided, which includes means for measuring temporal changes in emission intensity for each specific wavelength.
また、本発明においては、(1)流動チャンバー、(2
)微小粒子の懸濁液を前記流動チャンバーに送り込み実
質的に該粒子を1個ずつ間隔をもたせて含む粒子流とす
る手段、(3)強パルス光を発生させる手段、(4)前
記流動チャンバーで前記強パルス光を前記粒子流に照射
する手段、(5)前記粒子流を液滴とする手段、(6)
前記照射による粒子流の発光を分光する手段、および、
(7)発光スペクトルの時間変化を計測する手段、を具
備する微小粒子を識別する装置、が提供される。Further, in the present invention, (1) a flow chamber, (2)
) a means for feeding a suspension of microparticles into the flow chamber to form a particle stream containing substantially each particle at intervals, (3) a means for generating intense pulsed light, (4) a means for generating the flow chamber. means for irradiating the particle stream with the strong pulsed light; (5) means for converting the particle stream into droplets; (6)
means for spectrally emitting light from the particle stream caused by the irradiation, and
(7) A device for identifying microparticles is provided, which includes means for measuring temporal changes in emission spectra.
本発明による方法におい又は、前記の従来の流動システ
ム分析の技術、可同調短パルス光の技術および高速光現
象の測定技術を新たな高速実時間データ処理技術によっ
て結合し、微小粒子の識別すなわち、微小粒子の区分の
検出又はその区分に応じての粒子の選別を行う。In the method according to the invention, the above-mentioned conventional flow system analysis techniques, techniques of tunable short pulsed light and techniques of measuring high-speed optical phenomena are combined by new high-speed real-time data processing techniques, i.e., for the identification of microparticles. Detection of classification of microparticles or sorting of particles according to the classification.
本発明による方法においては、微小粒子そのもの又は、
色素を結合した微小粒子の懸濁液を細流とし、その後更
に細流をノズルから噴出させて噴出流としてから液滴と
なし、その細流又は噴出流に微小粒子の吸収帯に同調し
た強いパルス光を照射し、それによって発生する螢光等
のパルス光を受光して、発光の予め選択された特定波長
の強度の時間変化又は各波長毎のそれを同時に高速下に
検出し、かつ予め設定された該強度の時間変化に関する
区分の値と比較し、該区分の値との隔シの程度の区分に
応じたパルス波形に関する情報の電気信号を発生させ、
一方噴出流の液滴となる瞬間に荷電電極によって帯電さ
れ、次いで偏向板を通過して試料受器に採取され、この
とき、前記電気信号は、パルス光の照射を受けた粒子が
通過するときに荷電電極又は偏向板に送られ、粒子は前
記区分に応じて帯電又は偏向されて選別される。In the method according to the present invention, the microparticle itself or
A suspension of fine particles bound with dye is made into a trickle, and then the trickle is further ejected from a nozzle to form a jet and then into droplets, and the trickle or jet is injected with intense pulsed light tuned to the absorption band of the fine particles. irradiate and receive the resulting pulsed light such as fluorescent light, detect time changes in the intensity of a pre-selected specific wavelength of emitted light, or simultaneously detect each wavelength at high speed, and Compare the value of the division regarding the time change of the intensity, and generate an electrical signal of information regarding the pulse waveform according to the division of the degree of separation from the value of the division,
On the other hand, at the moment when the jet stream becomes a droplet, it is charged by a charging electrode, then passes through a deflection plate and is collected in a sample receiver, and at this time, the electrical signal is generated when the particles irradiated with pulsed light pass The particles are then sent to a charging electrode or deflection plate, where they are charged or deflected and sorted according to the classification.
本発明による方法においては、従来の流動システム分析
法および装置に比較して、照射光として、強パルス光を
用い、該パルス光の照射による予め選択された特定波長
の発光強度の時間変化又は特定波長毎のそれを同時に測
定することにょシ、更に又は発光ス被りトルの時間変化
を測定することによシ、微小粒子を識別する。In the method according to the present invention, compared to conventional flow system analysis methods and devices, intense pulsed light is used as the irradiation light, and the emitted light intensity of a preselected specific wavelength is changed over time or identified by irradiation with the pulsed light. Microparticles can be identified by simultaneously measuring each wavelength or by measuring temporal changes in the emission sheath.
本発明による方法および装置は下記の事実にその基礎を
おくものである。The method and device according to the invention are based on the following facts.
まず、微小粒子内に発光成分を有する粒子、例えば発光
する生体構成物質などの粒子そのもの又は染色用色素を
結合した微小粒子は、その微小粒子に含まれる分子の吸
収帯に同調した強い光即ちパルス光を受けて励起され、
螢光や燐光等の光を発し、失活する。First, particles that have a luminescent component within them, such as the particles themselves such as luminescent biological constituents, or microparticles bound with dyes for staining, are produced using strong light, that is, pulses, tuned to the absorption band of the molecules contained in the microparticles. Excited by receiving light,
It emits light such as fluorescence or phosphorescence and becomes inactive.
とのノ4ルス光励起にょシ分子から発した特定波長の光
は、その分子又は分子同志の相互作用に固有な強度の時
間変化をみせる。また、特定波長を逐次に連続的に選べ
ば発光のス被りトルの時間変化が各分子などに固有であ
シ、従ってそれを包含する微小粒子に固有である。The light of a specific wavelength emitted from a photoexcited molecule exhibits a temporal change in intensity specific to the molecule or the interaction between the molecules. Furthermore, if specific wavelengths are selected successively and continuously, the temporal change in the emission spectrum will be unique to each molecule, and therefore unique to the microparticles containing it.
ここに各粒子に固有とは、例えば大部分の正常な細胞の
グループと、ガン細胞又は悪性細胞等の異常な細胞のグ
ループにそれぞれに固有であることを云い、従って細胞
に固有な特定波長の発光強度の時間変化あるいは発光ス
ペクトルの時間変化を検知することができれば、正常な
細胞と異常なそれとを区分することが可能である。Here, "specific to each particle" means, for example, that it is unique to a group of most normal cells and a group of abnormal cells such as cancer cells or malignant cells. If temporal changes in luminescence intensity or luminescence spectra can be detected, it is possible to distinguish between normal cells and abnormal cells.
微小粒子に含着れる分子の吸収帯には、大略、分子骨格
、例えばDNA塩素の公子骨格、が光吸収する吸収帯と
、色素、例えばアクリジン染料等の色素が光吸収する吸
収帯があり、そのどちらの吸収帯に同調するA)レス光
を照射するかによって得られる情報が異なってくる。The absorption bands of molecules contained in microparticles generally include an absorption band in which the molecular skeleton, for example, the princely skeleton of DNA chlorine, absorbs light, and an absorption band in which pigments, such as acridine dye, absorb light. The information obtained differs depending on which absorption band the A) response light is tuned to.
