DE20215270U1

DE20215270U1 - Vorrichtung zur Antikörperdiagnose mit kombinierten Membranen

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Publication number: DE20215270U1
Application number: DE20215270U
Authority: DE
Original assignee: Euroimmun AG
Current assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2002-10-02
Filing date: 2002-10-02
Publication date: 2003-01-23
Anticipated expiration: 2012-10-03

Description

Vorrichtung zur Antikörperdiaanose mit kombinierten Membranen

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum immunologischen Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen, die aus mehreren Membranen besteht, auf die jeweils unterschiedliche Antigene und/oder Antigenspektren aufgebracht sind, wobei die erste Membran eine Basismembran bildet, auf der einseitig eine oder mehrere weitere Membranen fixiert sind, wobei die Membranen jeweils aus demselben und/oder unterschiedlichen Materialien bestehen. Die verwendeten Antigene werden rekombinant hergestellt, aus natürlichen Quellen isoliert oder sind eine Mischung mehrerer der vorgenannten Antigene, wobei die Antigene gegebenenfalls aufgereinigt sind. Diese Vorrichtung erlaubt im Vergleich zum Stand der Technik erstmals die Untersuchung eines erweiterten analytischen Spektrums durch die Auswertung eines umfangreichen Antigenspektrums in Kombination mit einem oder mehreren spezifischen, ggf. aufgereinigten Antigen (en) und die Verwendung unterschiedlicher Membranen für einzelne Antigene in einer Analyse durch freie Kombinierbarkeit verschiedener Membranen.

Nachweis von Antikörpern auf Membranen

Zur genauen Diagnose vieler Krankheiten wird häufig unterstützend der Nachweis spezifischer Antikörper in einer Probe des Patienten benötigt. Für diesen Nachweis wird ein für die nachzuweisende Krankheit typisches Spektrum von Antigenen, es kann sich dabei um Proteine, Lipide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate und/oder zuckerhaltige Strukturen (wie z.B. komplexe Moleküle, die einen Kohlenhydrat- und/oder einen Lipid- und/oder Proteinanteil besitzen, wie Glykoproteine oder Protein/Kohlenhydratmischformen bzw. Glykolipide, wie z.B. Ganglioside etc.) handeln, auf einer Membran immobilisiert und mit der Probe des Patienten inkubiert. Spezifisch an die immobilisierten Antigene gebundene Antikörper aus der Probe des Patienten können auf der Membran nachgewiesen werden. Ein Nachweis dieser Antikörper ist ein Positivbefund und wird zur Beurteilung von unklaren Krankheitsbildern genutzt.

Ein routinemäßig eingesetztes Verfahren zur Immobilisierung von Antigenen, z.B. von Proteinen, auf einer Membran ist der Westernblot. Hierbei werden Proteine oder Proteingemische elektrophoretisch in einem Gel nach ihren Molekularmassen aufgetrennt. Die Proteine oder Proteingemische werden gewöhnlich aus Tieren, Menschen, Geweben, aus einer Zelllinie oder einem Infektionserreger, aus Lebensmitteln oder Pollen (Allergenen) isoliert. Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung der Proteine folgt ihre Übertragung auf eine Membran (&ldquor;Blotten") sowie ihre Fixierung auf dieser Membran. Die Membranen mit den fixierten Antigenen werden nun für Diagnoseverfahren eingesetzt. Die Gesamtheit der Antigene aus einer der oben genannten Quellen wird hier definitionsgemäß als Antigenspektrum bezeichnet und beinhaltet auch Antigene, die eine allergische Immunantwort auslösen können (Allergene).

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Neben Proteinen können weitere Moleküle als Antigene fungieren. Beispielsweise werden Nukleinsäuren nach einer elektrophoretischen Auftrennung durch ein Blotverfahren auf Membranen transferiert und können als Antigene in Nachweisverfahren eingesetzt werden, z.B. beim Nachweis des systemischen Lupus erythematodes, einer Autoimmunkrankheit, die sich u.a. durch das Vorkommen eines Antikörpers gegen doppelsträngige DNA auszeichnet. Bei der Northern-Blottechnik werden Ribonukleinsäuren (RNA), bei der Southern-Blottechnik Desoxyribonukleinsäuren elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Membran transferiert .

Bei der Linienblot-Technologie werden Antigene in Form einer scharf abgegrenzten Linie auf eine Membran aufgetragen. Der Transfer auf die Membran erfolgt dabei entweder mit Hilfe eines Stempels als homogene Linie oder berührungsfrei mit Hilfe einer Düse als eng beieinander liegende Tropfen in Form einer Linie.

Ausgangsmaterial bei der Linienblot-Technologie sind spezifische, aufgereinigte Antigene oder Vollextrakte aus einzelnen Organismen, Zellkulturen oder Organen. Diese Antigene werden einzeln oder als definiertes Gemisch in einer einstellbaren Konzentration verwendet.

