DE2225827B2 - Verfahren zur diagnostizierung von hyperthyreose - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Methode zur Diagnostizierung von Hyperthyreose.

Die bisherige Schilddrüsendiagnostik ist methodisch aufwendig und bis heute auf wenige Speziallaboratorien beschränkt. Sie beruht auf der Analyse der beiden Schilddrüsenhormone, des Thyroxin (Ta) und des Trijodthyronin (73), sowie auf den! Radiojod-Test, der ein Maß für die Speicherungsfähigkeit der Schilddrüse für Jod darstellt.

Neben Albumin und den y-Globulinen stellen die Lipoproteine die dritte, am stärksten konzentrierte. Fraktion der extrazellulären Makromoleküle im Plasma des Menschen dar. Ihre Struktur und Funktion hat in der letzten Dekade ein wachsendes Interesse gefunden, und die Dynamik ihres Stoffwechsels beginnt sich zu klären.

Der regulierende Einfluß der Schilddrüsenhormone, insbesondere des Thyroxins, auf den Cholesterinstoffwechsel ist seit über 50 Jahren bekannt und in einer Vielzahl von Studien untersucht worden. Man weiß heute, daß Schilddrüsenhormone die Syntheserate des Cholesterins in der Leber stimulieren, aber den Aufbau und die Ausscheidung des Cholesterins durch die Galle noch stärker positiv beeinflussen. Dies hat zur Folge, daß es bei einer Schilddrüsenunterfunkuon zu einem Anstieg, bei der Hyperthyreose zu einem Abfall der Plasmacholesterinkonzentration kommt. Diese Prozesse laufen wahrscheinlich unabhängig von dem gleichzeitig bestehenden Hypo- bzw. Hypermetabolismus bei der Hypo- bzw. Hyperthyreose ab, da die Plasmacholesterinspiegel keine eindeutige Beziehung zum Grundumsatz zeigen. Die Aktivierung des Stoffwechsels des Fettgewebes und der Triglyceride durch die Schilddrüsenhormone geht nicht nur aus dem Fettschwund bei der Hyperthyreose hervor, sondern zeigt sich vor allem in den niedrigen respiratorischen Quotienten, der Neigung zur Ketoazidose und auch in der gesteigerten Utilisation der Fettsäuren bei der Hyperthyreose. Analog dem Cholesterinstoffwechsel, wenn auch nicht so ausgeprägt, läßt sich auch im Stoffwechsel der Triglyceride zumindest bei hyperthyreoten Tieren eine erhöhte Synthese, aber noch stärker ein beschleunigter Abbau nachweisen, wahrscheinlich bedingt durch das gesteigerte Kalorienbedürfnis der Gewebe bei erschöpftem Glukoseangebot.

Die Wirkung der Schilddrüsenhormone auf den Phospholipidstoffwechsel ist bisher kaum untersucht worden und ohne daß hier klare Beziehungen erkannt sind, kann sicher gesagt werden, daß die Hyperthyreose zu keiner signifikanten Senkung der Phospholipidkonzentration im Plasma führt. Dieser Befund, wie die Tatsache, daß Patienten mit Hyperthyreose trotz niedriger Plasmacholesterinwerte ein normales Lipidelektropherogramm zeigen, war der Anlaß, den Transportmechanismus der Plasmalipide bei der Hyperthyreose genauer zu untersuchen, um hierdurch Aufschlüsse über die Gründe der veränderten Cholesterinwerte und über neue Diagnosemöglichkeiten zu erhalten.

Die Gründe für dieses Vorgehen liegen in der Erkenntnis, daß es bei einem ungestörten Transport der Plasmalipide undenkbar ist, daß der Cholesterinspiegel im Plasma bei gleichbleibenden Phospholipidkonzentrationen absinkt, ohne von einer Verminderung der cholesterinreichen ß- Lipoproteine begleitet zu sein. Dies ist unter physiologischen Bedingungen und normalen Transportverhältnissen dadurch bedingt, daß die wasserunlöslichen Plasmalipide nicht frei im Plasma zirkulieren, sondern transportiert werden, indem sie nach einer ganz bestimmten Ordnung aller Plasmalipide in festen Konzentrationsverhältnissen und wohl strukturiert Verbindungen mit besonderen Proteinen eingehen. Man bezeichnet diese konjugierten Makromoleküle heute als lösliche oder Plasmalipoproteine im Gegensatz zu den Struktur- oder Membranlipoproteinen. Ihnen kommt, wie die Ergebnisse der Lipidforschung der letzten Jahre vielfältig gezeigt haben und wie durch die vorliegende Erfindung bestätigt wird, eine zentrale Bedeutung bei der Differenzierung und in der Suche nach den pathophysiologischen Zusammenhängen der Dyslipoproteinämien zu.

Biochemische Charakteristik der normalen Lipoproteinfraktionen (D. S e i d e 1, »Fettstoffwechselstörungen«, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1971)

Die physikochemischen und chemischen Eigenschaften der Plasmalipoproteine, wie ihre Dichte, Größe und elektrophoretische Mobilität sind festgelegt durch ihre konstante Protein-Lipid-Zusammensetzung (vgl. Tabelle 1). Da bekanntlich die Lipide eine wesentlich niedrigere Dichte besitzen als die Proteine, zeichnen sich aile Plasmalipoproteine durch eine, verglichen mit den Plasmaproteinen, niedrigere Dichte aus. Das Plasmalipoproteinspektrum erstreckt sich über den Dichtebereich von 0,9 bis 1,21 g/ml. Die Plasmalipoproteine mit sehr niedriger Dichte bestehen vorwiegend aus Triglyceriden und sind die größten Lipoproteine, während mit höherer Dichte ihre Größe ab- und ihr Proteingehalt zunimmt. Sie alle setzen sich jedoch aus den 4 Komponenten Protein, Cholesterin, Triglyceriden und Phospholipid zusammen, allerdings zu'unterschied-

ichen, aber normalerweise sehr konstanten Konzentraionsverhältnissen. Untersucht man das Plasmalipoproeinspektrum in der analytischen Ultrazentrifuge, so :eigen sich vier immer weiderkehrende Konzentra ionsniaxima und -minima. Die Konzentrationsmaxima reiten als Grenzdichten zur Fraktionierung der »lasmalipoproteine nach Dichteklassen mit Hilfe der ,räparativen Ultrazentrifuge. Mit ihr lasser, sich die Plasmalipoproteine in prinzipiell vier Klassen fraktioiieren: ι

1. Die sogenannten Chylomikronen

(d 0,9 — 0.S5 g/ml).
2 Die sogenannten very-low-density-lipoproteins;

VLDL(C/0,95 - 1,006 g/ml).
3. Die sogenannten low-density-lipoproteins; LDL

(d 1,006- 1,063 g/ml).
4 Die sogenannten high-density-liooproteins; HDL (d 1,063- 1,21 g/ml).

