DE2132822B1

DE2132822B1 - Process for the production of convallatoxin

Info

Publication number: DE2132822B1
Application number: DE19712132822
Authority: DE
Inventors: Hartenstein Johannes Dipl- Nat; Satzinger Gerhard Dipl-Che Nat
Original assignee: Goedecke GmbH
Current assignee: Goedecke GmbH
Priority date: 1971-07-01
Filing date: 1971-07-01
Publication date: 1972-06-08

Description

Zur Gewinnung des restlichen Acetonids genügt es, den Mutterlaugenrückstand durch eine grobe Chromatographie an neutralem Aluminiumoxid in drei Fraktionen zu zerlegen: in a) die Acetonid-Fraktion, b) eine weniger polare und c) eine polarere Fraktion, entsprechend den R-Werten im Dünnschichtchromatogramm (Kieselgel, Fließmittel: Chloroform/Methanol 90:10). Aus der Aceton enthaltenden Fraktion läßt sich nach Eindampfen im Vakuum aus Methanol! Wasser eine weitere Fraktion analysenreines Convallatoxin-Acetonid zur Kristallisation bringen. Insgesamt läßt sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Convallatoxin-Acetonid in einer Ausbeute von 0,09 bis 0,11 ovo, bezogen auf das Trockengewicht der eingesetzten Droge, gewinnen. Der für das vorliegende Verfahren verwendete Glykosidrohextrakt kann nach den in der Literatur beschriebenen Anreicherungsverfahren gewonnen werden, z. B. nach der von B o 1 t z e undTo obtain the remaining acetonide, it is sufficient to remove the residue from the mother liquor by coarse chromatography on neutral aluminum oxide in three fractions break down: into a) the acetonide fraction, b) a less polar and c) a more polar one Fraction, corresponding to the R values in the thin layer chromatogram (silica gel, solvent: Chloroform / methanol 90:10). From the fraction containing acetone can be Evaporation in vacuo from methanol! Water another fraction of analytically pure convallatoxin acetonide bring to crystallization. Overall, according to the method according to the invention Convallatoxin acetonide in a yield of 0.09 to 0.11 ovo based on the Dry weight of the drug used. The one for the present proceedings The crude glycoside extract used can be prepared according to the enrichment process described in the literature can be obtained, e.g. B. after that of B o 1 t z e and

L a u f k e (a.a.O.) angegebenen Vorschrift (s. Beispiel 1). Wird im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung von einem derart gewonnenen Rohextrakt ausgegangen, ist es entgegen der Auffassung in der Literatur (Arch. Pharm., 290, S. 412 [1957]) überraschenderweise möglich, das Convallatoxin von den Begleitstoffen und Nebenglykosiden vollständig und selektiv abzutrennen. Ein besonderer Vorzug des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt jedoch darin, daß es gestattet, auf die bei der Isolierung von Herzglykosiden übliche zeitraubende und verlustreiche Fällung von störenden Begleitstoffen mittels Bleisalzen zu verzichten. Man hat dann nach erfolgter Acetonierung des Glykosidextraktes lediglich eine grobe Vortrennung des Rohprodukts an neutralem Aluminiumoxid vorzunehmen, um das Convallatoxin-Acetonid zur Kristallisation bringen zu können (s. Beispiel 2). Auf diese Weise vereinfacht sich das bisher sehr umständliche Isolierungsverfahren ganz erheblich. Aus dem nach dem vorliegenden Verfahren erhaltenen Convallatoxin-Aceton läßt sich durch milde saure Hydrolyse kristallines Convallatoxin in 85- bis 900/0iger Ausbeute gewinnen. Zur Ausführung der Reaktion wird das Acetonid in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. Äthanol, Aceton oder Dioxan, gelöst und nach Zusatz von wäßriger Mineralsäure, vorzugsweise verdünnter Schwefelsäure, bei Raumtemperatur oder mäßig erhöhten Temperaturen, vorzugsweise bei 50 bis 55"C, der Hydrolyse unterworfen. Die Säurekonzentration soll dabei zweckmäßig zwischen 0,1 und 1 0/o liegen.L a u f k e (loc. Cit.) Specified regulation (see example 1). Will in the context of the method according to the invention from a crude extract obtained in this way started, it is contrary to the opinion in the literature (Arch. Pharm., 290, P. 412 [1957]) surprisingly possible, the convallatoxin from the accompanying substances and to separate off secondary glycosides completely and selectively. A special advantage However, the method according to the invention is that it allows to on the the usual time-consuming and lossy precipitation for the isolation of cardiac glycosides to refrain from disturbing accompanying substances by means of lead salts. Then you have to If the glycoside extract is acetone, only a rough preliminary separation of the To make the crude product on neutral aluminum oxide to produce the convallatoxin acetonide to be able to crystallize (see Example 2). Simplified this way the isolation process, which was previously very cumbersome, is significantly reduced. From the after Convallatoxin acetone obtained by the present process can be obtained by mild Acid hydrolysis of crystalline convallatoxin in yields of 85 to 900/0. To carry out the reaction, the acetonide is dissolved in a water-miscible solvent, such as B. ethanol, acetone or dioxane, dissolved and after the addition of aqueous mineral acid, preferably dilute sulfuric acid, at room temperature or moderately elevated temperatures, preferably at 50 to 55 "C, subjected to hydrolysis. The acid concentration should expediently be between 0.1 and 10 / o.

