DE2243014A1

DE2243014A1 - Lyophilisiertes serum oder plasma und verfahren zu dessen herstellung

Info

Publication number: DE2243014A1
Application number: DE19722243014
Authority: DE
Inventors: Anglis Ray Briggs; Thomas John Maxwell
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1971-09-03
Filing date: 1972-09-01
Publication date: 1973-03-08
Also published as: NL7211923A; FR2154452B1; SE425461B; NL174429B; IT1043886B; JPS4835027A; CA980249A; DE2243014C2; CH574590A5; NL174429C; JPS5727422B2; FR2154452A1; GB1395651A

Description

E. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY 10th Market Streets, Wilmington, Delaware 19893.,. V.St.A.

Lyophilisiertes Serum oder Plasma und Verfahren zu dessen Herstellung

Die Erfindung betrifft ein neues lyophilisiertes Serum- oder Plasmaprodukt sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Serum oder Plasma von bekanntem Gehalt werden wegen ihrer grossen chemischen und physikalischen Ähnlichkeit mit Proben, die tatsächlich getestet werden sollen, als Standard- oder Kontrollsubstanzen bei klinischen Analysen verwendet. Die sich rasch verschlechternde Beschaffenheit vieler Serum- oder Piasmabestandteile macht Anstrengungen notwendig, das Serum oder Plasma so nah wie möglich am natürlichen Zustand zu halten. Dies ist oft mit Bemühungen verbunden, Serum oder Plasma nach verschiedenen absichtlich vorgenommenen oder unerwünschten Veränderungen wieder in seinen natürlichen Zustand zu bringen. Konserviertes Serum oder Plasma.können auch auf anderen Anwendungsgebieten,

309810/1121

BAD ORIGINAL

22A30H

IPD-3

wie als Impfstoffe, ^-Globuline und als spezielle Antikörper- oder Antigensubstanζen verwendet werden.

Eine Konservierungsmethode für Serum oder Plasma ist die, die Substanz einzufrieren und im gefrorenen Zustand zu halten. Dies erfordert jedoch besondere Handhabung und Einrichtungen, um die Substanz die ganze Zeit über im gefrorenen Zustand zu halten.

Andererseits sind schon Serummengen als Block gefroren und anschließend lyophilisiert worden. Dies führt jedoch zu einem langsamen Gefrieren und dadurch zu einer Verschlechterung der Enzyme und anderer Bestandteile. Außerdem bereitet die Rekonstitution des lyophilisierten Serums durch Auflösen in V/asser Schwierigkeiten, da oft mehr als 20 bis 30 Minuten benötigt werden. Oft stört auch ein Mangel an Klarheit sich anschließende fotometrische Analysen, die mit dem wiederhergestellten Serum durchgeführt werden.

Man hat sich auch bemüht, dem durch das langsame Gefrieren bedingten Enzymabbau dadurch entgegenzuwirken, daß man Enzyme und andere Bestandteile vollständig aus dem Serum entfernte und vorbestimmte Mengen dieser Substanzen einwog, um nach dem Gefrieren und dor Trocknung des Produktes konstante Gehalte zu erzielen. Die Probleme der Trübheit oder der langen Rekonstitutionszeit werden jedoch durch diese Methode nicht beseitigt. Außerdem stellt das Gewicht eines Enzymes nicht ganz echt die Menge an zugesetztem Material dar. Da Enzyme dem Abbau unterliegen ist das echte Maß für die Enzymkonzentration die Aktivität, für die das Gev/icht nicht der richtige Ersatz ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft neues homogenes lyophilisiertes Serum- oder Plasmaprodukt und ein Verfahren zu dessen Herstellung, wobei Serum oder Plasma in Form von Tröpfchen in ein Fluor-