第1図は、光照射に対する発光および失活についての説
明図であり、縦軸にエネルギレベル(E、L、)をとる
。実線矢印はレーザー光吸収、励起(EX)を、屈曲状
矢印は螢光(FL)を、破線矢印はエネルギトランスフ
ァー(TR)をそれぞれあられず。(a)は分子骨格の
吸収帯に同調するパルス光を照射した場合であって、分
子骨格自身と色素からの両方から異種の光が発せられる
。(b)は分子骨格に対して、2つの色素が結合され、
エネルギーのドナーとなる色素の吸収帯に同調するパル
ス光を照射した場合であって、ドナー色素とアクセプタ
ー色素とからなる異種の光が発せられる。(c)は2つ
の色素(例えばドナー色素とアクセプター色素)が結合
された分子骨格の吸収帯に同調するパルス光を照射した
場合であって、分子骨格自身と、2つの色素から異種の
光が発せられる。FIG. 1 is an explanatory diagram of light emission and deactivation in response to light irradiation, with energy levels (E, L,) plotted on the vertical axis. Solid arrows represent laser light absorption and excitation (EX), curved arrows represent fluorescence (FL), and dashed arrows represent energy transfer (TR). (a) shows the case where pulsed light tuned to the absorption band of the molecular skeleton is irradiated, and different types of light are emitted from both the molecular skeleton itself and the dye. In (b), two dyes are bonded to the molecular skeleton,
This is the case when pulsed light tuned to the absorption band of a dye that serves as an energy donor is irradiated, and different types of light consisting of a donor dye and an acceptor dye are emitted. (c) is a case where two dyes (for example, a donor dye and an acceptor dye) are irradiated with pulsed light tuned to the absorption band of the bonded molecular skeleton, and different types of light are emitted from the molecular skeleton itself and the two dyes. Emitted.
以上の発光は、パルス光であるが、これらを微小粒子の
識別のパラメーターとするためには、これら発光を分光
して、粒子を特徴とする特定波長について、発光の立上
9時間、減衰時間あるいは発光ス波りトルの時間変化を
測定することとなる。The above-mentioned light emission is pulsed light, but in order to use it as a parameter for identifying microparticles, it is necessary to analyze the light emission and determine the 9-hour rise time and decay time of the light emission for a specific wavelength that characterizes particles. Alternatively, the time change of the luminous wave torque can be measured.
更に照射するノ?ルス光が直線偏光である場合には、光
の電気ベクトルの方面に遷移モーメントをもった分子が
選択的に励起される。この分子は熱運動によって回転し
、励起直後の異方性を失い、等方向になっていく。この
配向緩>FI+の様子は、励起分子からの螢光等の発光
の特定波長毎の偏光の時間変化あるいは特定波長を逐次
に連続的に選んだときの偏光のスペクトルの時間変化を
観測することとなり、これらの時間変化(以下配向緩和
時間という)は各分子に固有であり、分子の大きさ、そ
れを取り囲む溶媒や他分子との相互作用の程度によυ異
なり、配向緩和時間を測定することができれば粒子の識
別が可能となる。この場合の1例を掲げると、細胞膜は
異方性に敏感であるだめ、細胞膜に関する細胞の識別に
この/4’ラメーターは有効である。Should I irradiate more? When the lasing light is linearly polarized light, molecules having a transition moment in the direction of the electric vector of the light are selectively excited. This molecule rotates due to thermal motion, loses its anisotropy immediately after excitation, and becomes isotropic. This state of loose orientation > FI+ can be observed by observing the time change in the polarization of light emitted from excited molecules, such as fluorescence, for each specific wavelength, or the time change in the polarization spectrum when specific wavelengths are selected one after another. These time changes (hereinafter referred to as orientation relaxation time) are unique to each molecule and vary depending on the size of the molecule and the degree of interaction with the surrounding solvent and other molecules. If this is possible, it will be possible to identify the particles. To give an example of this case, since the cell membrane is sensitive to anisotropy, this /4' parameter is effective in identifying cells with respect to the cell membrane.
なお励起パルス光の偏光角に対し、並行方向(0°)と
直角方向(90°)に生ずるそれぞれの発光強度をI(
0)、I (90)とすると各波長毎の発光偏光ipは
で定義される。これらの時間変化を粒子区分のパラメー
ターとすることができる。Note that the respective emission intensities occurring in the parallel direction (0°) and perpendicular direction (90°) to the polarization angle of the excitation pulse light are expressed as I(
0), I (90), the emission polarization ip for each wavelength is defined by ip. These temporal changes can be used as parameters for particle classification.
実施例
本発明の方法および装置を、正常細胞と異常細胞を識別
(区分又は選別)することを−態様として、以下に更に
詳しく説明する。EXAMPLES The method and apparatus of the present invention will be described in more detail below, with an embodiment of distinguishing (sorting or sorting) between normal cells and abnormal cells.
第2図は、本発明の一実施例としての微小粒子の識別(
区分又は選別)を行う装置の全体的な構成を示す図であ
る。第3図および第4図は第2図装置における流動チャ
ンバーの構造の例を示す図である。FIG. 2 shows the identification of microparticles (
1 is a diagram showing the overall configuration of a device that performs sorting or sorting. FIGS. 3 and 4 are diagrams showing examples of the structure of the flow chamber in the apparatus shown in FIG. 2. FIG.
細胞サンプルは必要ならばまず適切な螢光色素によシ染
色される。適切な色素とは、細胞と結合してパルス光の
吸収帯をもつような、そして好ましくは異常細胞の異常
部位に選択的に結合するようなものである。例えばフォ
イルゲン染料やアクリジン染料などが用いられる。また
モノクローナル抗体と称し、特定細胞の特定部位にしか
つかない抗体を細胞につけ、その抗体に色素を吸着させ
るようなことも選択的な結合に有用である。If necessary, the cell sample is first stained with an appropriate fluorescent dye. Suitable dyes are those that bind to cells, have pulsed light absorption bands, and preferably bind selectively to abnormal sites in abnormal cells. For example, Feulgen dye, acridine dye, etc. are used. It is also useful for selective binding to attach an antibody called a monoclonal antibody, which is unique to a specific site of a specific cell, to a cell and allow the antibody to adsorb a dye.
