DE212021000386U1

DE212021000386U1 - Nachweis von Krankheitserregern und Infektionen

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Publication number: DE212021000386U1
Application number: DE212021000386.9U
Authority: DE
Original assignee: Biomensio Ltd
Current assignee: Biomensio Ltd
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2023-02-01
Anticipated expiration: 2031-05-26
Also published as: FI13360Y1; AT18168U1; WO2021239746A2; EP3916382A1; WO2021239746A3

Abstract

Vorrichtung (100) zum Nachweisen des Vorhandenseins, vorzugsweise der Menge, von und/oder einer Infektion mit mindestens einer Substanz (SB, SB1, SB2) in einer Probe in einer Flüssigkeit (SA1, SA2), wobei die mindestens eine Substanz Virus/en oder Teil(e) von Virus/en ist/sind, wobei das Virus/die Viren SARS-CoV-2 (schweres akutes respiratorisches Syndrom-bezogenes Coronavirus 2) ist/sind, umfassend:- ein massensensitives Mikroarray (10) mit einer Vielzahl von massensensitiven Detektorelementen (RE, RE1, RE2), die jeweils eine Nachweisschicht (L, L1, L2) mit einem Oberflächenabschnitt (S1, S2) umfassen, wobei das massensensitive Mikroarray (10) einen Resonatorarray (10) mit einer Vielzahl von Film-Bulk-Akustikresonatorelementen (RE, RE1, RE2) umfasst,- wobei die Oberfläche (S, S1, S2) oder ein Abschnitt einer Oberfläche (S, S1, S2) der Nachweisschicht (L, L1, L2) mit einer Oberflächenbeschichtung beschichtet ist, die ein Nachweismittel (A, A1, A2) umfasst,- wobei die Nachweisschicht (L, L1, L2) von mindestens einem der massensensitiven Detektorelemente (RE, RE1, RE2) zur Sorption der mindestens einen Substanz (SB, SB1, SB2) einer Probe (SA1, SA2), die aus einem Menschen erhalten wurde, aktiviert ist, insbesondere wobei die Probe (SA1, SA2) aus Blut, Plasma, Serum, Speichel, Zerebrospinalflüssigkeit, Schweiß, Tränen, Fäkalien, Erbrochenem, Nasopharyngealabstrich, Trachealaspirat und/oder Urin ausgewählt ist,- eine Auswertungseinheit (EU), die ein Datenverarbeitungselement mit einem umgesetzten Algorithmus zum Durchführen einer Vergleichsanalyse umfasst,- wobei die massensensitiven Detektorelemente (RE, RE1, RE2) mit der Auswertungseinheit (EU) verbunden sind, um mindestens einen Probenwert an die Auswertungseinheit (EU) zu übertragen,- wobei die Auswertungseinheit (EU) so ausgebildet ist, dass sie den mindestens einen Probenwert quantifiziert und den mindestens einen Probenwert mit einem mindestens einen Referenzwert vergleicht.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis von Krankheitserregern und Infektionen, nämlich eine Vorrichtung zum Nachweisen von mindestens einer Substanz einer Probe, umfassend ein massensensitives Mikroarray. Des Weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Analyse von mindestens einer Substanz in einer Probe, das die Vorrichtung bereitstellt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Detektorkit, das die Vorrichtung umfasst.
Verunreinigungen und Krankheitserreger sind derzeit unaufhaltsam, was sie zu einem großen Problem für die globale Sicherheit macht, insbesondere solche, die ernsthafte Gesundheitsbedenken für Menschen und Tiere darstellen. Viele von ihnen sind Substanzen mit niederem Molekulargewicht. Die mit der Abhilfe verbundenen Schwierigkeiten in Verbindung mit den Gesundheitsrisiken von Verunreinigungen und Krankheitserregern haben Kontrollverfahren hervorgerufen, um die Sicherheit von Mensch und Tier zu gewährleisten. Dies schließt ein Verwenden von genauen und zuverlässigen Testverfahren ein, um durch Krankheitserreger verursachte Infektionen und Krankheiten zu verhindern.
Der Nachweis von Verunreinigungsmolekülen wird bereits seit etwa 50 Jahren durchgeführt. Dies hat wiederum die Entwicklung und Kommerzialisierung von Verfahren zur molekularen Analyse von Infektionen und Krankheitserregern vorangetrieben. Es sind viele Analyseverfahren erhältlich, und ihr Einsatz hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab. Zum Beispiel wird die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) in großem Umfang als bestätigendes Referenzverfahren eingesetzt, da sie die gleichzeitige Bestimmung verschiedener Moleküle erlaubt. Andere chromatografische Verfahren existieren, die mit Ultraviolett- (UV), Diodenarray- (DAD) und Fluoreszenzdetektoren (FLD) gekoppelt werden können, einschließlich Dünnschichtchromatografie oder Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC). Diese Verfahren sind jedoch auf große kommerzielle Unternehmen, Referenz- und akademische Labors mit qualifizierten Technikern und teurer Laborausrüstung beschränkt. Außerdem sind diese Verfahren in der Regel zeitaufwändig und arbeitsintensiv.
Unter diesem Gesichtspunkt werden kommerzielle Schnelltest-Kits zur Analyse als eine Alternative für einen benutzerfreundlicheren und robusteren Nachweis verwendet. Der Großteil der heute auf dem Markt befindlichen Testkits basiert auf einem Immunoassay-Format, das auf der Fähigkeit eines Antikörpers beruht, an eine spezifische Antigenstruktur (Zielmolekül) zu binden. Für den Nachweis kleiner Moleküle (weniger als 1 kDa) ist ein „Sandwich“-Typ-Immunoassay, bei dem mehrere Antikörper an ein einzelnes Molekül binden, nicht geeignet; stattdessen wird in der Regel ein kompetitiver Assay verwendet. Bei einem kompetitiven Immunoassay beeinflusst der interessierende Analyt aus einer Probe den Nachweis und die Messung eines Konkurrenten, was bedeutet, dass das erzeugte Ergebnis eine indirekte Messung des interessierenden Analyten ist. Die Eigenschaften des Konkurrenten variieren abhängig vom Assay, aber unabhängig davon muss jeder Konkurrent in der Lage sein, ein Signal auszulösen, das von der für diesen Assay vorgesehenen Vorrichtung/Lesevorrichtung erkannt und gemessen werden kann. Herkömmliche und derzeit hergestellte Testkits auf Immunoassay-Basis für das Screening von Molekülen schließen Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISAs), Lateral Flow Immunoassays (LFIAs) und fluorometrische Assays ein.
Die Anforderungen an Assays entwickeln sich weiter, was sich auf die Leistung der derzeitigen vorstehend genannten immunologischen Testkits auswirkt. Die wichtigsten derzeitigen Trends, die es zu erfüllen gilt, schließen Tragbarkeit und multimolekularen Nachweis ein. Der Grund dafür, dass die Tragbarkeit immer wichtiger wird, liegt in der wachsenden Nachfrage nach Vor-Ort-Testen. Vor-Ort-Testen kann an Orten im Gesundheitsbereich auftreten. So kann beispielsweise in einer Arztpraxis die Analyse des Materials unter Verwendung eines tragbaren Testkits in einem technologiearmen Umfeld durchgeführt werden. Die Ergebnisse können schnell erhalten werden, da die Proben nicht zur Analyse an Referenzlabors geschickt werden müssen. Dies verhindert auch eine Verlangsamung des Therapieprozesses. Vor-Ort-Testen kann daher als eine zeitsparende und kostensparende Wahl angesehen werden. Tragbare multimolekulare Testvorrichtungen, die zum Vor-Ort-Testen geeignet sind, würden daher zusätzliche kosten- und zeitsparende Vorteile bringen. Dies gilt umso mehr, wenn der Test Daten mit einer guten Empfindlichkeit liefern soll, ohne das Erfordernis zusätzlicher Schritte wie z. B. die Markierung einer oder mehrerer Substanzen.
Es ist daher ein Ziel der Erfindung, eine verbesserte Vorrichtung und Verfahren zum zeitsparenden Vor-Ort-Nachweis einer Substanz in einer Probe bereitzustellen, der eine gute Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit ohne das Erfordernis einer Markierung einer solchen Substanz zeigt.
Dieses Ziel wird durch die Vorrichtung gemäß Anspruch 1, ein Verfahren zur Analyse von mindestens einer Substanz gemäß Anspruch 13, und ein Detektorkit gemäß Anspruch 15 erreicht.
Erfindungsgemäß umfasst die Vorrichtung zum Nachweisen von mindestens einer Substanz einer Probe, vorzugsweise in einer Flüssigkeit oder verflüssigt, ein massensensitives Mikroarray (im Folgenden auch als „MSMA“ abgekürzt) mit einer Vielzahl massensensitiver Detektorelemente, die jeweils eine Nachweisschicht mit einem Oberflächenabschnitt umfassen.
Erfindungsgemäß wird die Nachweisschicht von mindestens einem der massensensitiven Detektorelemente zur Sorption der mindestens einen Substanz der Probe aktiviert, wobei die Probe vorzugsweise von einem Probanden, stärker bevorzugt von einem Mensch oder einem Tier, noch stärker bevorzugt von einem Mensch, erhalten wird, insbesondere wobei die Probe aus einem oder mehreren von (Voll-)Blut, Plasma, Serum, Speichel, Zerebrospinalflüssigkeit, Schweiß, Tränen, Fäkalien, Erbrochenem, Nasopharyngealabstrich, Trachealaspirat und/oder Urin ausgewählt ist.
Mit anderen Worten weist das jeweilige massensensitive Detektorelement (aufgrund der Aktivierung) eine aktivierte Nachweisschicht auf, die auf eine solche Weise vorbereitet (aktiviert) ist, dass das massensensitive Detektorelement in der Lage ist, die in der Probe enthaltene Substanz nachzuweisen. Die Prinzipien der Aktivierung werden nachstehend erläutert.
Erfindungsgemäß bezieht sich der Begriff „massensensitive Detektorelemente“, wie er hier verwendet wird, auf Elemente des massensensitiven Mikroarrays, wobei jedes der Elemente im Mikroarray zum Nachweisen einer bestimmten Substanz dienen kann. Der Begriff „massensensitives Detektorelement“, wie er hier verwendet wird, wird synonym als „Detektorelement“ oder „Pixel“ des massensensitiven Mikroarrays bezeichnet. Typischerweise liegt die Größe eines solchen massensensitiven Detektorelements im Bereich von einigen zehn bis einigen hundert um.
In einer besonders bevorzugten Vorrichtung umfasst ein Detektorelement des MSMA mindestens ein Resonatorelement (hier auch als „Resonator“ bezeichnet) als einen „Wandler“, um die Massenänderung aufgrund einer Sorption einer Substanz auf der Nachweisschicht des Detektorelements in ein elektrisches Signal umzuwandeln.
Die Nachweisschicht - einschließlich des aktivierten Oberflächenabschnitts - ist innerhalb des massensensitiven Detektorelements integriert (vorzugsweise als eine obere Schicht), so dass bei einer Wechselwirkung mit einer Probe ein auf der Nachweisschicht stattfindendes Bindungsereignis oder eine Reaktion über das Detektorelement ein elektronisches Signal erzeugen wird (durch Verwenden der Massenempfindlichkeit des Detektorelements), das von einem Steuerungssystem wie nachstehend erklärt gemessen wird. Ein solches elektronisches (Ausgangs-)Signal stellt einen (Ausgangs-)Wert dar, der die Information über das Vorhandensein und/oder die Menge der Substanz an dem Oberflächenabschnitt, wie nachstehend erläutert, umfasst.
Der Oberflächenabschnitt der Nachweisschicht (der die gesamte Oberfläche oder nur ein Teil der Oberfläche der Nachweisschicht sein kann) wird typischerweise aktiviert, d. h. vorbereitet oder beschichtet, ein oder mehrere Nachweismittel, wie biologisches Material, ein biologisch abgeleitetes Material und/oder ein Biomimetikum, zu umfassen. Bevorzugte Nachweismaterialien, die für den Nachweis verwendet werden können, werden an anderer Stelle hierin offenbart.
Um das Binden des Nachweismittels zu verbessern, kann die Oberfläche vor der Aktivierung besonders vorbereitet, z. B. gereinigt oder vorbeschichtet werden.
Die Oberfläche der Nachweisschicht umfasst vorzugsweise die Nachweismittel in immobilisierter Form auf einer Oberfläche, die mit der Probe in Kontakt gebracht werden soll, die die mindestens eine Substanz umfasst, deren Menge bestimmt werden soll.
Vorzugsweise umfasst die Nachweisschicht eine Oberflächenbeschichtung, die in der Lage ist, die Menge der mindestens einen Substanz zu bestimmen, die spezifisch an das mindestens eine Nachweismittel gebunden ist. Insbesondere ermöglicht die Nachweisschicht einen quantitativen Nachweis der mindestens einen Substanz.
Wie vorstehend erwähnt, ist gemäß der Erfindung die Aktivierung der Nachweisschicht eines Detektorelements derart, dass mindestens eine Substanz der Probe, die vorzugsweise von einem Probanden erhalten sein kann, sorbiert wird.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „Sorption“ die Bildung einer chemischen oder physikalischen Bindung der Substanz an den Oberflächenabschnitt, und schließt sowohl Absorption als auch Adsorption ein.
Der Begriff „Probe“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Probe eines Probanden, vorzugsweise einer Körperflüssigkeit, stärker bevorzugt auf eine Probe von Blut (einschließlich Vollblut), Plasma oder Serum. Der Begriff umfasst jedoch auch Proben, die z. B. aus einem oder mehreren von (Voll-)Blut, Plasma, Serum, Speichel, Zerebrospinalflüssigkeit, Schweiß, Tränen, Fäkalien, Erbrochenem, Nasopharyngealabstrich, Trachealaspirat und/oder Urin abgeleitet sind. Die Probe kann z. B. durch Vorbehandlungsschritte wie die Herstellung von Fraktionen von z. B. Blut, Plasma oder Serum behandelt werden, die z. B. durch einen oder mehrere Reinigungsschritt(e) erhalten werden. Vorzugsweise ist die Probe eine Flüssigkeit.
Der Begriff „Proband“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Tier, vorzugsweise einen Säuger und am stärksten bevorzugt einen Menschen. Der Proband kann eine Krankheitsdiagnose und Krankheitstherapie benötigen, wobei die Krankheit vorzugsweise eine Folge einer bakteriellen und/oder viralen Infektion ist.
Da jedes der Detektorelemente des massensensitiven Mikroarrays dazu dient, mindestens eine spezifische Substanz nachzuweisen, ist es prinzipiell möglich, multimolekulares Testen zu ermöglichen, ohne dass für jede Probe mehrere Einzelmolekül-Tests gekauft und durchgeführt werden müssen, wodurch ein oder mehrere Ergebnis/se mit guter Empfindlichkeit und in einer zeitsparenden Weise erzeugt werden.
Dennoch ist es durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung prinzipiell möglich, Substanzen, die eine Markierung umfassen, nachzuweisen. Vorteilhafterweise erlaubt die vorteilhafte Vorrichtung auch den Nachweis von Substanzen ohne Markierung. Durch die Verwendung einer solchen nicht markierten Substanz wird jeglicher sterische Effekt, der die Bindung einer markierten Substanz an ein Substrat beeinflusst, vermieden, wodurch sogar eine Echtzeitmessung der Bindungskinetiken einer bestimmten Substanz an ein bestimmtes Substrat ermöglicht wird.
Vorzugsweise ist es basierend auf der Vielzahl von Detektorelementen eines MSMA vorteilhafterweise möglich, eine Vielzahl von Detektorelementen zu aktivieren, um die gleiche Substanz der Probe zu sorbieren, was somit eine redundante Messung der Substanz ermöglicht. Durch Erzeugen einer (statistisch relevanten) Anzahl von redundanten Daten ist eine statistische Analyse möglich, wie eine statistische Analyse von verschiedenen Virusproben, die z. B. verschiedene Virusstämme, z. B. verschiedene Stämme von SARS-CoV-2, umfassen.
Vorteilhafterweise werden durch Anwenden der erfindungsgemäßen Vorrichtung, im Gegensatz zur visuellen Ausgabe beim Großteil von anderen Assays, solche Daten in digitalem Format erhalten. Die digitalen Daten können ohne weiteren Aufwand an eine zentrale Datenbank weitergegeben werden. Dies ist beim Vor-Ort-Testen eine vorteilhafte Hilfe.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Analyse von mindestens einer Substanz in einer Probe, vorzugsweise in einer Flüssigkeit, das die Schritte umfasst

