DE2243014A1 - Lyophilisiertes serum oder plasma und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents
Lyophilisiertes serum oder plasma und verfahren zu dessen herstellungInfo
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Description
E. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY 10th Market Streets, Wilmington, Delaware 19893.,. V.St.A.
Lyophilisiertes Serum oder Plasma und Verfahren zu dessen Herstellung
Die Erfindung betrifft ein neues lyophilisiertes Serum- oder Plasmaprodukt sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Serum oder Plasma von bekanntem Gehalt werden wegen ihrer grossen chemischen und physikalischen Ähnlichkeit mit Proben, die
tatsächlich getestet werden sollen, als Standard- oder Kontrollsubstanzen bei klinischen Analysen verwendet. Die sich rasch verschlechternde
Beschaffenheit vieler Serum- oder Piasmabestandteile macht Anstrengungen notwendig, das Serum oder Plasma so
nah wie möglich am natürlichen Zustand zu halten. Dies ist oft mit Bemühungen verbunden, Serum oder Plasma nach verschiedenen
absichtlich vorgenommenen oder unerwünschten Veränderungen wieder in seinen natürlichen Zustand zu bringen. Konserviertes
Serum oder Plasma.können auch auf anderen Anwendungsgebieten,
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wie als Impfstoffe, ^-Globuline und als spezielle Antikörper-
oder Antigensubstanζen verwendet werden.
Eine Konservierungsmethode für Serum oder Plasma ist die, die Substanz einzufrieren und im gefrorenen Zustand zu halten.
Dies erfordert jedoch besondere Handhabung und Einrichtungen, um die Substanz die ganze Zeit über im gefrorenen Zustand zu
halten.
Andererseits sind schon Serummengen als Block gefroren und anschließend
lyophilisiert worden. Dies führt jedoch zu einem langsamen Gefrieren und dadurch zu einer Verschlechterung der
Enzyme und anderer Bestandteile. Außerdem bereitet die Rekonstitution des lyophilisierten Serums durch Auflösen in V/asser
Schwierigkeiten, da oft mehr als 20 bis 30 Minuten benötigt werden. Oft stört auch ein Mangel an Klarheit sich anschließende
fotometrische Analysen, die mit dem wiederhergestellten Serum durchgeführt werden.
Man hat sich auch bemüht, dem durch das langsame Gefrieren bedingten
Enzymabbau dadurch entgegenzuwirken, daß man Enzyme und andere Bestandteile vollständig aus dem Serum entfernte
und vorbestimmte Mengen dieser Substanzen einwog, um nach dem Gefrieren und dor Trocknung des Produktes konstante Gehalte
zu erzielen. Die Probleme der Trübheit oder der langen Rekonstitutionszeit werden jedoch durch diese Methode nicht beseitigt.
Außerdem stellt das Gewicht eines Enzymes nicht ganz echt die Menge an zugesetztem Material dar. Da Enzyme dem Abbau
unterliegen ist das echte Maß für die Enzymkonzentration die Aktivität, für die das Gev/icht nicht der richtige Ersatz
ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft neues homogenes lyophilisiertes
Serum- oder Plasmaprodukt und ein Verfahren zu dessen Herstellung, wobei Serum oder Plasma in Form von Tröpfchen in ein
Fluor-
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kohlenstoff-Kältemittel gesprüht und anschliessend lyophilisiert
wird. Das neue Produkt hat bestimmte Vorteile. Zu diesen Vorteilen gehören rasches Auflösen, Klarheit beim Auflösen,
Stabilität der Enzyme und leichte Handhabung des fertigen Produktes. Genauer gesagt, wird "bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren das Serum oder Plasma in.ein sich "bewegendes Bad
aus siedendem ITuorkohlenstoff-Kältemittel gesprüht, das- eine
Temperatur unter etwa -20° C hat. Das Versprühen erfolgt in ausreichender Höhe über dem Kältemittel, so daß Tröpfchen aus
dem Serum, oder Plasma gebildet werden. Die Tröpfchen, die
sehr rasch im Kältmittel gefrieren, werden dann bei einer Temperatur, die zur Sublimation des Wasser aus den Tröpfchen
führt, unter ein Vakuum gesetzt. Die dabei erhaltenen Partikel läßt man auf Raumtemperatur und Druck kommen und es
können Portionen von passender oder vorbestimmter Größe entfernt werden.
