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Exonuclease und deren Gewinnung Die vorliegende Erfindung betrifft
eine Exonuclease aus dem Meeresschwarm Verongia aerphoba, Verfahren zu deren Gewinnung
und Reinigung, sowie deren Verwendung als Mittel gegen unerwilnschten Zellwachstum
und derartiges Mittel als solche.
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Im folgenden wird die Isolierung einer elektrophoretisch einheitlichen
Desoxyribonuclease (DNase) aus den Meeresschwamm Verongia aerophoba, im folgenden
V.a.
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genannt, beschrieben. Außerdem wurden einige nigenschaften untersucht,
von denen zwei besonders interessant sind: 1. Das Enzym ist in der Lage, das Wacllstum
von Tumor-Zellen (Lymphomzellen L 5178 Y) in der Zellkultur zu hemmen.
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Außerdem kann durch die Behandlung mit diesem Enzym die Lebensdauer
tumortragender Mäuse verlängert werden.
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2. Obwohl schon von andexen Desoxyribonucleasen bekannt r ist, daß
sie exonucleolytisch (vom Molekülende her) Desoxyribonucleinsäure (DNA) abbauen
können, ist es bei diesem Enzym bemerkenswert, daR in Form des Schwanmes Verongia
aerophoba große Schstoffguellen zur Verfügung stchen. Die Re-inigungsschritte sind
einfach und liefern ein Enzym, as DNA zu 3-phosphorylierten Desoxyribotiden abbaut.
Bisher konntc keine enzymatische rethode zur Gewinnung von 3'-Muklectiden so ausgebaut
werden, daß diese Produkte kommerziell angeboten werden können.
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Beispiel.
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1.) Gewinnung und Reinigung Der in Rovinj (Jugoslawien) aus 6-8m Wassertiefe
geerntete Schwamm V.a. wird luftgetrocknet transportiert. Das luftgetrocknete Material
wird mit Io@mm Azetatpuffer, pH 6,0, erschöpfend extrahiert. Die vereinigten Extrakte
werden gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wird in 10 mm Azetatpuffer, pH 6,0,
gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert (4°C). Nach Konzentrieren mit festem
Poly äthylenglykol (PÄG) wird der überstand des Konzentrats auf pH 3,0 (0° C) eingestellt.
Der dabei anfallende Niederschlag wird in der Kälte abzentrifugiert. Der Uberstand
wird auf pH 6,0 eingestellt und über Sephadex G 200 superfine chromatographiert.
Died enzymhaltigen Fraktionen de Eluats werden nach Konzentrierung (PÄG) auf pH
6,5 eingestellt und über Hydroxylapatit chromatrgraphiert. Die ahschließende Chromatographie
an Phosphatcellulose, pH 3,8, trennt die begleitenden Enzymaktivitäten weitestgehend
ab. Die Restaktivität (im Vergleich zum Ausgangsmaterial) an saurer RNase beträgt
weniger als 1%, die an saurer Phosplwatase weniger als lto.
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Die Gosamtausbeute der Enzymreinigung liegt bei 50%; die spezifische
Aktivität kann um den Faktor 1CO angereichert werden.
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2.) Eigenschaften nie V.a. -Exonuclease ist im pH-Bereich 5 - 6 bis
620C thermostablt. Das Dnzym baut hitzedenaterierte DNA bevorugt gegenüber nativer
DNA ab (Faktor 4 - 5).
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Das pH-Optimum liegt bei 4,7. Der pH-Wert am isoelektrischen Punkt
beträgt 6,1. Das Molekulargewicht des Enzyms liegt bei 62 000. Das Substratoptimum
(für Herings-DNA) liegt für denaturierts DNA (Michaeliskonstante km = 4,7 µg/ml)
bei 100 µg/ml und für native km = 13,6 Vg/ml) bei 25 ug/ml.
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Einwertige Kationen (Li+, Na+, K+, Cs+) aktivieren die Spaltung von
DNA durch Verongia-Exonuclease. FUr Na wurde eine optimale Konzentration von 120
mM gefunden. Oberhalb von 120 mM hemmt Na+ die enzymatische Reaktion.
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Vergleicht man die Aktivierung der DNase-Reaktion unter verschiedenen
einwertigen Ionen, so ergibt sich ein linearer Zusammenhang der ansteigenden Reaktionsgeschwindigkeit,
wenn man sie gegen den Ionenradius der aktivierenden Kationen aufträgt. Bei einem
Ionenradius von 1,35 R ist eine maximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht.
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Es besteht eine unterschiedliche Abhängikeit zwischen enzyinatischem
Abbau der DNA und aktivierenden Kationen, wenn man Subtrat mit unterschiedlicher
Sekundärstruktur anbietet. Bei nativer, doppelsträngiger DNA ist ein: steiler Anstieg
der Reaktionsgeschwindigkeit mit steigendem Ionenradius der aktivierenden Kationen
bis zu einem scharfen Knickpunkt bei einem Ionenradius von etwa 1,35 2 festzustellen.