そして細胞サンプル又は適切な螢光色素によυ染色され
た細胞サンプルは生理食塩水の如き液に懸濁させ水性懸
濁液とし、沖過して大きなくずやかたまシを除去して試
料容器2に入れられる。試料容器から懸濁液は、加圧さ
れて、管5を通じて流動チャンバー6に送られる。加圧
の手段の一例は第2図の管32に示されるような空気等
の気体による加圧である。又他の例は脈動のない又は脈
動の消去されたポング加圧である。流動チャンパ−6に
送られた懸濁液は、そのチャンバー内で細流となる。細
流は、流動チャンバー内で、細流中の細胞が装置の中心
軸にくるようにするため、又細胞の区分又は選別が可能
な間隔をとるだめに包囲鞘としての役割をするシース液
63、例えば生理食塩水に同心円的に包囲されて流動チ
ャンバー6の出口ノズル62から注入される。The cell sample or the cell sample stained with an appropriate fluorescent dye is then suspended in a solution such as physiological saline to form an aqueous suspension, filtered to remove large debris and clumps, and placed in a sample container. can be placed in The suspension from the sample container is conveyed under pressure through tube 5 to flow chamber 6 . An example of pressurizing means is pressurizing with a gas such as air, as shown by tube 32 in FIG. Another example is pong pressurization without pulsation or with elimination of pulsation. The suspension sent to the flow chamber 6 forms a trickle within the chamber. The rivulet is filled with a sheath fluid 63, e.g. It is injected from the outlet nozzle 62 of the flow chamber 6 while being concentrically surrounded by physiological saline.
シース液は、容器1から加圧され管4を通って流動チャ
ン・ダー内の出口ノズルを同軸的に包囲するシース管に
送られる。シース液と懸濁液との圧力調整は、細胞が実
質的に1個ずつ出口ノズルを通過できるようになされる
。Sheath fluid is conveyed from the container 1 through a pressurized tube 4 to a sheath tube coaxially surrounding the outlet nozzle in the flow chamber. The pressure adjustment of the sheath fluid and suspension is such that cells are passed through the exit nozzle substantially one at a time.
流動チャンバーの型式には、第3図の細流の段階でノ々
ルス光の照射を受けるように光源の投射口と観測口を有
し、出口ノズルを有する液中測定型のものがある。また
第4図のように流動チャンバーは噴出流を形成するもの
であって、流動チャ/バーから噴出された噴出流がパル
ス光の照射を受けるような空中測定型のものがある。本
発明では、このいずれの型でも適用できる。そしていず
れにしても液滴となシ落下する。Among the types of flow chambers, there is a submerged measurement type having a light source projection port and an observation port, and an exit nozzle so as to be irradiated with Nollus light at the stage of a trickle flow as shown in FIG. Further, as shown in FIG. 4, the flow chamber forms a jet flow, and there is an aerial measurement type in which the jet flow ejected from the flow chamber/bar is irradiated with pulsed light. In the present invention, any of these types can be applied. In any case, the liquid falls as a droplet.
流動チャンバーの上部には流れ出てくる液体噴出流を規
則的に振動させることによって均一な液滴を生ぜしめる
ために機械的に接続された振動手段61、例えば圧電型
結晶が設けられる。全ての液滴に細胞を含むとは限らず
、又ある液滴には複数個の細胞を含むこともあるが、統
計的には大部分の細胞は、1つの液滴に1個に単離され
ることが理想的であるが、現実には、数個の液滴に細胞
が1個という風に若干希釈される。The upper part of the flow chamber is provided with mechanically connected vibration means 61, for example a piezoelectric type crystal, for regularly vibrating the outflowing liquid jet to produce uniform droplets. Not all droplets contain cells, and some droplets may contain multiple cells, but statistically the majority of cells are isolated to a single droplet. Ideally, the droplets would be slightly diluted, but in reality there would be one cell per several droplets.
これらの調節は細胞懸濁液とシース液の加圧の程度と、
圧電型結晶に印加される周波数と電圧、通常では周波数
40〜50 kHz 、電圧15Vを制御することによ
ってなされる。These adjustments depend on the degree of pressurization of the cell suspension and sheath fluid;
This is done by controlling the frequency and voltage applied to the piezoelectric crystal, usually a frequency of 40 to 50 kHz and a voltage of 15V.
前述のように細流又は噴出流となった細胞流は、パルス
光の照射を受ける。光源は、例えば−モード同期により
パルス光となる機構を備えたアルゴン・イオンレーザ1
0と波長可変およびパルス幅の極小化を行なう色素レー
ザ11およびパルス列周期のコントロールを行なうキャ
ビティダンパー12によシ構成される。The cell flow, which has become a trickle or a jet as described above, is irradiated with pulsed light. The light source is, for example, an argon ion laser 1 equipped with a mechanism to generate pulsed light by mode-locking.
It is composed of a dye laser 11 that performs wavelength tuning from 0 to 0 and minimizes the pulse width, and a cavity damper 12 that controls the pulse train period.
光源としてはいずれもパルス光を使用するが、使用する
光ビームとしては、アルゴンイオンレーザの発振波長、
主として488nmまたは514.5 nmが強くその
他紫外領域の波長、および、色素レーザよシ出てくる波
長、例えば色素としてローダミン6Gを用いた場合は6
00nm前後の波長、の両者を使用する。これら両者の
波長を用いると、ダブルビームの光源となり、細胞への
最適励起波長の選択が容易となる。Both use pulsed light as the light source, but the light beam used is the oscillation wavelength of the argon ion laser,
Mainly 488 nm or 514.5 nm, other wavelengths in the ultraviolet region, and wavelengths emitted by dye lasers, for example, 6 when rhodamine 6G is used as the dye.
Both wavelengths around 00 nm are used. If both of these wavelengths are used, it becomes a double beam light source, and it becomes easy to select the optimal excitation wavelength for cells.
このパルスブCのレーザビーム、例えばパルス幅として
10psec〜10nsecのレーザビームを、S/N
比を向上させるだめに、そのウェストポイントが細胞流
の部分にくるように集光して、細胞流にほぼ直角に照射
する。This pulsed laser beam C, for example, a laser beam with a pulse width of 10 psec to 10 nsec, is
In order to improve the ratio, the light is focused so that its waist point is in the area of the cell flow, and irradiated almost perpendicular to the cell flow.
照射光の細胞流をつきぬけた側に、照射光源に向けたフ
ォトダイオード162は、細胞が検出範囲に入った事を
検知し、例えばストリークカメラ20のシャッターを開
閉するだめの信号を取シ出すために使用される。フォト
ダイオード162への入射光は通常パルス動作をしてい
るが、細胞がノクルス光に入ってくると吸収が起り信号
に変化が起きるのでこれをシャッター開信号とする。A photodiode 162 facing the irradiation light source on the side where the irradiation light passes through the cell flow detects that the cells have entered the detection range and outputs a signal to open or close the shutter of the streak camera 20, for example. used for. The light incident on the photodiode 162 normally operates in a pulsed manner, but when a cell enters the Noculus light, absorption occurs and the signal changes, which is used as a shutter open signal.