— 2 —

309810/ 1121

22430U

kohlenstoff-Kältemittel gesprüht und anschliessend lyophilisiert wird. Das neue Produkt hat bestimmte Vorteile. Zu diesen Vorteilen gehören rasches Auflösen, Klarheit beim Auflösen, Stabilität der Enzyme und leichte Handhabung des fertigen Produktes. Genauer gesagt, wird "bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das Serum oder Plasma in.ein sich "bewegendes Bad aus siedendem ITuorkohlenstoff-Kältemittel gesprüht, das- eine Temperatur unter etwa -20° C hat. Das Versprühen erfolgt in ausreichender Höhe über dem Kältemittel, so daß Tröpfchen aus dem Serum, oder Plasma gebildet werden. Die Tröpfchen, die

sehr rasch im Kältmittel gefrieren, werden dann bei einer Temperatur, die zur Sublimation des Wasser aus den Tröpfchen führt, unter ein Vakuum gesetzt. Die dabei erhaltenen Partikel läßt man auf Raumtemperatur und Druck kommen und es können Portionen von passender oder vorbestimmter Größe entfernt werden.

Mit dem Versprühen des Serums oder Plasmas in siedendes Pluorkohlenstoff-Kältemittel in Porm von Tröpfchen wird rasches Gefrieren erreicht. Die Tröpfchenform "bietet dem kalten Milieu eine große -wirksame Oberfläche und beschleunigt daher rasches Gefrieren. Die Hähe des Siedepunktes des Fluorkohlenstoff-Kältemittels zur Temperatur der Tröpfchen erzeugt weniger Dampfbarriere rund um die Tröpfchen als Kältmittel mit niedrigeren Siedepunkten, wie flüssiger Stickstoff. Auch die sich ergebende teilchenförmige Beschaffenheit des Produktes scheint teilweise für sein rascheres Auflösen verantv/ortlich zu sein.

Das rasche Gefrieren des Serums oder Plasmas führt zu einer größeren Stabilität ihrer Enzyme und anderer Substanzen. Das Gefrieren von Enzymlösungen scheint im allgemeinen abbauende Wirkungen auf die Enzyme selbst zu nahen. Erfolgt das Gefrieren jedoch rascher, so ist der Abbau der Enzyme geringer. Es gibt keine spezielle kritische Temperatur für die Enzyme; wenn jedoch das Gefrieren sehr rasch erreicht werden kann, so kann im wesentlichen die gesamte Enzymaktivität erhalten bleiben.

— 3 — 3 0 9 8 10/1121

22430U

IPD-3

Man merkt auch, daß das rasche Gefrieren zu einem lyophilisierten Produkt mit größerer Klarheit beim anschließenden Auflösen führt. Langsames Gefrieren läßt die Bildung eines Konzentrationsgefälles zu. Dies zv/ingt die Cholesterin- und Triglyzeridtröpfchen im Serum oder Plasma dazu, zu koaleszieren. Diese Tröpfchen redispergieren offensichtlich nicht "beim Auflösen in einem wässrigen Lösungsmittel sondern bleiben koalesziert und erzeugen die beobachtete Trübung.

Außerdem ist das resultierende teilchenförmige Produkt von großer Homogenität und es kann durch die vorteilhafte Methode des Auswiegens bestimmter Mengen des trockenen Produktes gleichmäßig zugeteilt werden. Das inhomogene Produkt der bekannten Langsamgefriermethode kann nach dem Lyophilisieren nicht ausgewogen werden sondern erfordert vielmehr eine volumetrische Zuteilung vor dem Gefrieren.

Darüber hinaus kann das Gewicht der entnommenen Portionen so gewählt werden, daß jede Portion eine vorbestimmte spezifische Menge eines speziellen Bestandteiles enthält, vorzugsweise Natrium, der durch das Gefrieren und Lyophilisieren unbeeinflußt bleibt. Man analysiert kleine Mengen des Produktes, um ihre Natriumkonzentration zu bestimmen. Dies gestattet die Bestimmung der Größe der Portionen, die eine genaue Menge Natrium enthalten. Man fand, daß Portionen, die diese spezifische Natriummenge enthalten, im allgemeinen auch die gewünschten Mengen der meisten anderen Bestandteile enthalten.

Schließlich sorgt das Raschgefrieren für eine gleichmäßige Verteilung der Serum- oder Plasmakomponenten in den gefrorenen Partikeln und verhindert die Ausbildung großer Eiskristalle. Die homogene Verteilung dieser Kristalle und damit der resultierenden Poren, sobald die Partikel lyophilisiert sind, scheint auch zu den kurzen Auflösungszeiten beim Auflösen der Partikel

_ 4 _ 30981 0/1121

22430H

IPD-3

.er

beizutragen. Man hat Auflösungszeiten von 20 "bis 30 Sekunden gefunden, gegenüber 20 bis 30 Minuten bei den bekannten Produkten.