Bedingt durch qualitative wie quantitative Unterschiede in ihrem Proteinanteil lassen sich die vier Dichtefraktionen der Plasmalipoproteine bei elektrophoretischer Trennung in vier entsprechende Banden auftrennen:

1. Die nicht wandernden Chylomikronen.

2 Die mit den /?-Globulinen wandernden ^-Lipoproteine, die den LDL entsprechen.

3. Die mit den a2-Globulinen wandernden prae-|3-Lipoproteine, die den VLDL entsprechen und

4. die mit den Λΐ-Globulinen wandernden a-Lipopro-

teine, die den HDL entsprechen.
Sowohl die Dichteklassen der Plasmalipoproteine wie ihre elektrophoretisch trennbaren Fraktionen stellen nun aber heterogene Gruppen hinsichtlich ihrer Proteinanteile der sogenannten Apolipoproteine dar. Durch eine Vielzahl weitreichender physikochemischer, chemischer und immunologLicher Untersuchungen konnten im Plasmalipoproteinspektrum des Menschen wenigstens 3 voneinander verschiedene Apolipoproteine demonstriert werden. Man bezeichnet diese Apolipoproteine, die sich in ihrer Aminosäurezusammensetzung, wie in ihren terminalen Aminosäuren, ihrem Molekulargewicht, wie ihrer antigenen Determinate voneinander unterscheiden, als Apo A, Apo B und Apo C. Hieraus ergibt sich die dritte und vom physiologisch-chemischen Standpunkt aus gesehen wertvollste Klassifizierung der Plasmalipoproteine, eine Einordnung in Familien mit gleichen Apolipoproteinen. Den Apolipoproteinen kommt nämlich die zentrale Rolle bezüglich der Struktur, der Protein-Lipid-Zusammensetzung und somit dem Stoffwechsel der Lipoproteine zu. Es ist wahrscheinlich, daß die verschiedenen Apolipoproteine eine unterschiedliche Kapazität besit-

zen, Fettsäuren und Phospholipide kovalent zu binden; solche Bindungen besitzen einen hohen lipophilen Charakter und sind von entscheidender Bedeutung bei der endgültigen Protein-Lipid-Zusammensetzung eines Lipoproteins. In ähnlicher Weise können die Protein-

> Kohlenhyd/atbindungen am Apolipoprotein und ihre Kohlenhydratanteile selbst eine Rolle spielen.

Tabelle 1

Charakteristik der normalen Plasmalipoprcteine

a.) Physiko - chemische Eigenschaften

Dichte -k lasse

VLDL

0,9g/ml

LDL I HDL L006g/ml W63g/ml !,2IgZmI

Elektrophore tische Mobilität

Größe und Form

Protein bildzusammensetzung

[Chyfomikmnen\ Pra-ß I j Lipoproteine I

1000- WOOO l A I

}%\Pmt 4°/o\PL 6%\C 85-90% j TG

300 -A ß-Lipoproteine

ISO - 250 A

α Lipoproteine

75 - 100 A

8-10%\Pmt. 18 ⁰A \ PL 19% \ C 50% I TG

20% I Prot 23%\PL £5%\C 10 % j TG

50%

30%

18%

2-5 %

b. ) Verteilung der Apoli poproteine

Dichteklasse

Etektro -phorese

VLDL

hOOSglml L DL W63glmt HDL ijtg/ml

Apolipo- A proteine

20

";■:■„.

Chylomikronen

Prä-fi-Lipopnoteine ß-Lipoproteine

α- Lipoproteine

Es erscheint verständlich, und es gibt bereits eine Reihe biochemischer Hinweise dafür, daß kleinste Änderungen am Proteinanteil der Plasmalipoproteine zu neu strukturierten Lipoproteinen führen können oder müssen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch die Analyse der Lipoproteinfraktionen von Körperflüssigkeiten Einblicke in die Lipoproteinzusammenstellung bei der Hyperthyreose, einer sekundären Hypolipoproteinämie zu erhalten, um aus feststellbaren Abnormitäten umgekehrt die Hyperthyreose diagnostizieren zu können.

Normalerweise finden sich in der high-density-Lipoproteinfraktion (d 1,063 — 1,21 g/ml) nur Lipoproteine mit «-Mobilität bei elektrophoretischer Trennung, während die Lipoproteine der Dichteklasse d< 1,063 g/ml als ß- bzw. prae-0-Lipoproteine wandern. Dies gilt streng für die PlasmaHpoproteinfraktionen von gesunden Kontrollpersonen wie von Patienten mit Dyslipoproteinämien. Eine einzige Ausnahme von dieser Regel stellte bisher das von Berg 1969 zuerst beschriebene Lp(a)-Lipoprotein dar (K.Berg, Acta path, microbiol. Scand. 59, 369 [1963]). das trotz seiner Zugehörigkeit zur HDL-Fraktion prae-/?-Mobilität entwickelt und, da es sich etwa in 10% einer gesunden Population nachweisen läßt, offensichtlich keine Beziehung zu einer bestimmten Krankheit aufweist