細胞がノ!ルス光を横切らないときには、螢光は発せら
れないのでストリークカメラ20からはベースノイズ以
外の信号は出力されないが、このベースノイズを消去す
るためにフォトダイオード162の出力信号をストリー
クカメラ2oに入力して、細胞がパルス光をさえぎらな
いときには、ストリークカメラ20の加速電圧を0とし
、チャンネルグレートの操作電圧を0とするようなシャ
ッター同期信号を発せしめる。シャッターを開いて加速
電圧およびチャンネルグレートが動作開始した後シャッ
ターを閉じる信号は、例えばパルスが100個通過して
のち、又は、1μB経過後に発せられる。Cells are no! When the lasing light does not cross, no fluorescent light is emitted, so no signal other than base noise is output from the streak camera 20. However, in order to eliminate this base noise, the output signal of the photodiode 162 is input to the streak camera 2o. When the cells do not block the pulsed light, a shutter synchronization signal is generated to set the acceleration voltage of the streak camera 20 to 0 and the operating voltage of the channel grade to 0. After the shutter is opened and the accelerating voltage and channel rate start operating, the signal for closing the shutter is issued, for example, after 100 pulses have passed or after 1 μB has elapsed.
パルス光と細胞流が交わる点に細胞が流れてくると、そ
こで細胞内の生体高分子又はそれに結合した色素が励起
され、パルス状の螢光が発せられる。この螢光の列は、
細胞流とパルス光の照射方向の双方にほぼ直交する方向
にて、できるだけ広角で集光レンズ153で集め、分光
器19又は特定波長のバンドパスフィルター173,1
74等の分光手段を介してストリークカメラ20および
/または光電子増倍管やフォトダイオード163゜16
4に送られ、必要ならば、これらの検知手段の前には偏
光板(図示せず)が置かれる。When cells flow to a point where the pulsed light and the cell flow intersect, biopolymers within the cells or dyes bound to them are excited, and pulsed fluorescence is emitted. This line of fluorescent light is
The cells are collected by a condensing lens 153 at a wide angle as much as possible in a direction substantially orthogonal to both the cell flow and the irradiation direction of the pulsed light, and are collected using a spectroscope 19 or a bandpass filter 173, 1 of a specific wavelength.
The streak camera 20 and/or photomultiplier tube or photodiode 163° 16
If necessary, a polarizing plate (not shown) is placed in front of these detection means.
但し、第1図装置における流動チャンバーが第3図、第
4図に例示したものでなく、細胞流が入射光軸に平行し
て流れるタイプのもの、又は斜めに入射されるタイプの
ものの場合には、螢光の検知は、前記細胞流とパルス光
の照射方向の双方に直交する必要はなく入射光の影響を
受けないように螢光が検知されればよい。However, if the flow chamber in the apparatus shown in Fig. 1 is not the one illustrated in Figs. 3 and 4, but the type in which the cell flow flows parallel to the incident optical axis, or the type in which the cell flow is incident obliquely, The detection of fluorescence does not need to be perpendicular to both the cell flow and the irradiation direction of the pulsed light, as long as the fluorescence is detected so as not to be affected by the incident light.
光電子増倍管やフォトダイオードは、応答時定数が大き
いため、その時定数より短いパルス光は、検知できない
。逆にストリークカメラの時定数は長くできない場合が
ある。従って、検知手段として両者を選択使用すればよ
いこととなる。なお例えば入射パルス光のパルス幅が0
.1nsecでくシ返し間隔が10nsecとすると、
細胞がパルス光を通過する間に受けるパルスの数は、細
胞流速によるが100〜1,000個となる。Photomultiplier tubes and photodiodes have large response time constants, so pulsed light shorter than that time constant cannot be detected. Conversely, the time constant of a streak camera may not be long. Therefore, it is sufficient to selectively use both of them as a detection means. For example, if the pulse width of the incident pulsed light is 0
.. If it is 1nsec and the repeat interval is 10nsec,
The number of pulses that cells receive while passing through the pulsed light is 100 to 1,000, depending on the cell flow rate.
ストリークカメラ20の動作が第5図を参照しつつ説明
される。発光パルスはまず光電面201に入射して、そ
の刻々の光の強さくI)に応じ、光電子を放出する。入
射光の横軸が波長となる。刻々の光電子は、加速電極2
02で初速度を揃えて加速されてチャンネルプレート2
04に向う一方、電子ビームの進行方向に垂直な、偏向
電極203による偏向電場で上下方向に偏向される。The operation of the streak camera 20 will be explained with reference to FIG. The light emission pulse first enters the photocathode 201, and photoelectrons are emitted depending on the momentary intensity of the light I). The horizontal axis of the incident light is the wavelength. The momentary photoelectrons are accelerated by the accelerating electrode 2.
Channel plate 2 is accelerated with the same initial speed at 02
04, the electron beam is deflected vertically by a deflection electric field generated by a deflection electrode 203 perpendicular to the traveling direction of the electron beam.
この偏向電極203には、シンクロスキャン方式を用い
て、はぼ発光パルスに同期する高速掃引電圧が印加され
ており、従って遅れて発生する光電子は例えばチャンネ
ルグレートの下方に入射することとなυ、その後電子増
倍されて螢光面に衝突し、再び光に変換される。結局こ
の螢光面には、時間tを縦軸とし、波長λを横軸として
螢光パルスの強度が輝度(L)として表わされた像が与
えられる。この光像は、光電子ビームが螢光パルス毎に
発生し、高速掃引されるけれども、螢光面の残像効果の
だめに、パルスの累積されたもの、すなわち、細胞毎の
像である。A high-speed sweep voltage synchronized with the light emission pulse is applied to this deflection electrode 203 using a synchronized scan method, so that photoelectrons generated late are not incident on the lower side of the channel grating, for example. The electrons are then multiplied, collide with a fluorescent surface, and are converted into light again. Eventually, an image is given to this fluorescent surface in which the intensity of the fluorescent pulse is expressed as luminance (L) with time t on the vertical axis and wavelength λ on the horizontal axis. Although the photoelectron beam is generated for each fluorescent pulse and is swept at high speed, this optical image is an accumulation of pulses due to the afterimage effect of the fluorescent surface, that is, an image for each cell.
この光像は、出力リレーレンズ、オプティカルファイバ
ー等21を通して撮像管又はダイオードアレイ等の受光
素子22に結像する0この結果、受光素子を掃引して得
られる電気信号は、励起発光パルスの強度の時間変化又
は発光スペクトルの時間変化を示すものとなる。This optical image passes through an output relay lens, optical fiber, etc. 21 and forms an image on a light receiving element 22 such as an image pickup tube or a diode array.As a result, the electrical signal obtained by sweeping the light receiving element is equal to the intensity of the excitation emission pulse. It shows the time change or the time change of the emission spectrum.
前記発光パルスに同期する偏向電極203の高速掃引電
圧は、同期源としては、照射ノ2ルス光の一部をフォト
ダイオード161で受けたときの出力を用いた掃引同期
回路によって得られる。The high-speed sweep voltage of the deflection electrode 203 that is synchronized with the light emission pulse is obtained by a sweep synchronization circuit that uses, as a synchronization source, an output when a portion of the irradiation pulse light is received by the photodiode 161.