Mit dem Versprühen des Serums oder Plasmas in siedendes Pluorkohlenstoff-Kältemittel
in Porm von Tröpfchen wird rasches Gefrieren erreicht. Die Tröpfchenform "bietet dem kalten Milieu
eine große -wirksame Oberfläche und beschleunigt daher rasches Gefrieren. Die Hähe des Siedepunktes des Fluorkohlenstoff-Kältemittels
zur Temperatur der Tröpfchen erzeugt weniger Dampfbarriere rund um die Tröpfchen als Kältmittel mit niedrigeren
Siedepunkten, wie flüssiger Stickstoff. Auch die sich ergebende teilchenförmige Beschaffenheit des Produktes scheint
teilweise für sein rascheres Auflösen verantv/ortlich zu sein.
Das rasche Gefrieren des Serums oder Plasmas führt zu einer
größeren Stabilität ihrer Enzyme und anderer Substanzen. Das Gefrieren von Enzymlösungen scheint im allgemeinen abbauende
Wirkungen auf die Enzyme selbst zu nahen. Erfolgt das Gefrieren jedoch rascher, so ist der Abbau der Enzyme geringer. Es
gibt keine spezielle kritische Temperatur für die Enzyme; wenn jedoch das Gefrieren sehr rasch erreicht werden kann, so kann
im wesentlichen die gesamte Enzymaktivität erhalten bleiben.
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Man merkt auch, daß das rasche Gefrieren zu einem lyophilisierten
Produkt mit größerer Klarheit beim anschließenden Auflösen führt. Langsames Gefrieren läßt die Bildung eines
Konzentrationsgefälles zu. Dies zv/ingt die Cholesterin- und Triglyzeridtröpfchen im Serum oder Plasma dazu, zu koaleszieren.
Diese Tröpfchen redispergieren offensichtlich nicht "beim Auflösen in einem wässrigen Lösungsmittel sondern bleiben
koalesziert und erzeugen die beobachtete Trübung.
Außerdem ist das resultierende teilchenförmige Produkt von großer Homogenität und es kann durch die vorteilhafte
Methode des Auswiegens bestimmter Mengen des trockenen Produktes gleichmäßig zugeteilt werden. Das inhomogene Produkt
der bekannten Langsamgefriermethode kann nach dem Lyophilisieren nicht ausgewogen werden sondern erfordert vielmehr
eine volumetrische Zuteilung vor dem Gefrieren.
Darüber hinaus kann das Gewicht der entnommenen Portionen so gewählt werden, daß jede Portion eine vorbestimmte spezifische
Menge eines speziellen Bestandteiles enthält, vorzugsweise Natrium, der durch das Gefrieren und Lyophilisieren
unbeeinflußt bleibt. Man analysiert kleine Mengen des Produktes, um ihre Natriumkonzentration zu bestimmen. Dies gestattet
die Bestimmung der Größe der Portionen, die eine genaue Menge Natrium enthalten. Man fand, daß Portionen, die
diese spezifische Natriummenge enthalten, im allgemeinen auch die gewünschten Mengen der meisten anderen Bestandteile enthalten.
Schließlich sorgt das Raschgefrieren für eine gleichmäßige Verteilung der Serum- oder Plasmakomponenten in den gefrorenen
Partikeln und verhindert die Ausbildung großer Eiskristalle. Die homogene Verteilung dieser Kristalle und damit der resultierenden
Poren, sobald die Partikel lyophilisiert sind, scheint auch zu den kurzen Auflösungszeiten beim Auflösen der Partikel
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.er
beizutragen. Man hat Auflösungszeiten von 20 "bis 30 Sekunden
gefunden, gegenüber 20 bis 30 Minuten bei den bekannten Produkten.