(i) Bereitstellen eines massensensitiven Mikroarrays mit einer Vielzahl von massensensitiven Detektorelementen, die jeweils eine Nachweisschicht mit einem Oberflächenabschnitt umfassen,
(ii) Aktivieren der Nachweisschicht von mindestens einem der Detektorelemente zur Sorption der mindestens einen Substanz der Probe,
(iii) Aufbringen der Probe auf die massensensitiven Detektorelemente.

Bezogen auf die Schritte (ii) und (iii) ist die Probe vorzugsweise von einem Probanden, stärker bevorzugt einem Menschen oder einem Tier, noch stärker bevorzugt einem Menschen, gewonnen, wobei die Probe insbesondere aus einem oder mehreren von (Voll-)Blut, Plasma, Serum, Speichel, Zerebrospinalflüssigkeit, Schweiß, Tränen, Fäkalien, Erbrochenem, Nasopharyngealabstrich, Trachealaspirat und/oder Urin ausgewählt ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren vorzugsweise ein ex vivo- und/oder ein in vitro-Verfahren.
Vorzugsweise erlauben die Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren gemäß der Erfindung nicht nur den einfachen Nachweis des Vorhandenseins der Substanz, sondern auch den quantitativen Nachweis der Substanz in der Probe auf der Grundlage der Verwendung der massensensitiven Detektorelemente.
Die von dem massensensitiven Detektorelement bestimmte Menge wird durch das elektronische (Ausgangs-)Signal des massensensitiven Detektorelements dargestellt, das, wie bereits erwähnt, an das Steuerungssystem übertragen wird.
Ein solches Steuerungssystem kann Mittel zum Bereitstellen von elektrischer Leistung an die Vorrichtung und Mittel zum Erkennen eines elektrischen (Ausgangs-)Signals der Detektorelemente umfassen, z. B. zum Überwachen der Resonanzfrequenz der Detektorelemente und zum Registrieren jeglicher Änderung der Resonanzfrequenz als elektronisches (Ausgangs-)Signal.
Vorzugsweise kann das Steuerungssystem auch eine Auswertungseinheit umfassen, um die elektronischen Signale in geeignete Ausgabewerte oder „Probenwerte“ umzuwandeln, die wiederum an einen Benutzer ausgegeben und/oder auf andere Weise verwendet, z. B. in einem Speicher gespeichert oder weiterverarbeitet werden können.
Die Auswertungseinheit kann ein datenverarbeitendes Element, wie einen Computer, insbesondere einen Mikrocomputer, umfassen, vorzugsweise mit einem umgesetzten Algorithmus zum Durchführen einer Vergleichsanalyse, d. h. eines Vergleichs verschiedener Probenwerte oder eines Vergleichs eines oder mehrerer Probenwerte mit einem oder mehreren Referenzwerten.
Dementsprechend umfasst das Verfahren des Weiteren die Schritte

(iv) Erhalten von mindestens einem Probenwert von einem massensensitiven Detektorelement,
(v) Quantifizieren des mindestens einen Probenwerts,
(vi) gegebenenfalls Vergleichen des mindestens einen Probenwerts mit mindestens einem Referenzwert.