配向緩和時間は次のようにしてストリークカメラによっ
て検知できる。即ち、発光パルスを0゜および90°の
2つの偏光板を通る光路に分け、ある特定波長のそれぞ
れを各々のス) IJ−クカメラで検知する方法や、偏
光板を通した偏光角O0および90°の2つの偏光螢光
パルスをある特定波長のそれぞれを1台のストリークカ
メラの左半分および右半分に別けて入光し、チャンネル
プレートの後の螢光面の左右に別けてそれぞれの光像を
描かせ、別々にそれぞれの光像の電気信号を得る方法で
ある。The orientation relaxation time can be detected by a streak camera as follows. That is, there is a method in which a light emission pulse is divided into optical paths that pass through two polarizing plates at 0° and 90°, and each specific wavelength is detected with an IJ camera, and the polarization angles O0 and 90° are detected through the polarizing plates. Two polarized fluorescent light pulses of a certain wavelength are separately incident on the left and right halves of one streak camera, and the light images are separated on the left and right sides of the fluorescent surface behind the channel plate. In this method, the electrical signals of each optical image are obtained separately.
前記したように、励起パルス光がレーザパルスである場
合には、パルス光も直線偏光であることが一般的である
が、この場合、発光パルスについて偏光の効果を除いて
、発光の載設時間を測定するには、偏光角がマジックア
ングルと呼ばれる54.7°に設定された偏光板を通し
て観測すればよい。As mentioned above, when the excitation pulse light is a laser pulse, the pulse light is also generally linearly polarized light. To measure this, it is sufficient to observe through a polarizing plate whose polarization angle is set to 54.7 degrees, which is called the magic angle.
光電子増倍管やフォトダイオードアレイ163゜164
を発光パルスの検知手段に使用する場合は、1つの細胞
について数多く発せられる螢光パルスの1つを検知して
、直接に、発光の立上り時間、減衰時間や、配向緩和時
間を検知することができる。高感度を得るために数個の
i4ルスの平均値をとってもよい。Photomultiplier tube and photodiode array 163°164
When used as a means for detecting luminescence pulses, it is possible to detect one of the many fluorescent pulses emitted by one cell and directly detect the rise time, decay time, and orientation relaxation time of luminescence. can. The average value of several i4 pulses may be taken to obtain high sensitivity.
ストリークカメラ又は、光電子増倍管やフォトダイオー
ドからの電気信号は、後記される時定数計時回路によっ
て特定波長の発光の立上り時間、減衰時間、配向緩和時
間又は発光スペクトルの時間変化が演算される。The electric signal from the streak camera, photomultiplier tube, or photodiode is used to calculate the rise time, decay time, orientation relaxation time, or time change of the emission spectrum of light emission at a specific wavelength by a time constant timing circuit described later.
第2図装置における信号処理部7の構成が第6図に示さ
れる。The configuration of the signal processing section 7 in the device shown in FIG. 2 is shown in FIG.
時定数計時回路700a、700bの演算出力である発
光の立上少時間、減衰時間、配向緩和時間はデータマル
チプレクサ71及びソーティングマルチプレクサ72に
送られる。The arithmetic outputs of the time constant clock circuits 700a and 700b, which are the light emission rise time, decay time, and orientation relaxation time, are sent to the data multiplexer 71 and the sorting multiplexer 72.
データマルチプレクサは、中央処理ユニット(CPU
) 740指令に基づき、各センサーの信号を順次切換
えてメ七り73に書き込む。メモリ73に書き込まれた
信号は、微小粒子の識別の表示として、CPU74の指
令によりCRT等のディスプレイ81上に測定値あるい
はグラフ等のデータとして表示し、まだ、印字装置にそ
れらのデータを印字し、ハードコピーを作成する。The data multiplexer is a central processing unit (CPU)
) Based on the 740 command, the signals of each sensor are sequentially switched and written to the menu 73. The signals written in the memory 73 are displayed as measured values or data such as graphs on a display 81 such as a CRT according to instructions from the CPU 74 as an indication of the identification of microparticles, and these data are still printed on a printing device. , create a hard copy.
一方、ソーティングマルチプレクサ72は、ソーティン
グ(分取)ずべき要素、例えは波長、立上少時間、減衰
時間、配向緩和時間等の要素が設定さ:冗ると、CPU
74からの指令により1つ又は複数の要素の信号源選
択され、1つ又は複数の上限あるいは下限比較器75.
76に送られる。ここであらかじめ設定された値又はス
ペクトルと測定値又は測定スペクトルが比較され、所定
の範囲(例えば上限以下でかつ下限以下)にあるときは
、信号処理部7の動作により荷t/”ルス発生回路82
は一定の遅延時間、例えは500〜1,000μS程度
をもたせて偏向信号を出力する。On the other hand, the sorting multiplexer 72 is configured with elements that should be used for sorting (separation), such as wavelength, startup time, decay time, orientation relaxation time, etc.
One or more element signal sources are selected by commands from 74 and one or more upper or lower limit comparators 75 .
Sent to 76. Here, the preset value or spectrum is compared with the measured value or the measured spectrum, and if it is within a predetermined range (for example, below the upper limit and below the lower limit), the load t/'' pulse generation circuit is controlled by the operation of the signal processing section 7. 82
outputs a deflection signal with a certain delay time, for example, about 500 to 1,000 μS.
このようにして1個の細胞の特定波長の螢光の立上少時
間、減衰時間、発光スペクトルの時間変化又は配向緩和
時間が正常な細胞のもつこれらの基準値(前記設定値又
は設定スペクトル)と比較され、その基準値との隔シに
応じて識別され偏向信号が細胞のソーティング(分散)
のために出力されることとなる。In this way, the short rise time, decay time, time change of emission spectrum, or orientation relaxation time of fluorescence at a specific wavelength of one cell are set to these reference values (the above-mentioned set value or set spectrum) that a normal cell has. The deflection signal is compared to the reference value and identified according to the distance from the reference value.
It will be output for.
細胞流が液滴を形成する所に、細胞流をはさんで荷電電
極23が設けられており、荷電電極には1.9 ルス幅
50〜200μB、電圧±50〜300vのノ2ルスが
荷電パルス発生回路から印加されている。そして液滴が
形成される瞬間に液滴はその荷電パルスに応じて荷電さ
れる。この荷電パルスは、前記のように細胞が・マルス
光の照射を受けて、螢光等を検知され、比較演算された
のち遅延されているので、その細胞が丁度荷車電極を通
過するときには、比較演算の結果としての荷電を受ける
ようにされている。A charging electrode 23 is provided across the cell flow at the location where the cell flow forms droplets, and the charging electrode is charged with a 1.9 Lus width of 50 to 200 μB and a voltage of ±50 to 300 V. It is applied from the pulse generation circuit. Then, at the moment the droplet is formed, the droplet is charged according to the charging pulse. This charge pulse is delayed after the cell is irradiated with Mars light, fluorescence, etc. is detected and compared, so that when the cell just passes through the cart electrode, the It is adapted to receive a charge as a result of an operation.