Vor dein Gefrieren können verschiedene andere Bestandteile dem
Serum oder Plasma zugesetzt oder entzogen werden. Insbesondere kann ein Bestandteil zur Regelung des pH-Wertes, den das
fertige lyophilisierte Produkt erhält, wenn es in einem neutralen
wässrigen Lösungsmittel aufgelöst wird, zugegeben werden. Dies ist besonders wichtig, da die Lyophilisierung
die Entfernung unbestimmter CO„-Mengen bewirkt und daher
den pH-Wert, den das fertige Produkt beim Auflösen erzeugt, anhebt. Die Menge des zuzugebenden Satiren Bestandteiles wird
bestimmt, in dem man kleine Mengen Serum vor dem Gefrieren nimmt, verschiedene Mengen Säure zu jeder Probe gibt, sie
gefriert und lyophilisiert, sie in Wasser auflöst und den
pH einer jeden Probe bestimmt. Die Verwendung von wenigstens · drei derartigen Lösungen·ergibt eine Eichkurve für die Säuremenge,
die vor dem Gefrieren zu dem Serum oder Plasma gegeben v/erden muß, damit man den gewünschten pH-Wert beim Auflösen
des fertigen lyophilisierten Produktes erhält. Der endgültige
pH sollte im·allgemeinen im Bereich von 7,1 bis 7,4 liegen. . '
Serum und Plasma bleiben übrig, wenn man vom Blut das teilchenförmige
Material abgetrennt hat, was oft durch Zentrifugieren erfolgt. Bei der Gewinnung von Plasma gibt man ein
die Gerinnung verhütendes Mittel, gewöhnlich Natriumzitrat,
zum frischen Blut unmittelbar nach seiner Gewinnung, um die Ausfällung von Fibrinogen zu verhüten, dieses Mittel bildet
daher einen Bestandteil des Plasmas. Pur die Gewinnung von Serum wird kein derartiges die Gerinnung verhütendes Mittel
zugesetzt, Fibrinogen fällt aus und es wird während der Abtrennung zusammen mit dem zelligen Material entfernt.
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Die Grosse der beim Einsprühen des Serums in das Kältemittel
gebildeten Tröpfchen ist die Grosse der resultierenden Partikel
nach der Lyophilisierung. Es empfiehlt sich die Flüssigkeit durch Nadeln der Stärke 16 bis 28 zu versprühen (Nadelstärke nach
Stubbs). Nadeln mit Sondenspitzen werden gegenüber Nadeln mit
abgeschrägten Spitzen bevorzugt. Verwendet man eine Nadel mit einer Stärke, die geringer ist als 28, so führt dies zu so
kleinen Partikeln, dass elektrostatische Effekte dazu beitragen, die Leichtigkeit ihrer Handhabung zu beeinträchtigen. Verwendet
man eine Nadel, die eine Bohrung von mehr als Stärke hat, so werden so grosse Partikel gebildet, dass sie zum Zerbrechen
neigen, was ihr freies FÜessen und die Leichtigkeit
der Handhabung beeinträchtigen kann. Ausserdem ist die Produkthemogenität
eher gewährleistet, wenn die Partikel nicht zerbrochen
werden. Jegliches durch das Gefrieren verursachte Konzentrationsgefälle entwickelt sich innerhalb eines jeden Parti·-
kels. Durch unzerbrochene Partikel werden die Dehomogenisierungseffekte
irgend eines Konzentrationsgefälles, das sich beim Gefrieren entwickelt, eliminiert,
Fluorkohlenstoff-Kältemittel haben im allgemeinen einen höheren Siedepunkt als andere flüssige Kältemittel, wie z. B.
flüssiger Stickstoff. Der höhere Siedepunkt, der näher bei der Temperatur der Serum- oder Plasmatröpfchen liegt, hat
zur Folge, dass sich weniger von einer Dampfphasenbarriere zwischen den Partikeln und dem Kältemittel bildet. Dies ermöglicht
ein rascheres Gefrieren der Partikel. Dieses rasche Gefrieren vereitelt auch den Verlust an Serum- oder Plasmabestandteilen,
die andernfalls in der Fluorkohlenstoffverbindung löslich sein würden. Die Verluste an Cholesterin
und Triglyzeriden haben sich daher als vernachlässigbar erwiesen, obgleich dies organische Verbindungen sind, die normalerweise
in der Fluorkohlenstoffverbindung löslich sind. Bei einer niedrigeren Hachweisgrenze von 2 - 3 % wurde kein
Verlust dieser Substanzen gefunden.
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IPD-3 . ' '
Von den verschiedenen Fluorkohlenstoff-Kältemitteln (die
E. I. du Pont de Nemours and Company aus Wilmington, Delaware, unter dem Viarenzeichen "Preon " vertreibt) stellt Dichlordifluormethan
(Freon® 12) ein bevorzugtes Beispiel dar. Dieses Kältemittel siedet bei etwa -25° C. Verleiht man dem
Fluorkohlenstoff-Kältemittel eine schwache Bewegung, wenn das Serum oder Plasma hineingesprüht wird, so werden die gefrierenden
Partikel getrennt und ihre Agglutination wird verhütet.