Die Auswertungseinheit kann z. B. auf der Grundlage der Ergebnisse des Vergleichs „bewerten“, ob eine Probe eines Probanden mindestens eine Substanz umfasst oder nicht. Referenzwerte können durch andere Detektorelemente vor, parallel oder nach der Messung erhalten werden. Diese Detektorelemente können vorbereitet werden, als „Referenzdetektorelemente“ zu dienen. Zusätzlich oder alternativ können Referenzwerte auch aus einer Datenbank entnommen werden.
Vorteilhafterweise sind die Referenzwerte so zu wählen, dass entweder ein Unterschied oder eine Ähnlichkeit in den verglichenen Mengen ein Identifizieren der Testprobanden erlaubt, die zu der Gruppe der Testprobanden gehören, die z. B. eine Substanz umfassen oder damit infiziert sind (positive Gruppe), oder keine Substanz umfassen oder damit nicht infiziert sind (negative Gruppe).
Zum Beispiel kann mindestens eines der Detektorelemente eines MSMA konfiguriert sein, einen Referenzwert zu erzeugen, der z. B. aus einer Positivkontrolle oder Negativkontrolle resultieren kann, d. h. aus einer Probe, die eine Substanz umfasst, von der bekannt ist, dass sie an ein spezifisches Nachweismittel bindet (Positivkontrolle), oder aus einer Probe, von der bekannt ist, dass ihr die spezifische Substanz fehlt, und/oder wo die Oberfläche des Detektorelements kein spezifisches Nachweismittel umfasst (Negativkontrolle).
Der Vergleich mit Referenzwerten wird nachstehend ebenfalls in weiterem Detail beschrieben werden.
Die Ergebnisse, die die Probenwerte und/oder die Ergebnisse der Analyse dieser Probenwerte oder Referenzwerte umfassen, können als Ausgabe von diagnostischen (Roh-)Daten angegeben werden, vorzugsweise als absolute oder relative Mengen. Es kann passend sein, dass diese Daten eine Interpretation durch einen Kliniker benötigen. Es sind jedoch auch Vorrichtungen und Verfahren denkbar, bei denen die Ausgabe verarbeitete diagnostische Rohdaten umfasst, deren Interpretation keinen spezialisierten Kliniker erfordert.
Das Steuerungssystem kann vorzugsweise des Weiteren eine Benutzerschnittstelle wie ein Display und eine Eingabeeinheit (vorzugsweise einen Touchscreen) umfassen. Zu diesem Zweck kann z. B. ein Smartphone (mit einer App und einer geeigneten Schnittstelle zur Vorrichtung, wie einer über Bluetooth, USB usw. mit dem Smartphone gekoppelten Schnittstelle) verwendet werden. Eine physische Schnittstelle zum Koppeln mit der Vorrichtung kann zum Beispiel eine „Box“ sein, die die Vorrichtung (in Form einer Kartusche) aufnimmt und per Kabel oder drahtlos mit dem Smartphone gekoppelt ist.
Das Steuerungssystem kann zumindest teilweise auf der Vorrichtung integriert sein. Insbesondere kann die Auswertungseinheit ein Teil der Vorrichtung selbst sein.
Das Steuerungssystem kann zumindest teilweise extern sein, und die Vorrichtung und das Steuerungssystem können geeignete Schnittstellen zum Koppeln der Vorrichtung und des Steuerungssystems umfassen. Das Steuerungssystem kann mehrere Untereinheiten umfassen, wie einen Computer und eine Leseeinheit als eine Schnittstelle zum Koppeln der Vorrichtung mit dem Computer.
Das Steuerungssystem kann vorzugsweise auch eine kompakte Steuerungseinheit umfassen, die in einem tragbaren Gehäuse (Handeinheit) untergebracht sein kann, und die die Benutzerschnittstelle und die Schnittstelle oder die Leseeinheit zum Koppeln mit der Vorrichtung umfassen kann, z. B. in Form eines Schlitzes im Gehäuse, in den die Vorrichtung so eingesetzt werden kann, dass elektrische Kontaktelemente der Vorrichtung mit elektrischen Kontaktelementen der Steuerungseinheit in Kontakt kommen.
Daher ist die vorliegende Erfindung auch auf ein Detektorkit gerichtet, das mindestens eine Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, die vorzugsweise ein Steuerungssystem wie vorstehend erläutert umfasst.
Das Steuerungssystem umfasst, wie bereits erwähnt, eine Auswertungseinheit, die derart ausgebildet ist, dass sie mindestens einen von einem massensensitiven Detektorelement erhaltenen Probenwert quantifiziert und gegebenenfalls den mindestens einen Probenwert mit einem mindestens einen Referenzwert vergleicht. Der Referenzwert kann z. B. ein Basiswert sein.
Alternativ oder zusätzlich kann das Detektorkit Nachweismittel zum Nachweisen des Vorhandenseins, vorzugsweise der Menge, der mindestens einen Substanz in einer Probe des Probanden umfassen; besonders bevorzugt umfasst das Kit Nachweismittel zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Virus, am stärksten bevorzugt des Vorhandenseins eines Coronavirus, in einer Probe eines Probanden.
Die Untereinheiten oder Module des vorstehend genannten Steuerungssystems oder der Steuerungseinheit können vollständig oder teilweise als Softwaremodule realisiert sein, die auf einem Prozessor der Steuerungseinheit ablaufen. Eine Realisierung weitgehend in Form von Softwaremodulen kann den Vorteil haben, dass bereits auf einem bestehenden System installierte Anwendungen mit relativ geringem Aufwand aktualisiert werden können, um die Vorrichtung der vorliegenden Anmeldung zu installieren und zu betreiben.
Die vorliegende Erfindung kann daher auch auf ein Computerprogrammprodukt mit einem Computerprogramm gerichtet sein, das direkt in den Speicher eines Steuerungssystems ladbar ist, und das Programmeinheiten zum Durchführen von Teilen der Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Ausführung des Programms durch die Steuerungseinheit umfasst, nämlich zumindest die Schritte, die von der Auswertungseinheit durchzuführen sind. Zusätzlich zum Computerprogramm kann ein solches Computerprogrammprodukt auch weitere Teile wie Dokumentation und/oder zusätzliche Bestandteile umfassen, auch Hardwarebestandteile wie einen Hardwareschlüssel ((personalisierte) Smartcard usw.), um den Zugang zur Software zu erleichtern.
Ein computerlesbares Medium wie ein Speicherstick, eine Festplatte oder ein anderer transportierbarer oder fest installierter Träger kann dazu dienen, die ausführbaren Teile des Computerprogrammprodukts zu transportieren und/oder zu speichern, so dass diese von einer Prozessoreinheit eines Steuerungssystems gelesen werden können.
Auch kann die Vorrichtung eine Internetverbindung aufweisen, um Ergebnisse zu übertragen oder sogar eine cloudbasierte Software zur Analyse der Ergebnisse zu verwenden (z. B. unter Verwendung anonymisierter Daten für eine selbstlernende künstliche Intelligenz auf der Grundlage der Ergebnisse von Tausenden von gemessenen Probanden, d. h. Patienten).
Die in der vorliegenden Erfindung erwähnten Vergleichsanalysen können, wie vorstehend erläutert, computergestützt durchgeführt werden. Sie können jedoch auch manuell durchgeführt werden.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen zusammen mit der nachfolgenden Beschreibung, wobei die Patentansprüche einer bestimmten Kategorie durch abhängige Ansprüche einer verschiedenen Kategorie gebildet werden können, und Merkmale der verschiedenen Beispiele zu neuen Beispielen kombiniert werden können. Es sollte verstanden werden, dass die vorstehend und nachstehend gemachten Definitionen und Erläuterungen der Begriffe entsprechend für alle in dieser Beschreibung und den begleitenden Ansprüchen beschriebenen Ausführungsformen gelten. Im Folgenden werden besondere Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung näher ausgeführt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das massensensitive Mikroarray ein Resonator-Array mit einer Vielzahl von Film-Bulk-Akustikresonatorelementen, die vorzugsweise als im Schermodus arbeitende, fest montierte Resonatorelemente (im Folgenden auch als „FBAR“ bezeichnet) ausgeführt sind. Solche Film-Bulk-Akustikresonatorelemente sind auf elektroakustischer Technologie basierende massensensitive Sensoren mit einer Nachweisschicht, die mindestens eine dünne polykristalline piezoelektrische Schicht mit einer auf der polykristallinen piezoelektrischen Schicht angeordneten Elektrode und einer oder mehreren weiteren auf der polykristallinen piezoelektrischen Schicht angeordneten Elektrode/n umfassen.
Der Aufbau und die Steuerung geeigneter Ausführungsformen eines solchen FBAR ist z. B. in WO 2004/017063 A1 beschrieben, die hinsichtlich dieser Aspekte hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Vorzugsweise sind das polykristalline Piezoelektrikum, die Elektroden und der Oberflächenabschnitt der Nachweisschicht in einer solchen Weise zueinander angeordnet, dass eine elektrische Ansteuerung der Elektroden zu einer Schwingung des Resonators bei einer Resonanzfrequenz führt, wobei die Resonanzfrequenz von einer Menge der auf dem Oberflächenabschnitt sorbierten Substanz abhängig ist. Die Nachweisschicht ist in das Resonatorelement integriert, so dass bei Wechselwirkung mit der Probe ein Bindungsereignis oder eine Reaktion an der Nachweisschicht ein elektronisches Signal erzeugt.
Vorteilhafterweise wird eine Schichtdicke der polykristallinen piezoelektrischen Schicht von mindestens 0,1 um und/oder bis zu 20 µm gewählt.
Vorzugsweise liegt die Resonanzfrequenz der Schwingung im Bereich von mindestens 500 MHz und/oder bis zu 10 GHz. Insbesondere ist die Schwingung des Resonators eine Dickenschermodusschwingung.
Ein bevorzugter Resonator kann ein piezoelektrisches Material umfassen, vorzugsweise einen Dünnfilm mit einer Dicke von mindestens 0,5 um und/oder bis zu 3 um.
Stärker bevorzugt umfasst ein solcher Dünnfilm Ferroelektrika wie Blei-Zirkonat-Titanat (Pb (Zr_xTi_1-x)O₃) und/oder Piezoelektrika wie Aluminiumnitrid (AlN) und/oder Zinkoxid (ZnO) . Noch stärker bevorzugt umfasst ein dünner piezoelektrischer Film Aluminiumnitrid und/oder Zinkoxid.
Vorteilhafterweise weist Aluminiumnitrid hohe Werte an chemischer Trägheit, akustischer Längswellengeschwindigkeit, elektrischem Widerstand und hervorragendem piezoelektrischen Verhalten auf.
Da der Resonator aus solchen dünnen piezoelektrischen Filmen bei höheren Frequenzen arbeitet, kann die Vorrichtung Massendaten mit hoher Empfindlichkeit liefern.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform hat ein Resonator eine seitliche Ausdehnung von mindestens 20 um und/oder bis zu 1000 um.
Vorteilhafterweise ermöglicht der Resonator gemäß einer bevorzugten Ausführungsform den Nachweis von Substanzen mit einer Größe von bis zu 100 000 kDa, stärker bevorzugt bis zu 1 000 kDa, noch stärker bevorzugt bis zu 500 kDa, insbesondere bis zu 200 kDa, am stärksten bevorzugt von 100 bis zu 150 kDa.
Insbesondere ermöglicht der Resonator den Nachweis von Substanzen mit einer bevorzugten Größe von etwa 10 nm und/oder etwa 500 nm, stärker bevorzugt etwa 20 nm und/oder etwa 250 nm, noch stärker bevorzugt 50 nm und/oder etwa 200 nm, insbesondere etwa 100 nm und/oder etwa 150 nm.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Resonator auf einem Halbleitersubstrat angeordnet.
Noch stärker bevorzugt stellt die Vorrichtung eine akustische Isolierung des Resonators und des Halbleitersubstrats bereit. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dient jeder der Resonatoren in dem massensensitiven Mikroarray zum Nachweis von mindestens einer spezifischen Substanz. Besonders bevorzugt dient jeder der Resonatoren zum Nachweis genau einer spezifischen Substanz.
Eine besonders bevorzugte Vorrichtung umfasst eine Auswertungseinheit, wobei die massensensitiven Detektorelemente mit der Auswertungseinheit verbunden sind, um mindestens einen Probenwert an die Auswertungseinheit zu übertragen, und wobei die Auswertungseinheit so ausgebildet ist, dass sie den mindestens einen Probenwert quantifiziert und gegebenenfalls den mindestens einen Probenwert mit einem mindestens einen Referenzwert (wie vorstehend bereits beschrieben) vergleicht. In dieser Ausführungsform ist die Auswertungseinheit in die Vorrichtung integriert oder auf ihr angeordnet, insbesondere auf derselben Leiterplatte oder demselben Halbleitersubstrat wie das MSMA.
Wie bereits vorstehend erwähnt, können die Probenwerte mit Referenzwerten verglichen werden, um ein zuverlässiges Ergebnis einer Substanzanalyse, z. B. in Verbindung mit einem klinischen Aspekt, zu erhalten.
Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff „Vergleich“ oder „Vergleichen“ ein Vergleichen der Menge der einen oder mehreren Substanz(en), die in der zu analysierenden Probe enthalten ist/sind, mit einer Menge einer geeigneten, nachstehend angegebenen Referenz.
Es sollte verstanden werden, dass ein Vergleichen, wie hierein verwendet, sich auf einen Vergleich entsprechender Parameter oder Werte bezieht, z. B. wird eine absolute Menge mit einer absoluten Referenzmenge verglichen, während eine Konzentration mit einer Referenzkonzentration verglichen wird, oder ein von einer Testprobe erhaltenes Intensitätssignal mit der gleichen Art von Intensitätssignal einer Referenzprobe verglichen wird. Erfindungsgemäß ist es jedoch auch vorgesehen, einen Wert auf der Grundlage der quantitativen Messung der Substanz zu berechnen. Weitere Einzelheiten finden sich in den beigefügten Beispielen (nachstehend).
Der Begriff „Referenz“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Wert oder Schwellenwert, der auf Mengen der Substanz basiert, was eine Zuordnung einer Probe (eines Probanden) erlaubt, z. B. zu der Gruppe von Probanden zu gehören, die eine Substanz umfassen oder mit ihr infiziert sind (positive Gruppe), oder die eine Substanz nicht umfassen oder nicht mit ihr infiziert sind (negative Gruppe). Vorzugsweise ist eine solche Referenz ein Negativ- und/oder Positivkontrolltyp oder eine individuelle Referenz.
Eine solche Referenz kann eine Schwellenmenge sein, die die Gruppen (entweder positiv oder negativ) voneinander trennt. Eine geeignete Schwellenmenge, die die beiden Gruppen trennt, kann ohne weiteres durch einen Test auf der Grundlage der Substanzmengen entweder von einem Probanden oder einer Gruppe von Probanden berechnet werden, von denen bekannt ist, dass sie zu einer positiven oder negativen Gruppe gehören, d. h. ein positives Signal oder ein negatives Signal zeigen.
Eine Referenz kann im Prinzip auch für einen Probanden, wie vorstehend beschrieben, auf der Grundlage der Durchschnitts- oder Mittelwerte für eine bestimmte Substanz durch Anwenden statistischer Standardverfahren berechnet werden. Dementsprechend kann die Referenz, die für die vorstehend genannte Vorrichtung und/oder das Verfahren zu verwenden ist, für den genannten Probanden wie vorstehend beschrieben erzeugt werden und daraus eine Schwellenmenge abgeleitet werden.
Geeignete Referenzen können aus Proben abgeleitet werden, die für die Erzeugung einer Referenz oder von Referenzmengen, wie an anderer Stelle hierin vorstehend beschrieben, verwendet werden. Die Ergebnisse können als Ausgabe von diagnostischen Rohdaten, vorzugsweise als absolute oder relative Mengen, angegeben werden. Es kann geeignet sein, dass diese Daten eine Interpretation eines Klinikers benötigen. Es sind jedoch auch Expertensystemvorrichtungen vorgesehen, bei denen die Ausgabe verarbeitete diagnostische Rohdaten umfasst, deren Interpretation keinen spezialisierten Kliniker erfordert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche oder ein Abschnitt einer Oberfläche der Nachweisschicht einer vorteilhaften Vorrichtung mit einer Oberflächenbeschichtung beschichtet, die ein Nachweismittel, d. h. ein Substrat, umfasst, d.h. um ein Molekül, das in der Lage ist, die nachzuweisende Substanz spezifisch zu binden, zu umfassen.
Vorzugsweise umfasst ein solches Substrat biologisches Material wie z. B. Gewebe, Mikroorganismen, Organellen, Zellrezeptoren, Enzyme, Antikörper, Nukleinsäuren, Naturprodukte usw. Alternativ oder zusätzlich umfasst ein solches Substrat biologisch abgeleitetes Material, wie z. B. rekombinante Antikörper, künstlich hergestellte Proteine, Aptamere und/oder ein Biomimetikum, wie z. B. synthetische Rezeptoren, biomimetische Katalysatoren, kombinatorische Liganden, geprägte Polymere usw.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Oberflächenbeschichtung der Nachweisschicht ein Nachweismittel, das ausgewählt ist aus