次いで液滴は、液滴流をはさむ形で2〜5anの間隔で
対向しておかれている2枚の偏向板24の間を通過する
。偏向板には±1500〜2000 Vの電圧が加えら
れておυ、荷電された液滴は、静電気力により偏向され
偏向板の4〜5crn下方の細胞受器25に集められる
。荷電されていない液滴はそのまま偏向されずに落下す
る。Next, the droplets pass between two deflection plates 24 that are opposed to each other with an interval of 2 to 5 anns across the droplet flow. A voltage of ±1500 to 2000 V is applied to the deflection plate, and the charged droplets are deflected by electrostatic force and collected in the cell receiver 25 4 to 5 crn below the deflection plate. Uncharged droplets fall without being deflected.
なお偏向信号を荷電ノやルス発生回路から出力させる代
りに、荷電電極では一定の荷電状態として、偏向板の電
場を駆動する回路を用いて偏向電場の強さを変化させる
ようにしてもよい。Note that instead of outputting the deflection signal from the charge generator or the pulse generation circuit, the charge electrode may be kept in a constant charge state, and the strength of the deflection electric field may be varied using a circuit that drives the electric field of the deflection plate.
第1図装置における粒子流、照射するパルス光、発生す
る発光パルス、ストリークカメラのシャッター用ゲート
、ストリークカメラの掃引電圧、液滴にかける荷電電場
、相互間の時間的関係が第7図の波形図を参照しつつ説
明される。Figure 1 shows the waveforms of the particle flow in the device, the irradiated pulsed light, the emitted light pulses, the shutter gate of the streak camera, the sweep voltage of the streak camera, the charged electric field applied to the droplet, and the temporal relationship between them as shown in Figure 7. This will be explained with reference to the figures.
第7図の(1)は微粒子がパルス光を横切るときをHレ
ベル、そうでないときをLレベルとして粒子流の状態を
示したものである。第7図の(2)は照射する・ぞルス
光を示し、第7図の(3)は発生する発光・やルスを示
している。第7図の(4)および(5)はそれぞれスト
リークカメラのシャッター用ゲートと、ストリークカメ
ラの掃引電圧を示し、第7図の(6)は荷電電極にかけ
る電圧を2つのレベルで示している。第7図の(2)か
ら(3)の間は、発光の立上り時間だけ少し遅れ、ピー
クに達したあと、緩やかに減衰する。(1) in FIG. 7 shows the state of the particle flow, with the H level when the particles cross the pulsed light, and the L level when they do not. (2) in FIG. 7 shows the irradiated light, and (3) in FIG. 7 shows the generated light. (4) and (5) in Figure 7 show the shutter gate of the streak camera and the sweep voltage of the streak camera, respectively, and (6) in Figure 7 shows the voltage applied to the charged electrode at two levels. . Between (2) and (3) in FIG. 7, there is a slight delay in the rise time of the light emission, and after reaching the peak, the light attenuates slowly.
第7図の(5)の周期は、発光源からストリークカメラ
までの光の到達時間だけの遅れを生じるが、図では無視
した。第7図の(6)は、微小粒子がパルス光の照射を
受けてから、荷電電場に至る時間差だけ遅れる。光の遅
れを問題とする第7図の(2)〜(5)の遅れに比べれ
ば比較にならない程の遅れとなるが、便宜上図では若干
大きく画くことにとどめた。The period (5) in FIG. 7 causes a delay corresponding to the arrival time of the light from the light source to the streak camera, but this is ignored in the diagram. In (6) of FIG. 7, after the microparticle is irradiated with pulsed light, there is a delay by the time difference between when the microparticle reaches the charged electric field. Although the delay is incomparable compared to the delays in (2) to (5) in FIG. 7, which involve light delay, it is drawn slightly larger in the figure for the sake of convenience.
第6図回路における時定数計時回路の構成が第8図およ
び第9図に示される。時定数計時回路が発光パルスの立
上シ時間、又は減衰時間を演算する場合の時定数計時回
路は第8図のように構成される。The configuration of the time constant clock circuit in the circuit of FIG. 6 is shown in FIGS. 8 and 9. When the time constant timing circuit calculates the rise time or decay time of a light emission pulse, the time constant timing circuit is configured as shown in FIG.
第8図回路において、発光の立上り時間の測定は、光像
を変換した電気信号S (OPT )をまず前置増幅し
、スムージング等の前処理を行なったのち、第1比較器
703により立上シの基準レベルを定め、これを信号5
(703)とする。信号5(703)とする立上υの基
準レベルは、しきい値設定器により任意の値に設定5(
702)できるものとする。このしきい値は、発光信号
の無信号時からの変化点、光学系あるいはこの回路に入
る迄の電気系のノイズ等を勘案して決められる。In the circuit shown in FIG. 8, the rise time of light emission is measured by first pre-amplifying the electrical signal S (OPT) converted from the optical image and performing pre-processing such as smoothing. Determine the standard level of
(703). The reference level of the rising edge υ, which is signal 5 (703), is set to an arbitrary value by the threshold setting device 5 (
702) It shall be possible. This threshold value is determined by taking into consideration the change point of the light emission signal from the time of no signal, noise in the optical system or the electrical system leading up to this circuit, and the like.
立上り時間の測定上信号がピーク値に到達した時の信号
が必要となるが、これには第2比較器705により作成
される信号5(705)を用いる。即ち発光信号とその
ピークホールド回路の信号を第2比較器で比較し、発光
信号の方が小さくなるときのピーク点の信号を得る。こ
の5(703)。To measure the rise time, a signal when the signal reaches its peak value is required, and for this purpose, signal 5 (705) created by the second comparator 705 is used. That is, the light emission signal and the signal from its peak hold circuit are compared by the second comparator to obtain a signal at the peak point when the light emission signal becomes smaller. This 5 (703).
8(705)の2つの信号発生時点の時間差を立上シ時
間計時回路にて計測する事により発光の立上り時間を測
定できる。The rise time of light emission can be measured by measuring the time difference between the two signal generation points 8 (705) using a rise time clock circuit.
発光の減衰時間の測定は、凍ず第2比較器705によシ
前記ピーク点となるべき時間をとらえる。To measure the decay time of the light emission, the second freezing comparator 705 captures the time at which the peak point should occur.
それには発光信号とピークホールド回路を通った信号を
比較すれば発光信号の方が小さくなった所で第2比較器
705の出力が逆転するので、これを4M号5(705
)として時間測定回路の時間計S+開始の46号として
使用する。To do this, if the light emission signal and the signal passed through the peak hold circuit are compared, the output of the second comparator 705 will be reversed when the light emission signal becomes smaller.