Die fest-gefrorenen Partikel sollten dann lycphilisiert werden,
dabei ist darauf zu achten, dass zwischendurch kein Auftauen' · stattfindet. Die Lyophilisierung erfolgt dadurch, dass man
die Partikel im gefrorenen Zustand unter ein Vakuum setzt und danach so viel Wärme zuführt, dass die Sublimationswärme
kompensiert wird. Da die Partikel unter Vakuum stehen, kann die Temperatur bis zu einem Punkt erhöht werden, an dem die
Partikel unter atmosphärischem Druck tauen würden. Bei 50
bis 70 mm Hg z. B. können -die Partikel für kurze Zeit zu Beginn der Lyophilisierung auf ^9° C erwärmt werden, dann
lässt man sie ins Gleichgewicht mit Raumtemperatur kommen, um Wärrne-Denaturierung zu verhüten. Die Sublimation sollte fortgesetzt
werden, bis die Partikel trocken sind.
Nach der Sublimation werden die Partikel auf Raumdruck und auch auf Raumtemperatur gebracht, falls sie nicht schon diese
Temperatur haben. Portionen der Partikel werden dann nach Belieben entnommen.
Das erhaltene Produkt besteht aus freifliessenden sphärischen Teilchen, vorzugsweise mit wenigstens 90 % Poren. Vorzugsweise
haben die Teilchen keinen Durchmesser von mehr als etwa 1 mm. Jedes der Partikelchen besteht aus den Bestandteilen des Serums
oder Plasmas indan Verhältnissen, in denen sie in der ursprünglichen Flüssigkeit vorlagen. Ausserdem ist jedes Kügelchen wegen
des raschen Gefrierens im allgemeinen durch und, durch homogen.
Die Standard-Auflösungszeit für die Partikelchen, bestimmt nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode, überschreitet nicht
2 Minuten.
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Da die Zusammensetzung des Produktes von Partikel zu Partikel nicht schwankt, kann das Produkt in Portionen einer gewünschten
Größe ausgewogen werden. Dieses Wägen eines trockenen Produktes ist bequemer und ist mit weniger Fehlern behaftet
als volumetrische Messungen der Flüssigkeit.
Verteilt man das Produkt nach Gewicht, so entnimmt man Portionen, die die gewünschte Menge eines speziellen Bestandteiles
enthalten, aus der Masse der lyophilisierten Partikel. Da die Anteile der meisten der verschiedenen Bestandteile im
Serum oder Plasma im allgemeinen während der Lyophilisierung unverändert bleiben, ist gewährleistet, daß ein aus der
Masse entnommener Anteil eine vorbestimmte Menge eines speziellen Bestandteiles enthält und es ist im allgemeinen'gewährleistet,
daß dieser Teil spezifische Mengen der meisten anderen Bestandteile des Serums oder Plasmas enthält. Insbesondere,
wenn die Größe der Portion so gewählt wird, daß beim Auflösen in einer vorgeschlagenen Menge Wasser die Konzentration
eines speziellen Bestandteils derjenigen im ursprünglichen Serum oder Plasma entspricht, findet man, daß
auch die Konzentration der anderen Bestandteile im Serum oder Plasma dicht bei der der ursprünglichen Lösung liegt..
Natrium ist einer der Bestandteile, der zur Bestimmung der . Größe der zu entnehmenden Portionen verwendet v/erden kann.
Natrium hat den besonderen Vorteil, daß es durch die Lyophilisierung nicht angegriffen wird und unter verschiedenen Bedingungen
nicht an Aktivität verliert, wie die Enzyme. Im allgemeinen beträgt die normale Natriumkonzentration im Serum
oder Plasma ungefähr 140 Milliäquivalente pro Liter. Die Portionen sollten daher so gewählt werden, daß beim Auflösen
in der richtigen Wassermenge Natriumkonzentrationen erhalten werden, die ungefähr der obigen entsprechen, der Bereich von
135 bis 143 Milliäquvalentepro Liter ist akzeptabel.
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Eine zweckdienliche und genaue Methode zur NatriumbeStimmung
ist die Flammenfotometrie. Eine kleine Menge der lyophilisierten Partikel wird auf ihren Natriumgehalt pro Gewichtseinheit
analysiert. Diese Ergebnisse legen dann die Gewichtsmenge lyophilisierter Partikel fest, die entnommen werden muß, damit
man die vorbestimmte Natriunnnenge in jeder Portion erhält.