Es wurde nun gefunden, daß der Unterstand (d> 1,063) nach der Fraktionierung des Plasmas von Patienten mit gesicherter Hyperthyreose bei der Dichte d 1,063 g/ml bei elektrophoretischer Trennung im Gegensatz zu Normalplasma nicht nur eine Bande im «-Bereich, sondern darüber hinaus eine solche im Bereich der J3-Globuline zeigt. Diese abnorme und hier erstmals beschriebene Lipoproteinbande der HDL-Fraktion wird als 0-HDL bezeichnet. Die Konzentration des abnormen /J-HDL kann die der normalen /J-Lipo-Droteine erreichen oder gar übersteigen. Die Immunelektrophorese der HDL-Fraktion von Patienten mit Hyperthyreose zeigt entsprechend nicht nur die spezifische Reaktion gegen anti-a-Lipoprotein-Serum im ai-Globulin-Bereich, sondern darüber hinaus eine Präzipitationslinie gegen ami-/3-Lipoprotein-Serum in der Position der jS-Globuline. Beide Präzipitationslinien

lassen sich mit Öl-Rot-O anfärben, was klar ihren Lipoproteincharakter anzeigt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Diagnostizierung der Hyperthyreose, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Körperflüssigkeiten von Patienten auf einen möglichen Gehalt an einem abnormen Lipoprotein mit einer Dichte d> 1,063 g/ml und ^-Mobilität untersucht werden.

Als Körperflüssigkeiten kommen in erster Linie Blut (Plasma, Serum) und Urin in Frage. Hierbei hat Urin den Vorteil der einfacheren Gewinnung der zu untersuchenden Proben. Außerdem scheint das Bergsche Lipoprotein nicht nierendurchgängig zu sein, so daß sich hier eine Differenzierung erübrigt. Bei gleichzeitigem oder alleinigem Vorliegen des Bergschen Lipoproteins kann aber von diesem sehr wohl unterschieden werden, wie die folgenden Ausführungen zeigen.

Um eine Ähnlichkeit zwischen dem jS-HDL und den-Lp(a)-Lipoprotein Bergs auszuschließen, wurden die Plasmalipoproteinfraktionen eines Patienten ml· Hyperthyreose, der Lp(a)-positiv war, untersucht. Da: Heparinpräzipitat dessen HDL-Fraktion zeigt in dei Lipidelektrophorese eine prae-0- und /?-Lipoprotein bande, aber nur die prae-jS-Fraktion reagiert immunolo gisch mit dem spezifischen anti-Lp(a)-Serum, wahrem beide Fraktionen mit den anti-0-Lipoproteinserei reagieren. In keinem Fall reagierte ein isoliertes 0-HDI immunologisch mit anti-Lp(a)-Serum. Dadurch ist eim

f>5 Verwandtschaft oder Ähnlichkeit dieser beiden Lipo proteine ausgeschlossen.

Nachdem gefunden wurde, oaß das Apo C ein* wesentliche Proteinkomponente des Lpt(a)-Lipoprotein

darstellt, erklärt sich das gelegentliche Auftreten von ApoC im Heparinpräzipitat einer HDL-Fraktion von Patienten mit Hyperthyreose. Das Apo C in einer solchen Präparation läßt sich durch Immunabsorption mit der Immunglobulinfraktion eines spezifischen anti-Apo-C-Serums und nachfolgender Ultrazentrifugation bei der Dichte £/1,12 g/ml eliminieren.

Die biochemische, elektrophoretische und immunologische Analyse der isolierten LDL- und VLDL-Fraktion von Patienten mit Hyperthyreose zeigt keine Abweichungen von der Norm. Wie entsprechend isolierte Fraktionen des Normalplasmas zeigen die VLDL von Patienten mit Hyperthyreose immunologisch Apo A, Apo B wie Apo C und wandern in der Lipidelektrophorese als prae-0-Lipoproteine. Ebenso zeigen die LDL, die allerdings bis zur Hälfte ihrer Normalkonzentration vermindert sein können, Apo B als Haupt-Apolipoprotein, nur in Spuren Apo A und wandern als ^-Lipoproteine. Das Apo B der LDL zeigt eine normale Aminosäurezusammensetzung.

Das 0-HDL stellt ein abnormes Lipoprotein dar und findet sich, soweit bisher festgestellt werden konnte, nur bei Patienten mit Hyperthyreose. Es handelt sich hierbei um ein Lipoprotein, das in seiner Dichte den normalen HDL-Lipoproteinen verwandt ist, in seinem Proteinanteil und seiner elektrophoretischen Mobilität allerdings eher den /'-Lipoproteinen entspricht. Das abnorme Lipoprotein besteht wahrscheinlich aus einem Proteinkern (H-I-Protein) und aus einem Mantel, der aus Cholesterin, Phospholipiden und dem Apo-B-Protein besteht Über die Lokalisation der Triglyceride an diesem konjugierten Makromolekül lassen sich bis heute noch keine Aussagen machen. Nach den ersten klinischen Untersuchungen an etwa 45 Patienten zeig! die Konzentration des 0-HDL eine sehr gute Korrelation zu dem Schweregrad der Erkrankung und verschwindet nach erfolgreicher Therapie einer Hyperthyreose. Hieraus ergibt sich die Möglichkeit eines neuen biochemischen Parameters zur Diagnostik der Schilddrüsenüberfunktion, die in ihrer Häufigkeit an zweiter Stelle aller hormonbedingten Stoffwechselstörangen steht und somit von großer klinischer Relevanz ist.

Das 0-HDL läßt sich in den meisten Körperflüssigkeiten, speziell im Blutplasma und im Urin nachweisen. Der Nachweis des 0-HDL kann auf verschiedene Weise vorgenommen werden, wobei man sich unter anderem seine abnormen Eigenschaften zunutze macht.

1. Auf Grund seines Größenunterschiedes zu den normalen Lipoproteinen im Plasma. Diese Unterscheidung gelingt mit Hilfe der Gel-Chromatographie im weitesten Sinne, mit Hilfe von Mikrofiltrationen, mit Hilfe von elektronenmikroskopischen Untersuchungen, mit Hilfe von Elektrophoresen in vernetzenden Medien (Polyacrylamid) sowie durch ein unterschiedliches Filtrationsverhalten.

