DE2162923A1

DE2162923A1 - Enzymkomplex

Info

Publication number: DE2162923A1
Application number: DE19712162923
Authority: DE
Inventors: Zeenat Miami Fla. Gunja-Smith (V.StA.)
Original assignee: Resarch Corp., New York, N.Y. (V.St.A.)
Priority date: 1970-12-18
Filing date: 1971-12-17
Publication date: 1972-06-29
Also published as: NL7117405A; GB1377064A; FR2118744A5; IT945488B; CA996480A; BE776856A

Description

Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmann Dr. R. Koenlgsberger - Dlpl.-Phys. R. Holzbauer - Dr. F. Zumstein Jun.

PATENTANWÄLTE

TELEFON: SAMMEL-NR. 225341 TELEGRAMME: ZUMPAT POSTSCHECKKONTO: MÜNCHEN 91139

BANKKONTO: BANKHAUS H. AUFHÄUSER

8 MÜNCHEN 2.

97/90/Wei

Case 25.101-021

BESEARCH CORPORATION, Few York/USA

Enzymkomplex

Die Erfindung betrifft ein das Glykogen und die Stärke entzweigendes Enzym, welches von Spezies der Gattung Cytophaga hergestellt wird.

Die britische Patentschrift 1 048 887 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Enzymsystems von einer Spezies der Gattung Cytophaga, welches bei der National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen/Schottland unter der Nr. NCIB 9497 hinterlegt wurde. Das Enzymsystem, welches aus Cytophaga NCIB 9497 erhalten wurde, wurde "L1 Enzym" bezeichnet. Dieses Enzymsystem enthält wertvolle proteolytische Enzyme und wurde bislang in der Hauptsache als ein proteolytiscb.es Agens angesehen. Es wurde nun gefunden, daß der 11 Enzymkomplex ein Isoamylaseenzym enthält, welches stärkehaltige Polysaccharide und Oligosaccharide mit a-1->6-verknüpften Zweigen, z.B. Glykogen und Amylopektin, entzweigen kann. Dieses Enzym wird im folgenden als Cytophaga-Isoamylase bezeichnet und hat die folgenden

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kennzeichnenden Eigenschaften:

a) eine optimale Aktivität bei einem pH-Wert von 5,5; "b) ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 120000, bestimmt unter Anwendung des Dichte-Gradienten-Zentrifugierverfahrens (density-gradient centrifugation);

c) einen isoelektrischen Punkt zwischen 5»0 und 5»5»

d) Inhibierung durch Äthylendiamin-tetraacetat;

e) keine Inaktivierung durch Tris-(2-amino-2-hydroxymethyl-1, 3-propandiol) oder p-CMB (p-Chlormercuribenzoat)

Andere Eigenschaften des zum Teil gereinigten Enzympräparats ■werden im folgenden beschrieben.

Die Cytophaga-Isoamylase kann zumindest zum Teil von anderen Materialien in den L1 -Enzymkomplex durch Fraktionierung und Auswahl derjenigen Fraktionen, welche eine bedeutende Aktivität aufweisen, abgetrennt werden. Die Säulenchromatographie auf DEAE-Cellulose und Polyacrylamid erwies sich als besonders wirksam. ^

Das rohe L1-Enzympräparat kann durch Züchtung einer Spezies der Gattung Cytophaga, z.B. Cytophaga NCIB 9497, oder einer Isoamylase bildenden Mutante davon auf einen dafür geeigneten Nährboden unter aeroben Bedingungen hergestellt werden.

Die Züchtung kann mit den in der Fermentationsindustrie wohl bekannten Methoden durchgeführt werden, vorzugsweise durch aerobe Submersionsfermentation.

Eine große Vielzahl von Media der Art, wie sie im allgemeinen bei der Züchtung von Mikroorganismen angewandt werden, können verwendet werden. Solche Media enthalten im wesentlichen eine Stickstoffquelle, erforderlichenfalls ergänzt durch Kohlehydrate und oder Nährsalze. Unter den sich als zufriedenstellend erwiesenen Stickstoffquellen sind Malzextrakt, Fleischextrakt, Pepton und Maiswasser allein oder im Gemisch miteinander. Besonders brauchbare Stickstoffquellen jedoch schließen Pilzmycel, wie Mycel der Gattung Cephalosporium und Penicillium, ein. Es ist somit möglich, als Stickstoffquelle als Rückstand verbliebene

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mycellige Abfälle aus der Produktion voxi Antibiotika zu verwenden, welche eine vergleichsweise billige Materialquelle darstellen.

Die Stiekstoffquelle kann oft den Kohlenstoff- und/oder Mhrsalzbedarf des Organismus ohne Ergänzung liefern, und das Wachstum erfolgt zum Beispiel zufriedenstellend in einem Medium, das nur aus Fleischextrakt und Pepton besteht und auch natriumchlorid enthält. Eine Ergänzung jedoch durch Kohlehydrate kann in manchen Fällen erforderlich sein, wobei geeignete Kohlehydrate zu diesem Zweck Saccharose, Maltose, Glukose usw. einschließen. Spurenmineralien, welche erforderlich sein können, schließen Magnesium, Eisen und Zink ein. Der pH-Wert des Mediums vor der Sterilisierung liegt günstigerweise zwischen 5,0 und 8,0 und vorzugsweise zwischen 5,5 und 6,0. _

Die Zucht wird durchgeführt bei einer Semperatur zwischen 20 und 35⁰O und vorzugsweise zwischen 22 und 32⁰C, wobei eine Temperatur um 26°C das Optimum darstellt. Günstige Kulturzeiten betragen 20 bis 50 Stunden.