Vor dein Gefrieren können verschiedene andere Bestandteile dem Serum oder Plasma zugesetzt oder entzogen werden. Insbesondere kann ein Bestandteil zur Regelung des pH-Wertes, den das fertige lyophilisierte Produkt erhält, wenn es in einem neutralen wässrigen Lösungsmittel aufgelöst wird, zugegeben werden. Dies ist besonders wichtig, da die Lyophilisierung die Entfernung unbestimmter CO„-Mengen bewirkt und daher den pH-Wert, den das fertige Produkt beim Auflösen erzeugt, anhebt. Die Menge des zuzugebenden Satiren Bestandteiles wird bestimmt, in dem man kleine Mengen Serum vor dem Gefrieren nimmt, verschiedene Mengen Säure zu jeder Probe gibt, sie gefriert und lyophilisiert, sie in Wasser auflöst und den pH einer jeden Probe bestimmt. Die Verwendung von wenigstens · drei derartigen Lösungen·ergibt eine Eichkurve für die Säuremenge, die vor dem Gefrieren zu dem Serum oder Plasma gegeben v/erden muß, damit man den gewünschten pH-Wert beim Auflösen des fertigen lyophilisierten Produktes erhält. Der endgültige pH sollte im·allgemeinen im Bereich von 7,1 bis 7,4 liegen. . '

Serum und Plasma bleiben übrig, wenn man vom Blut das teilchenförmige Material abgetrennt hat, was oft durch Zentrifugieren erfolgt. Bei der Gewinnung von Plasma gibt man ein die Gerinnung verhütendes Mittel, gewöhnlich Natriumzitrat, zum frischen Blut unmittelbar nach seiner Gewinnung, um die Ausfällung von Fibrinogen zu verhüten, dieses Mittel bildet daher einen Bestandteil des Plasmas. Pur die Gewinnung von Serum wird kein derartiges die Gerinnung verhütendes Mittel zugesetzt, Fibrinogen fällt aus und es wird während der Abtrennung zusammen mit dem zelligen Material entfernt.

3 0 9 8 10/1121

IPD-3

Die Grosse der beim Einsprühen des Serums in das Kältemittel gebildeten Tröpfchen ist die Grosse der resultierenden Partikel nach der Lyophilisierung. Es empfiehlt sich die Flüssigkeit durch Nadeln der Stärke 16 bis 28 zu versprühen (Nadelstärke nach Stubbs). Nadeln mit Sonde_nspitzen werden gegenüber Nadeln mit abgeschrägten Spitzen bevorzugt. Verwendet man eine Nadel mit einer Stärke, die geringer ist als 28, so führt dies zu so kleinen Partikeln, dass elektrostatische Effekte dazu beitragen, die Leichtigkeit ihrer Handhabung zu beeinträchtigen. Verwendet man eine Nadel, die eine Bohrung von mehr als Stärke hat, so werden so grosse Partikel gebildet, dass sie zum Zerbrechen neigen, was ihr freies FÜessen und die Leichtigkeit der Handhabung beeinträchtigen kann. Ausserdem ist die Produkthemogenität eher gewährleistet, wenn die Partikel nicht zerbrochen werden. Jegliches durch das Gefrieren verursachte Konzentrationsgefälle entwickelt sich innerhalb eines jeden Parti·- kels. Durch unzerbrochene Partikel werden die Dehomogenisierungseffekte irgend eines Konzentrationsgefälles, das sich beim Gefrieren entwickelt, eliminiert,

Fluorkohlenstoff-Kältemittel haben im allgemeinen einen höheren Siedepunkt als andere flüssige Kältemittel, wie z. B. flüssiger Stickstoff. Der höhere Siedepunkt, der näher bei der Temperatur der Serum- oder Plasmatröpfchen liegt, hat zur Folge, dass sich weniger von einer Dampfphasenbarriere zwischen den Partikeln und dem Kältemittel bildet. Dies ermöglicht ein rascheres Gefrieren der Partikel. Dieses rasche Gefrieren vereitelt auch den Verlust an Serum- oder Plasmabestandteilen, die andernfalls in der Fluorkohlenstoffverbindung löslich sein würden. Die Verluste an Cholesterin und Triglyzeriden haben sich daher als vernachlässigbar erwiesen, obgleich dies organische Verbindungen sind, die normalerweise in der Fluorkohlenstoffverbindung löslich sind. Bei einer niedrigeren Hachweisgrenze von 2 - 3 % wurde kein Verlust dieser Substanzen gefunden.