Wenn ungewöhnliche Bestandteilkonzentrationen gewünscht werden, können Portionen, die größere oder kleinere Gewichtsmengen an Natrium (oder irgend einem anderen besondern Bestandteil)
haben, aus der Masse entnommen werden.
Durch die Lyophilisierung geht jedoch ein !Teil des gelösten
Kohlendioxyds im Serum oder Plasma verloren. Dadurch steigt der pH des Endproduktes beim Auflösen in destilliertem Wasser
auf einen unnormal hohen Viert. Ein anderes nachteiliges Ergebnis des COp-Verlustes und der damit verbundenen pH-Erhöhung
ist der Verlust an Bestandteilen, die pH-empfindlich sind. Ein derartiger Bestandteil ist Glutaminsäure-Pyruvat-Transaminase
(GPT).
Eine Methode, diesem Kohlendioxydverlust entgegenzuwirken, wäre
die, vor dem Gefrieren so viel Säure zur Serum- oder Plasmalösung zu geben, daß der pH dieser lösung auf eine vorbestimmte
Höhe gebracht wird. Die'Schwierigkeit mit dieser Methode
liegt jedoch in der Tatsache, daß die exakte Kohlendioxydmenge, die beim Lyophilisieren verlorengeht, von Serumansatz
zu Serumansatz schwankt. Mit dieser Methode wird daher in verschiedenen Ansätzen kein einheitlicher pH-Wert beim
Auflösen erreicht.
Alternativ können vor dem Gefrieren unterschiedliche Säuremengen zu mehreren aliquoten Anteilen des Serums oder Plasmas
gegeben werden. Diese aliquoten Anteile mit dem Säurezusatz können dann lyophilisiert werden (beispielsweise nach üblichen
Techniken) in Wasser wieder aufgelöst und jeweils auf ihren
— Q «=
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AO
pH-Wert analysiert werden. Dies ergibt eine Standardkurve: pH gegen zum ursprünglichen Serum oder Plasma gegebene
Säuremenge. Diese Kurve zeigt dann die richtige Säuremenge, die zugegeben v/erden muß, damit das lyophilisierte Produkt
den richtigen pH hat.
Eine für diesen Zweck geeignete Säure ist 4n Zitronensäure. Im allgemeinen ergeben 20 bis 23 Milliäquivalente Säure pro
Liter Serum oder Plasma ein Endprodukt mit dem gewünschten pH von 7,1 - 7,4 beim Auflösen in destilliertem Wasser. Außerdem
können vor dem Gefrieren andere Bestandteile der Serurc- oder Plasmalösung zugesetzt oder entnommen werden, um einen
gewünschten Effekt im speziellen Falle zu erzielen. Bei der Zugabe der Säure sollte man den jill der Lösung nicht unter
etwa 6,0 absinken lassen; niedrigere pH-Werte näheren sich dem isoelektrischen Punkt der Proteine im Serum. Dies würde
die Ausfällung der Proteine aus der Lösung verursachen und die Endergebnisse nachteilig beeinflussen. Im allgemeinen
jedoch macht die bei der Lyophilisierung verlorengegangene COp-Menge es nicht erforderlich, daß eine so große Menge
Säure zugegeben wird, daß der pH unter 6,0 absinkt.
Beispiel ι
Zu drei 50 ml Portionen frischen Serums gibt man 288 jal, 325jul
und 350,Ul einer 4n Zitronensäure. Diese Portionen werden gefroren
(im Block) und unter 100 mm Hg oder weniger bei Umgebungstemperatur
lyophilisiert. Die lyophilisierten Rückstände
der Portionen werden eingeweicht. 500 mg jeder der drei eingeweichten Rückstände ergeben beim Auflösen in 5 ml destilliertem
Wasser pH-Werte von 7,5, 7,4 bzw. 7,25 und zeigen, daß eine Zugabe von 7,0 ml einer 4n Zitronensäure pro Liter Serum
einen pH von 7,25 beim Auflösen des Produktes in destilliertem Wasser ergeben würde. Dementsprechend wird diese Menge Zitronensäure
dem Serum zugesetzt.
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Das Serum wird dann aus Nadeln mit Sondenspitze und von der Stärke 26 (nominale Bohrung 0,251 mm) bei 1,05 bis 1 S'1O kg/cm2
(15 - 20 psi) in bewegtes, siedendes Dichlordifluormethan-KaIt1
hat.
hat.