Es muß als überraschend gelten, daß unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens Nebenreaktionen, die zu einer Schmälerung der Ausbeute führen könnten, wie Eliminierung der labilen tertiären Hydroxylgruppen oder Glykosidspaltung, nicht auftreten.It must be considered surprising that under the conditions of the invention Process side reactions which could lead to a reduction in the yield, like elimination of the labile tertiary hydroxyl groups or glycoside cleavage, not appear.

Convallatoxin dient wegen seiner strophantinähnlichen Wirkung als Therapeutikum zur Behandlung der Herzinsuffizienz. Als bevorzugte Darreichungsform dienen wäßrige, gegebenenfalls stabilisierte Lösungen, die intravenös appliziert werden. Die tägliche Dosis liegt zwischen 0,125 und 0,5 mg. Convallatoxin is used because of its strophantine-like effect as Therapeutic agent for the treatment of heart failure. As the preferred form of administration Aqueous, optionally stabilized solutions that are administered intravenously are used will. The daily dose is between 0.125 and 0.5 mg.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unmittelbar isolierte Convallatoxin-Acetonid kann auch gemäß der deutschen Patentanmeldung P 20 42 646 zur Herstellung von oral wirksamen Convallatoxin-Präparaten dienen. The convallatoxin acetonide directly isolated by the process according to the invention can also according to the German patent application P 20 42 646 for the preparation of oral effective conjallatoxin preparations are used.

Die folgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren illustrieren, ohne seinen Umfang einzuschränken. The following examples are intended to illustrate the process according to the invention, without limiting its scope.

Beispiel 1 Herstellung des Glykosidrohextrakts 500 g in einem Mixer gepulverte, mit Blütenstengeln verunreinigte Maiglöckchenblüten werden mit 5 1 500/0igem wäßrigem Methanol unter Rühren 72 Stunden bei Raumtemperatur mazeriert. Danach saugt man ab und wäscht den Rückstand mit 1 1 wäßrigem Methanol nach. Der erhaltene dunkelbraune Drogenauszug wird in einem Rotationsverdampfer im Vakuum bei einer Badtemperatur von 35 bis 40"C auf etwa 1 1 eingeengt, mit einer Lösung von 40 g Bleiacetat in 220 ml Wasser versetzt und anschließend zentrifugiert. Example 1 Preparation of the crude glycoside extract 500 g in a mixer powdered lily of the valley flowers contaminated with flower stalks have a vigor of 5 1 500/0 aqueous methanol macerated with stirring for 72 hours at room temperature. After that sucks it is washed off and the residue is washed with 1 liter of aqueous methanol. The obtained dark brown Drug extract is made in a rotary evaporator in a vacuum at a bath temperature concentrated from 35 to 40 "C to about 11, with a solution of 40 g of lead acetate in 220 ml of water are added and then centrifuged.