- mindestens einem Protein und/oder
- mindestens einem künstlich hergestellten Protein, und/oder
- mindestens einem Antikörper und/oder einem Teil/Teilen von mindestens einem Antikörper, wobei der mindestens eine Antikörper und/oder Teil/Teile eines Antikörpers vorzugsweise ausgewählt sind, an mindestens einen Krankheitserreger und/oder mindestens ein Protein des mindestens einen Krankheitserregers und/oder mindestens ein Antigen des mindestens einen Krankheitserregers und/oder mindestens ein Epitop des mindestens einen Krankheitserregers und/oder mindestens ein von dem mindestens einen Krankheitserreger abgeleitetes Toxin zu binden, und/oder
- mindestens einem Aptamer, und/oder mindestens einem Biomimetikum.

Das mindestens eine Protein zum Nachweis eines Substrats kann entweder aus einem natürlichen Protein ausgewählt sein, z. B. einem Protein aus einer natürlichen Quelle. Alternativ oder zusätzlich kann ein Protein aus einem künstlich hergestellten Protein ausgewählt sein, d. h. einem aus chemischer Synthese abgeleiteten Protein, das eine oder mehrere nicht natürliche Aminosäuren umfassen kann.
Mindestens ein bevorzugter Antikörper und/oder Teil(e) von mindestens einem Antikörper könnten aus einem rekombinanten oder gentechnisch hergestellten Antikörper, einem einkettigen Antikörper, einem Fab-Fragment eines Antikörpers und/oder einem (einzelnen) Arm oder Teil eines Arms eines Antikörpers ausgewählt sein.
Der mindestens eine Antikörper und/oder Teil(e) eines Antikörpers sind vorzugsweise ausgewählt, an mindestens einen Krankheitserreger und/oder mindestens ein Protein des mindestens einen Krankheitserregers und/oder mindestens ein Antigen, insbesondere ein Epitop, des mindestens einen Krankheitserregers und/oder mindestens ein von dem mindestens einen Krankheitserreger abgeleitetes Toxin zu binden.
Weiter bevorzugt ist/sind der/die mindestens eine(n) Antikörper oder Teil(e) eines Antikörpers in der Lage, an ein Antigen zu binden, das insbesondere Teil eines Antikörpers ist, der in einer Probe wie vorstehend beschrieben enthalten ist. Vorzugsweise ist eine solche Probe aus (Voll-)Blut oder Serum abgeleitet. Noch stärker bevorzugt ist ein solcher Antikörper ein IgG-Antikörper und/oder ein IgM-Antikörper.
Vorteilhafterweise ist es durch Messen von sowohl IgG-Antikörpern als auch von IgM-Antikörpern möglich, Informationen über eine bestimmte Krankheitsphase zu erhalten, d. h. eine frühe Phase des Krankheitsstatus zur Bekämpfung einer bestimmten Infektion, die durch einen erhöhten Spiegel von IgM-Antikörpern angezeigt wird, während ein erhöhter Spiegel von IgG-Antikörpern eine Immunität gegen eine Infektion in einem späteren Stadium anzeigt.
Dies ist vorzugsweise von Bedeutung beim Messen des Krankheitsstatus nach einer Infektion mit einem Virus oder einem Bakterium, stärker bevorzugt eines Krankheitsstatus infolge einer Infektion mit einem Virus, noch stärker bevorzugt einem Coronavirus, insbesondere einer Infektion infolge von SARS-CoV-2.
Vorzugsweise ist ein IgG-Antikörper aus einem IgG1-Antikörper, einem IgG2-Antikörper, einem IgG3-Antikörper und/oder einem IgG4-Antikörper ausgewählt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein in der Substratbeschichtung umfasstes Nachweismittel mindestens ein Aptamer. Der Begriff „Aptamer“ wie hierin verwendet bezieht sich auf ein Oligonukleotid- oder Peptidmolekül, das an eine spezifische Substanz (Molekül) bindet, d. h. eine Substanz, die zu analysieren ist (d. h. der Analyt) und in der Probe enthalten ist. Vorzugsweise umfasst ein Aptamer einzelsträngige Oligonukleotide aus DNA und/oder RNA (mit einer Länge von z. B. 10 bis 100 bis zu 200 Nukleotiden), die mit der Substanz wechselwirken können. Stärker bevorzugt umfasst ein Aptamer einzelsträngige Oligonukleotide von DNA (vorzugsweise mit einer Länge von 10 bis 200 Nukleotiden). Vorteilhafterweise können Aptamere, im Gegensatz zu Antikörpern, regeneriert und für andere bzw. weitere Analysen wiederverwendet werden.
Alternativ oder zusätzlich wird ein im Substrat enthaltenes Nachweismittel aus mindestens einem Biomimetikum, wie z. B. einem synthetischen Rezeptor, einem biomimetischen Katalysator, einem kombinatorischen Liganden und/oder einem geprägten Polymer ausgewählt.
Gemäß einer spezifischen Ausführungsform umfasst die Oberflächenbeschichtung, d. h. das Nachweismittel, mindestens ein Protein und/oder ein künstlich hergestelltes Protein, das aus mindestens einem Antikörper oder Antikörperfragment gegen mindestens ein virales Epitop oder Spike-Protein und/oder mindestens ein Membranprotein und/oder mindestens ein Nukleokapsidprotein und/oder mindestens ein ACE2-Rezeptorprotein ausgewählt ist. Vorzugsweise umfasst ein solches Spike-Protein und/oder Membranprotein und/oder Nukleokapsidprotein und/oder ACE2-Rezeptorprotein einen His-Tag.
Eine Immobilisierung solcher Nachweismittel auf der Oberfläche der Nachweisschicht kann durch Vorbeschichtung der Oberfläche der Nachweisschicht verbessert werden. Eine solche Vorbeschichtung ist dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und wird z. B. in Vikholm-Lundin, I. et al. Sensors and Actuators B 171-172 (2012) 440-448 beschrieben.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die zu analysierende Substanz, d. h. der Analyt, ausgewählt aus einem oder mehreren Proteinen, Peptiden, Zuckereinheiten, DNA, RNA, Virus/en oder Teilen von Virus/en, virusartigen Partikeln, Bakterien oder Teilen von Bakterien, bakterienartigen Partikeln, Toxin/en, Metaboliten. Die DNA oder RNA kann entweder einzel- oder doppelsträngig sein. Vorzugsweise ist die DNA oder RNA einzelsträngig.
Noch stärker bevorzugt ist die Substanz aus einzelsträngiger RNA ausgewählt, die am stärksten bevorzugt aus einem oder mehreren Virus/en abgeleitet ist, die, noch stärker bevorzugt, aus einer Speichel umfassenden Probe erhalten sind.
Falls die Substanz nicht aus einem oder mehreren Virus/en abgeleitet ist, ist es jedoch bevorzugt, dass die Substanz aus einer einzelsträngigen DNA ausgewählt ist.
Weiter bevorzugt ist die Substanz aus Antikörpern ausgewählt, die, noch stärker bevorzugt, aus einer Blut- oder Serumprobe erhalten sind.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Substanz aus einem Virus und/oder einem Teil eines Virus und/oder aus einem Bakterium und/oder einem Teil eines Bakteriums ausgewählt.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Substanz ausgewählt aus mindestens einem Virus oder einem Teil von mindestens einem Virus, wobei das mindestens eine Virus vorzugsweise ausgewählt ist aus einem Influenza-Virus, insbesondere aus dem Influenza-A-Virus; aus einem Respiratorischen-Synzytial-(RS)-Virus; aus einem gastrointestinalen Virus, insbesondere aus Rotavirus, Norovirus, Adenovirus oder Astrovirus; aus einem respiratorischen Virus, insbesondere aus humanem Bocavirus 1; aus einem Coronavirus, insbesondere aus HCoV-HKU1 (humanes Coronavirus HKU1), HCoV-NL63 (humanes Coronavirus NL63), HCoV-OC43 (humanes Coronavirus OC43), HCoV-229E (humanes Coronavirus 229E), SARS-CoV (schweres akutes respiratorisches Syndrom-bezogenes Coronavirus), MERS-CoV (Middle East respiratory syndrom-related coronavirus) und/oder SARS-CoV-2 (schweres akutes respiratorisches Syndrom-bezogenes Coronavirus 2).
Falls die Substanz aus einem Bakterium oder einem Teil eines Bakteriums abgeleitet ist, kann ein solches Bakterium oder ein Teil eines Bakteriums ausgewählt sein aus, z. B. Streptococcus, wie Streptococcus A und/oder Streptococcus pneumoniae; aus Mycoplasma, wie Mycoplasma pneumoniae; aus Klebsiella, wie Klebsiella pneumoniae; aus Enterobacter, wie Enterobacter agglomerans; aus Haemophilus, wie Haemophilus influenzae; aus Chlamydophila, wie Chlamydophila pneumoniae; aus Coxiella wie Coxiella burnetii; aus Legionella wie Legionella pneumophila; aus Staphylococcus wie Staphylococcus aureus; aus Bacillus wie Bacillus cereus; aus Clostridium wie Clostridium perfringens und/oder Clostridium botulinum und/oder Clostridium difficile; aus Escherichia wie Escherichia coli (z. B. ETEC, EPEC, EHEC, EAEC, EIEC); aus Yersinia wie Yersinia enterocolitica; aus Vibrio wie Vibrio cholerae und/oder Vibrio parahemolyticus; aus Listeria wie Listeria monocytogenes; aus Aeromonas wie Aeromonas hydrophila; aus Salmonella wie Salmonella enteritidis und/oder Salmonella typhimurium; aus Shigella wie Shigella dysenteriae; aus Campylobacter wie Campylobacter jejuni und/oder Campylobacter coli; und/oder aus Plesiomonas wie Plesiomonas shigelloides.
Vorzugsweise ist die aus einem Bakterium abgeleitete Substanz aus einem Teil des Bakteriums abgeleitet, wie einem Epitop und/oder einem Membranprotein.