Kältemittel versprüht, das eine Temperatur von etwa -25° C
Die gefrorenen Tröpfchen werden kontinuierlich mit einem Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,177 mm (80 mesh)
eingesammelt und in Keramikschalen bis zu einer Dicke von nicht mehr als 2,54 cm (1 inch) geschüttet und unter einVakuum
von etwa 50 - 70 mm Hg gesetzt, bei einer Temperatur von 49° C am Anfang, die man kurz danach sich auf Raumtemperatur
angleichen lässt.
Drei Proben von 420, 440 und 493 mg lyophilisierte' Partikel
werden mit 5 ml destilliertem Wasser wieder aufgelöst und
flammeηfotometrisch auf Natriumgehalt analysiert und man
findet, dass·sie 124, 131, bzw. l4o mäqu/1 enthalten. Das ursprüngliche
Serum enthielt l40 mäqu/1 Natrium. Dementsprechend werden 493 mg-Portionen Partikel entnommen und in Ampullen
für die Wiederauflösung mit 5 ml destilliertem Wasser gegeben. Die Partikel werden bis zur Wiederauflösung bei-etwa
5 C im Kühlschrank gehalten.
Eine derartige Portion lyophilisiertes Produkt wird wieder aufgelöst und auf die verschiedenen Bestandteile analysiert.
Tabelle I enthält die Ergebnisse:
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I | Bestandteil | Mittelwert | Tabelle I | N | |
Glucose - Orig. P.S. |
93,1 mg/dl 89,3 |
Standard- Abweichung |
5 | ||
LDH - Orig. P.S. |
153 uts·. 127 |
1,58 4,87 |
4 | ||
PCHE - Orig. P.S. |
12,32 uts. 11,98 |
4,76 3,41 |
5 | ||
GPT - Orig. P.S. |
12,8 uts. 9,2 |
0,39 0,41 |
5 | ||
co σ co |
GOT - Orig. P.S. |
31,2 uts. 24 |
2,95 0,45 |
5 | |
OO CD |
CPK - Orig. P.S. |
73,6 uts. 56 |
1,92 2,0 |
5 | |
■ν» | ALK.P - Orig. P.S. |
9,4 uta./dl 5,9 |
2,96 1,41 |
5 | |
Albumin - Orig. P.S. |
4,32 g/dl 4,5 g/dl |
3,79 0,77 |
5 | ||
T.P. - Orig. P.S. |
7*38 g/dl 7,20 g/dl |
0,012 0,007 |
5 | ||
BUN - Orig. P.S. |
19,2 mg/dl 18,75"mg/dl |
0,028 0,038 |
5 | ||
0,28 0,09 |
|||||
Methode
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197 (1939)
R. Nadeau, U.S. Patent No. 3 485
22A30H
IPD-3
L3DH - Milchsäure-Dehydrogenase
PGHE - Pseudocholinesterase
GPT - Glutaminsäure-Pyruvat-Transaminase
GOT - Aspärtat-Aminotransferase
CPK - Creatin-Phosphokinase .
ALK.P - Alkalische Phosphatase
T.P. - Gesamtprotein
BM - Blutharnstoff-Stickstoff
Orig. - Originalserum
P.S. - Gefrierversprühtes Serum
Die Tabelle' gibt die Ergebnisse der Tests wieder, die mit
Originalserum ("Orig.") und dem gefrierversprühten Serum
der vorliegenden Erfindung ("P.S.") durchgeführt worden sind. Die meisten Bestandteile verloren im allgemeinen,
wenn überhaupt, wenig Aktivität durch das Verfahren. Die Abweichungen vom Standard, wo welche erhalten wurden, entsprechen
etwa denjenigen für das ursprüngliche Serum und sind bei GPT und OPK besser und für Glucose etwas schlechter.
,
Die Zunahme der Trübung wurde für herkömmliche und die erfindungsgemäßen
Gefrierversprühungs-Lyophilisierungen gemessen. Das teilchenförmige Produkt der Methode der Gefrieryersprühung
ergibt weniger als 20 % der Trübungszunähme, die
mit dem Produkt der herkömmlichen Lyophilisierung beobachtet wird.