Die überstehende Lösung wird mit 100/,Der wäßriger sek. Natriumphosphatlösung entbleit, abgesaugt, mit 200/,Der Sodalösung auf einen pH-Wert von 6,6 eingestellt und durch Verdampfen im Vakuum auf ein Volumen von 800 ml konzentriert. Das Konzentrat wird sodann 25 Stunden mit einem Gemisch von Chloroform/Methanol 93:7(v/v) bei 35 bis 40"C1140 Torr perforiert, wobei das Extraktionsmittel nach jeweils 8 Stunden erneuert wird. Die vereinigten organischen Phasen werden durch Verdampfen im Vakuum auf etwa 5ml konzentriert und mit 100ml Petroläther versetzt. Nach 2stündigem Stehen bei 50C wird die überstehende Lösung, die kein Kedde-positives Material enthält, abgegossen. Das in der verbleibenden dunkelbraunen Schmiere enthaltene Convallatoxin läßt sich nach Arch. Pharm., 290, S. 412 (1957), aus Methanol Wasser nicht zur Kristallisation bringen.The supernatant solution is with 100 /, the aqueous sec. Sodium phosphate solution defleaded, suctioned off, adjusted to a pH of 6.6 with 200 /, the soda solution and concentrated by evaporation in vacuo to a volume of 800 ml. The concentrate will then 25 hours with a mixture of chloroform / methanol 93: 7 (v / v) at 35 perforated to 40 "C1140 Torr, with the extractant every 8 hours is renewed. The combined organic phases are evaporated in vacuo concentrated to about 5ml and mixed with 100ml petroleum ether. After standing for 2 hours at 50C the supernatant solution, which does not contain any Kedde-positive material, poured off. The convallatoxin contained in the remaining dark brown goo According to Arch. Pharm., 290, p. 412 (1957), water cannot crystallize from methanol bring.

Herstellung von Convallatoxin-Acetonid aus dem Glykosidrohextrakt Die Rohglykosid wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der dunkelbraune Schaum in 50 ml wasserfreiem Aceton suspendiert. Man versetzt mit 25 mol 2,2-Dimethoxypropan und 500 mg p-Toluolsulfonsäure-monohydrat. Nach lOminutigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wird die Lösung mit 5 0/0iger wäßriger Natriumbikarbonatlösung neutralisiert und dreimal mit Chloroform extrahiert. Man trocknet die vereinigten Extrakte mit Natriumsulfat, filtriert und dampft zur Trockne ein. Aus Methanol/wenig Wasser kristallisieren bei 0°C, gegebenenfalls nach Animpfen, 348 mg Convallatoxin-Acetonid vom Fp. 158 bis 1600C, das sich als dünnschichtchromatographisch homogen erweist. Production of convallatoxin acetonide from the raw glycoside extract The raw glycoside is evaporated to dryness in vacuo and the dark brown foam suspended in 50 ml of anhydrous acetone. 25 mol of 2,2-dimethoxypropane are added and 500 mg of p-toluenesulfonic acid monohydrate. After standing for 10 minutes at room temperature the solution is neutralized with 5 0/0 aqueous sodium bicarbonate solution and extracted three times with chloroform. The combined extracts are dried with sodium sulfate, filtered and evaporated to dryness. Crystallize from methanol / a little water at 0 ° C., if necessary after inoculation, 348 mg convallatoxin acetonide, melting point 158 up to 1600C, which proves to be homogeneous by thin-layer chromatography.