2. Durch besondere Präzipitationsmethoden mit Polyanionen- bzw. Polykationensystemen, z. ß. Hepa-Hn, Dextransulfat, Manganchlorid, Magnesiumchlorid usw.

3. Durch Präzipitation am isoelektrischen Punkt des Lipoproteinmoleküls. 6s

4. Durch den spezifischen Nachweis der am ,8-HDL beteiligten Proteine; hierzu kommen immunologische Verfahren in Betracht sowie die übrigen Nachweismethoden für Eiweiße in erster Linie, Verfahren der Elektrophorese und Chromatographie.

5. Durch die Bestimmung der einzelnen Lipidanteile am 0-HDL; in Betracht kommt die Bestimmung der Phospholipide, der Triglyceride und des Cholesterins am 0-HDL. Die hierfür notwendigen Methoden stellen Routinemethoden dar, sind leicht durchführbar und eignen sich bei entsprechender Standardisierung auch für die Ausführung durch den praktischen Arzt.

Je nachdem, ob es die einzelne Bestimmungsmethode erforderlich macht oder nicht, wird das 0-HDL soweit von anderen Proteinen bzw. Lipoproteinen abgetrennt, daß der Nachweis spezifisch ist. Der Nachweis kann qualitativ, halbquantitativ oder, wenn erwünscht, auch quantitativ durchgeführt werden.

Isolierung de: abnormen 0-HDL (vgl. Zeichnung F ig. 2)

Die Isolierung des 0-HDL aus der Plasmalipoproteinfraktion d> 1,063g/ml gelingt z.B. unter Anwendung einer Heparinpräzipitation, einer Methode, die geeignet ist, auch die normalen 0- und prae-0- Lipoproteine von den «-Lipoproteinen zu trennen. Da diese beiden Fraktionen jedoch ausschließlich in der Dichteklasse d< 1,063 g/ml vorkommen, findet sich in dem Heparinpräzipitat einer HDL-Fraktion (d> 1,063 g/ml) von Patienten mit Hyperthyreose nur das abnorme 0-HDL, während die a-Lipoproteine gelöst im Filtrat bleiben. Die nachfolgende Analyse des gelösten Heparinpräzipitats in der Ultrazentrifuge bei der Dichte d 1,063 g/ml und 1,21 g/ml ergibt, daß es sich bei dem isolierten 0-HDL um ein sogenanntes HDL2 {d 1,063 — 1,12 g/ml) handelt Weder der c/-l,063-g/ml-uberstand noch der </-l,12-g/ml-Unterstand zeigen immunologisch eine Reaktion gegen anti-0-Lipoproteinserum.

Charakterisierung des 0-HDL

Das isolierte 0-HDL wandert in der Papierelektrophorese mit normaler 0-Mobilität, während es in Agarose eine Mobilität zeigt, die im Vergleich zu den normalen 0-Lipoproteinen leicht beschleunigt ist. Diese Differenz ist wahrscheinlich eher auf Unterschiede in der Größe der Moleküle zurückzuführen als aul Unterschiede in ihrer Ladung. Im Elektronenmikroskop erscheinen isolierte 0HDL als runde Partikeln ml· einem Durchmesser von 150 Ä und damit kleiner in Vergleich zu den normalen 0-Lipoproteinen dei LDL-Fraktiön mit einem Durchmesser bis 260 A Entsprechend dringt das isolierte 0-HDL bei eine Polyacrylamidelektrophorese in einen 7,5%igen Gel eir im Gegensatz zu den normalen 0-Lipoproteinen, die nu in Geikonzentrationen von 3,5% und geringer wandern

Da die high-density-Lipoproteine einen größere! Protein- und geringeren Lipidanteil aufweisen als di low-density-Lipoproteine, war zu vermuten, daß sic auch das 0-HDL in seinem Protein/Lipid-Verhältnis un« somit in seiner Protein-Lipid-Zusammensetzung vo den normalen 0-Lipoproteinen unterscheidet. Di separate Bestimmung des Protein-, Cholesterin-, Triglj cerid- und Phospholipidanteils am isolierten 0-HD bestätigen diese Annahme. Die Ergebnisse sind i

Sn9 583/3.

ίο

Tabelle 2 wiedergegeben und zeigen, daß sich das 0-HDL durch einen hohen Gehalt an Protein, der zu einem Anwachsen des Protein/Lipid-Quotienten führt, wie durch einen niedrigen Gehalt an Cholesterin im Vergleich zu den normalen 0-Lipoproteinen auszeichnet. Der Gehalt an Triglyceriden und Phospholipiden ist bei beiden Lipoproteinfraktionen ähnlich, wenn nicht identisch.

Tabelle 2

Protem-Lipid-Zusammensetzung
proteinfraktionen

isolierter Lipo-

Protein-Lipid-Zusammensetzung in %

Prot C PL TG Prot./Lip.

Normal 0-LP	22	45	23	10	0,28
0-HDL	43	25	22	10	0,75

Charakterisierung des Proteinanteils des 0-HDL

Während die HDL-Fraktion von Patienten mit Hyperthyreose immunologisch nicht nur mit anti-a-Lipoprotein-Serum, sondern ebenso mit anti-0-Lipoprotein-Serum reagiert, zeigt die isolierte 0-HDL-Fraktion immunologisch nur noch eine Reaktion mit anti-0-Lipoprotein-Serum. Es reagiert weder in der Doppelimmundiffusion noch in der Immunelektrophorese mit Antiseren gegen Human-a-Lipoproteine, Lipoprotein C, Albumin oder irgendein anderes Plasmaprotein. Diese Untersuchungen wurden bei unterschiedlichen Konzentrationen des Antigens und Antikörpers durchgeführt.