) is used as No. 46 of the hour meter S+ start of the time measuring circuit.
減衰時間とは、通常、信号ピーク値からの値が1/e
(63% )になるまでの時間を採用ずればよいがこの
1/e又はその他の値を減衰比設定器に設定し、これと
発ブC信号を第3比較器708に入れ、大きさの逆転す
る時出力信号5(708)が得られる。減衰時間の測定
は、この信号5(705)。Decay time is usually a value of 1/e from the signal peak value.
(63%), but set this 1/e or other value to the attenuation ratio setter, input this and the emitted C signal to the third comparator 708, and calculate the magnitude. When reversing, output signal 5 (708) is obtained. The decay time is measured using this signal 5 (705).
5(708)を用い、減衰時間測定回路により計測され
る。STTは計時開始を、STPは計時停止を、それぞ
れあられす。5 (708) and is measured by a decay time measuring circuit. STT is used to start timing, and STP is used to stop timing.
立下シ時間計時回路の計時終了信号COMPLにより、
ピークホールド回路および2つの計時回路をリセッ)
R8Tする。このようにして第8図回路により立上り時
間計時信号5(707)、立下り時間計時信号5(70
9)が得られる。Due to the clock completion signal COMPL of the falling time clock circuit,
(Reset the peak hold circuit and two clock circuits)
R8T. In this way, the rise time clock signal 5 (707) and the fall time clock signal 5 (70
9) is obtained.
以上は特定の一波長に関する時定数計時回路であるが、
特定波長が複数ある場合には、特定波長の数に応じてそ
れぞれの波長について同様の処理を行なえばよい。また
、第8図回路が用いられる場合においては、信号5(7
07)、信号5(709)の一方を省略することが可能
である。The above is a time constant timing circuit for one specific wavelength.
If there are multiple specific wavelengths, similar processing may be performed for each wavelength depending on the number of specific wavelengths. In addition, when the circuit shown in FIG. 8 is used, the signal 5 (7
07) and signal 5 (709) can be omitted.
時定数計時回路が配向緩和時間を演算する場合の時定数
計時回路は、第9図のように構成される。When the time constant clock circuit calculates the orientation relaxation time, the time constant clock circuit is configured as shown in FIG.
第9図回路において、光像検出器よりの偏光角0゜およ
び90°の電気信号8 (OPT )を前置増幅を行々
りたのち、前記偏光を示す換算値、例えば発光偏光度を
演算させる。その回路よシの出力を前記減衰時間計時と
同様に処理するものである。このようにして第9図回路
によシ配向緩和時間計時信号5(7i6)が得られる。In the circuit shown in FIG. 9, after preamplifying electrical signals 8 (OPT) with polarization angles of 0° and 90° from the optical image detector, a converted value indicating the polarization, for example, the degree of polarization of light emission is calculated. let The output of the circuit is processed in the same manner as the decay time measurement described above. In this way, the orientation relaxation time clock signal 5 (7i6) is obtained by the circuit of FIG.
複数の特定波長については、その各々に同様の処理を行
なえばよい。For a plurality of specific wavelengths, similar processing may be performed for each of them.
第2図装置においては、微小粒子の区分、選別のパラメ
ーターは、微小粒子の分子レベルの局所構造の違いに基
づくものである。具体的には、生体微小粒子について言
えば、分子生物学的又は分子化学的な細胞レベル、染色
体レベル更には生体分子レベルにまでたちかえったもの
である。更に具体的には、まず第1に各構成分子、部位
の接近度、例えば核酸−塩基ベアの距離、染色用色素分
子−分子骨格の距離、ドナ色素分子とアクセプタ色素分
子との距離等であり、第2に核酸、タンパク質などの粒
子の大きさや型で・あり、第3に分子の構造に関し、例
えば2重らせんのピッチ、分子の内部振動、ブラウン運
転、鎖のベンディング、分子の局部的な回転運動等の情
報である。In the apparatus shown in FIG. 2, the parameters for classifying and sorting microparticles are based on differences in the local structure of the microparticles at the molecular level. Specifically, when it comes to biological microparticles, they are based on molecular biology or molecular chemistry at the cell level, chromosome level, and even down to the biomolecular level. More specifically, first of all, the proximity of each component molecule and site, such as the distance between a nucleic acid and a base bare, the distance between a staining dye molecule and a molecule skeleton, the distance between a donor dye molecule and an acceptor dye molecule, etc. The second is the size and type of particles such as nucleic acids and proteins, and the third is the structure of molecules, such as the pitch of double helices, internal vibrations of molecules, Brownian operation, chain bending, and local changes in molecules. This is information such as rotational movement.
第4に光化学反応を含む生化学反応の過渡中間生成物の
検出であり、第5に細胞の領域の情報であって、例えば
、細胞膜とタンパク質との結合状態や膜の厚さである。The fourth is detection of transient intermediate products of biochemical reactions including photochemical reactions, and the fifth is information on cell regions, such as the state of binding between cell membranes and proteins and the thickness of the membrane.
第6に細胞の融合状態、表面レクチオンリセプターの分
オli%クロメージョン接近などの生体微小粒子のその
他の性質に関する情報である。Sixth, there is information regarding other properties of biological microparticles, such as the state of cell fusion and the fractional chromatography approach of surface lection receptors.
これらは、生体微小粒子の異n因子に直接係わる高価値
の情報である。第2図装置においては、これらの高価値
の情報によって生体微小粒子を区分、選別でき、しかも
それを大量のサンダルを短時間でオンラインで行なうこ
とが可能である。このことは、第2図装置の医学分野に
おける臨床的有用性と、その基質医学への有用性を意味
し、またその他の微小粒子の区分、選別への有用性をも
意味する。These are highly valuable information directly related to the different factors of biological microparticles. In the apparatus shown in FIG. 2, biological microparticles can be classified and sorted based on this highly valuable information, and moreover, it is possible to do this on-line on a large number of sandals in a short time. This means the clinical utility of the device shown in FIG. 2 in the medical field, its utility in substrate medicine, and also its utility in classifying and sorting other microparticles.
本発明の実施にあたっては、前述の実施例のほか、種々
の変形形態をとることが可能である。まだ、本発明の方
法および装置には、前記特公昭56−13266号公報
に記載されたようなコウルターオリフィスを使用する容
量検知システムやパルス光照射による粒子からのパルス
状の螢光や散乱光を連続光としてならしてその強弱を検
知し、それらを粒子の区分、選別のパラメーターとする
こと、即ち、従来の流動システム分析の手法を併用する
ことは勿論可能である。In implementing the present invention, various modifications can be made in addition to the embodiments described above. However, the method and apparatus of the present invention do not include a capacitive sensing system using a Coulter orifice as described in the above-mentioned Japanese Patent Publication No. 13266/1983, or pulsed fluorescence or scattered light from particles by pulsed light irradiation. Of course, it is possible to normalize the light as a continuous light, detect its intensity, and use these as parameters for particle classification and sorting, that is, to use conventional flow system analysis techniques in combination.