309810/1 121 - 6 -

22430U

IPD-3 . ' '

Von den verschiedenen Fluorkohlenstoff-Kältemitteln (die

E. I. du Pont de Nemours and Company aus Wilmington, Delaware, unter dem Viarenzeichen "Preon " vertreibt) stellt Dichlordifluormethan (Freon® 12) ein bevorzugtes Beispiel dar. Dieses Kältemittel siedet bei etwa -25° C. Verleiht man dem Fluorkohlenstoff-Kältemittel eine schwache Bewegung, wenn das Serum oder Plasma hineingesprüht wird, so werden die gefrierenden Partikel getrennt und ihre Agglutination wird verhütet.

Die fest-gefrorenen Partikel sollten dann lycphilisiert werden, dabei ist darauf zu achten, dass zwischendurch kein Auftauen' · stattfindet. Die Lyophilisierung erfolgt dadurch, dass man die Partikel im gefrorenen Zustand unter ein Vakuum setzt und danach so viel Wärme zuführt, dass die Sublimationswärme kompensiert wird. Da die Partikel unter Vakuum stehen, kann die Temperatur bis zu einem Punkt erhöht werden, an dem die Partikel unter atmosphärischem Druck tauen würden. Bei 50 bis 70 mm Hg z. B. können -die Partikel für kurze Zeit zu Beginn der Lyophilisierung auf ^9° C erwärmt werden, dann lässt man sie ins Gleichgewicht mit Raumtemperatur kommen, um Wärrne-Denaturierung zu verhüten. Die Sublimation sollte fortgesetzt werden, bis die Partikel trocken sind.

Nach der Sublimation werden die Partikel auf Raumdruck und auch auf Raumtemperatur gebracht, falls sie nicht schon diese Temperatur haben. Portionen der Partikel werden dann nach Belieben entnommen.

Das erhaltene Produkt besteht aus freifliessenden sphärischen Teilchen, vorzugsweise mit wenigstens 90 % Poren. Vorzugsweise haben die Teilchen keinen Durchmesser von mehr als etwa 1 mm. Jedes der Partikelchen besteht aus den Bestandteilen des Serums oder Plasmas indan Verhältnissen, in denen sie in der ursprünglichen Flüssigkeit vorlagen. Ausserdem ist jedes Kügelchen wegen des raschen Gefrierens im allgemeinen durch und, durch homogen.

Die Standard-Auflösungszeit für die Partikelchen, bestimmt nach der in Beispiel 2 beschriebenen Methode, überschreitet nicht 2 Minuten.

BAD ORIGINAL

3 0 98 1 0/ 1 1 2 1

22A30U

IPD-3

Da die Zusammensetzung des Produktes von Partikel zu Partikel nicht schwankt, kann das Produkt in Portionen einer gewünschten Größe ausgewogen werden. Dieses Wägen eines trockenen Produktes ist bequemer und ist mit weniger Fehlern behaftet als volumetrische Messungen der Flüssigkeit.

Verteilt man das Produkt nach Gewicht, so entnimmt man Portionen, die die gewünschte Menge eines speziellen Bestandteiles enthalten, aus der Masse der lyophilisierten Partikel. Da die Anteile der meisten der verschiedenen Bestandteile im Serum oder Plasma im allgemeinen während der Lyophilisierung unverändert bleiben, ist gewährleistet, daß ein aus der Masse entnommener Anteil eine vorbestimmte Menge eines speziellen Bestandteiles enthält und es ist im allgemeinen'gewährleistet, daß dieser Teil spezifische Mengen der meisten anderen Bestandteile des Serums oder Plasmas enthält. Insbesondere, wenn die Größe der Portion so gewählt wird, daß beim Auflösen in einer vorgeschlagenen Menge Wasser die Konzentration eines speziellen Bestandteils derjenigen im ursprünglichen Serum oder Plasma entspricht, findet man, daß auch die Konzentration der anderen Bestandteile im Serum oder Plasma dicht bei der der ursprünglichen Lösung liegt..