Bei der Immundiffusion gegen anti-0-Lipoprotein-Serum erhält man eine volle Identität zwischen Kontrollserum, den 0-Lipoproteinen der LDL-Fraktion und dem 0-HDL von Patienten mit Hyperthyreose. Dieser Befund zeigt eindeutig, daß am Aufbau des 0-HDL dem Proteinanteil der normalen 0-Lipoproteine, dem Apo B, eine wesentliche Rolle zukommt.

Nach dem immunologischen Verhalten des isolierten 0-HDL, dessen Homogenität und Reinheit nicht nur durch die immunologischen Methoden, sondern darüber hinaus durch den Nachweis nur einer einzigen Bande in der Polyacrylamidelektrophorese erwiesen ist, würde man von einem anti-0-HDL-Serum erwarten, daß es nur mit Apo B immunologisch reagiert.

Das vom Kaninchen nach iP-Injektion eines isolierten 0-HDL gewonnene Antiserum gegen 0-HDL reagiert aber in der Immunelektrophorese immer (verschiedene Präparationen bei verschiedenen Tieren) mit zwei Präzipitationslinien gegen Plasma von Normalpersonen. Eine Linie, die eine volle Identität zu den normalen 0-Lipoproteinen aufweist, läßt sich mit Lipidfarbstoff anfärben. Die zweite, nicht identische Linie läßt sich nicht mit Lipidfarbstoff anfärben und entwickelt eine geringere elektrophoretische Mobilität in Agarose als die 0-Lipoproteine. Sie zeigt sich in dem Bereich zwischen Start und der 0-GIobulinposition.

Die zweite Proteinkomponente des 0-HDL wird im folgenden als Hl bezeichnet. Das H!-Protein reagiert immunologisch nicht mit spezifischen Antikörpern gegen a2-Makroglobulin, Haptoglobin, IgG, IgM, IgA, IgE, Caeruloplasmin, Transferrin, 0iC-Makroglobulin, 02-GIykoprotein, Fibrinogen, C-reaktives Protein, *2HS-Glykoprotein, 0-Lipoprotein, «-Lipoprotein, Lipoprotein-C und Albumin, was eine Verwandtschaft mit diesen Plasmaproteinen ausschließt. Eine Ähnlichkeit des Hl-Proteins mit dem thyroxinbindenden Globulin

(TBG) kann auf Grund seiner unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilität ausgeschlossen werden. Das TBG wandert bekanntlich als «2-Globulin.

Immunologisch unterscheidet sich das H1-Protein ebenso eindeutig in seiner antigenen Determinante von

ο allen bekannten Apolipoproteinen und zeigt darüber hinaus signifikante Unterschiede in seiner Aminosäurezusammensetzung zu diesen. Auffällig ist sein relativ niedriger Gehalt an Histidin und relativ hoher Gehalt an Methionin im Vergleich zu bekannten Apolipoprote-

is inen. Als N-terminale Aminosäure wurde für das H1 -Protein Asparaginsäure gefunden.

Während verschiedene Antiseren gegen human Vollserum der Firma Behring-Werke Marburg/Lahn keine Kreuzreaktion mit dem Hl-Protein zeigten, wurde mit einer Charge von antihuman Serum der Firma Meath, Greenford, England, eine Immunpräzipitationslinie gegen das isolierte H!-Protein erhalten, die voll identisch mit jener des Hl-Proteins gegen anti-HI-Serum war. Dies, wie die Tatsache, daß anti-HI-Serum mit Normalplasmi. immunologisch reagiert, weist darauf hin, daß es sich bei dem Hl-Protein um ein, offenbar bisher nicht identifiziertes, normales Plasmaprotein handelt, das bei der Hyperthyreose mit dem Apo B und Lipiden einen makromolekularen

Komplex eingeht. Da ein monospezifisches anti-HI-Serum nicht mit intaktem 0-HDL, aber sehr wohl mit dem delipidierten 0-HDL reagiert und isoliertes 0-HDL durch in-vitro-Inkubation nur ein anti-0-Lipoprotein-Serum, nicht aber ein anti-HI-Serum erschöpft, scheint

die Hl-Komponente im Kern, der Apo-B-Anteil an der Oberfläche des 0-HDL lokalisiert zu sein.

Lipidbindungsvermögen des 0-HDL

Da der Cholesteringehalt des 0-HDL gegenüber dem normalen 0-Lipoprotein erniedrigt und sein Proteingehalt erhöht ist, sollte durch eine Serie von in-vitro-Lipidbindungsversuchen ein Einblick in die Lipidbindungskapazität des 0-HDL gewonnen werden. Es wurde der Versuch unternommen, das isolierte 0-HDL durch Inkubation mit Lipiden an Lipid anzureichern, um es domit aus seiner hohen in eine für die 0-Lipoproteine normale Dichtefraktion zu zwingen. Dies gelingt weder mit dem Lipidextrakt einer normalen LDL-Fraktior noch mit intaktem normalem LDL oder Vollplasma vor Normalpersonen, wie von Patienten mit einer Hyperli poproteinämie vom Typ II oder Typ IV. Untei identischen Bedingungen ist es hingegen gelungen partiell delipidierte normale 0-Lipoproteine oder tota delipidierte «-Lipoproteine mit Lipid aufzuladen. Es laß sich daraus schließen, daß nicht das Angebot an Lipid insbesondere an Cholesterin, sondern wahrscheinlich die spezifische Kombination eines normalen Apo B mi dem H!-Protein verantwortlich ist für die abnorrw Protein-Lipid-Zusammensetzung des 0-HDL und fü das daraus resultierende abnorme physikochemischi Verhalten dieses Lipoproteins.

Versuchsbeschreibung

Insgesamt wurde das Plasma von 33 Patieniei beiderlei Geschlechts mit biochemisch wie kliniscl gesicherter Hyperthyreose untersucht. Bei 3 de

untersuchten Patienten lag ein toxisches Adenom vor; die erste Blutentnahme zur Analyse der Plasmalipoproteine (in vereinzelten Fällen wurde eine Plasmaphorese durchgeführt) wurde vor Therapiebeginn und in der Regel 10 Stunden nach der letzten Mahlzeit vorgenommen. In 2 Fällen wurden Verlaufskontrollen während der therapeutischen Einstellung und in etwa der Hälfte der Fälle Nachuntersuchungen nach optimaler Therapie durchgeführt.