Die Kulturflüssigkeit kann dann einer Fraktionierung unterworfen werden, um die gewünschte Isoamylase von den anderen eiweißartigen Komponenten abzutrennen. Eine Vielzahl von Fraktionierungsmethoden kann verwendet werden. In jedem Fall können die erhaltenen Fraktionen auf Isoamylase-Aktivität getestet werden und nur die aktiven Fraktionen ausgewählt werden. Derart kann eine wesentliche Reinigung erzielt werden. Dieses Material ist zur Verwendung als Laboratoriumsreagens zum Studium der Spaltung der 1:6-Bindung in Amylopectin, Glykogen und verwandten Glukosepolymeren geeignet. Jedoch kann ein weniger reines Material zur Anwendung im großen Maßstab, wo ein Enzym von hoher spezifischer Aktivität nicht nötig ist, z.B. beim Stärkeabbau, brauchbar sein.

Wenn Proteasen noch im Enzymkomplex anwesend sind, werden diese dazu neigen, in Lösung die Isoamylase zu inaktivieren

. H'." /7/09 5 2

und es ist daher vorteilhaft, bei Verwendung solcher Protease enthaltenden Isoamylasepräparate einen Proteaseinhibitor hinzuzugeben, wie z.B. Phenylmethansulfonylfluorid oder Diisopropylfluorophosphat [(RO)₂ POF, diisopropylphosphorfluoridate]. Es kann vorteilhaft sein, die Isoamylase und den Proteaseinhibitor als ein vorher hergestelltes Gemisch zu verwenden.

Die rohen Kulturmedien können nach Entfernung der Zellen, z.B. durch Zentrifugierung, mit einem Protein ausfällenden anorganischen Salz, wie Ammoniumsulfat, und/oder mit einem organischen Fällungsmittel, wie Aceton, behandelt werden, um die Isoamylase auszufällen, wobei einiges unerwünschtes Material in Lösung bleibt.

Die Behandlung mit Aceton oder verwandten wassermischbaren Fällungsmitteln dient zur Fällung des Enzyms, während der größte Teil des Polysaccharidgehaltes in Lösung bleibt. Aceton fällt den größten Teil der Isoamylase in dem Konzentrationsbereich von 50 bis 80 % aus.

Das verbleibende Fällungsmittel in der Enzympräparat!on kann mittels Dialyse entfernt werden.

Das Kulturmedium in roher oder zum Teil gereinigter Form kann günstigerweise zum Beispiel durch Zusatz eines Proteaseinaktivators, wie Phenylmethansulfonylfluorid, behandelt werden, um die Proteasen zu inaktivieren, um den proteolytischen Abbau der Isoamylase zu verringern oder zu unterdrücken und ihre Ausbeuten zu erhöhen.

So kann zum Beispiel das rohe Enzym Puder während 30 Min. bei 4⁰C in einer Lösung von 1 mM-Phenylmethansulfonylfluorid in 25 mM Zitratphosphatpuffer von pH 8,0 in einem Anteil von 20 mg Puder pro ml Lösung gerührt werden, gegen denselben Puffer während 24 Stunden dialysiert und dann bei 40000 g während 30 Minuten bei 2⁰C zentrifugiert werden (mM=millimolar)

Das rohe Kulturmedium oder die zum Teil gereinigten Formen

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davon können auf einem schwach basischem Ionenaustauscherharz, z.B. Diäthylaminoäthyl-(DEAE)-Cellulose der Chromatographie unterworfen werden. Die Isoamylase wird bei pH-We^en im Bereich von 7>0 bis 8,0 und Ionenkonzentrationen im Bereich von 5 bis 25 mM nicht adsorbiert, während unter diesen Bedingungen viele Proteine im Präparat auf dem Harz zurückgehalten werden und so abgetrennt werden können.

So bewirkt zum Beispiel die säulenchromatographische oder absatzweise Behandlung mit DEAE-Cellulose bei einem pH-Wert von 8,0 unter Anwendung von 0,005 Mol oder 0,025 Mol Zitratphosphat-Puffer eine 2- bis 5-fache Reinigung.

Die Isoamylase wird nicht auf schwachsaure Ionenaustauscherharze, wie Carboxymethy1-(CM)-CeIIuIose bei pH 5,0 in 50 mM Acetatpuffer adsorbiert.

Es ist ebenfalls möglich, die Reinigung der Isoamylase durch Behandlung des teilweise gereinigten Materials mit einem PoIyacrylamidgel, wie das Biogel P-60, zu bewirken, z.B. unter Anwendung einer schwachsauren,, vorzugsweise 0,05 molaren Pufferlösung, wie Natriumacetat, bei pH 5>0, ale Eluierungsmittel. Eine Reinigung auf DEAE-Cellulose, wie vorstehend beschrieben, gefolgt von einer Behandlung mit Biogel P-60 bewirkte eine zusätzliche etwa 5-fache Erhöhung der spezifischen Aktivität.

Das Enzym ist in Lösung relativ stabil und dialysierte Lösungen wurden einige lage be:
lust der Aktivität gelagert.

sungen wurden einige lage bei 4⁰C ohne nennenswerten Ver-

tfie vorstehend angedeutet wurde, hat die neue erfindungsgemäße Cytophaga-Isoamylase die Eigenschaft Amylopectin, GIykogen und verwandte oc-1—$> 4-verknüpfte Glukane mit a-1—>6-verknüpften Zweigen und zwischenkettigen Verknüpfungen zu entzweigen. Das Enzym Pullulanase zeigte bereits eine ähnliche Fähigkeit gegenüber dem Amylopectin, jedoch ist es nicht in der Lage, eine bedeutende Entzweigung von unabgebautem Glykogen herbeizuführen. Diese Eigenschaften machen das

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neue Enzym sehr geeignet für die Ermittlung der Feinstruktur von Polysacchariden mit oc-1—^6-verknüpften Zweigen und allein¹ für Laboruntersuchungen besteht ein beachtlicher Markt.