Natrium ist einer der Bestandteile, der zur Bestimmung der . Größe der zu entnehmenden Portionen verwendet v/erden kann. Natrium hat den besonderen Vorteil, daß es durch die Lyophilisierung nicht angegriffen wird und unter verschiedenen Bedingungen nicht an Aktivität verliert, wie die Enzyme. Im allgemeinen beträgt die normale Natriumkonzentration im Serum oder Plasma ungefähr 140 Milliäquivalente pro Liter. Die Portionen sollten daher so gewählt werden, daß beim Auflösen in der richtigen Wassermenge Natriumkonzentrationen erhalten werden, die ungefähr der obigen entsprechen, der Bereich von 135 bis 143 Milliäquvalentepro Liter ist akzeptabel.

- 8 30981 0/1121

IPD-5 .

Eine zweckdienliche und genaue Methode zur NatriumbeStimmung ist die Flammenfotometrie. Eine kleine Menge der lyophilisierten Partikel wird auf ihren Natriumgehalt pro Gewichtseinheit analysiert. Diese Ergebnisse legen dann die Gewichtsmenge lyophilisierter Partikel fest, die entnommen werden muß, damit man die vorbestimmte Natriunnnenge in jeder Portion erhält. Wenn ungewöhnliche Bestandteilkonzentrationen gewünscht werden, können Portionen, die größere oder kleinere Gewichtsmengen an Natrium (oder irgend einem anderen besondern Bestandteil) haben, aus der Masse entnommen werden.

Durch die Lyophilisierung geht jedoch ein !Teil des gelösten Kohlendioxyds im Serum oder Plasma verloren. Dadurch steigt der pH des Endproduktes beim Auflösen in destilliertem Wasser auf einen unnormal hohen Viert. Ein anderes nachteiliges Ergebnis des COp-Verlustes und der damit verbundenen pH-Erhöhung ist der Verlust an Bestandteilen, die pH-empfindlich sind. Ein derartiger Bestandteil ist Glutaminsäure-Pyruvat-Transaminase (GPT).

Eine Methode, diesem Kohlendioxydverlust entgegenzuwirken, wäre die, vor dem Gefrieren so viel Säure zur Serum- oder Plasmalösung zu geben, daß der pH dieser lösung auf eine vorbestimmte Höhe gebracht wird. Die'Schwierigkeit mit dieser Methode liegt jedoch in der Tatsache, daß die exakte Kohlendioxydmenge, die beim Lyophilisieren verlorengeht, von Serumansatz zu Serumansatz schwankt. Mit dieser Methode wird daher in verschiedenen Ansätzen kein einheitlicher pH-Wert beim Auflösen erreicht.

Alternativ können vor dem Gefrieren unterschiedliche Säuremengen zu mehreren aliquoten Anteilen des Serums oder Plasmas gegeben werden. Diese aliquoten Anteile mit dem Säurezusatz können dann lyophilisiert werden (beispielsweise nach üblichen Techniken) in Wasser wieder aufgelöst und jeweils auf ihren

— Q «=

3098 10/1121

IPD-3

AO

pH-Wert analysiert werden. Dies ergibt eine Standardkurve: pH gegen zum ursprünglichen Serum oder Plasma gegebene Säuremenge. Diese Kurve zeigt dann die richtige Säuremenge, die zugegeben v/erden muß, damit das lyophilisierte Produkt den richtigen pH hat.