Der Mutterlaugenrückstand wird an 160 g neutralem Aluminiumoxid Woelm (Aktivitätsstufe II) chromatographiert. Die Säule wird zunächst mit 600 ml Chloroform und dann mit 300 ml Chloroform/Methanol 99: 1 (v/v) voreluiert, um apolares Material abzutrennen. Beim Eluieren mit Chloroform/Methanol erhält man 770 mg einer dünnschichtchromatographisch einheitlichen Fraktion, aus der man durch Kristallisation (Methanol/Wasser) 246 mg reines Convallatoxin-Acetonid vom Fp. 1600C gewinnt. The mother liquor residue is added to 160 g of neutral aluminum oxide wool (Activity level II) chromatographed. The column is first filled with 600 ml of chloroform and then pre-eluted with 300 ml of chloroform / methanol 99: 1 (v / v) to remove apolar material to separate. When eluting with chloroform / methanol, 770 mg of a thin layer chromatography is obtained uniform fraction, from which one can by crystallization (methanol / water) 246 mg of pure convallatoxin acetonide with a melting point of 1600C.

IR-Spektrum (KBr): imas(F) u. a. 2,88, 3,40, 3,63, 5,66 (Sch), 5,80, 5,88 (Sch), 6,20, 7,27, 9,34, 9,64.IR spectrum (KBr): imas (F) and others. 2.88, 3.40, 3.63, 5.66 (Sch), 5.80, 5.88 (Sch), 6.20, 7.27, 9.34, 9.64.

UV-Spektrum: Ams (nie) 212 (e 14 500; EtOH).UV spectrum: Ams (nie) 212 (e 14 500; EtOH).

NMR-Spektrum (CDCl2, 8 in ppm): 0,89 (s, 3 H), 1,29 (d, 3 H, 6 Hz), 1,38 (s, 3 H), 1,54 (s, 3 H), 4,93 (m, 2 H), 5,14 (s, 1 H), 5,93 (m, 1 H), 10,10 (s, 1 H).Nuclear Magnetic Resonance Spectrum (CDCl2, 8 in ppm): 0.89 (s, 3 H), 1.29 (d, 3 H, 6 Hz), 1.38 (s, 3H), 1.54 (s, 3H), 4.93 (m, 2H), 5.14 (s, 1H), 5.93 (m, 1H), 10.10 (s, 1H).

Gesamtausbeute an kristallinem Convallatoxin-Acetonid: 594 mg (0,12 0/o). Diese Ausbeute entspricht einem Mindestgehalt der Droge an Convallatoxin von 0,11 O/o. Total yield of crystalline convallatoxin acetonide: 594 mg (0.12 0 / o). This yield corresponds to a minimum content of convallatoxin in the drug 0.11 o / o.

Beispiel 2 320 g in einem Mixer gepulverte, mit Blütenstengeln verunreinigte Maiglöckchenblüten derselben Provenienz wie unter Beispiel 1 werden mit 4 1 500/,igem wäßrigem Methanol unter Rühren 72 Stunden bei Raumtemperatur mazeriert. Man saugt danch ab und wäscht den Rückstand mit 1 l wäßrigem Methanol nach. Der dunkelbraune Drogenauszug wird in einem Rotationsverdampfer im Vakuum bei einer Badtemperatur von 35 bis 40"C auf 0,8 1 konzentriert und anschließend in einem Perforator 48 Stunden bei 35"C/ 110 Torr mit einem Chloroform-Äthanol-Gemisch 93: 7 (vXv) kontinuierlich extrahiert. Der Extrakt wird auf ein Volumen von etwa 5 ml konzentriert und mit 50 ml Petroläther versetzt. Nach 2stündigem Stehen bei 5"C wird die überstehende Lösung abgegossen. Der Rückstand wird zur Trockne gebracht und in 60 ml Aceton suspendiert. Man gibt 20 ml 2,2-Diinethoxypropan und 150 mg p-Toluolsulfonsäuremonohydrat zu und läßt unter gelegentlichem Umschwenken 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Die Lösung wird dann mit 50/0Mixer wäßriger Natriumbikarbonatlösung neutralisiert und dreimal mit Chloroform extrahiert. Die vereinigten und getrockneten, leicht trüben Chloroform-Auszüge werden im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand durch eine grobe Chromatographie an 80 g neutralem Aluminiumoxid Woelm (Aktivitätsstufe II) mit Chloroform und Chloroform/Methanol 98 : 2 als Eluens in eine Acetonidfraktion, in eine weniger polare und eine polarere Fraktion zerlegt. Kristallisation der Acetonidfraktion aus Methanol/wenig Wasser bei 0°C ergibt 365mg (O,114 °/o) reines Convallatoxin-Acetonid vom Fp. Example 2 320 g powdered in a blender and contaminated with flower stalks Lily of the valley flowers of the same provenance as in Example 1 are mixed with 4 1 500 /, igem aqueous methanol macerated with stirring for 72 hours at room temperature. Man sucks then off and the residue was washed with 1 l of aqueous methanol. The dark brown one Drug extract is made in a rotary evaporator in a vacuum at a bath temperature from 35 to 40 "C concentrated to 0.8 1 and then in a perforator for 48 hours at 35 "C / 110 Torr with a chloroform-ethanol mixture 93: 7 (vXv) continuously extracted. The extract is concentrated to a volume of approximately 5 ml and mixed with 50 ml of petroleum ether. After standing for 2 hours at 5 "C, the protruding The solution poured off. The residue is brought to dryness and suspended in 60 ml of acetone. 20 ml of 2,2-diinethoxypropane and 150 mg of p-toluenesulfonic acid monohydrate are added and let stand for 10 minutes at room temperature with occasional swirling. The solution is then neutralized with a 50/0 mixer of aqueous sodium bicarbonate solution and extracted three times with chloroform. The combined and dried, easily cloudy chloroform extracts are evaporated to dryness in vacuo and the residue by coarse chromatography on 80 g of neutral aluminum oxide Woelm (activity level II) with chloroform and chloroform / methanol 98: 2 as eluent in an acetonide fraction, broken down into a less polar and a more polar fraction. Crystallization of the acetonide fraction from methanol / a little water at 0 ° C gives 365mg (0.114%) pure convallatoxin acetonide from fp.