Weiterhin besteht eine große Nachfrage nach Stärken, welche einen hohen Amylosegehalt, d.h. wenige Verzweigungen haben, wohingegen die meisten natürlichen Stärken ca. 75 % des verzweigten Amylopectins enthalten. Das neue Enzym kann wirksam die Verzweigungen des Amylopectins in der natürlichen Stärke entfernen, wodurch ihr Handelswert erhöht wird. Diese unverzweigten Polysaccharide können zu klaren Filmen gepreßt oder extrudiert werden. Solche Folien sind natürlich genießbar und können bei der Verpackung von Eßwaren, wie Würsten, anstelle der zur Zeit verwendeten nicht-eßbaren Folien verwendet werden. ^

Das neue Enzym ist auch in der Qualitätskontrolle der Stärke bei ihrer Produktion und bei Stärkeabbauverfahren brauchbar. Weiterhin kann das Enzym durch Angriff der a-1—^6-Verknüpfungen zusammen mit anderen Enzymen, wie ß-Amylase und Amyloglukosidase, Stärke schnell und im wesentlichen vollständig abbauen, wobei die Geschwindigkeit der Reaktion bis zu ihrer Beendigung den Wiederaufbau im wesentlichen ausschließt.

Bei Anwendung von ß-Amylase zusammen mit der Isoamylase wird das erhaltene Produkt Maltose, bei der zusätzlichen Anwesenheit von Amyloglukosidase wird das Produkt Glukose sein. Somit können unter Anwendung dieser Technik Zucker wie Maltose, wirksam und leicht aus Stärke hergestellt werden. In Anbetracht der relativ kleinen Anzahl von α-1 —^6-Verknüpfungen kann die Anwendung des Enzyms allein den teilweisen Abbau der Stärke bewirken, welcher automatisch zum Stillstand kommen wird, wenn alle a-1—^6-Verknüpfungen gesprengt worden sind, ohne daß es nötig ist das Enzym zu denaturieren, um einen weiteren Angriff zu unterbinden, wie es bei Verwendung von ß-Amylase zum begrenzten Abbau der Fall ist. Weiterhin hängen die gewünschten Eigenschaften von Dextrinen für verschiedene

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Verwendungszwecke zum Teil von den verzweigten Ketten ab, die anwesend sind. Durch Entfernung eines vorbestimmten Anteils solcher Verzweigungen können die Eigenschaften des Dextrins den besonderen Erfordernissen angepaßt werden.

Im folgenden wird auf die beiliegenden Zeichnungen Bezug genommen, wobei

Figur 1 die Adsorptionspieks der Jodfärbung von Amylopectin ( )

und Schalentierglykogen (shellfischglycogen) (■ ) vor und nach

der Behandlung mit Isoamylase (0,04 Einh/ml) bei 37⁰G während

24 Stunden,

Figur 2 ein Chromatogramm von Reaktionsgemischen von G-lykogen und Grlykogen-ß-dextrin,

Figur 3 die Zunahme der Reduktionskraft als Folge der Einwirkung von Isoamylase auf Schalentier-, Leber- und Pflanzenglykogenen,

Figur 4 die Proteinverteilung und die Isoamylaseaktivitäten des L1-Enzymkomplexes,

Figur 5 das Elutionsprofil des Enzyrakomplexes an Biogel P-60,

Figur 6 die Ergebnisse einer Saccharose Dichte-Gradienten-Zentrifugierung des Enzympräparats (sucrose density-gradient centrifugation of the enzyme preparation) und

Figur 7 die Ergebnisse der Gel-Elektrofokussiebung (gel electrofocussing) des Enzympräparats zeigt.

Die Entzweigungsaktivität der Cytophaga-Isoamylase auf verschiedenen Substraten wird in Tabelle 1 wiedergegeben.

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Tabelle 1
Wirkung von Isoamylase auf Poly- und Oligosaccharide

Substrat Durch Isoamy- Durch Pullula- Ausmaß der ß-

läse hydroly- nase nachfol- Amylolyse nach sierte glukosi- gend hydroly- der Einwirdische Bindun- sierte glukosi- kung von Isogen ($) dische Bindungen amylase ($)

0 109

0 108

tr j ν κ iin'tin ~ ·

J5cnaj.en"üierglykogen-ß-

3,8 78

0 100

0 106

2,2 70

0 102

Pullulan 1,8 29 9,5

10,7 81

Phytoglykogen	8,7
Schalentier-
glykogen	9,45
Schalentier-
glykogen-ß-
dextrin	12,7
Schalentier-
glykogen-0-
dextrin	12,3
Amylopectin	5,1
Amylopectin-ß-
dextrin	9,3
Amylopectin-0-
dextrin	9,4
Pullulan	1,8
a-Grenzdextrine
(a-Limi t-d extrins)	6,7

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Unter den in den Beispielen beschriebenen Bedingungen wurden Substrate (5 mg/ml) mit gereinigter Isoamylase (0,15 Einh/ml) inkubiert. Nach 18 Stunden wurden Proben (0,2 ml) zur Messung der reduzierenden Kraft entnommen, wobei die verbliebene Abbaulb'sung (digest) 3 Minuten auf 100⁰C erhitzt wurde. Eine Probe dieser erhitzten Lösung (0,2 ml) wurde mit Pullulanase (0,1 ml, 0,5 Einheiten) 1 Stunde lang bei 37⁰C behandelt und die Zunahme der Reduktionskraft gemessen. Eine zweite Probe (0,4 ml) wurde mit ß-Amylase (0,1 ml, 500 Einh/ml) 24 Stunden lang bei 37⁰C behandelt. Die Reduktionskraft wurde dann gemessen.(Siehe Tabelle 1).