Vorteilhafterweise kann durch Verwenden der erfindungsgemäßen Vorrichtung ein Virus oder ein Teil des Virus mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden, indem ein Nachweismittel verwendet wird, d. h. ein Sondenmolekül, das spezifisch an eine auf der Oberfläche des Virus exponierte Substanz bindet.
Besonders bevorzugt ist die Substanz des mindestens einen Virus ausgewählt aus einem Epitop, vorzugsweise aus einem Epitop gegen B-Lymphozyten oder T-Lymphozyten.
Stärker bevorzugt ist das virale Epitop aus einem Spike-Protein und/oder einem Nukleokapsidprotein und/oder einem Hüllprotein und/oder einem Membranprotein ausgewählt. Noch stärker bevorzugt ist das Epitop aus einem S-Glykoprotein S1 und/oder S2 und/oder einem Nukleokapsidprotein N1 oder N2 und/oder einer ACE2-Rezeptorbindungsstelle und/oder einer CD26-Bindungsstelle ausgewählt. Insbesondere können solche Substanzen eine oder mehrere Regionen des S-Glykoproteins S1 und/oder S2 und/oder eine ACE2-Rezeptorbindungsstelle umfassen.
Weiter bevorzugt umfasst eine solche Substanz ein Epitop gegen MHCI (Haupthistokompatibilitätskomplex I) und/oder MHCII (Haupthistokompatibilitätskomplex II).
Vorzugsweise umfasst eine Substanz, d. h. ein Protein, eine Aminosäuresequenz, die mindestens 60% Sequenzidentität mit einer Sequenz teilt, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist, stärker bevorzugt mindestens 75% Sequenzidentität mit einer Sequenz teilt, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist, noch stärker bevorzugt mindestens 90% Sequenzidentität mit einer Sequenz teilt, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist, insbesondere mindestens 95% Sequenzidentität mit einer Sequenz teilt, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist, am stärksten bevorzugt mindestens 98% Sequenzidentität mit einer Sequenz teilt, die aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Substanz aus einem Protein ausgewählt, das mindestens 80% Sequenzidentität mit einer Sequenz teilt, die aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist, vorzugsweise mindestens 90% Sequenzidentität mit einer Sequenz teilt, die aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist, stärker bevorzugt mindestens 95% Sequenzidentität mit einer Sequenz teilt, die aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist, noch stärker bevorzugt mindestens 98% Sequenzidentität mit einer Sequenz teilt, die aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist, am stärksten bevorzugt mindestens 99% Sequenzidentität mit einer Sequenz teilt, die aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 ausgewählt ist.
Vorzugsweise wird eine solche Substanz aus einem Virus, ausgewählt aus Coronavirus, insbesondere aus SARS-CoV-2, erhalten.
Wie vorstehend erwähnt, umfasst ein massensensitives Mikroarray eine Vielzahl an massensensitiven Detektorelementen. Die Detektorelemente können in Form einer Matrix auf einer Basis angeordnet sein. Die Matrix kann eindimensional angeordnet sein, was bedeutet, dass die Detektorelemente in einer einfachen Reihe oder zweidimensional in Reihen und Zeilen angeordnet sind. Im Prinzip kann ein beliebiges Array-Format definiert werden, eine Anzahl mⁿ von Detektorelementen zu umfassen, wobei m und n natürliche Zahlen sind.
Die Vorrichtung kann ein solches MSMA in einem Nachweiskompartiment umfassen.
Grundsätzlich kann das massensensitive Mikroarray konstruiert sein, ein Nachweiskompartiment zu umfassen, das zur anschließenden Messung verschiedener Proben, z. B. gereinigter Proben, die aus verschiedenen Quellen abgeleitet sind, verwendet wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Vorrichtung mehr als ein Nachweiskompartiment, z. B. mindestens zwei Nachweiskompartimente, stärker bevorzugt mindestens vier Nachweiskompartimente, noch stärker bevorzugt mindestens acht Nachweiskompartimente, insbesondere mindestens sechzehn Nachweiskompartimente.
Eine Vorrichtung kann beispielsweise eine Anordnung von Nachweiskompartimenten umfassen, vorzugsweise mehrere benachbarte Nachweiskompartimente, die jeweils eine Gruppe, insbesondere eine Reihe von Detektorelementen umfassen.
Die Vorrichtung kann so aufgebaut sein, dass ein MSMA in eine Vielzahl (mindestens zwei) Nachweiskompartimente geteilt ist. In dieser Ausführungsform sind eine oder mehrere Gruppen von Detektorelementen des MSMA voneinander getrennt und/oder von Wänden umschlossen, die zwischen den verschiedenen Gruppen angeordnet sein können. Mit anderen Worten ist das massensensitive Mikroarray ist aufgebaut, mehr als ein Nachweiskompartiment zu umfassen. Vorzugsweise sind solche Wände aus polymeren Substanzen hergestellt, wie PDMS (Polydimethylsiloxan).
Solche Nachweiskompartimente können so konstruiert und mit dem MSMA verbunden sein, so dass es Nachweiskompartimente auf dem Chip gibt, die nicht in direktem Kontakt miteinander stehen. Solche Nachweiskompartimente können aus weichen Polymermaterialien wie PDMS oder SU-8 (Photoresistmaterial auf Epoxidbasis, Microchem Corp.) hergestellt sein.
Alternativ oder zusätzlich kann die Vorrichtung auch mehr als ein MSMA umfassen, wobei sich die verschiedenen MSMA vorzugsweise in getrennten Nachweiskompartimenten befinden.
Vorzugsweise ist jedes der Nachweiskompartimente mit einer mikrofluidischen Vorrichtung verbunden, wobei die mikrofluidische Vorrichtung eine Anzahl von Einlässen oder Behältern umfasst, von denen jeder über einen oder mehrere Kanäle (z. B. Spritzen) mit den verschiedenen Nachweiskompartimenten verbunden ist. Vorzugsweise ist jeder der Einlässe oder Behälter über einen separaten Kanal mit einem anderen Nachweiskompartiment verbunden, um verschiedene Proben in verschiedene Kompartimente zu leiten.
Die verschiedenen Proben, z. B. aus Blut, Speichel, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit usw., können von den Einlässen oder Behältern gleichzeitig oder nacheinander durch die mikrofluidische Vorrichtung in die verschiedenen Nachweiskompartimente überführt werden. Vorzugsweise werden die verschiedenen Proben gleichzeitig in die verschiedenen Kompartimente überführt.
Durch Verwenden getrennter Nachweiskompartimente ermöglicht die Vorrichtung die gleichzeitige Messung von z. B. Proben und Referenzproben und/oder Proben, die parallel auf unterschiedliche Zielsubstanzen getestet werden. So können z. B. aus Blut erhaltene Proben parallel zu aus Speichel erhaltenen Proben, die auf ein oder mehrere Viren getestet werden sollen, auf verschiedene Antikörper (wie IgG, IgM) untersucht werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann somit mindestens eines der Detektorelemente in einem Nachweiskompartiment konfiguriert sein, einen Referenzwert zu erzeugen.
Durch Verwenden von z.B. vier Nachweiskompartimenten ermöglicht die Vorrichtung eine gleichzeitige Messung von zwei Proben (wie z. B. aus Blut oder Speichel abgeleitete Proben) und zwei Referenzproben.
Eine weitere Anzahl von Nachweiskompartimenten, z. B. acht Nachweiskompartimente, ermöglicht sogar eine gleichzeitige Messung weiterer Proben, d. h. eine parallele Messung von Proben, die z. B. aus Urin, Zerebrospinalflüssigkeit usw. und/oder von Proben verschiedener Probanden abgeleitet sind.
Die Proben können automatisch oder manuell in ein Nachweiskompartiment (z. B. über die mikrofluidische Vorrichtung) oder auf die Detektorelemente gegeben werden (z. B. unter Verwendung einer Pipette oder Mehrfachpipette oder einer Spritze).
Ein typisches flüssiges Probenvolumen, das zum Übertragen auf ein Resonatorelement verwendet wird, ist im Bereich von z. B. einem oder mehreren µl bis zu 1 ml, vorzugsweise mindestens 2 µl und/oder bis zu 500 µl, stärker bevorzugt mindestens 10 µl und/oder bis zu 300 µl, noch stärker bevorzugt mindestens 20 µl und/oder bis zu 200 µl, insbesondere mindestens 50 µl und/oder bis zu 100 ul.
Es versteht sich, dass für den Fall, dass eine Probe von einem Probanden keine ausreichende Flüssigkeit aufweist, eine solche Probe in geeigneter Weise verflüssigt werden kann, z. B. durch Verdünnen der Probe in einem geeigneten Puffer wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Ein bevorzugtes verdünntes Probenvolumen würde immer noch innerhalb der vorstehend angegebenen Bereiche verwendet werden.
Weitere Ziele und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden aus den folgenden detaillierten Beschreibungen, betrachtet in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen, ersichtlich werden. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die Zeichnungen nur zu Zwecken der Veranschaulichung dienen und nicht als eine Definition der Beschränkungen der Erfindung. In den Diagrammen beziehen sich gleiche Nummern durchgehend auf gleiche Objekte. Die Objekte in den Diagrammen sind nicht unbedingt maßstabsgetreu gezeichnet.