159 bis 1600C. Diese Ausbeute entspricht eine Mindestgehalt der eingesetzten Droge an Convallatoxin von 0,105 01o.159 to 1600C. This yield corresponds to a minimum content of the used Drug of convallatoxin from 0.105 01o.

Beispiel 3 Convallatoxin aus Convallatoxin-Acetonid 250 mg nach Beispiel 1 oder 2 erhaltenes Convallatoxin-Acetonid werden in 20 ml Alkohol gelöst und nach Zugabe von 10 ml 1°/Oiger wäßriger Schwefelsäure unter Stickstoff 2 Stunden auf 55"C erwärmt. Anschließend wird mit 50/,Der wäßriger Natriumbikarbonatlösung neutralisiert und dreimal mit Chloroform/ Äthanol 8: 2 extrahiert. Trocknen und Eindampfen der vereinigten Extrakte im Vakuum ergibt 273 mg farblosen Schaum. Durch Kristallisation aus Methanol/ Wasser erhält man in zwei Portionen 203 mg (88 0/o der Theorie) reines Convallatoxin vom Fp. 220 bis 235"C, das sich in jeder Hinsicht als mit authentischem Material identisch erwies. Example 3 Convallatoxin from convallatoxin acetonide 250 mg according to the example 1 or 2 obtained convallatoxin acetonide are dissolved in 20 ml of alcohol and after Addition of 10 ml of 1% aqueous sulfuric acid under nitrogen for 2 hours 55 ° C. It is then neutralized with 50% of the aqueous sodium bicarbonate solution and extracted three times with chloroform / ethanol 8: 2. Drying and evaporation of the combined extracts in vacuo give 273 mg of colorless foam. By crystallization 203 mg (88% of theory) of pure material are obtained in two portions from methanol / water Convallatoxin from m.p. 220 to 235 "C, which is found to be authentic in all respects Material proved identical.

Claims

Claim: Process for obtaining convallatoxin from convallaria drug, by the fact that one is initially familiar with this in a way that is known per se Way or by maceration of the drug with 500 /, the aqueous methanol, concentration of the drug extract obtained in vacuo, continuously extracting the concentrated Drug extract using a chloroform-ethanol mixture (ratio 93: 7, v / v) and evaporation of the obtained extract produced crude extract-enriched convallatoxin converted into the acetonide, this by crystallization and / or chromatography separated from the accompanying substances and then in a water-miscible Solvent in the presence of 0.1 to 10 / o aqueous mineral acid at room temperature hydrolyzed to moderately elevated temperature.