Die Behandlung von Schalentierglykogen und Amylopectin mit dem entzweigenden Enzym während 24 Stunden ergab eine be- ^ merkenswerte Zunahme der Jod-Färbkraft (iodine-staining power), welche durch eine geringfügige Verschiebung von E_,___ (470 nm-^ 490 nm; 530 nm—^545 nm, siehe Fig. 1) begleitet wurde. Die Chromatographie des G-lykogen-Reaktionsgemisches zeigte die Bildung einer Reihe von Oligosacchariden an, welche vollkommen durch die Einwirkung von ß-Amylase zu Maltose und Glukose abgebaut wurden, wie der Figur 2 zu entnehmen ist. Messungen der Reduktionskraft (reducing power measurements) bestätigten, daß die aufeinanderfolgenden Einwirkungen des entzweigenden Enzyms und der ß-Amylase eine vollkommene Umwandlung des Glykogens zu Maltose und Glukose herbeiführten, wie in der Tabelle 1 dargestellt wird. Die Zunahmen der Reduktionskraft und der Jod-Färbkraft, die die entzweigende Einwirkung auf 3 verschiedene Glykogene begleiten, sind in Figur 3 dargestellt. In jedem Fall war die Reaktion nach 21 Stunden praktisch vollständig mit im wesentlichen keiner weiteren Änderung der Jod-Färbkraft oder der Kupferreduktionskraft nach 42 Stunden, woraus geschlossen werden kann, daß a-Amylase nicht vorhanden war. Das.endgültige Ausmaß der Hydrolyse, welche für die Glykogene der Schalentiere, der Leber und des Zuckermaiees (sweet corn) beobachtet wurde, entspricht einer mittleren Kettenlänge von 10,5, 14 u. 11,5, in dieser Reihei

• - folge.

Diese Werte sind im Einklang mit den Kettenlängen, welche durch Bestimmung mit anderen Methoden berichtet wurden; Die Chromatographie der Endprodukte zeigte wiederum eine Reihe von

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Oligosaccharide!! an. Eine kleine Menge Glukose wurde ebenfalls in den Produkten festgestellt, jedoch zeigte ein Abschätzung durch Glukoseoxydase, daß weniger als 0,4 ^ der Gesamtkohlehydrate nach 21-stündiger Inkubation als Glukose freigesetzt wurden. Dies zeigt an, daß das entzweigende Enzympräparat im wesentlichen frei von a-Glukosidaseaktivität ist. Zwischen pH 5 und 7 ist der pH-Wert der Reaktion nicht kritisch, jedoch tritt ein merklicher Verlust der Enzymaktivität bei niedrigeren pH-Werten ein. Wenn nicht anders angegeben, wurden daher alle übrigen hier aufgeführten Inkubationen des Cytophaga-Enzyms bei pH 5»5 durchgeführt. Eine Inkubation von 5 Minuten bei 50⁰C ergab einen Verlust der entzweigenden Aktivität von über 70 j£.

Der Tabelle 1 kann entnommen werden, daß das Enzym auf Pullulan nicht einwirkt und eine begrenzte Wirkung gegenüber a-Grenzdextrinen aufweist. Eine rapide Hydrolyse wurde in den Anfangsstadien der letztgenannten Inkubation (1 Stunde) beobachtet, was darauf hindeutet, daß das a-Dextringemisch einen kleinen Anteil von Molekülen enthält, welche gegenüber der entzweigenden Wirkung des Enzyms sehr anfällig sind.

Die Einwirkung des Enzyms auf Amylopectin und Glykogen ist praktisch nach 24-stündiger Inkubationszeit beendet. Die vollständige ß-Amylolyse von Glykogen, Amylopectin und deren Phosphorylase-Grenzdextrinen nach der Entzweigung (siehe Tabelle 1) deutet darauf hin, daß alle Verzweigungsstellen in diesen Molekülen gespalten wurden. Die beschränkte ß-Amylolyse der ß-Dextrine nach derselben Behandlung legt die Anwesenheit von Verzweigungsstellen nahe, welche gegenüber der Einwirkung des Cytophaga-Enzyms widerstandsfähig sind. Dies wird bestätigt durch eine weitere Zunahme der Reduktionskraft, wenn die entzweigten ß-Dextrine mit Pullulanase behandelt wurden (siehe Tabelle 1). Wie erwartet, ergab sich keine Zunahme der Reduktionskraft des vollkommen entzweigten Amylopectins, Glykogens und der Phosphorylasedextrine, jedoch wurden Pullulan und die a-Grenzdextrine (α-limit dextrins) hydrolysiert. Die Chromatographie der Glykogen-ß-dextrinProdukte nach der Behandlung mit Pullulanase oder mit dem

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Cytophaga entzweigenden Enzym, um dasselbe Ausmaß der Entzweigung zu erhalten (75 #), ergab daß, während durch Pullulanase etwa dieselben Mengen Maltotriose und Maltose freigesetzt werden, durch das Cytophaga-Enzym Maltotriose aus dem Dextrin in viel größeren Mengen als Maltose freigesetzt wird, wobei Maltose kaum wahrnehmbar ist, wie der Figur 2 zu entnehmen ist. Die Verknüpfungen zwischen den Ketten, die die Maltose-Seitenketten des ß-Dextrins tragen, müssen daher gegenüber der Wirkung des entzweigenden Cytophage-Enzyms resistent sein, obwohl sie leicht durch Pullulanase hydrolysiert werden.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Reinigung der Cytophaga-Isoamylase und ihre Charakterisierung. Die Isoamylaseaktivität wurde geprüft durch Freisetzen von Kupferreduktionskraft aus Glykogen. Eine Probe, welche eine geeignete Menge des Enzyms, Glykogen (5 rag/ml) und Natriumacetat-(100 mM) Puffer bei pH 5,5 enthält, wird bei 37⁰C inkubiert. Eine Einheit ist definiert als diejenige Menge des Enzyms, welche unter diesen Bedingungen 1 mM Glukoseäquivalent pro Minute freisetzt. Die Wirkung von Isoamylase auf verschiedene Substrate wurde bei 37⁰C in Proben, welche das Enzym (wie angegeben), das Substrat (5 mg/ml) und Uatriumacetat-(100 mM) Puffer bei pH 5,5 enthalten.