Eine für diesen Zweck geeignete Säure ist 4n Zitronensäure. Im allgemeinen ergeben 20 bis 23 Milliäquivalente Säure pro Liter Serum oder Plasma ein Endprodukt mit dem gewünschten pH von 7,1 - 7,4 beim Auflösen in destilliertem Wasser. Außerdem können vor dem Gefrieren andere Bestandteile der Serurc- oder Plasmalösung zugesetzt oder entnommen werden, um einen gewünschten Effekt im speziellen Falle zu erzielen. Bei der Zugabe der Säure sollte man den jill der Lösung nicht unter etwa 6,0 absinken lassen; niedrigere pH-Werte näheren sich dem isoelektrischen Punkt der Proteine im Serum. Dies würde die Ausfällung der Proteine aus der Lösung verursachen und die Endergebnisse nachteilig beeinflussen. Im allgemeinen jedoch macht die bei der Lyophilisierung verlorengegangene COp-Menge es nicht erforderlich, daß eine so große Menge Säure zugegeben wird, daß der pH unter 6,0 absinkt.

Beispiel ι

Zu drei 50 ml Portionen frischen Serums gibt man 288 jal, 325jul und 350,Ul einer 4n Zitronensäure. Diese Portionen werden gefroren (im Block) und unter 100 mm Hg oder weniger bei Umgebungstemperatur lyophilisiert. Die lyophilisierten Rückstände der Portionen werden eingeweicht. 500 mg jeder der drei eingeweichten Rückstände ergeben beim Auflösen in 5 ml destilliertem Wasser pH-Werte von 7,5, 7,4 bzw. 7,25 und zeigen, daß eine Zugabe von 7,0 ml einer 4n Zitronensäure pro Liter Serum einen pH von 7,25 beim Auflösen des Produktes in destilliertem Wasser ergeben würde. Dementsprechend wird diese Menge Zitronensäure dem Serum zugesetzt.

309810/1 121

IFD-3

Das Serum wird dann aus Nadeln mit Sondenspitze und von der Stärke 26 (nominale Bohrung 0,251 mm) bei 1,05 bis 1 _S'1O kg/cm² (15 - 20 psi) in bewegtes, siedendes Dichlordifluormethan-KaIt₁
hat.

Kältemittel versprüht, das eine Temperatur von etwa -25° C

Die gefrorenen Tröpfchen werden kontinuierlich mit einem Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,177 mm (80 mesh) eingesammelt und in Keramikschalen bis zu einer Dicke von nicht mehr als 2,54 cm (1 inch) geschüttet und unter einVakuum von etwa 50 - 70 mm Hg gesetzt, bei einer Temperatur von 49° C am Anfang, die man kurz danach sich auf Raumtemperatur angleichen lässt.

Drei Proben von 420, 440 und 493 mg lyophilisierte' Partikel werden mit 5 ml destilliertem Wasser wieder aufgelöst und flammeηfotometrisch auf Natriumgehalt analysiert und man findet, dass·sie 124, 131, bzw. l4o mäqu/1 enthalten. Das ursprüngliche Serum enthielt l40 mäqu/1 Natrium. Dementsprechend werden 493 mg-Portionen Partikel entnommen und in Ampullen für die Wiederauflösung mit 5 ml destilliertem Wasser gegeben. Die Partikel werden bis zur Wiederauflösung bei-etwa 5 C im Kühlschrank gehalten.

Eine derartige Portion lyophilisiertes Produkt wird wieder aufgelöst und auf die verschiedenen Bestandteile analysiert. Tabelle I enthält die Ergebnisse:

30981 0/1121 - 11 -

	I	Bestandteil	Mittelwert	Tabelle I	N
		Glucose - Orig. P.S.	93,1 mg/dl 89,3	Standard- Abweichung	5
		LDH - Orig. P.S.	153 uts·. 127	1,58 4,87	4
		PCHE - Orig. P.S.	12,32 uts. 11,98	4,76 3,41	5
		GPT - Orig. P.S.	12,8 uts. 9,2	0,39 0,41	5
co σ co		GOT - Orig. P.S.	31,2 uts. 24	2,95 0,45	5
OO CD		CPK - Orig. P.S.	73,6 uts. 56	1,92 2,0	5
■ν»	ALK.P - Orig. P.S.	9,4 uta./dl 5,9	2,96 1,41	5
	Albumin - Orig. P.S.	4,32 g/dl 4,5 g/dl	3,79 0,77	5
	T.P. - Orig. P.S.	7*38 g/dl 7,20 g/dl	0,012 0,007	5
	BUN - Orig. P.S.	19,2 mg/dl 18,75"mg/dl	0,028 0,038	5
		0,28 0,09