Convallatoxin is a cardiac glycoside with the chemical structure of a Strophanthidin-a-L-rhamnosids.

It occurs mainly in the flowers and leaves of lily of the valley (Convallaria), associated with numerous related cardiac glycosides. So far are already more than twenty cardenolide glycosides have been detected in Convallaria majalis (W. K u -belka, M. Wichtl, Naturwiss., 50, p.498 [1963]). Since K a r r e r (Helv. Chim. Acta, 12, p. 506 [1929]) for the first time the production of crystalline convallatoxin from Convallaria majalis, several works have appeared which aimed to improve extraction processes. All known The common method is that one first selects from aqueous or aqueous-alcoholic Drug extracts make up most of the fiber (e.g.

Saponins, tannins) removed (usually by precipitation with lead acetate) and then the convallatoxin by selective extraction with chloroform-alcohol mixtures of the majority of the secondary glycosides and other accompanying substances (such as. B. sugar) separates. The isolation of pure convallatoxin from the in this way enriched convallatoxin extract by means of crystallization is a result of getting remaining impurities incomplete or not possible at all; one further enrichment by chromatography is due to the small polarity differences the secondary glycosides complex and time-consuming. The ones obtained by these procedures Yields of crystalline convallatoxin based on the dry weight of the used Drugs, are between 0.02 and 0.06 01, (see e.g.

K. Mohr, T. Reichenstein, Pharm. Acta Helv., 23, p. 1969 [1948]). Higher yields (0.07 to 0.08 01o for Herba Convallariae, 0.14 01o for Flores Convallariae) indicate B o l tze and L a u f k e (Arch. Pharm., 290, p. 412 [1957]). It should be noted, however, that according to more recent analytical content determinations of convallaria drugs of various origins (W. B 1 e i e r, Diss. Vienna, 1969) both the total glycoside content and the percentage distribution of each Cardenolide glycosides are subject to strong fluctuations. So were for the convallatoxin content for flowers values between 0.067 and 0.302%, for leaves between 0.026 and 0.148 ° lo found. The yields given in the individual processes are therefore not easily comparable with each other. In the case of the drug samples examined, it failed the method of B o 1 tze et al., since the crude glycoside extract prepared according to this procedure Contained too many accompanying substances which prevented the convallatoxin from crystallizing.

It has now been found, surprisingly, that the convallatoxin is from the raw glycoside extract can be obtained in good yield if you look at the large one Makes use of the tendency of convallatoxin acetonide to crystallize. The production this easily crystallizing convallatoxin derivative from pure convallatoxin has already been described in German patent application P 2 042 646. the There was no smooth formation of convallatoxin acetonide from the crude glycoside extract to be expected, because rather with a disturbance of the reaction by the accompanying substances present had to be reckoned with.

The invention therefore relates to a method for obtaining Convallatoxin from Convallaria drug, which is characterized in that one this initially in a manner known per se or by maceration of the drug with 500 /, the aqueous methanol, concentration of the drug extract obtained in a vacuum, continuous extraction of the concentrated drug extract by means of a chloroform-ethanol mixture (Ratio 93: 7, vlv) and evaporation of the extract obtained crude extract Enriched convallatoxin is converted into acetone, this by crystallization and / or chromatography separated from the accompanying substances and then in one water-miscible solvent in the presence of 0.1 to 10% aqueous mineral acid hydrolyzed at room temperature to moderately elevated temperature.

In the method according to the invention, the enriched raw dry extract suspended in acetone and treated with 2,2-dimethoxypropane (ratio of acetone to dimethoxypropane 2 to 3: 1) treated in the presence of catalytic amounts of p-toluenesulfonic acid monohydrate. After standing for 10 minutes at room temperature, it is neutralized and between water and chloroform distributed. The dried organic phases are evaporated. By crystallization from methanol, to which small amounts of water are added, a first fraction of pure acetonide is obtained, optionally after inoculation from m.p. 159 to 1600C.