- 13 -. 3 0 9 8 10/1121
22430U
JH-
Man stellt Blutserum durch Zugabe von 6,25 nil 4n Zitronensäure
je Liter Serum auf einen pH-Wert von 7>^ ein. Das Blutserum
wird dann in Teile A, B und C aufgeteilt. Eine Anzahl von 5»3-ml-Anteilen
von Teilen A und B gibt man in rechteckig-zylindrische Glasgefasse, welche einen Innendurchmesser von 20 mm und eine
Innenlänge von 30 mm, d, h. von dem Gefässboden bis zur inneren
Oberfläche des Verschlussstopfens aufweisen. In den nicht verschlossenen Glasgefässen A und B wird das Blutserum in üblicher
Weise eingefroren und lyophilisiert. Das erhaltene kuchenartige Produkt hat annähernd die Form des Bodenteils des Glasgefässes.
Das Gewicht ons lyophilisierten Serums in jedem der Glasgefässe A und B beträgt 500 + 5 mg. Das lyophilisierte Serum in den
Glasgefässen B wird mazeriert, d. h. es wird fein zerkleinert ,indem man es im Glasgefäss mit einem Spatel aufbricht.
Die Glasgefässe A und B werden verschlossen und bei 4 bis 10° C
gelagert.
Teil C wird entsprechend der Verfahrensweise des Beispiels 1
gefrierversprüht und lyophilisiert. Das erhaltene Produkt C besteht aus sphärischen, hochporösen, frei fliessenden Teilchen,
die alle durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,84 mm hindurchgehen, d. h. die Teilchen haben eine Grosse,
die nicht über 840 Mikron Durchmesser hinausgeht. Man gibt Anteile des Produktes C, die jeweils 500 mg wiegen, in Glasgefässe,
wie sie oben beschrieben sind, verschliesst diese und lagert sie bei 4 bis 10° C.
Man bestimmt die Standard-Auflösungszeit für die Produkte Λ, Β
und C nach dem nachfolgend wiedergegebenen Verfahren. Jeweils 5 ml deionisiertes Wasser (R ^ 1 Megaohm) werden bei 25 - 2° C
rasch in eine Reihe von Glasgefässen der Gruppen A, B und C
(die vorher sich auf dieselbe Temperatur einstellen konnten) durch Einpipettieren aus einer automatischen Pipettenvorrichtung
gegeben, wobei die Abgabespitze der Pipette in Berührung steht
BAD OR»G»NAL
309810/ 1121
- 14 -
- 14 -
/Γ
mit der Innermandoberflache jedes Glasgefässes. Jedes Glasgefäss
wird dann rasch mit einem Stopfen verschlossen und auf
elektrisch angetriebene, umlaufende Walzen gegeben, wobei die zylindrische Achse des Glasgefässes horizontal ist. Die Zeit
von der Zugabe des Wassers bis zur Anordnung des Glasgefässes auf den umlaufenden Walzen übersteigt nicht etwa 5 Sekunden.
Die Walzen rotieren mit einer solchen Geschwindigkeit, dass
die Glasgefasse mit 32 Umdrehungen je Minute gedreht v/erden.
Die Auflösungsgeschwindigkeit wird dadurch überprüft, dass man Glasgefässe von den Walzen in bestimmten Zeitintervallen entfernt. Man entfernt rasch den Stopfen und entfernt durch eine Probenpipette 100 ul der flüssigen Probe, welche dann auf Gesamtprotein durch colorimetrische Prüfung nach H. L.
Rosenthal und H. T. Cundiff , Clinical Chemistry, Bd. 2
(1956), Seite 394, untersucht wird. Die unten wiedergegebenen Werte für -die Standard-Auflösungszeit der Produkte A, B und C wurden aus einer graphischen Darstellung der Auflösung {%) auf der Ordinate gegen die auf- den umlaufenden Walzen verstrichene Zeit (Sekunden) auf der Abszisse bestimmt. 100 % Auflösung entspricht einem Wert von 7 g Protein je 100 ml Blutserum.
elektrisch angetriebene, umlaufende Walzen gegeben, wobei die zylindrische Achse des Glasgefässes horizontal ist. Die Zeit
von der Zugabe des Wassers bis zur Anordnung des Glasgefässes auf den umlaufenden Walzen übersteigt nicht etwa 5 Sekunden.
Die Walzen rotieren mit einer solchen Geschwindigkeit, dass
die Glasgefasse mit 32 Umdrehungen je Minute gedreht v/erden.
Die Auflösungsgeschwindigkeit wird dadurch überprüft, dass man Glasgefässe von den Walzen in bestimmten Zeitintervallen entfernt. Man entfernt rasch den Stopfen und entfernt durch eine Probenpipette 100 ul der flüssigen Probe, welche dann auf Gesamtprotein durch colorimetrische Prüfung nach H. L.
