DE2028823C3 - Verfahren zur Isolierung eines Süßstoffs aus Dioscoreophyllum-cumminsü-Beeren und die Verwendung desselben - Google Patents

Description

In neuerer Zeit sind Bedenken gegen die bisher bekannten, synthetischen Süßstoffe erhoben worden, denen teilweise gesundheitsgefährdende Wirkungen zugeschrieben werden. Es besteht daher ein Bedarf nach der Auffindung weiterer Süßstoffe, welche in dieser Hinsicht unbedenklich sind. Eine solche Unbedenklichkeit ließe sich vor allem bei Süßstoffen aus natürlichen Quellen erwarten.

Nunmehr wurde festgestellt, daß aus der vor allem in Afrika wachsenden Pflanze Dioscoreophyllum eumminsii bzw. deren Früchten eine Substanzen isoliert werden kann, welche eine außerordentlich hohe Süßkraft, vergleichbar mit den stärksten synthetischen Süßstoffen, aufweist und sich zum Süßen von Nahrungs- und Genußmitteln eignet.

Dioscoreophyllum eumminsii ist eine Kletterpflanze, die mehrere Meter Höhe erreicht und beerenartige Früchte mit 1 bis l'/₂cm Durchmesser trägt, die in traubenartigen Bündeln mit ungefähr 50 bis 100 Beeren je Traube wachsen. Aus diesen Beeren läßt sich erfindungsgemäß ein Süßstoff gewinnen.

Gegenstand der Erfindung ist somit das im vorste-Isolierung eines Süßstoffs aus den Beeren von Dioscoreophyllum eumminsii und die Verwendung dieses Süßstoffs zum Süßen von Nahrungs- und Genußmitteln.

Die Extraktion der Beeren mit Wasser kann auf verschiedene Weise erfolgen. Es ist möglich, das Beerenfleisch einfach wiederholt mit Wasser durchzurühren und dann den wäßrigen Extrakt abzutrennen. Das Durchrühren muß so erfolgen, daß die Kerne der Beeren nicht zerkleinert werden, da diese einen stark bitter schmeckenden Inhalt haben. Der erhaltene wäßrige Extrakt wird zweckmäßig gefriergetrocknet und ist in dieser Form lagerfähig. Bei fünfmaliger Extraktion bei Zimmertemperatur während etwa 30 bis 60 Minuten erhält man auf diese Weise etwa 3 bis 4%, bezogen auf das Gewicht der eingesetzten Trauben, eines Rohmaterials in Form eines leicht rötlichen Pulvers von starkem süßem Geschmack, welches jedoch einen muffigen und bitteren Beigeschmack auf-

-0 weist.

Die Herstellung des Extraktes kann auch unter Zugabe von aufschlußfördernden Enzymen erfolgen, nämlich von Pectinase. Durch Incubation mit einem solchen Enzym wird die Viskosität des Beerenhomogenates verringert und die Abtrennung des wäßrigen Extraktes erleichtert.

Der wäßrige Traubenextrakt kann vorteilhaft einer Dialyse gegen ionenfreies Wasser unterworfen werden. Die Dialyse wird vorzugsweise bei niedrigen

ίο Temperaturen zwischen etwa 0 und 8° C durchgeführt. Vorzugsweise erfolgt die Dialyse bei Kühlraumtemperatur (etwa 4° C).

Die weitere Fraktionierung des wie beschrieben gewonnenen Rohproduktes erfolgt unter Ausnutzung der UV-Absorption des gesuchten Süßstoffes und seiner ausgeprägt süßenden Eigenschaften. Das UV-Spektrum des Süßstoffes zeigt einen Absorptionsgipfel bei 270 bis 275 nm und ist auch bei 280 nm noch . stark genug, um mit Hilfe der für diese Wellenlänge vorliegenden Meßgeräte bestimmt zu werden.

Bei der anschließenden Molekularsiebfraktionierung wird die gesuchte Fraktion anhand der Absorption bei 280 nm und des süßen Geschmacks identifiziert. Zur Fraktionierung eignen sich die üblichen Molekularsiebmaterialien mit mittleren Vernetzungsgraden, die im Molekulargewichtsbereich zwischen 10000 und 200000 fraktionieren. Als besonders geeignet erwiesen sich die von der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden erhältlichen Molekularsiebmaterialien auf Basis von Dextranen. Hierbei wird der durch die Extraktion der Beeren gewonnene Rohextrakt, bzw. nach Gefriertrocknung dieses Rohextraktes, die durch erneutes Auflösen desselben in Wasser oder einem geeigneten Puffer erhaltene Lösung direkt auf die Molekularsiebkolonne gegeben und mit dem gleichen Wasser oder Puffer eluiert, wobei die bei 280 nm absorbierende und süßen Geschmack aufweisende: Fraktion gesammelt und abgetrennt wird.