Bei hitzedenaturierter DNA ist die Ahhängigkeit weit weniger deutlich: während bei
der Abbaugeschwindigkeit nativer DNA eine Steigerung von der mit Li+ geressenen
Geschwindigkeit bis zum Knickpunkt von etwa 116% festzustellen
ist,
liegt der korrespondierende Wert beim Abbau denaturierter DNA bei ta. 26%. Außerdem
liegt die maximal erreichbare Abbaugeschwindigkeit der denaturierten DNA höher als
für native DNA bei gleicher Substratkonzentration, wobei km <22 µg/ml<Substratoptimum.
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Es' kann angenommen werden, daß das aktivierende Kation zwei Funktionen
beim DNA-Abbau wahrnimmt: 1. eine streng vom Ionenradius abhängige bei nativer DNA,
2. eine nur geringfügig vom Ionenradius abhängige Funktion, Vielleicht ist für-die
2. Aufgabe der lonenradlus ahsolut unerheblich, wenn man bedenkt, daß die verbleibende
Steigerung von 26% beim Abbau von denaturierter DNA etwa 1/5 der heim Abbau von
nativer DflA gemessenen Steigerung von 116% darstellt. Es liegt nahe, diesen Effekt
auf die Teilrenaturierung von bitzedenaturierter UNA zurückzuführen, die meist etwa
zu 20% eintritt.
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Hei beiden Substratformen werden heim Abbau Phosphodiesterbrücken
gespalten. Beim Abbau nativer DNA kommt außerdem die Trennung der Wasserstoffbrücken
hinzu. Durch die un terschiedliche Abhängigleit der Reaktionsgeschwindigkeit von
Ionenradius je nach Sekundärstruktur des Substrats kann vermutet werden, daß native
DRB zwei Bindungszentren am Enzym benötigt, eines zur Spaltung der Phosphodiesterbindung
und ein 2. zur Spaltung der Wassenstoffbräckenbindungen. Am 1. Zentrum hat das Kation
aktivierende Wirkung, ohne daß der lonenradlus einen größeren Eijifluß ausübt.
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Am 2. Zentrum zur Lösung der H-Br@c@en ergibt sich eine deutliche
Bevorzugung von Ralionen mit steigendem loncuradins.
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Der Knickpunti bei einem Ionenradius von 1,35 Å läßt sich in diesem
Zusammenhang leicht d@@len, wenn mas die betan@r
ten Abstände von
2,8-2,9 Å der H-Brücken zwischen den Nucleobasen berücksichtigt.
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Ionen mit einem Radius <1,35 Å können störend in die Zone der
Wasserstoffbindungen eindringen und einen Bruch der Bindung einleiten, wenn gleichzeitig
mit größerer Geschwindigkeit die Phosphodiesterbindung gespalten wird.
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Die-Lösung der H-BrUcken ist wahrscheinlich der geschwindigkeitsbegrenzende
Schritt in der Gesantreaktion; denn die Abbaugeschwindigkeit liegt bei gleicher
Substratkonzentration für native DNA niedriger als für denaturierte DNA. Fehlt weitgehend
eine L0sung der H-Brücken, also bei denaturierter DNA, so kann bis zu 4 x mehr Substrat
gespalten werden, ohne daß eine Substrathermung eintritt.
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Zweiwertige Kationen (Mg2+ Ca2+ Sr 2+ Ba 2+) aktivieren bei gleicher
ionaler Konzentration (30 mM) wie die einwertigen Ionen die enzymatische Spaltung
von DNA, nur liegt die Heaktionsgeschwindigkeit niedriger als bei der Aktivierung
durch einwertige Ionen. ähnlich zu den Effekten, die mit einwertigen Ionen gefunden
werden, zeigt die Aktivierung der Reaktion ein SSttigungsniveau, beginnend bei einem
Ionenradius von 1,35 Å.
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Auffallende Unterschiede sind jedoch: 1. die # förmige Kurve, die
die Abhängigkeit zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und Ionenradius beschreibt und
2. der nur geringfügige Unterschied zwischen dem Abbaa nativer und denaturierter
DNA. es drängt sich der Gedanke auf, daß ein allo sterischer Nachanismus die Enzymaktivität
verändert- fördernd zwar- daß aber die doggelte Ladung dem Kation (mit steigendem
Ionenradins) mehr hermende als aktivierende Figenschaften,vorleiht.
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Der durch die V.a.-Exonuclease erfolgende Totalabbau der DNA liefert
Mononucleotide. Es handelt sich um 3'-phosphorylierte Desoxyribotide wie durch Ionenaustauscher-
und Dünnschichtchromatographie festgestellt werden kann.