Die Gesamtmenge der reduzierenden Zucker wurde nach HeIson bestimmt und Glukose mit Glukoseoxydase bestimmt (JB. Lloyd und W.J. Whelan Anal. Biochem. 30 (1969) S. 467). Die Konzentrationen von Polysaccharidlösungen wurden bestimmt durch Hydrolyse mittels a-Glukosidase (J.J. Marshall und W.J. Whelan FEBS Letters 9 (1970) 85) mit nachfolgender Abschätzung des Kupfer reduzierenden Zuckers oder der Glukose. Das Ausmaß der ß-Amylolyse von Polysacchariden wurde nach Walker und Whelan (Biochem. J. 76 (1960) 264) bestimmt.

Die Jod-Färbkraft von Glykogen und Amylopectin wurde durch Zugabe von 5 ml Jodreagens (Jod (0,02 ^-Natriumiodid (0,2 %) in 0,05n HCl) zu 0,1 ml einer Lösung, die 5,0 mg Polysaccharid

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pro ml enthält, gemessen. Die Absorbtionen der Lösungen wurden "bei 490 nm bzw.680 nm . in einem Coleman-Junior 11-Spektrophotometer gemessen.

Das Protein wurde nach. Lowry et al. bestimmt. Die Chromatographie wurde auf Whatman No. 1-Papier mit Propanol : Äthylacetat : Wasser (14:2:7) oder Äthylacetat : Pyridin : Wasser (10:4:3) als Laufmittel durchgeführt. Zuckerflecken wurden mit AgHO-z/UaOH sichtbar gemacht.

Beispiel 1 Reinigung der Isoamylase

1250 mg des L1-Enzympräparats, welches nach der Methode des Beispiels 7 der britischen Patentschrift 1 048 887 hergestellt worden ist, wurden in 50 ml Wasser gelöst und bei 20 000 U/min, zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. 40 ml der klaren überstehenden Lösung (deren Isoamylasegehalt im folgenden als "rohe Isoamylase" bezeichnet wird) wurde mit kaltem Aceton fraktioniert, wobei zwei Fraktionen (0-50 i» und 50-80 $) gesammelt wurden. Jedes Präzipitat wurde durch Zentrifugieren gesammelt, in 10 ml eines 0,1 M Zitrat-phosphat-Puffers vom pH 6,0 gelöst und dann über Nacht gegen diesen Puffer dialysiert.

Acetonkon- Volumen Aktivität Gesamt-Praktion zentration (ml) (iEinh/ml) einhei- f

anfängliche 40 0,132 5,27 100 obere

P1 0-50 11,6 0,184 .2,13 40,4

!"2 50-80 14,7 0,155 2,29 43,5

Gesamtausbeute = 83,9 %

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Die fraktion 2 (106 ml = 1,65 Einheiten) wurde gegen einen 0,025 M Zitrat-phosphat-Puffer vom pH 8,0 dialysiert und auf eine DEAE-Cellulosesäule von 6,5 x 1,5 cm aufgebracht. Das Eluieren wurde durchgeführt mit einem Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl in diesem Puffer über 100 ml, wobei Fraktionen
von 5,2 ml gesammelt wurden. Die Proteinverteilung und die Aktivitäten (gemessen durch die Zunahme der Jod-Färbkraft
von Glykogen) sind der Fig. 5 zu entnehmen. Die Fraktionen 3 bis 6 wurden vereinigt.

Volumen

Aktivität

isolierte Gesamteinheiten Isolierung von der DEAE-Cellulose Gesamtausbeute

20,8 ml

0,056 Einh/ml

1,17
71
31 %

Proteingehalt und spezifische Aktivitäten:

Lösung

Protein Aktivität Spezifische (mg/ml) (Einh./ml) Aktivität

(Einh./mg)

anfängliche	überstehende	5	,6	0,	132	,023
F1		7	,5	0,	184	,024
F2		2	,Ο'	0,	155	,077

nach der DEAE-Cellulose
(vereinigte Fraktionen
3 bis 6j

Analyse für Polysaccharid:

0,44

lösung

anfängliche
überstehende

Polysaccharid (als Glukose, mg/ml)

3,15 8,30 0,28

0,056 0,13

Volumen Gesamt-Polysaccha-(ml) rid (mg)

40 126,0

11.6 96,0

14.7 4,0

d.h. die Acetonfraktionierung ergibt eine Fraktion (F2),
welche praktisch polysaccharidfrei ist.

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Diese Fraktion wurde auf Proteaseaktivität getestet, welche vorhanden war, jedoch in einem beträchtlich niedrigerem Ausmaß als in der Anfangslösung.

Die gereinigte Isoamylaselösung von der DEAE-Cellulose wurde dann gegen Wasser dialysiert. Das Volumen nahm um etwa 20 % zu.

2. Aktivität und Stabilität bei verschiedenen pH-Werten

Der Zusammenhang zwischen Aktivität und pH-Wert wurde durch Inkubation von Enzympräparaten (0,25 ml, 0,040 Einh./ml) bei * 30⁰C während 90 Minuten mit einem Natriumzitrat-phosphat-(0,2M) Puffer bei verschiedenen pH-Werten und einer Schalentierglykogenlösung (1,0 ml, 10 mg/ml) untersucht. Proben von 0,5 ml wurden zur Bestimmung der Reduktionskraft entnommen.

Der Zusammenhang zwischen Stabilität und pH-Wert wurde durch Vorinkubation des Enzympräparates mit verschiedenen Pufferlösungen während 120 Minuten bei 23⁰C und Bestimmung der verbliebenen Aktivität, wie vorstehend angegeben, nach Zugabe der Glykogensubstratlösung untersucht.

pH Aktivität verbliebene Aktivität nach 2 Std.