ω Durch Trocknung des so erhaltenen Extraktes wird ein weißes, fasriges Pulver mit intensivem, reinem Süßgeschmack in eim;r Ausbeute von insgesamt etwa 0,25 bis 0,35 Gew.% bezogen auf die frischen Trauben erhalten. Dieses pulvrige Material ist etwa 800-bis lSOOmal so süß wie Rohrzucker, wie durch organoleptische Untersuchungen festgestellt wurde.
Bestimmungen des Süßschwellenwertes ergaben

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gleich zu Rohrzucker, während Verdünnungsversuche eine etwa 800fache Süßkraft im Vergleich zu Rohrzucker ergaben.

Der nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene Süßstoff ist frei von dem bitteren, muffigen Nebengeschmack des Rohextraktes.

Eine 5%ige Lösung des erfindungsgemäß gewonnenen Süßstoffes weist einen schwach-sauren pH-Wert um etwa 5,5 auf.

Die Totalhydrolyse des Süßstoffs mit 6 N Salzsäure während 16 Stunden ergab ein Hydrolysat mit einem Gehalt von mehr als 77% Aminosäuren. Es wurden 15 Aminosäuren gefunden, insbesondere saure Aminosäuren. Außerdem wurden etwa 20 Gew.% Saccharide gefunden.

Die elektrcphoretische Prüfung ergab Einheitlichkeit. Das gleiche Ergebnis wurde in der analytischen Ultrazentrifuge bei 56 000 UpM und Verwendung von reinem Wasser als Lösungsmittel erhalten. Das Molekulargewicht liegt zwischen etwa 10000 und 30000.

Durch Incubation des wie oben beschrieben erhaltenen Süßstoffs mit proteolytischen Enzymen, z. B. Papain, Pepsin und Bromelain, konnte eine weitere Aufspaltung des Süßstoffs erhalten werden. Besonders günstige Ergebnisse wurden mit Bromelain bei Zimmertemperatur erhalten. Eine Molekularsiebprochromatographie des mit Bromelain behandelten Produktes ergab 2 absorbierende Fraktionen, von denen die später eluierte, also niedrigmolekularere Fraktion die süßen Eigenschaften aufwies. Die süße Fraktion machte etwa V₁₀ des ursprünglich eingesetzten Produktes aus. Durch Disk-Elektrophorese an Polyacrylamid-Gel konnte eine süße Substanz erhalten werden, in der sich keine Proteine nachweisen ließen, die mit Anthron-Reagcnz aber eine positive Reaktion ergab, welche auf das Vorhandensein von Kohlenhydratsubstanzen hinweist.

Der erfindungsgemäß erhältliche Süßstoff weist unter allen, bisher bekanntgewordenen, aus natürlichen, pflanzlichen Quellen isolierten Süßstoffen die weitaus stärkste Süßkraft auf und eignet sich daher in sehr geringen Mengen zum Süßen von Nahrungsund Genußmitteln.

Die folgenden Beispiele erläutern das Verfahren der Erfindung und den erfindungsgemäß gewonnenen Süßstoff weiter.

Beispiel 1

16,2 kg Trauben von Dioscoreophyllum cumminsii wurden entstielt und aufgequetscht. Die so erhaltene zäh-klebrige Masse wurde in Portionen zu jeweils 300g fünfmal mit der gleichen Menge Wasser 40 Minuten geschüttelt und dann dreimal mit wenig Wasser mit einem mechanischen Rührer mit stumpfen Rührblättern durchgerührt. Die so gewonnenen wäßrigen Extrakte wurden mit Hilfe eines feinen Siebs von den Kernen und Schalten abgetrennt und gefriergetrocknet. Man erhielt so ca. 100 1 wäßriges Extrakt, aus denen 500 g lyophilisiertes Rohmaterial gewonnen wurden. Die Ausbeute, bezogen auf eingesetzte Trauben, betrug 3,1 %. Das Produkt stellt ein leicht rötliches Pulver mit stark süßem Geschmack dar, welches einen muffigen und bitteren Beigeschmack aufweist.

Das Lyophilisat wird in der 15fachen Menge Wasser gelöst und dann auf eine mit Molekularsiebmate-

ι lui uui lyv-Auaii-uaata giwu gi~iuiiLi* üauiv yvjii ^.,λ. in Länge und 3,5 cm Durchmesser gegeben. Es wurden Fraktionen von 10 ml gesammelt. Die U V-Absorption des Eluats bei 280 nm wurde in der Durchflußküvette bestimmt. Nach einem ersten Gipfel mit UV-Absorption wurde bei den Fraktionen 120 bis 135 ein zweiter Gipfel erhalten. Die in diesen Fraktionen enthaltene Substanz war stark süß und wurde durch Lyophilisieren getrocknet. Man erhielt so 50 g eines weißen, fasrigen Pulvers mit intensivem, reinen Süßgeschmack. ίο Die Ausbeute, bezogen auf unverarbeitete Trauben, betrug 0,31 Gew.%.