Methode

P.H. Schmidt, Klin. Wschr. 40, 585 (1961)

W.E.C. Wacker et al., New England, J. Med. ,251 449 (1956)

E.H. GaI et al., ClIn-. Chem. Acta, 2 316 (1957)

H. Bergmeyer et al. Methode of Enz. Analysis, H₀ Bergmeyer Ed. pp. 84b-853, Academic Press- (New York, 1965)

A.J. Kannen, Clin. Invest. 34, 131 (1955) -~

J.W. Hess et al., Amer. J. Clin. Path. 50, 89 (1968)

O.A. Bessey et al., J. Biol. Chem. 164, 321 (1946)

B. T. Doumas et al., Clin. Chem. Acta, H, 87 (1971)

G.R. Kingsley, J. Biol. Chem. 131, 197 (1939)

R. Nadeau, U.S. Patent No. 3 485

22A30H

IPD-3

Erklärung der Abkürzungen in Tabelle I

L3DH - Milchsäure-Dehydrogenase

PGHE - Pseudocholinesterase

GPT - Glutaminsäure-Pyruvat-Transaminase

GOT - Aspärtat-Aminotransferase

CPK - Creatin-Phosphokinase .

ALK.P - Alkalische Phosphatase

T.P. - Gesamtprotein

BM - Blutharnstoff-Stickstoff

Orig. - Originalserum

P.S. - Gefrierversprühtes Serum

Die Tabelle' gibt die Ergebnisse der Tests wieder, die mit Originalserum ("Orig.") und dem gefrierversprühten Serum der vorliegenden Erfindung ("P.S.") durchgeführt worden sind. Die meisten Bestandteile verloren im allgemeinen, wenn überhaupt, wenig Aktivität durch das Verfahren. Die Abweichungen vom Standard, wo welche erhalten wurden, entsprechen etwa denjenigen für das ursprüngliche Serum und sind bei GPT und OPK besser und für Glucose etwas schlechter. ,

Die Zunahme der Trübung wurde für herkömmliche und die erfindungsgemäßen Gefrierversprühungs-Lyophilisierungen gemessen. Das teilchenförmige Produkt der Methode der Gefrieryersprühung ergibt weniger als 20 % der Trübungszunähme, die mit dem Produkt der herkömmlichen Lyophilisierung beobachtet wird.

- 13 -. 3 0 9 8 10/1121

22430U

JH-

Beispiel 2

Man stellt Blutserum durch Zugabe von 6,25 nil 4n Zitronensäure je Liter Serum auf einen pH-Wert von 7>^ ein. Das Blutserum wird dann in Teile A, B und C aufgeteilt. Eine Anzahl von 5»3-ml-Anteilen von Teilen A und B gibt man in rechteckig-zylindrische Glasgefasse, welche einen Innendurchmesser von 20 mm und eine Innenlänge von 30 mm, d, h. von dem Gefässboden bis zur inneren Oberfläche des Verschlussstopfens aufweisen. In den nicht verschlossenen Glasgefässen A und B wird das Blutserum in üblicher Weise eingefroren und lyophilisiert. Das erhaltene kuchenartige Produkt hat annähernd die Form des Bodenteils des Glasgefässes. Das Gewicht ons lyophilisierten Serums in jedem der Glasgefässe A und B beträgt 500 + 5 mg. Das lyophilisierte Serum in den Glasgefässen B wird mazeriert, d. h. es wird fein zerkleinert ,indem man es im Glasgefäss mit einem Spatel aufbricht. Die Glasgefässe A und B werden verschlossen und bei 4 bis 10° C gelagert.

Teil C wird entsprechend der Verfahrensweise des Beispiels 1 gefrierversprüht und lyophilisiert. Das erhaltene Produkt C besteht aus sphärischen, hochporösen, frei fliessenden Teilchen, die alle durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,84 mm hindurchgehen, d. h. die Teilchen haben eine Grosse, die nicht über 840 Mikron Durchmesser hinausgeht. Man gibt Anteile des Produktes C, die jeweils 500 mg wiegen, in Glasgefässe, wie sie oben beschrieben sind, verschliesst diese und lagert sie bei 4 bis 10° C.