(als i> des Maximums) Vorinkubation bei Zimmertemp. bei

dEsem pH (als % der Aktivität ge- ^ messen ohne Vorinkubation)

3,24	3,7
3,60	9,1
3,90	19,5
4,40	80,0
4,81	94,5
5,44	100,0
6,13	99,8
7,11	91,0
8,70	65,0

20 72 84 85 93 96,5

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3. Stabilität des Enzympräparates bei der Lagerung

Die dialysierte DEAE-Cellulose-Enzymfraktion wurde im Kühlschrank gelagert und Proben wurden in Abständen zur Aktivität sbeStimmung entnommen. Die Aktivität wurde ebenfalls in einer lösung bestimmt, welche im Bezug auf Clelands Reagens 10 mM gemacht wurde.

ohne Clelands-Reagens

mit Clelands-Reagens

Anzahl der Aktivität verbleibende Aktivität verbleibende gelagerten (Einh/ml) Aktivität (%) (Einh/ml) Aktivität (<f°) Sage

0	0,040	100	0,044	110
1	0,038	95	0,033	82,5
3	0,037	92,5	0,032	80
9	0,04-1	102
12	0,039	97

Wie ersichtlich, ist das Enzym bei der Lagerung im Kühlschrank stabil. Clelands Reagens scheint nicht notwendig zu sein.

4. !Eemperaturoptimum und Stabilität

Der Zusammenhang zwischen Aktivität und Temperatur wurde durch Inkubation des Enzyms (0,2 ml) mit Schalentierglykogen (5 mg/ml) und Natriumacetatpuffer (0,015 M) bei pH 5,5 bei 30, 35f 40 und 50⁰C untersucht. Nach der Inkubation während einer Stunde wurden Proben (0,5 ml) zur Bestimmung der Reduktionskraft entnommen.

Der Zusammenhang zwischen Stabilität und Temperatur wurde durch Vorinkubation des Enzyms und Pufferlösung bei 30 und 40⁰C während 60 Minuten vor der Zugabe des Glykogens untersucht. Nach der weiteren Inkubation während 60 Minuten bei •derselben Temperatur wurden Proben (0,5 ml) zur Bestimmung der Reduktlcnslcraft entnommen.

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	— IO -	2162923	0	,033
		!Temperatur scheinbare Aktivität (Einh/ml)	0	,046
	30	0	,056
	35	0	,028
	40		verbleibende Aktivität (#)
	50		85
Temperatur	scheinbare Aktivität nach 1 Std. bei die ser Temperatur		4
30	0,028
40	0,002

Es geht klar hervor, daß die scheinbare Aktivität bei ca. 4O⁰C am höchsten ist, jedoch scheint das Enzym bei dieser Temperatur in Abwesenheit eines Substrates sehr unbeständig zu sein.

5. Test für mögliche Enzym-Inhibitoren

Proben, enthaltend Enzymlösung (0,2 ml), Natriumacetatpuffer (50 mM), pH 5,5 (0,2 ml), Schalentierglykogen (0,5 ml, 10 mg/ml) zusammen mit

a) ohne Zusatz (Vergleichsprobe)

b) EDTA (Endkonzentration 10 mM)

c) EDTA (10 mM) + Ca⁺⁺ (50 mM)

d) pCMB (Endkonzentration 10"⁵M)

e) Tris-(2-amino-2-hydroxy-methyl-1,3-propandiol) (Endkonzentration 50 mM; mit Essigsäure auf pH 5,5 eiliges ballt)

wurden hergestellt.

Der Einfluß dieser verschiedenen Additive auf die Aktivität wurde durch Jod-Pärbmessungen bestimmt.

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Additiv Verlust der Aktivität

EDTA (10 mM) 72

EDTA + Ca⁺⁺ 72

pOMB (10"⁵M) O

Tris (50 mM) 0

6. Scheiben-Gel Elektrophorese (Disc-Gel Electrophoresis)

Die Elektrophorese unter Anwendung der Iris-Puffer von pH 8,4 enthaltenden "Standard" Canalco Reagentien zeigt eine größere sich langsam "bewegende Proteinbande mit einer Anzahl kleinerer schnell beweglicher Banden. Eine Enzymaktivität konnte jedoch in dem Gel nicht festgestellt werden.

Die Elektrophorese wurde daher durchgeführt in einem Phosphat-' puffer bei pH 7,5. Die dialysierte Enzymlösung (0,25 ml) wurde gefriergetrocknet, in Wasser (0,05 ml) wieder aufgelöst und auf die Gele aufgetragen. Das Protein wurde nach Beendigung der Elektrophorese mit Coomassieblau ermittelt und zeigte eine breite Bande zusammen mit zwei schmaleren intensiveren Banden.

Das zweite Gel wurde in 21 Stücke geschnitten und jede Fraktion wurde 11 Stunden mit einer Glykogen-Substratlösung (0,2 ml) und einem Natriumacetatpuffer (50 mM) bei pH 5,5 inkubiert und die Zunahme der Jodfärbung wurde bestimmt.

Es zeigte sich, daß die Enzymaktivität nicht mit der größeren Proteinbande zusammenhing, sondern mit einer der kleineren sich langsamer bewegenden Banden (bei Fraktion 3 und 4).

7. Saccharose Dichte-Gradient-Zentrifugierung

Es wurden in 5 ml Zentrifugenröhrchen Gradienten von 5 bis 20 ^l _t Saccharose in Hatriumzitrat-phosphatpuffer (0,1 M) bei pH 7,5 mit je einem Gesamtvolumen von 4»6 ml hergestellt.