1 zeigt ein massensensitives Mikroarray (MSMA) gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung;
2 zeigt eine schematische Darstellung zur Erläuterung eines Beispiels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen von Substanzen in einer Speichelprobe;
3 zeigt eine schematische Darstellung zur Erläuterung eines Beispiels des Verfahrens der vorliegenden Erfindung zum Nachweisen von Substanzen in einer Blutprobe;
4 zeigt eine schematische Darstellung zur Erläuterung der Bindung eines Virus an eine aktivierte Oberfläche eines massensensitiven Detektorelements, das in dem MSMA von 1 verwendet werden *kann;
5 zeigt ein Diagramm einer Messung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

1 zeigt eine Vorrichtung 100 mit einem MSMA 10, der vier in parallelen Reihen angeordnete Nachweiskompartimente SL1, SL2, SL3, SL4 umfasst. Im Folgenden werden diese Nachweiskompartimente SL1, SL2, SL3, SL4 auch als Probenreihen SL1, SL2, SL3, SL4 bezeichnet.
Im MSMA 10 gemäß 1 umfasst jedes der vier Nachweiskompartimente SL1, SL2, SL3, SL4 sechzehn Resonatorelemente RE (Pixel RE), die mit An1 bis An16 nummeriert sind. Zwölf dieser sechzehn Resonatorelemente RE (die Resonatorelemente An1 bis An6 und An9 bis An14 in jeder Reihe) werden für die Analyse verschiedener, in einer Probe umfasster Substanzen verwendet. Die Resonatorelemente RE sind mit verschiedenen Nachweismitteln beschichtet, im vorliegenden Fall mit verschiedenen Substraten, um für Viren spezifische Substanzen nachzuweisen, einschließlich für SARS-CoV-2 spezifische Substanzen. Eine Immobilisierung der Nachweismittel auf den Resonatorelementen RE kann unter Verwendung einer Spot-Auftragsmaschine durchgeführt werden, so dass verschiedene Proteine auf verschiedene Resonatorelemente RE aufgebracht werden, um einen gleichzeitigen Nachweis verschiedener Substanzen aus derselben Probe zu ermöglichen.
Im Fall von 1 sind vier der Resonatorelemente RE jeder Probenreihe SL1, SL2, SL3, SL4 beschichtet, um ein Referenzsignal zu ermöglichen, im vorliegenden Fall werden zwei Resonatorelemente An7, An15 in jeder Probenreihe SL1, SL2, SL3, SL4 für eine Positivkontrolle verwendet (um eine bekannte Substanz zu binden, z. B. ein Protein, das normalerweise reichlich in z. B. menschlichem Speichel vorhanden ist, wie Lysozym) und zwei weitere Resonatorelemente An8, An16 in jeder Probenreihe SL1, SL2, SL3, SL4 werden als Negativkontrolle verwendet (um eine bekannte Substanz nicht zu binden, z. B. eine Probe nicht menschlichen Ursprungs, wie Rinder-Immunglobulin).
Für einen Test oder eine Messung können verschiedene flüssige Proben, im vorliegenden Fall aus Blut, Serum, Speichel und Urin abgeleitete Proben, in die verschiedenen Behälter 1, 2, 3, 4 einer mikrofluidischen Vorrichtung MD gefüllt werden. Die Proben werden über separate Spritzen der mikrofluidischen Vorrichtung MD durch die Probenreihen SL1, SL2, SL3 und SL4 überführt.
Die Überführung der verschiedenen Proben kann gleichzeitig oder nacheinander eingeleitet werden; im vorliegenden Fall werden die verschiedenen Proben gleichzeitig überführt, um in die verschiedenen Kompartimente zu gelangen. Beim Binden der zu analysierenden Substanzen, im vorliegenden Fall ein SARS-CoV-2-Spike-Protein, wird eine Massenänderung festgestellt, was somit eine Frequenzänderung des Resonators einleitet, was zu einer Änderung eines elektrischen Signals führt, das an eine Steuerungseinheit CD übertragen oder von dieser ausgelesen wird. Das Prinzip dieses Mechanismus ist z. B. in der WO 2004/017063 A1 beschrieben.
Das Steuerungseinheit CD umfasst eine Auswertungseinheit EU. Im vorliegenden Fall befindet sich die Steuerungseinheit CD mit der Auswertungseinheit EU außerhalb der Vorrichtung 100. Es ist jedoch prinzipiell möglich, dass die Auswertungseinheit EU im MSMA 10 selbst enthalten sein kann, zum Beispiel auf der gleichen Basis wie die Resonatorelemente RE. Ein Binden von Substanzen, die von Viren wie SARS-CoV-2 abgeleitet sind, wird in der Auswertungseinheit EU mit Hilfe von Datenanalysealgorithmen so berechnet, dass eine Reaktion der mit spezifischen Proteinen beschichteten Resonatorelemente RE mit einer Reaktion von Positiv- und Negativkontrollen verglichen wird. Eine Berechnung kann aber auch manuell durchgeführt werden.
Zur Erläuterung des Mechanismus der Aktivierung eines Resonatorelements RE, RE1, RE2 für eine bestimmte Substanz SB, SB1, SB2 wird nun auf 2, 3 und 4 verwiesen.
Jede dieser Figuren zeigt ein Resonatorelement RE, RE1, RE2, das eine Nachweisschicht L, L1, L2 und eine Oberfläche S, S1, S2 umfasst. Auf der Oberfläche S, S1, S2 der Nachweisschicht L, L1, L2 sind Nachweismittel A, A1, A2, im vorliegenden Fall Antikörper A, A1, A2, funktionalisiert. Flüssige Proben SA1, SA2 (in 4 nicht dargestellt), die aus Blut SA1 und Speichel SA2 abgeleitet sind, werden (z. B. über eine mikrofluidische Vorrichtung MD, wie in 1 erläutert) auf die Oberfläche S, S1, S2 der Nachweisschichten L, L1, L2 abgegeben.
Die in den flüssigen Proben SA1, SA2 enthaltenen Substanzen SB1, SB2, z. B. in der Blutprobe SA1 vorhandene Antikörper SB1 oder ein in der Speichelprobe SA2 vorhandenes Virus SB2, werden auf der Oberfläche S1, S2 gebunden, die mit spezifischen Antikörpern A1, A2 funktionalisiert ist, im vorliegenden Beispiel Antikörper A1, die die bei einer SARS-CoV-2-Infektion gebildeten Antikörper SB1 erkennen, und Antikörper A2, die ein Spike-Protein von SARS-Cov-2 SB2 erkennen.
Auf der linken Seite von 2 ist ein Resonatorelement RE1 gezeigt, das eine Nachweisschicht L1 mit einer Oberfläche S1 umfasst, die aktiviert ist, um einen immobilisierten Antikörper A1 zu umfassen. In einem nächsten Schritt (dargestellt durch den Pfeil) wird eine zu analysierende Blutprobe SA1, die verschiedene Substanzen (möglicherweise einschließlich der in der Probe gesuchten Zielsubstanz SB1) umfasst, auf die Oberfläche S1 der Nachweisschicht L1 gegeben. Beim Binden der Zielsubstanz SB1 an den immobilisierten Antikörper A1 (wie auf der rechten Seite von 2 gezeigt) wird eine Verringerung der Resonanzfrequenz f des Resonatorelements RE1 registriert.
Das Prinzip einer solchen Messkurve ist in der schematischen Darstellung unterhalb des Resonatorelements RE1 auf der rechten Seite von 2 gezeigt, die die Resonanzfrequenz f des Resonatorelements RE1 über die Zeit t zeigt. Im Zeitbereich vor dem markierten Bereich liegt das Niveau der Resonanzfrequenz f auf der Basislinie BL (dem Niveau der Oberfläche S1 der Nachweisschicht L1, die keine gebundene Substanz SB1 umfasst). Bei Sorption der Substanz SB1 verringert sich die Resonanzfrequenz f auf ein niedrigeres Niveau. Die Änderung df der Resonanzfrequenz ist ungefähr proportional zur Änderung der Masse dm der Detektorschicht L1 aufgrund der Sorption der Substanz SB1. Zusätzlich kann auch die Steigung df/dt der Resonanzfrequenz (die Geschwindigkeit der Änderung der Resonanzfrequenz) eine wertvolle Sensorausgabe sein. Diese Steigung df/dt hängt von der Bindungskinetik der Substanz an das Substrat ab, d. h. vom zeitlichen Verlauf der Bindung der Substanz an das Substrat.
3 zeigt das gleiche Prinzip und Messverfahren wie für 2 beschrieben, mit dem Unterschied, dass die Nachweisschicht L2 auf ihrer Oberfläche S2 mit dem Antikörper A2 beschichtet ist. Außerdem wird eine aus Speichel abgeleitete Probe SA2 (anstelle von Blut) auf die Oberfläche S2 der Nachweisschicht L2 gegeben. Analog zu 2 bindet ein Zielsubstrat SB2 der Speichelprobe SA2 an den Antikörper A2 und induziert dadurch eine Änderung der Resonanzfrequenz nach dem gleichen Prinzip wie in 2 beschrieben.
4 zeigt ein spezifisches Beispiel eines Resonatorelements RE, das ähnlich wie das Resonatorelement von 3 verwendet werden kann, hier mit einer Nachweisschicht L gezeigt, die auf ihrer Oberfläche S mit einem Antikörper A beschichtet ist, zum Nachweis eines Virus SB, insbesondere eines SARS-CoV-2 SB, das aus einem Viruskörper VB und Spike-Proteinen SP aufgebaut ist. Ein Binden des Virus SB an die Antikörper A erfolgt über die viralen Spike-Proteine SP.
5 und 6 zeigen Diagramme von Messkurven, die während eines Messverfahrens einer Probe umfassend SARS-CoV-2-Virusprotein S1 durch das MSMA ermittelt wurden. Die Kurven zeigen ein ähnliches Messprinzip wie in 2 und 3 beschrieben, jedoch zeigen die Diagramme nach 5 und 6 im Gegensatz zu den schematischen Zeichnungen der 2 und 3 nun Echtzeit-Messkurven der Frequenz über die Zeit.
6 zeigt die Daten der gleichen Messung wie in 5 beschrieben. Während jedoch 5 die Durchschnittskurve der vierzehn Resonatorelemente zeigt, stellt 6 die von jedem der vierzehn Resonatorelemente erhaltenen Signale dar.
Zum Zeitpunkt Null bis ca. 8 min zeigt 5 das Signal einer durchschnittlichen Basislinie BL, im vorliegenden Fall einer durchschnittlichen Basislinie BL eines Signals von vierzehn Resonatorelementen, die noch nicht mit irgendeinem Nachweismittel aktiviert wurden. Bei ca. 8 min wird eine flüssige Substratlösung, die einen Anti-S1-Antikörper (in PBS-Puffer gelöst, wie in Beispiel 1 beschrieben) umfasst, auf die Oberfläche der Nachweisschicht gegeben. Die Beschichtung mit dem flüssigen Substrat erfolgt durch Spülen der Flüssigkeit über die Resonatorelemente unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung.
Wie zu sehen ist, wird eine Verringerung der Frequenz beobachtet, die bei ca. 8 min beginnt und bis ca. 15 min andauert. Die Phase beginnend vom Zeitpunkt Null bis ca. 15 min. wird als Aktivierungsphase AP bezeichnet (wie in 5 und 6 dargestellt), da die Nachweisschicht des Resonatorelements kein Substrat umfasst. Am Ende dieser Aktivierungsphase ist das Resonatorelement in der Lage, die Substanz nachzuweisen. Dementsprechend ist das Niveau nach der Aktivierungsphase AP nun die neue Basislinie BL für das aktivierte Resonatorelement (entsprechend der Basislinie der schematischen Diagramme von 2 und 3).
Bei ca. 45 min. wird die Probe, die das SARS-CoV-2-Spike-Protein S1 in einer Konzentration von 10 µg/ml (in PBS, wie in Beispiel 1 erläutert) umfasst, unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung bei kontinuierlichem Fluss auf die Oberfläche der Resonatorelemente injiziert. Beim Binden des SARS-CoV-2-Spike-Proteins S1 an den immobilisierten Anti-S1-Antikörper wird eine Frequenzverringerung durch die Resonatorelemente nachgewiesen, was somit eine Änderung der Masse dm der Detektorschicht aufgrund der Sorption des SARS-CoV-2-Spike-Proteins S2 anzeigt (wie für 2 bis 4 vorstehend erläutert). Das Ergebnis kann weiter in einen Speicher übertragen werden.
Bezugszeichenliste