Man bestimmt die Standard-Auflösungszeit für die Produkte Λ, Β und C nach dem nachfolgend wiedergegebenen Verfahren. Jeweils 5 ml deionisiertes Wasser (R ^ 1 Megaohm) werden bei 25 - 2° C rasch in eine Reihe von Glasgefässen der Gruppen A, B und C (die vorher sich auf dieselbe Temperatur einstellen konnten) durch Einpipettieren aus einer automatischen Pipettenvorrichtung gegeben, wobei die Abgabespitze der Pipette in Berührung steht

BAD OR»G»NAL 309810/ 1121
- 14 -

/Γ

mit der Innermandoberflache jedes Glasgefässes. Jedes Glasgefäss wird dann rasch mit einem Stopfen verschlossen und auf
elektrisch angetriebene, umlaufende Walzen gegeben, wobei die zylindrische Achse des Glasgefässes horizontal ist. Die Zeit
von der Zugabe des Wassers bis zur Anordnung des Glasgefässes auf den umlaufenden Walzen übersteigt nicht etwa 5 Sekunden.
Die Walzen rotieren mit einer solchen Geschwindigkeit, dass
die Glasgefasse mit 32 Umdrehungen je Minute gedreht v/erden.
Die Auflösungsgeschwindigkeit wird dadurch überprüft, dass man Glasgefässe von den Walzen in bestimmten Zeitintervallen entfernt. Man entfernt rasch den Stopfen und entfernt durch eine Probenpipette 100 ul der flüssigen Probe, welche dann auf Gesamtprotein durch colorimetrische Prüfung nach H. L.
Rosenthal und H. T. Cundiff , Clinical Chemistry, Bd. 2
(1956), Seite 394, untersucht wird. Die unten wiedergegebenen Werte für -die Standard-Auflösungszeit der Produkte A, B und C wurden aus einer graphischen Darstellung der Auflösung {%) auf der Ordinate gegen die auf- den umlaufenden Walzen verstrichene Zeit (Sekunden) auf der Abszisse bestimmt. 100 % Auflösung entspricht einem Wert von 7 g Protein je 100 ml Blutserum.

Produkt Standard-Auflösungszeit

t~ ot 7

A 1200

B 1200

C 90

Im visuellen Vergleich zeigen die Lösungen, die man durch vollständige Wiederauflösung der Produkte A und B erhalten hat,
eine beträchtlich grössere Trübung als die Lösung, welche man durch vollständige Wiederauflösung des Produktes C erhalten hat,

309810/1 1 21 - 15 -

Claims

Patentansprüche
2. Lyophilisiertes Serum- oder Plasmaprodukt gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen einen Durchmesser von nicht mehr als 1 mm aufweisen.
3· Lyophilisiertes Serum- oder Plasmaprodukt gemäss Ansprüchen 1 oder.2, dadurch gekennzeichnet, dass die Standard-Auflösungszeit der Teilchen 2 Minuten nicht überschreitet.
4. Lyophilisiertes Serum- oder Plasmaprodukt gemäss einem
der Ansprüche 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, dass die sphärischen Teilchen zu wenigstens 90 % porös sind.
5. Verfahren zur Herstellung eines homogenen, lyophilisferten Serum- oder Plasmaproduktes, dadurch gekennzeichnet, dass

a) eine Serum- oder Plasmalösung in Form von Tröpfchen

in ein sich bewegendes Bad aus siedendem Pluorkohlenstoff-Kältemittel gesprüht wird, das eine Temperatur unter etwa -20° C hat, so dass die Tröpfchen gefroren werden;

b) die gefrorenen Tröpfchen unter ein Vakuum gesetzt werden;

c) die Tröpfchen danach, unter Beibehaltung des Vakuums, auf eine solche Temperatur gebracht werden, dass im wesentlichen das gesamte Wasser in den Tröpfchen sublimiert und aus den Tröpfchen Partikel gebildet werden; und

309810/ 112 1

22A30U

IPD-3

d) man die Partikel auf Raumtemperatur und -druck kommen lässt.

309810/1-12

- 17 -