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Eine Enzymlösung (7»5 ml) wurde gefriergetrocknet und in einem Natriurazitratphosphatpuffer (0,1 M ) bei pH 7,5 (0,4 ml) wieder aufgelöst. Ein aliqoter Teil dieser Lösung (0,1 ml)wurde am„oberen Ende eines Saccharose-Gradienten in Form einer Schicht aufgegeben

fund bei 39 000 U/Min, in dem SW 39-Kopf einer Beckman Ultrazentrifuge zentrifugiert. Zwei andere Röhrchen wurden zum Vergleich eingesetzt, von denen das eine Glukoaraylase (A. Niger) und das andere Lysozym und Phosphorylase enthielt.

Nach dem Zentrifugieren während 18 Stunden wurden die unteren Enden der Röhrchen durchstochen und Fraktionen von 5 Tropfen gesammelt (37 Fraktionen). Die Proben wurden auf Protein- * (Lowry) und Enzymaktivitäten geprüft. Die Glukoamylaseaktivität wurde durch die Abgabe von Glukose aus der löslichen Stärke und die Phosphorylaseaktivität wurde durch die Zunahme der Jod-Färbkraft in Glukose-1-phosphat und Glykogen als Grundlage ■ (primer) enthaltenden Proben geraessen. Das Lysozym wurde nur durch Proteinbestimmungen nach Lowry bestimmt.

Die Isoamylase sedimentierte etwas schneller als die Glukoamylase (Pig. 6). Unter Anwendung eines Molekulargewichts von 110 000 für das zuletzt genannte Enzym ergab sich für die Isoamylase ein Molekulargewicht in der Größenordnung von .120 000. Es wurde gezeigt, daß die Aktivität nicht mit dem größeren Proteinpiek zusammenfällt, was darauf hindeutet, P daß das Enzympräparat mit einer beträchtlichen Menge anderen Proteins verunreinigt ist. Die spezifische Aktivität der Fraktion 17 betrug 1,1 Einh/mg.

8. Gel-Elektrofokusaierung (Gel Elctrofocussing)

Die Elektrofokussierung wurde in LKB-Ampholyten (pH-Bereich 3-10) enthaltenden Polyacrylamidgelen durchgeführt. Ein Protein des Enzympräparats (0,25 mg Protein) wurde mit dem Gelmonomeren gemischt und dann in 38 mm Röhrchen chemisch polymerisiert. Die Elektrofokussierung wurde über Nacht bei 2⁰C bei einem Potential von 350 YoIt durchgeführt.

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Protein wurde in einem Gel durch Färben mit Coomassieblau siohtbar gemacht. Einige Proteinbanden waren sichtbar, was bestätigte, daß das Präparat unrein ist.·

Ein anderes Gel wurde unter Anwendung eines Skalpels in 1mm-Teile geschnitten und jedes Stück wurde mit 0,5 ml Wasser 2 Stunden lang extrahiert und dann wurde der pH-Wert bestimmt. Die Isoamylase-Aktivitäten wurden dann durch Inkubation der Lösungen mit Schalentierglykogen (0,2 .ml, 10 mg/ml) und Natriumacetatpuffer (50 mM, pH 5,5) bei 30⁰C über Nacht bestimmt .

Der isoelektrische Punkt lag zwischen 5?0 und 5,5 (I¹Ig. 7). Es sollte darauf hingewiesen werden, daß jedes Protein oder jede Aktivität oberhalb eines pH-Wertes von 7,7 mit dieser Methode nicht nachgewiesen werden könnte.

Beispiel 2 Reinigung der Isoamylase

Das L1-Enzympräparat (1,25 g), hergestellt nach der Methode des Beispiels 7 der britischen.Patentschrift 1 048 887 wurde in 50 ml eines Natriurazitrat-phosphatpuffers (0,005 Mol bei pH 8), welcher Phenylmethylsulphonylfluorid (PMSP, 1 mM) enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde 30 Min. bei 4⁰C gerührt. Wenn nicht anders angegeben, wurden alle nachfolgenden Operationen bei dieser Temperatur durchgeführt. Die Suspension wurde dann bei 40 000 g während 30 Min. zentrifugiert und die klare obere Schicht wurde 24 Stunden lang gegen einen Zitratphosphatpuffer (0,005 M ) von pH 8,0 dialysiert. Die Lösung wurde auf eine DEAE-Cellulosesäule (6,5 x 1,5 cm), welche zuvor mit demselben Puffer ins Gleichge-/geßracht wurde, aufgebracht und die Säule wurde dann mit einem linearen HaCl-Konzentrationsgradienten (0-0,5 Mol) in 100 ml eines Zitratphosphatpuffers (0,005 M ) von pH 8,0 eluiert. 5j2 ml-Fraktionen wurden gesammelt und die Proteinverteilung (Absorbtion bei 280 nm) und die Isoamylaseaktivität

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(fo Zunahme der Jod-Färbkraft von Glykogen) wurden gemessen. Das Eluierungsmuster war der in Fig. 4 gezeigten Art.

Die eine Isoamylaseaktivität aufweisenden Fraktionen wurden kombiniert und 18 Stunden gegen einen Natriumacetatpuffer (0,05 M ) von pH 5,0 dialysiert.

Ein Teil der dialysierten Lösung (3 ml, 1,5 mg Protein/ml) wurde bei Zimmertemperatur (23⁰C) auf eine Biogel P-60-Säule (2,5 x 95 cm), die zuvor bei Zimmertemperatur mit einem Natriumacetatpuffer (0,05M) von pH 5,0 ins Gleichgewicht gebracht wurde, aufgebracht. Die Säule wurde mit demselben Puffer bei einer Abflußgeschwindigkeit von 50 ml/Std. eluiert und 6,2 ml-Fraktionen wurden auf Profein und Isoamylaseaktivität, wie in der DEAE-Cellulose-Fraktionierung beschrieben, getestet. Das typische Eluierungsmuster war der in Fig. 5 wiedergegebenen Art.