Eine organoleptische Untersuchung des so erhaltenen Materials ergab, daß eine 0,0012 %ige Lösung desselben mit einer 2,0%igen Saccharose-Lösung (jeweils in entionisiertem Wasser) vergleichbar war. Die Probe des erfindungsgemäß erhaltenen Produktes war jedoch noch etwas süßer, so daß die Süßkraft mindestens das SOOfache des Rohrzuckers beträgt.

Das Produkt wurde 16 Stunden mit 6 N Salzsäure hydrolysiert. Im Hydrolysat wurde eine quantitative Aminosäure-Analyse durchgeführt. Sie ergab einen Gehalt von mehr als 77 % Aminosäuren mit auffallend großem Anteil saurer Aminosäuren. Insgesamt wurden 15 Aminosäuren nachgewiesen, Cystein und Methionin fehlten.

Disk-Elektrophorese an Polyacrylamid-Gei ergab Einheitlichkeil des Produktes. Desgleichen wurde in der analytischen Ultrazentrifuge bei 56000 UpM unter Verwendung von Wasser als Lösungsmittel nur ein jo Gipfel erhalten.

Die Untersuchung des Hydrolysates mit Anthron-Schwefelsäure-Reagenz ergab einen Gehalt von ungefähr 20% Saccharides

J₅ Beispiel 2

Gewaschene und eingefrorene Beeren von Dioscoreophyllum cumminsii wurden aufgetaut in entionisiertem Wasser mit einem Mischer homogenisiert. Der wäßrigen Pulpe wurde 1 g Pectinase je 250 g einge setzte Beeren zugesetzt und das Homogenisat 1 Tag bei Zimmertemperatur stehengelassen. Danach hatte die Viskosität des Homogenats deutlich abgenommen. Das Homogenat wurde dann abgenutscht und das FiI-trat 24 Stunden bei 4° C gegen entionisiertes Wasser dialysiert. Der Dialyse-Rückstand wurde lyophilisiert.

Das so gewonnene Rohmaterial wurde in Acetatpuffer pH 4,6 gelöst (10,0 ml je 200 bis 500 mg Rohprodukt) und dann über einer Kolonne, geschieht wie im Beispiel 1, chromatographiert. Die bei 280 nm absorbierende, süße Fraktion wurde gesammelt.

Der so erhaltene Extrakt wurde mit einer 0,05 %igen Lösung vom Bromelain in Natriumacetatpuffer pH 4,5, aktiviert mit Cysteinhydrochlorid, bei 25° C 24 Stunden incubiert. Anschließend wurde die Lösung in der oben beschriebenen Weise erneut chromatographiert. Das bei 280 nm absorbierende Material wurde gesammelt. Man erhielt so 2 Gipfel, von denen jedoch nur die 2. die süße Substanz enthielt.

bo Die Ausbeute des Produkts von Gipfel 2 betrug etwa 10% mit der eingesetzten Menge.

Die Disk-Elektrophorese des erhaltenen Produktes ergab einen Gehalt an Proteinen und einer, in der Elektrophorese nicht wandernden Substanz, welche die gesamte Süßkraft enthielt. Das elektrophoretisch unbewegliche Produkt ergab mit dem Anthron-Reagenz eine positive Reaktion, die auf das Vorhandensein von Kohlenhydraten hinweist. Gegenüber Nirs-

hydrin war die Reaktion negativ.

Das Verfahren konnte unter Verwendung des Molekularsiebmaterials und Dextran-Basis wiederholt werden, wobei vergleichbare Ergebnisse erzielt wurden.

Das so erhaltene Material wurde wie in Beispiel 1. Absatz 3 beschrieben, untersucht, wobei die gleichen Resultate erhalten wurden. Die Süßkraft des Produkts beträgt damit mindestens das HOOfache ües Rohrzuckers.

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Isolierung eines Süßstoffes aus Dioscoreophyllum-CLiTiminsii-Beeren, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die genannten Beeren mit Wasser extrahiert, wobei die Kerne der Beeren nicht zerkleinert werden dürfen,

b) den erhaltenen Extrakt mindestens einer Molekularsiebfraktionierung mit einem Molekularsiebmaterial, welches im Molekulargewichtsbereich zwischen 10000 und 200000 fraktioniert, unterwirft und die UV-Licht bei 280 nm absorbierenden und gleichzeitig süß schmeckenden Fraktionen sammelt und trocknet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion der Beeren in Gegenwart von Pectinase durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion bei einer Temperatur zwischen 0 und 50° C durchführt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man den gemäß a) erhaltenen Extrakt gefriergetrocknet und zur Molekularfraktionierung wieder in Wasser bzw. einem geeigneten Puffer gelöst.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das bei einer ersten Molekularsiebfraktionierung gewonnene Produkt mit Bromelain inkubiert und einer erneuten Molekularsiebfraktionierung unterwirft.

6. Verwendung nach dem Verfahren von Anspruch 1 bis 5 erhaltenen Süßstoffs zum Süßen von Nahrungs- und Genußmitteln.