Isolierung und Auftrennung der Plasmalipoproteinfraktionen (vgl. Zeichnung F i g. 1)

Das Plasma oder Serum der Patienten wurde durch entsprechende Zugabe von NaBr auf eine Dichte von d 1,063 g/ml gebracht und in der Ultrazentrifuge (Spinco-Modell 172) zentrifugiert. Alle Ultrazentrifugenläufe wurden bei 105 000 χ g während 22 Stunden bei 4° C in einem Typ 50-TI Rotor durchgeführt. Der durch eine Schneidetechnik gewonnene Überstand mit der Dichte von d< 1,063 g/ml wurde durch Dialyse gegen eine NaCl-Lösung auf eine Dichte von 1,006 g/ml gebracht und abermals unter den angegebenen Bedingungen ultrazentrifugiert, um die Fraktionierung der VLDL und LDL zu erreichen. Der </-l,063-g/ml-Unterstand wurde zur Isolierung der HDL-Fraktion durch entsprechende Zugabe von KBR auf eine Dichte von d 1,21 g/ml gebracht und erneut ultrazentrifugiert. Um eine Trennung der λ-Lipoproteine der HDL-Fraktion von dem hier beschriebenen abnormen 0-HDL zu erreichen, wurde der i/-l,063-g/ml-Unterstand einer Heparinpräzipitation (s. inten) unterworfen und die α-Lipoproteine aus dem Filtrat durch Ultrazentrifugation bei der Dichte d 1,21 g/ml im Überstand gewonnen. Das gelöste Heparinpräzipitat wurde zur endgültigen Reinigung und genauen Analyse der Dichte des 0-HDL zwei weiteren Ultrazentrifugationen unterworfen. Nach dem ersten Lauf bei einer Dichte von d 1,063 g/ml wurde der Unterstand auf eine Dichte von 1,12 g/ml eingestellt und erneut unter den angegebenen Bedingungen zentrifugiert. Der Überstand der letzten Ultrazentrifugation enthielt nur das abnorme 0-HDL, in einigen Fällen auch Lipoprotein C, das aber durch Immunabsorption mit anti-Apo-C-Serum quantitativ eliminiert werden konnte.

Alle isolierten Plasmalipoproteinfraktionen wurden vor der weiteren Analyse ausgiebig (48 Stunden) unter ständigem Wechsel bei 4° C gegen 0,9% NaCl dialysiert.

Quantitative Bestimmung des abnormen 0-HDL

Zur quantitativen Bestimmung des 0-HDL wurden 5 ml Nüchternplasma oder -Serum der Patienten bei einer Dichte von d 1,063 g/ml 48 Stunden lang bei 4° C und 105 000 · g zentrifugiert, am Unterstand nach einer 12stündigen Dialyse gegen 0,9% NaCl eine Heparinpräzipitation vorgenommen und am gelösten Präzipitat der Gehalt des Cholesterin bestimmt. Als Umrechnungsfaktor vom Cholesteringehalt des Heparinpräzipitates auf Gesamtplasmakonzentration 0-HDL (in mg/100 ml) wurde der Faktor 80 eingesetzt. Er errechnet sich aus dem prozentualen Gehalt an Cholesterin des 0-HDL und dem Heparinpräzipitat der HDL-Fraktion als Aliquot.

Auftrennung der Proteinanteile des abnormen 0-HDL

Das Apo-0-HDL setzt sich aus zwei Proteinanteilen zusammen, dem normalen Apo B und einem zweiten, als Hi bezeichneten Protein. Die Trennung der beiden Proteine gelang nach totaler Delipidierung des 0-HDL durch Äthanol-Äther. Hiernach bleibt der Apo-B-Anteil des 0-HDL unlöslich, während das Hi-Protein leicht wasserlöslich ist.

Lipoproteinelektrophorese

Die Lipoproteinelektrophorese des Gesamtplasmas wie der isolierten Plasmalipoproteinfraktionen wurde auf Papier nach Lees und Hatch (R. S. Lees and Hatch: ]. Lab. din. Med. 61, 518 [1963]) und in

Agarose/Agar nach der von Greten und Seidel (H. G r e t e η und D. S e i d e 1: Dtsch, med. Wschr. 95, 1716 [1970]) angegebenen Methode unter Zusatz von Albumin und unter Verwendung eines Veronalpuffers (pH 8,6, Ionenstärke 0,05) durchgeführt. Als Lipidfarb-

stoff diente Öl-Rot-O.

Präzipitation mit Polyanionen

Die von Burstein und Samaille (M. B u r s t e i η und J.Samaiile: CHn. Chim. Acta 5, 609 [¹960]) beschriebene Heparin-Präzipitation zur Isolierung von 0-Lipoproteinen wurde leicht abgewandelt. Auf 100 ml des </-l,063-g/ml-Unterstandes wurden nach Dialyse gegen 0,9% NaCl 4 ml einer 5%igen Heparinlösung und 5 ml einer 1-M-Manganchloridlösung zugesetzt. Nach 30 Minuten Stehen bei 25 bis 30⁰C wurden die präzipitierten Lipoproteine durch Zentrifugation während 20 Minuten bei 15 000UpM getrennt und der Überstand zur Isolierung der a-HDL weiter verwandt

(s. oben). Das Präzipitat wurde in einem Gemisch aus 1 ml einer 10%igen Na-Citrat- und 2 ml einer 20%igen NaCl-Lösung gelöst und mit einem 0,001 M Tris-Puffer pH 7,6 auf 100 ml verdünnt und anschließend umter Zugabe von 5 ml einer 1 -M-Manganchloridlösung repräzipitiert. Dieser Prozeß wurde zweimal wiederholt und das letzte Präzipitat wie oben beschrieben gelöst, anschließend während 30 Stunden gegen eine 9%ige NaCl- und 12 Stunden gegen eine 5%ige Bariumchloridlösung bei 4°C dialysiert. Der Heparin-Barium-Chlortdkomplex konnte danach durch Zentrifugation mit 5000 UpM aus der gelösten 0-HDL-Fraktion eliminiert werden, die im Anschluß daran 48 Stunden lang bei 4° C gegen eine 0,9%ige NaCl-Lösung dialysiert wurde, um sie später im physiologischen Milieu zu analysieren.