Zusammenfassung des Reinigungsverfahrens

Reinigungs schritt	Enzymaus beute (%)	spezifische Aktivität (Einh/mg Protein;	Reinigung
rohes L1-Präparat	100	0,010	—
Zentrifugierung	85	0,047	4,7
DEAE-Cellulose- chromatographie	85	0,200	20
Biogel P-60- Ohromatographie	68	1,200	120
Beispiel 3
Abbau von Stärke

Eine 5$ige Lösung von löslicher Stärke wurde bei pH 5,5 mit Isoamylase (40 000 Einh/g Stärke) und Gersten-ß-amylase ( 500 Einh/g Stärke) bei 40⁰C 24 Stunden lang behandelt. Die Analyse des Auszugs auf reduzierende Zucker ergab eine vollständige Umwandlung zu Maltose.

...· S 3 ? 7 / 0 9 5 2

Erläuterungen zu
Figur 1

Einfluß der rohen Isoamylase (0,04 Einh/ml) auf die Jodfärbungen von Schalentierglykogen (shellfish glycogen)

( ) und Amylopectin ( ). Die Inkubation betrug 24

Stunden bei 37°C mit dem Substrat (5 mg/ml) und einem Natriumacetatpuffer (100 mM) vom pH 5,5· Proben wurden mit Jod bei der Zeit Null und 24 Stunden (entzweigt) gefärbt und die Spektren wurden aufgenommen.

Figur 2

Vergleichende Wirkung von roher Isoamylase und von Pullulanase auf Schalentierglykogen und sein ß-Dextrin. (G = Vergleichsserien von Glukose (G1), Maltose (G2) usw.). A = Glykogen + Isoamylase; B = wie A, gefolgt von ß-Amylase; D = ß-Dextrin + Pullulanase; E = ß-Dextrin + Isoamylase; F = ß-Dextrin + Isoamylase, gefolgt von ß-Amylase; G = ß-Dextrin + Isoamylase + Pullulanase, gefolgt von ß-Amylase. In D und E waren das Ausmaß der Hydrolyse der 1—»6-Bindung gleich und etwa 75 %. Wo ß-Amylase verwendet wurde, wurde(n) das (die) entzweigende(n) Enzym(e) zuerst durch Wärme inaktiviert. Hydrolysebedingungen wie in Figur 1.

Figur 5

Zunahmen der Reduktionskraft und Jod-Färbkraft der mit roher Isoamylase behandelten Glykogene. Kaninchenleb er-(Jü), Zuckermai s-(·) und Schalentier-(J^) Glykogene wurden mit roher Isoamylase (0,04 Einh/ml) unter den für Fig. 1 gegebenen Bedingungen inkubiert. In Abständen wurden Proben zur Messung der Reduktionskraft ( )

und der Jodfärbung ( ) entnommen.

2 Π C 0 2 7 / 0 9 5 2

Claims

Patentansprüche

1. Ein Isoamylaseenzym, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer Spezies der Gattung Cytophaga erhalten wird, wobei es die folgenden charakteristischen Eigenschaften aufweist

a) eine optimale Aktivität bei einem pH von etwa 5>5;

b) ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 120 000, bestimmt unter Anwendung der Dichte-Gradienten-Zentrifugierung;

c) einen isoelektrischen Punkt zwischen 5>0 und 5,5»

d) Inhibierung durch Äthylendiamin-tetraacetat, und

e) keine Inaktivierung durch Tris-(2-amino-2-hydroxymethyl- W 1,3-propandiol) oder p-Chlormerkuribenzoat.

2. Verfahren zur Herstellung eines Isoamylaseenzyms,

dadurch gekennzeichnet, daß man eine Spezies der Gattung Cytophaga auf einen dafür geeigneten Nährboden unter aeroben Bedingungen züchtet und daß man die Isoamylase durch Fraktionierung und Auswahl derjenigen Fraktionen, welche eine Isoamylaseaktivität aufweisen, von den anderen proteinhaltigen Materialien in dem so erhaltenen Enzymkomplex mindestens teilweise abtrennt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Isoamylaseenzym durch Züchtung des Organismus

* Cytophaga HClB 9497 oder einer Isoamylase bildenden Mutante davon herstellt.

4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest teilweise Abtrennung durch Entfernung der Zellen aus den rohen Kulturmedia und nachfolgender Durchführung mindestens einer der folgenden Arbeitsweisen erfolgt:

1) Behandlung mit einem Protein fällenden anorganischen Salz und/oder einem organischen Fällungsmittel;

2) Chromatographie auf einem schwach basischen Ionenaustauscherharz ;

3) Behandlung mit einem Polyacrylamidgel.

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5. Verfahren gemäß Anspruch. 4, dadurch gekennzeichnet, daß das anorganische Protein fällende Salz Ammoniumsulfat und das organische Pällungsmittel Aceton ist..

6. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Chromatographie auf Diäthylaminoäthylcellulose bei pH 8,0 unter Anwendung eines etwa 0,005 bis 0,025 Molaren Zitratphosphatpuffers durchführt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit einem Polyacrylamidgel unter Anwendung von Biogel P 60 und einer schwachsauren Pufferlösung als Eluierungsmittel erfolgt.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das rohe oder zum Seil gereinigte Isoamylaseenzym zur Verringerung oder Verhinderung des proteolytischen Abbaus der Isoamylase mit einem Proteaseinhibitor behandelt.

9. Verfahren gemäß Anspruch S, dadurch gekennzeichnet, daß der Proteaseinhibitor Phenylmethansulphonylfluorid oder Diisopropylfluorophosphat ist.

10. Verwendung des Isoamylaseenzyms gemäß Anspruch 1 zum Entzweigen von Amylopectin, Glykogen und verwandten oc-1—>4-verknüpften Glukanen, welche oc-1—*.6-verknüpfte Zweige und Zwischenkettenverknüpfungen besitzen.

11. Verwendung des Isoamylaseenzyms gemäß Anspruch 1 zusammen mit ß-Amylase zum im wesentlichen vollständigen Abbau von Stärke.

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