Rosenthal und H. T. Cundiff , Clinical Chemistry, Bd. 2
(1956), Seite 394, untersucht wird. Die unten wiedergegebenen Werte für -die Standard-Auflösungszeit der Produkte A, B und C wurden aus einer graphischen Darstellung der Auflösung {%) auf der Ordinate gegen die auf- den umlaufenden Walzen verstrichene Zeit (Sekunden) auf der Abszisse bestimmt. 100 % Auflösung entspricht einem Wert von 7 g Protein je 100 ml Blutserum.
Produkt Standard-Auflösungszeit
t~ ot 7
A 1200
B 1200
C 90
Im visuellen Vergleich zeigen die Lösungen, die man durch vollständige
Wiederauflösung der Produkte A und B erhalten hat,
eine beträchtlich grössere Trübung als die Lösung, welche man durch vollständige Wiederauflösung des Produktes C erhalten hat,
eine beträchtlich grössere Trübung als die Lösung, welche man durch vollständige Wiederauflösung des Produktes C erhalten hat,
309810/1 1 21
- 15 -
Claims (5)
- Patentansprüche
- 2. Lyophilisiertes Serum- oder Plasmaprodukt gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen einen Durchmesser von nicht mehr als 1 mm aufweisen.
- 3· Lyophilisiertes Serum- oder Plasmaprodukt gemäss Ansprüchen 1 oder.2, dadurch gekennzeichnet, dass die Standard-Auflösungszeit der Teilchen 2 Minuten nicht überschreitet.
- 4. Lyophilisiertes Serum- oder Plasmaprodukt gemäss einem
der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, dass die sphärischen Teilchen zu wenigstens 90 % porös sind. - 5. Verfahren zur Herstellung eines homogenen, lyophilisferten Serum- oder Plasmaproduktes, dadurch gekennzeichnet, dassa) eine Serum- oder Plasmalösung in Form von Tröpfchenin ein sich bewegendes Bad aus siedendem Pluorkohlenstoff-Kältemittel gesprüht wird, das eine Temperatur unter etwa -20° C hat, so dass die Tröpfchen gefroren werden;b) die gefrorenen Tröpfchen unter ein Vakuum gesetzt werden;c) die Tröpfchen danach, unter Beibehaltung des Vakuums, auf eine solche Temperatur gebracht werden, dass im wesentlichen das gesamte Wasser in den Tröpfchen sublimiert und aus den Tröpfchen Partikel gebildet werden; und309810/ 112 122A30UIPD-3d) man die Partikel auf Raumtemperatur und -druck kommen lässt.309810/1-12- 17 -
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DE (1) | DE2243014C2 (de) |
FR (1) | FR2154452B1 (de) |
GB (1) | GB1395651A (de) |
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NL (1) | NL174429C (de) |
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Cited By (1)
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JPS61111909U (de) * | 1984-12-24 | 1986-07-15 | ||
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- 1972-09-01 CA CA150,851A patent/CA980249A/en not_active Expired
- 1972-09-01 FR FR7231155A patent/FR2154452B1/fr not_active Expired
- 1972-09-01 DE DE19722243014 patent/DE2243014C2/de not_active Expired
- 1972-09-01 SE SE1138772A patent/SE425461B/xx unknown
- 1972-09-01 GB GB4066272A patent/GB1395651A/en not_active Expired
- 1972-09-01 NL NL7211923A patent/NL174429C/xx not_active IP Right Cessation
- 1972-09-02 JP JP8759372A patent/JPS5727422B2/ja not_active Expired
- 1972-09-02 IT IT2878872A patent/IT1043886B/it active
- 1972-09-04 CH CH1298572A patent/CH574590A5/xx not_active IP Right Cessation
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NL7211923A (de) | 1973-03-06 |
FR2154452B1 (de) | 1976-03-05 |
SE425461B (sv) | 1982-10-04 |
NL174429B (nl) | 1984-01-16 |
IT1043886B (it) | 1980-02-29 |
JPS4835027A (de) | 1973-05-23 |
CA980249A (en) | 1975-12-23 |
DE2243014C2 (de) | 1986-05-28 |
CH574590A5 (de) | 1976-04-15 |
NL174429C (nl) | 1984-06-18 |
JPS5727422B2 (de) | 1982-06-10 |
FR2154452A1 (de) | 1973-05-11 |
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OD | Request for examination | ||
D2 | Grant after examination | ||
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