45 Immunelektrophorese und Immundiffusion

Proben von Gesamtplasma, isolierte intakte Plasnalipoproteinfraktionen, wie delipidierte Plasmalipoproteinfraktionen wurden mit der Doppelirnmundiffusionstechnik in 1 % Agar nach Ouchterlony (Ö. O u c h t e r Iony: Acta Pathol. Microbiol. Scand. 32, 231 [1953]) und der Immunelektrophoresetechnik in 1% Agarose (P. G r a b a r und C. A. W i 11 i a m s: Biochim. Biophys Acta 17,67 [1955]) unter Verwendung eines Veronalpmffers (ph 8,6; Ionenstärke 0,005) analysiert. Alle Platten wurden 24 bis 36 Stunden in einer feuchten Kammer zui vollen Entwicklung der Präzipitationslinien bei 37° C inkubiert und nach mehrmaligem Waschen (0,001 M Tris-Puffer pH 7,6) und Trocknen mit Amido-Schwan auf Protein und Öl-Rr>t-O auf Lipid angefärbt. Ali Antiseren wurden Seren gegen human Albumin «2-Makroglobulin, Haptoglobin, IgA, IgG. IgM, IgE Transferrin, Caeruloplasmin, 0i-C-Makroglobulin 02-Glykoprotein, Fibrinogen, C-reaktives Protein <\2-HS-Glykoprotein wie Seren gegen human Vollserun der Firma Behring-Werke. Marburg/Lahn, und de Firmen Meath, Paines and Byrne Ltd., Greenforc

England, verwandt Die Antiseren zum Nachweis der α-Lipoproteine, /i-Lipoproteine, des Lipoprotein C, des Lp(a)-Lipoproteins sowie die Antiseren gegen das abnorme 0-HDL wurden nach einer früher angegebenen Methode (D. S e i d e 1, P. AI a u ρ ο ν i c and R. H. Furman: J. elin. Invest 48, 124 [1969], D.Seidel, P.Alaupovic, R.H. Furman and W.J. McConathy: J. dia Invest 49, 2396 [1970], D.Seidel, H. P. G e i s e η und D. R ο e 1 c k e: FEBS-Letters im Druck) im eigenen Laboratorium durch Immunisierung von Kaninchen hergestellt. Die verwandten Antiseren wurden vor dem Gebrauch auf ihre Spezifität und Titer getestet.

Immunabsorption

Zur Immunabsorplion wurde zunächst das optimale Konzentrationsverhältnis des Antiserums zur antigenen Lösung mittels einer Mikrotitrationsmethode festgelegt. Das entsprechend angesetzte Antigen-Antikörper-Gemisch wurde während 3 Stunden bei 37⁰C inkubiert und anschließend 12 Stunden bei 4° C gehalten. Danach wurde das Immunpräzipitat durch Zentrifugation bei 10 000 UpM von der verbleibenden Lösung getrennt

Protein- und Lipidbestimmung

Die isolierten Lipoproteinfraktionen wurden in ihrem Proteingehalt nach Lowry et al. (O. H. Lo wry, N.J. Ro.sebrough, A. L Farr and R. J. R a η d a 11: J. Biol. Chem. 193,265 [1951]), in ihrem Cholesteringehalt nach Sperry und Webb (W. M. S ρ e r r y and M.Webb: J. Biol. Chem. 187, 97 [1950]), in ihrem Phospholipidgehalt nach Gerlach und Deuticke (E. Ge rl ach und B. Deuticke: Biochem. Z. 337, 477 [1963]) und in ihrem Triglyceridgehalt nach van Handel und Zilversmit (E. van Handel and D. B. Zilversmiz: J. Lab. Clin. Med. 50, 152 [1957]), bestimmt. Um von Lipid-Phosphor auf Phospholipid umzurechnen, wurde ein Faktor von 25 eingesetzt. Besonders lipidreiche Fraktionen wurden vor der Proteinbestimmung mit Äther extrahiert.

Polyacrylamid-Elektrophorese

Die Polyacrylamid-Elektrophorese wurde im Canalco-Modell mit 6 Einheiten nach den Angaben von Davis (B. J. D a ν i s : Ann. N.Y. Acad. Sei. 121,404 [1964]) und unter Verwendung eines kontinuierlichen Tris-Glycin-Puffers pH 8,8 durchgeführt. Das Acrylarnidtrenngel bestand aus einer oberen, 3,5%igen und einer unteren, 7,5%igen Schicht, die fugenlos aneinander anschlossen. Die Lipoproteinfraktionen wurden entweder vor der elektrophoretischen Trennung mit Sudan-Schwarz auf Lipid vorgefärbt oder nach elektrophoretischer Trennung mit Amido-Schwarz proteingefärbt.

Elektronenmikroskopie

Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen der isolierten /?-HDL-Fraktionen wurden nach Negativfärbung durch 1% Kalium-Phosphowolframsäure mit einem Siemens Elmiskop Typ 101 unter Verwendung von kohlebeschichteten Collodium- Kupfernetzen vorgenommen. In einzelnen Fällen wurden die Präparationen vor der Färbung mit 3% Glutaraldehyd in destilliertem Wasser fixiert.