10: mikrosensitives Mikroarray (MSMA)
100: Vorrichtung, die das MSMA und ein mikrofluidisches System umfasst
101: Detektorkit
1, 2, 3, 4: Probenbehälter/Einlässe
An1 bis An16: Resonatorelemente für die Analyse
CD: Steuerungssystem/Steuerungseinheit/Steuervorrichtung
EU: Auswertungseinheit
MD: mikrofluidische Vorrichtung
SL1, SL2, SL3, SL4: Nachweiskompartimente
RE, RE1, RE,: Resonatorelement
SA, SA1, SA2: Probe
SB, SB1, SB2: Substrat
A, A1, A2: Nachweismittel, z. B. ein spezifischer Antikörper
L, L1, L2: Nachweisschicht
S, S1, S2: Oberfläche der Nachweisschicht
BL: Basislinie
f: Frequenz
t: Zeit
df: delta der Frequenz
dm: delta der Masse
VB: Viruskörper
SP: Spike-Protein
AP: Aktivierungsphase

Beispiele:
Beispiel 1
Protokoll für den Nachweis von Sars-CoV-2 auf einem massensensitiven Mikroarray (MSMA):
Anti-S1-Antikörper gegen Sars-CoV-2 (Sinobiologicals, Kat.-Nr. 40150) wurden auf der Oberfläche der Resonatorelemente in einer Konzentration von 5 µg/ml oder 10 µg/ml (in PBS) immobilisiert, ebenso wie eine Negativkontrolle (Antikörper gegen Amphetamin, Fitzgerald Scientific, 10-A44F, 10 µg/ml (in PBS)). Die Beschichtung kann manuell erfolgen, indem die Flüssigkeit über die gesamte Sensoroberfläche getupft/pipettiert und bis zu 30 Minuten lang inkubiert wird, oder mit Hilfe einer automatisierten Spot-Auftragsmaschine, die verschiedene Antikörper auf verschiedene Sensorpixel aufträgt, was den Nachweis verschiedener Krankheitserreger in derselben Probe ermöglicht.
Danach wurde das mit His-Tag modifizierte Sars-CoV-2-Spike-Protein S1 (Sinobiologicals, Kat.-Nr. 40591) unter Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung mit einer Spritze bei anhaltendem Fluss über die modifizierte Resonatoroberfläche geleitet. Die Probenkonzentration betrug 10 µg/ml in PBS. Das Binden des Sars-CoV-2-Spike-Proteins S1 an den immobilisierten Anti-S1-Antikörper wurde durch kontinuierliche Messung der Frequenz überwacht, wie in 5 und 6 dargestellt.
Im vorliegenden Beispiel wurde die Größe des SARS-CoV-2-Spike-Proteins S1 als etwa 5,5-6,1 * 10⁶ g/mol berechnet, was 5,5-6,1 MDa (Megadalton) entspricht.
Um die Messung durchzuführen, können beliebige, vorzugsweise von menschlichen oder tierischen Probanden abgeleitete Probenquellen verwendet werden.
Insbesondere wird eine solche Probe für den Nachweis einer Infektion durch einen Krankheitserreger, vorzugsweise durch ein Virus, stärker bevorzugt durch ein Coronavirus, insbesondere durch SARS-COV-2, verwendet.
Besonders bevorzugt wird das Verfahren durchgeführt für den

1. Nachweis von Virus/en aus einer Speichelprobe;
2. Nachweis von Antikörpern aus einer Serumprobe;
3. Paralleler/ sequentieller Nachweis aus einer Speichel- und Serumprobe;
4. Nachweis von DNA/RNA aus einer Speichelprobe;

1. Nachweis von Virus/en aus einer Speichelprobe:
Eine Speichelprobe kann entweder durch ein passives Speichelabsonderungsverfahren, Spucken in ein Röhrchen oder unter Verwendung eines Probensammeltupfers gewonnen werden, in welchem Fall der Spender oder die sammelnde Person den Tupfer im Mund und den Wangen des Spenders bewegt. Die Probe kann auch ein Nasopharyngealabstrich sein. In diesem Fall wird die Sammelvorrichtung nach dem Sammeln in ein Röhrchen, das einen geeigneten Puffer enthält (z. B. PBS, pH 7,4, wie vorstehend beschrieben) gegeben, in den der Erreger aus dem Abstrich übertragen wird.
Um die Messung durchzuführen, wird die Oberfläche der Nachweisschicht mit Antikörpern beschichtet, die spezifisch für das Virus in der Probe sind (z. B. durch Beschichten mit einem Anti-Spike-S1- und/oder S2-Antikörper (z. B. von Biomedica Medizinprodukte GmbH, Wien, Österreich erhalten) gegen SARS-CoV-2-Spike-Protein S1 / S2).
Das Beschichten kann entweder manuell erfolgen, indem die Flüssigkeit über die gesamte Sensoroberfläche gespült wird, oder unter Verwendung einer automatisierten Spot-Auftragsmaschine (wie vorstehend beschrieben).
Eine solche automatisierte Spot-Auftragsmaschine kann auch unterschiedliche Antikörper auf jede Oberfläche der verschiedenen Nachweisschichten aufbringen, wodurch der Nachweis verschiedener Krankheitserreger aus derselben oder aus verschiedenen Proben möglich ist.
Es könnte eine Vorbehandlung durchgeführt werden, um den (in der Probe umfassten) Krankheitserreger in Fragmente zu zerlegen. Dies kann durch Mischen der Probe mit einer Pufferlösung erfolgen, die oberflächenaktive Mittel und/oder organische Lösungsmittel enthält. Alternativ oder zusätzlich kann die Probe mit Ultraschall behandelt werden, bevor sie auf die Oberfläche der Nachweisschicht übertragen wird.
Die flüssige Probe, die den Erreger umfassen soll, wird dann auf die Oberfläche der Nachweisschicht übertragen, was mit einer mikrofluidischen Vorrichtung über i) eine Spritze, ii) eine (Mehrfach-)Pipette oder iii) eine speziell für diesen Zweck gebaute Vorrichtung, die mit einem Resonatorelement (wie vorstehend beschrieben) verbunden ist, umgesetzt werden kann. Folglich wird die Probe über die aktivierte Oberfläche der Nachweisschicht fließen gelassen und der Krankheitserreger, sofern vorhanden, wird an die auf der Oberfläche immobilisierten Antikörper gebunden.
Positivkontrolle (z. B. Lysozym in PBS, pH 7,4) und Negativkontrolle (z. B. Rinderimmunglobulin in PBS, pH 7,4) werden parallel auf verschiedenen Resonatorelementen durchgeführt.
Wenn der Krankheitserreger in der Probe vorhanden ist, wird sich die Frequenz des Resonatorelements verringern. Aus dieser Frequenzverringerung wird über einen Datenanalysealgorithmus das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein des betreffenden Krankheitserregers berechnet.
2. Nachweis von Antikörpern gegen bakterielle oder virale Infektionen in einer Serumprobe:
Eine Blutprobe wird entweder aus einer Fingerspitze oder aus venösem Blut entnommen. Das Blut wird vorbehandelt, um rote Blutkörperchen zu entfernen, entweder durch mikrofluidische Filtration oder durch Zentrifugation, um das Serum zu erhalten.
Die Oberfläche der Nachweisschicht ist in diesem Fall mit einem Protein aus einem Krankheitserreger beschichtet, z. B. im Falle der SARS-CoV-2-Nukleokapsidproteine N1 und/oder N2 (z. B. von Sinobiological erhalten).
Alternativ könnte das Protein auch von einem Spike-Protein oder einem Membran-/Hüllprotein oder einem beliebigen anderen Protein von SARS-CoV-2 abgeleitet sein.
Die Nukleokapsidproteine N1 und N2 werden auf der Resonatoroberfläche immobilisiert, vorzugsweise mit Hilfe einer Spot-Auftragsmaschine.
Positiv- und Negativkontrollen können wie vorstehend beschrieben eingeschlossen sein.
Die Serumprobe wird dann über eine mit dem MSMA verbundene mikrofluidische Vorrichtung über die Oberfläche der verschiedenen Nachweisschichten gespült. Ein Binden der in der Serumprobe enthaltenen Antikörper wird durch eine Verringerung der Frequenz des Resonatorelements nachgewiesen.
Ein Binden von Antikörpern wird manuell oder durch Datenanalysealgorithmen berechnet.
4) Nachweis von DNA/RNA aus Speichelprobe:
Im Prinzip kann jede beliebige Körperflüssigkeit, die Viren und/oder Bakterien enthält, für den Nachweis von DNA/RNA verwendet werden. Die Probe kann z. B. aus Speichel, Urin, Nasopharyngealabstrich, Erbrochenem, Fäkalien, Schweiß, Tränen usw. entnommen sein.
Wie vorstehend beschrieben (siehe 1.), kann eine Speichelprobe entweder durch ein passives Speichelabsonderungsverfahren, Spucken in ein Röhrchen oder mit einem Probenentnahmetupfer gesammelt werden, in welchem Fall der Spender oder die sammelnde Person den Tupfer im Mund und in den Wangen des Spenders bewegt.
Die Probe kann auch ein Nasopharyngealabstrich sein. In diesem Fall wird die Sammelvorrichtung nach dem Sammeln in ein Röhrchen, das einen geeigneten Puffer enthält (z. B. PBS pH 7,4, wie vorstehend beschrieben) gegeben, in den der Krankheitserreger aus dem Tupfer übertragen wird. Vor der Messung am Resonator wird eine PCR (z. B. isothermisch) durchgeführt.
Um die Messung durchzuführen, ist die Oberfläche der Nachweisschicht mittels spezifischer Immobilisierungschemie (wie Thiole, Biotine, Aminogruppen, Myc-, His- oder andere Protein- oder Nukleotid-/synthetische Immobilisierungs-Tags) mit einzelsträngigen DNA-Sonden beschichtet. Alternativ kann eine (einzelsträngige) RNA-Sonde verwendet werden. Die Nukleotidsequenz ist spezifisch für das Virus in der Probe ausgewählt (z. B. eine Sequenz, die spezifisch für das SARS-CoV-2-Spike-S1 / S2- oder Nukleokapsid- oder Hüllprotein ist). Eine gleichzeitige Analyse eines einzigen Probenexemplars auf dem Resonator kann durch Immobilisieren mehrerer spezifischer Sequenzen für verschiedene Viren, Bakterien, Toxine und/oder Allergene durchgeführt werden.
Die Beschichtung kann entweder manuell erfolgen, indem die Flüssigkeit über die gesamte Sensoroberfläche gespült wird, oder durch Verwendung einer automatisierten Spot-Auftragsmaschine (wie vorstehend beschrieben).
Wie vorstehend beschrieben, kann eine Vorbehandlung umgesetzt werden, um den Krankheitserreger (der in der Probe umfasst ist) in Fragmente zu zerlegen. Dies kann gemäß dem/den vorstehend beschriebenen Verfahrensweisen durchgeführt werden.
Die flüssige Probe, die den Krankheitserreger enthalten soll, wird dann auf die Oberfläche der Nachweisschicht übertragen, was mit einer mikrofluidischen Vorrichtung über i) eine Spritze, ii) eine (Mehrfach-)Pipette oder iii) eine speziell für diesen Zweck gebaute Vorrichtung, die mit einem Resonatorelement (wie oben beschrieben) verbunden ist, umgesetzt werden kann. Die Probe wird anschließend über die aktivierte Oberfläche der Nachweisschicht fließen gelassen, und der Krankheitserreger, sofern vorhanden, wird an die auf der Oberfläche immobilisierten DNA- (oder RNA-) Sonden gebunden.
Eine Positivkontroll-DNA (oder -RNA) aus endogenen Wirtsproteinen (z. B. Lysozym in PBS, pH 7,4) und eine Negativkontrolle von Nicht-Wirtsursprung (z. B. Rinderimmunglobulin in PBS, pH 7,4) werden parallel auf verschiedenen Resonatorelementen durchgeführt.
Wie vorstehend beschrieben, wird sich die Frequenz des Resonatorelements verringern, wenn der Krankheitserreger in der Probe vorhanden ist. Aus dieser Frequenzverringerung wird über einen Datenanalysealgorithmus das Vorhandensein oder die Abwesenheit des betreffenden Krankheitserregers berechnet.
Obwohl die vorliegende Erfindung in Form von bevorzugten Ausführungsformen und Variationen davon offenbart wurde, wird es verstanden werden, dass zahlreiche zusätzliche Modifikationen und Variationen an ihnen vorgenommen werden könnten, ohne den Umfang der Erfindung zu verlassen. Der Klarheit halber ist zu verstehen, dass die Verwendung von „ein“ oder „eine“ in dieser Anmeldung eine Vielzahl nicht ausschließt und dass „umfassend“ andere Schritte oder Elemente nicht ausschließt. Auch schließt die Erwähnung einer „Einheit“ die Verwendung von mehr als einer Einheit nicht aus.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2004017063 A1 [0054, 0126]