発明の効果
本発明によれば、微小粒子の発光による識別を高価値の
識別情報により、大量のサンプルにつき迅速に高精度に
行うことができる。Effects of the Invention According to the present invention, identification of microparticles by light emission can be performed quickly and with high precision on a large amount of samples using high-value identification information.
第1図は、光照射に対する粒子の発光および失活の状況
を説明する図、第2図は、本発明の一実施例としての微
小粒子の識別(区分又は選別)を行う装置の全体的な構
成を示す図、第3図および第4図は流動チャンバーの構
造例を示す図、第5図はストリークカメラの動作を説明
する図、第6図は第2図装置における信号処理部の構成
を示す図、第7図は、第1図装置における各部の信号の
時間的関係を示す波形図、第8図および第9図は、第6
図回路における時定数計時回路の構成を示す図である。
1・・・シース液容器、2・・・試料容器、4.5・・
・管、6・・・流動チャンバー、7・・・信号処理部、
10・・・アルゴンイオンレーザ、11・・・色素レー
ザ、12・・・キャビティダンパー、19・・・分光器
、20・・・ストリークカメラ、23・・・荷電電極、
24・・・偏向板、25・・・細胞受器、32・・・管
、61・・・振動手段、62・・・出口ノズル、63・
・・シース液、81・・・ディスプレイ部、82・・・
荷tパルス発生部、83・・・掃引同期回路、84・・
・シャッター同期回路、131〜133・・・ハーフミ
ラ−1134,136・・・グイクロイックミラー、1
41゜142・・・全反射ミラー、151〜158・・
・レンズ、161.162・・・フォトダイオード、1
63゜164・・ブC電子増倍管又はフォトダイオード
、173〜174・・・バンドパスフィルタ。
第1図
DNA塩基 色素
DNA塩基 ドナー色素 アクセプター色素DNA塩基
ドナー色素 アクセプター色素第3図
第4図FIG. 1 is a diagram explaining the state of light emission and deactivation of particles in response to light irradiation, and FIG. 2 is an overall diagram of an apparatus for identifying (sorting or sorting) microparticles as an embodiment of the present invention. Figures 3 and 4 are diagrams showing the structure of the flow chamber, Figure 5 is a diagram explaining the operation of the streak camera, and Figure 6 is a diagram showing the configuration of the signal processing section in the apparatus shown in Figure 2. FIG. 7 is a waveform diagram showing the temporal relationship of signals of each part in the device shown in FIG. 1, and FIGS.
It is a figure which shows the structure of the time constant clock circuit in a circuit of a figure. 1... Sheath liquid container, 2... Sample container, 4.5...
・Pipe, 6... Flow chamber, 7... Signal processing unit,
DESCRIPTION OF SYMBOLS 10... Argon ion laser, 11... Dye laser, 12... Cavity damper, 19... Spectrometer, 20... Streak camera, 23... Charged electrode,
24... Deflection plate, 25... Cell receiver, 32... Tube, 61... Vibration means, 62... Outlet nozzle, 63...
... Sheath liquid, 81 ... Display section, 82 ...
Load t pulse generator, 83...Sweep synchronization circuit, 84...
・Shutter synchronization circuit, 131-133... Half mirror 1134, 136... Guicroic mirror, 1
41゜142... Total reflection mirror, 151-158...
・Lens, 161.162...Photodiode, 1
63°164...B C electron multiplier tube or photodiode, 173-174...Band pass filter. Figure 1 DNA base Dye DNA base Donor dye Acceptor dye DNA base Donor dye Acceptor dye Figure 3 Figure 4
Claims (1)
隔をもたせて含む粒子流とし、前記粒子流に強光線を照
射し、次いで強光線を照射された前記粒子流を液滴とな
し、強光線照射による粒子の発光の強度によって前記液
滴中にある粒子を識別する方法において、前記強光線と
して強パルス光を用い、ノソルス光の照射による特定波
長毎の発光強度の時間変化又は発光ス被りトルの時間変
化によって微小粒子を識別する方法。 2、(1) 流動チャンバー、 (2)g、小粒子の懸濁液を前記流動チャンバーに送り
込み実質的に該粒子を1個ずつ間隔をもたせて含む粒子
流とする手段、 (3)強パルス光を発生させる手段、 (4)前記流動チャンバーで前記強パルス光を前記粒子
流に照射する手段、 (5)前記粒子流を液滴とする手段、 (6)前記照射による粒子流の発光を分光する手段、お
よび (7)特定波長毎の発光強度の時間変化を計測する手段
、 を具備する微小粒子を識別する装置。 3、(1) 流動チャンバー、 (2)微小粒子の懸濁液を前記流動チャンバーに送シ込
み実質的に該粒子を1個ずつ間隔をもだせて含む粒子流
とする手段、 (3)強パルス光を発生させる手段、 (4)前記流動チャンバーで前記強i4ルス光を前記粒
子流に照射する手段、 (5)前記粒子流を液滴とする手段、 (6)前記照射による粒子流の発光を分光する手段、お
よび (7)発光スイクトルの時間変化を計測する手段、 を具備する微小粒子を識別する装置。[Claims] 1. A suspension of microparticles is formed into a particle stream containing substantially each of the particles at intervals, the particle stream is irradiated with strong light, and then the particle stream is irradiated with strong light. In a method in which the particle stream is formed into droplets and particles in the droplets are identified by the intensity of light emission of the particles by irradiation with strong light, strong pulsed light is used as the strong light and each specific wavelength is identified by irradiation with nosolous light. A method for identifying microparticles based on the time change in the luminescence intensity or the time change in the emission sheath. 2. (1) a fluidization chamber; (2) g. a means for feeding a suspension of small particles into the fluidization chamber to form a particle stream containing substantially each particle at intervals; (3) a strong pulse; (4) means for irradiating the particle stream with the intense pulsed light in the flow chamber; (5) means for converting the particle stream into droplets; (6) causing the particle stream to emit light due to the irradiation. A device for identifying microparticles, comprising: means for spectroscopy; and (7) means for measuring temporal changes in emission intensity for each specific wavelength. 3. (1) a fluidization chamber; (2) a means for feeding a suspension of microparticles into the fluidization chamber to form a particle stream containing substantially each particle at intervals; (3) a strong means for generating pulsed light; (4) means for irradiating the particle stream with the strong i4 las light in the flow chamber; (5) means for converting the particle stream into droplets; (6) reducing the particle stream by the irradiation. A device for identifying microparticles, comprising: means for spectrally emitting light; and (7) means for measuring changes over time in the emitted light quiescent.
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