Aminosäureanalyse

Zur Aminosäureanalyse wurden die total deüpidierten Lipoproteinfraktionen nach genauer Einwaage 18

Stunden lang bei Ϊ 10⁰C in einer 6-N-HCl-Lösung unter Verschluß hydrolysiert anschließend im Vakuum bei 40 bis 5O⁰C eingedampft und in einem Na-Citrat-Puffer pH 2,2 gelöst Die Aminosäureanalyse erfolgte in einem Beckmann-Unichrom AAA. Die neutralen und sauren

ίο Aminosäuren wurden auf einer Kationenaustauschsäule von 50 cm Länge mit einem Na-Citrat-Puffer (pH 3,28 und pH 4,2), die basischen Aminosäuren auf einer Kationenaustauschsäule von 16 cm Länge in einem Citrat-Puffer (pH 5,28) eluiert Tryptophan und Cystein

■5 wurden nicht bestimmt. Die Bestimmung der N-terminalen Aminosäure des Apo-/?-HDL wurde nach der Dansj'l-Chloridmethode (W. R. G r a y: Methods Enzymol. 11,139 [1967]) durchgeführt

Partielle und totale Delipidierung der Lipoproteinfraktionen

Die partielle Delipidation wurde mit alkalisiertem Diäthyläther vorgenommen. Hierzu wurden die Lipo-

proteinlösungen im Volumenverhältnis 1 : 50 mit Diäthyläther im verschlossenen Rundkolben über 20 Stunden bei 4°C kräftig geschüttelt und anschließend die Lipoproteine in der wäßrigen Phase mit einem Scheide trichter getrennt Die letzten Spuren von Äther wurden durch Einblasen von Stickstoff in die Lipoproteinlösung eliminiert

Die totale Delipidierung der Lipoproteinfraktion erfolgte nach einer Modifikation der Methode von Scanu et al. (A. L. S c a η u, A.Lewis and F. M.

Bum ρ us: Arch. Biochem. Biophys. 74, 390 [1958]). Jede Fraktion wurde hierzu lyophilisiert und anschließend dreimal ausgiebig insgesamt 24 Stunden bei 2O⁰C in einem Äthanol-Äther-Gemisch V/V 3 :2 extrahiert. Nach der letzten Behandlung mit dem Lösungsmittel wurden die Proteinanteile bei 5000 UpM abzentrifugiert und unter Stickstoff getrocknet, um die letzten Spuren des Lösungsmittels zu entfernen.

Lipidbeladung von isolierten Lipoproteinfraktionen

Die Lipidanreicherung wurde in vitro an isolierten, intakten jS-HDL-Fraktionen, partiell delipidierten normalen j9-Lipoproteinen wie total delipidierten «-Lipoproteinen nach der Methode von Scanu (A. L S c a η u :

J. Biol. Chem. 242, 711 [1967]) vorgenommen. Als Lipide wurden den Fraktionen mit Ultraschall behandelte Lipidextrakte von normalem LDL, intakte isolierte LDL oder Vollplasma von Patienten mit einer Hyperlipoproteinämie vom Typ II oder vom Typ IV angeboten. Die Inkubation erfolgte bei 37° C während 12 Stunden. Als Kriterium einer erfolgreichen Lipidbeladung galt bei den partiell delipidierten J3-Lipoproteinen wie bei den total delipidierten a-Lipoproteinen die Anfärbbarkeit ihrer Immunpräzipitationslinien mit Öl-Rot-O nach der Inkubation, bei dem /3-HDL die Sedimentation in der Ultrazentrifuge bei einer Lösungsdichte von d 1,063 g/ml.

Das Auftreten von /S-HDL im Plasma von Patienten mit Hyperthyreose

In allen untersuchten Fällen, in 3 Fällen handelte es sich um ein toxisches Adenom, bei denen die Diagnose einer Hyperthyreose durch die klinische SvmDtomatik

Ιό

wie klinisch-chemisch (T3-Test, T4/T3-lndex, PBJ-Bestimtnung, Radiojodtest) klar gestellt werden konnte, ergab sich das Vorliegen des abnormen Plasmalipoproteins, des jtf-HDL. In keinem untersuchten Fail konnte das 0-HDL noch nachgewiesen werden, nachdem es durch die Therapie eindeutig zur Normalisierung der Stoffwechselfunktion gekommen war.

In Fig.2 ist der Verlauf des T4/T3-lndex, die T3-Werte sowie die /?-HDL-Konzentration bei einer 48jährigen Patientin mit Hyperthyreose unter der Therapie dargestellt. Es zeigt sich eine gute Korrelation der J3-HDL-Konzentration mit den verglichenen Parametern, die sich parallel dem klinischen Bild änderten. Inwieweit die Konzentration des /J-HDL den Schweregrad der Hyperthyreose: widerspiegelt, kann allerdings erst nach der Bewertung einer größeren Anzahl von genau kontrollierten Fällen beurteilt werden.

IO Wie zu erwarten war und bekannt ist, ergaben hingegen die Bestimmungen des Gesamtcholesterins im Plasma der untersuchten Patienten kernen verläßlichen diagnostischen Hinweis für das Vorliegen oder den Ausschluß einer Hyperthyreose. Obgleich der Durchschnittswert unserer Patientengruppe mit W mg /u Plasmacholesterin unterhalb der Norm lag. der niedrigste Wert vor der Therapie betrug 87 mg°/o, können solche Werte wegen der großen individuellen Streuung nicht als sicherer diagnostischer Parameter herangezogen werden. Sie erlauben allenfalls einen gewissen Hinweis auf den Erfolg der Therapie. Es zeigte sich hier wie bei allen Störungen des Fettstoffwechsels deutlich die beschränkte Aussagekraft einer isolierten Analyse der einzelnen Plasmalipidfraktionen und unterstreicnt gleichzeitig die Bedeutung und den Wert der genauen Charakterisierung der Plasmalipoproteinfraktionen.

ί Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Diagnose von Hyperthyreose (Schilddrüsenüberfunktion), dadurch gekennzeichnet, daß Köi perflüssigkeiten von Patiep.ten luf einen möglichen Gehalt an einem abnormen Lipoprotein (J3-HDL) mit einer Dichte d> 1,063 g/ml und J3-Mobilität untersucht werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Gehalt an jS-HDL durch Nachweis des j?-HDL selbst oder durch Nachweis eines oder mehrerer seiner Bestandteile oder Komplexe festgestellt wird.