Claims

Vorrichtung (100) zum Nachweisen des Vorhandenseins, vorzugsweise der Menge, von und/oder einer Infektion mit mindestens einer Substanz (SB, SB1, SB2) in einer Probe in einer Flüssigkeit (SA1, SA2), wobei die mindestens eine Substanz Virus/en oder Teil(e) von Virus/en ist/sind, wobei das Virus/die Viren SARS-CoV-2 (schweres akutes respiratorisches Syndrom-bezogenes Coronavirus 2) ist/sind, umfassend: - ein massensensitives Mikroarray (10) mit einer Vielzahl von massensensitiven Detektorelementen (RE, RE1, RE2), die jeweils eine Nachweisschicht (L, L1, L2) mit einem Oberflächenabschnitt (S1, S2) umfassen, wobei das massensensitive Mikroarray (10) einen Resonatorarray (10) mit einer Vielzahl von Film-Bulk-Akustikresonatorelementen (RE, RE1, RE2) umfasst, - wobei die Oberfläche (S, S1, S2) oder ein Abschnitt einer Oberfläche (S, S1, S2) der Nachweisschicht (L, L1, L2) mit einer Oberflächenbeschichtung beschichtet ist, die ein Nachweismittel (A, A1, A2) umfasst, - wobei die Nachweisschicht (L, L1, L2) von mindestens einem der massensensitiven Detektorelemente (RE, RE1, RE2) zur Sorption der mindestens einen Substanz (SB, SB1, SB2) einer Probe (SA1, SA2), die aus einem Menschen erhalten wurde, aktiviert ist, insbesondere wobei die Probe (SA1, SA2) aus Blut, Plasma, Serum, Speichel, Zerebrospinalflüssigkeit, Schweiß, Tränen, Fäkalien, Erbrochenem, Nasopharyngealabstrich, Trachealaspirat und/oder Urin ausgewählt ist, - eine Auswertungseinheit (EU), die ein Datenverarbeitungselement mit einem umgesetzten Algorithmus zum Durchführen einer Vergleichsanalyse umfasst, - wobei die massensensitiven Detektorelemente (RE, RE1, RE2) mit der Auswertungseinheit (EU) verbunden sind, um mindestens einen Probenwert an die Auswertungseinheit (EU) zu übertragen, - wobei die Auswertungseinheit (EU) so ausgebildet ist, dass sie den mindestens einen Probenwert quantifiziert und den mindestens einen Probenwert mit einem mindestens einen Referenzwert vergleicht.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das massensensitive Mikroarray (10) einen Resonatorarray (10) mit einer Vielzahl von Film-Bulk-Akustikresonatorelementen (RE, RE1, RE2) umfasst, die als fest montierte Resonatorelemente umgesetzt sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei jedes der massensensitiven Detektorelemente (RE, RE1, RE2) in dem massensensitiven Mikroarray (10) zum Nachweisen einer bestimmten Substanz (SB, SB1, SB2) dient.
Vorrichtung nach einem beliebigen der voranstehenden Ansprüche, wobei die Oberfläche (S, S1, S2) oder ein Abschnitt einer Oberfläche (S, S1, S2) der Nachweisschicht (L, L1, L2) mit einer Oberflächenbeschichtung beschichtet ist, die ein Nachweismittel (A, A1, A2) umfasst, durch ein Molekül, um biologisches Material, ein biologisch abgeleitetes Material oder ein Biomimetikum zu umfassen.
Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die Oberflächenbeschichtung der Nachweisschicht (L, L1, L2) ein Nachweismittel (A, A1, A2) umfasst, das ausgewählt ist aus: - mindestens einem Protein, und/oder - mindestens einem künstlich hergestellten Protein, und/oder - mindestens einem Antikörper und/oder Teil/ Teilen von mindestens einem Antikörper, wobei der mindestens eine Antikörper und/oder Teil/ Teile eines Antikörpers gewählt sind, an mindestens einen Krankheitserreger und/oder mindestens ein Protein des mindestens einen Krankheitserregers und/oder mindestens ein Epitop des mindestens einen Krankheitserregers zu binden, wobei der Krankheitserreger SARS-CoV-2 ist, und/oder - mindestens einem Aptamer, und/oder - mindestens einem Biomimetikum.
Vorrichtung nach einem beliebigen der Ansprüche 4 und 5, wobei die Oberflächenbeschichtung umfasst mindestens einen Antikörper gegen mindestens eines von einem Spike-Protein, einem Nukleokapsid-Protein, einem Hüllprotein.
Vorrichtung nach einem beliebigen der Ansprüche 4 und 5, wobei die Oberflächenbeschichtung mindestens ein ACE2-Rezeptorbindungsprotein umfasst.
Vorrichtung nach einem beliebigen der voranstehenden Ansprüche, wobei die Substanz aus: einer DNA und/oder RNA, vorzugsweise aus einer einzelsträngigen DNA und/oder RNA ausgewählt ist.
Vorrichtung nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Substanz aus einem Spike-Protein, einem Hüllprotein und/oder einem Membranprotein und/oder einem Nukleokapsid-Protein ausgewählt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei die Substanz aus einem S-Glykoprotein und/oder einem Nukleokapsid-Protein N1 oder N2 und/oder einer ACE2-Bindungsstelle und/oder einer CD26-Bindungsstelle ausgewählt ist.
Vorrichtung nach einem beliebigen der voranstehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung, vorzugsweise das massensensitive Mikroarray (1), mindestens ein Nachweiskompartiment (SL1, SL2, SL3, SL4), vorzugsweise mindestens zwei Nachweiskompartimente, stärker bevorzugt mindestens vier Nachweiskompartimente, insbesondere mindestens acht Nachweiskompartimente umfasst.
Vorrichtung nach einem beliebigen der voranstehenden Ansprüche, wobei mindestens eines der Detektorelemente (RE, RE1, RE2) ausgebildet ist, einen Referenzwert zu erzeugen.
Detektorkit (101), das mindestens eine Vorrichtung (100) gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 11 und ein Steuerungssystem (CD) umfasst, wobei das Steuerungssystem (CD) eine Auswertungseinheit (EU) umfasst, die ein Datenverarbeitungselement mit einem umgesetzten Algorithmus zum Durchführen einer Vergleichsanalyse umfasst, welches so ausgebildet ist, dass es mindestens einen von einem massensensitiven Detektorelement (RE, RE1, RE2) erhaltenen Probenwert quantifiziert und den mindestens einen Probenwert mit einem mindestens einen Referenzwert vergleicht.
Detektorkit, das mindestens eine Vorrichtung (100) gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 11 umfasst, vorzugsweise ein Kit gemäß Anspruch 14, wobei das Kit Nachweismittel zum Nachweisen des Vorhandenseins, vorzugsweise der Menge, der mindestens einen Substanz in einer Probe des Probanden umfasst, wobei das Kit Nachweismittel zum Nachweisen des Vorhandenseins von SARS-CoV-2 (schweres akutes respiratorisches Syndrom-bezogenes Coronavirus 2) in einer Probe eines Probanden umfasst.