Verschiedene Transferverfahren für Antigene können miteinander kombiniert werden. So werden beispielsweise Membranen, die durch Blotten ein Antigenspektrum tragen (&ldquor;Westernblot"), nachträglich mit zusätzlichen aufgereinigten Antigenen oder definierten Antigengemisehen, z.B. einem Treponema pallidum-Extrakt als Vollextrakt, in Form einer feinen Linie beschichtet, die auf gestempelt oder mittels einer Düse in der Art eines Linienblots aufgebracht wird.

Die Verwendung von Westernblotmembranen erlaubt die Auswertung eines breiten Proteinspektrums auf einer Membran. Durch die Verwendung denaturierender Bedingungen während der gelelektrophoretischen Auftrennung der Antigene (SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese) können einzelne Untereinheiten von komplexen Antigenstrukturen aufgetrennt werden und somit die Antikörperreaktionen einzelner Untereinheiten nachfolgend untersucht werden.

Durch diese denaturierenden Bedingungen kann es jedoch andererseits auch zu Beeinträchtigungen der Antigenität bestimmter Antigene kommen, wenn einzelne Epitope irreversibel verändert werden und für eine Reaktion mit spezifischen Antikörpern nicht mehr zur Verfügung stehen.

Der Nachweis der spezifischen Antikörper-Bindung an die entsprechenden Antigene (z.B. Proteine) auf der Membran kann vorliegend unter Verwendung von Verfahren durchgeführt werden, die im Stand der Technik hinreichend beschrieben sind (vgl. F. Lottspeich, H. Zorbas &ldquor;Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin, 1998) und beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe, radioaktiv markierte Moleküle, Chemilumineszenz oder colorimetrische Detektion beinhalten. Die Interpretation eines Antikörpernachweises ist jedoch kompliziert und erfordert wegen mitunter nicht eindeutiger Ergebnisse einen versierten Anwender für die Auswertung.

Ein Vorteil der Linienblot-Technik liegt in der Möglichkeit einer optimalen Anpassung der Membran an einzelne verwendete Antigene. Die Verwendung genau definierter Antigene ermöglicht weiterhin eine sehr einfache Auswertung der Ergebnisse.

Nachteilig für die Verwendung des Linienblots ist die begrenz te Auswahl zur Verfügung stehender Antigene, die in aufgerei

nigter Form vorliegen müssen, um ausschließlich spezifische Signale zu erzeugen.

Die Kombination aus einer Westernblotmembran mit einem oder mehreren aufgesprühten Antigen(en) in Form einer Linie ist kommerziell erhältlich (Firma EUROIMMUN, z.B. Leberwesternblot mit einer Linie rekombinantem SLA/LP (Art. DW 1300-1601 G) zur Diagnose von Autoimmunhepatitis oder primär-biliärer Leberzirrhose, bzw. HSV-1-Westernblot mit einer Linie affinitätsgereinigtem Glykoprotein gG2 aus HSV2 (Art. DY 2531-1601 G oder M) zur Differenzierung von Infektionen mit Herpes simplex-Virus I und 2).

Solche Kombinationen sind im Prinzip in der Lage, das diagnostische Spektrum zu erweitern, indem das Antigenspektrum der Westernblotmembran durch ausgewählte, spezifische Antigene in aufgereinigter Form und in bekannter Konzentration in Form einer Linie ergänzt wird. Dadurch kann auch die Sensitivität oder Spezifität des Antikörpernachweises erheblich erhöht und/oder die Ablesbarkeit verbessert werden. Weiterhin können solche Antigene auf der Westernblotmembran durch zusätzlich aufgebrachte Linien substituiert werden, deren Antigenität während der denaturierenden Gelelektrophorese durch den Verlust eines oder mehrerer Epitope irreversibel vermindert wurde.

Die bestehenden Kombinationen weisen aber in einigen Fällen deutliche Nachteile auf. So ist der Fachmann beim nachträglichen Auftragen eines Antigens direkt auf eine fertiggestellte Westernblotmembran an die für den Westernblot verwendete Membran gebunden. Das Material und die Ladung dieser Membran schränkt das Spektrum geeigneter Antigene für den Auftrag als Linie auf die Westernblotmembran wesentlich ein. Weiterhin ist die Sensitivität des Nachweis eingeschränkt, da wegen der schlechten Bindung eine größere Menge des Antigens aufgetragen

werden muß. Aus diesen Gründen müssen häufig mehrere Nachweisverfahren (z.B. Westernblot und Linienblot) parallel oder aufeinanderfolgend durchgeführt werden, wodurch sich der Material- und Arbeitsaufwand des Labors nicht unerheblich erhöht.

Ein weiteres Problem ist ferner die Qualität der nachträglichen Antigenbeschichtung und ihre Eignung für diagnostische Zwecke. Probleme beim nachträglichen Transfer eines Antigens auf eine Westernblotmembran oder eine verminderte Qualität des aufgetragenen Antigens führt wegen der hohen Anforderungen an die Qualität der Antigene häufig zum Totalverlust der gesamten Membran.

Die Aufgabe der Erfindung ist es daher, Mittel bereitzustellen, mit denen ein spezifischer Antikörper- und Antigennachweis ermöglicht wird, die jedoch die oben beschriebenen Nachteile nicht aufweisen. Insbesondere sollen die Mittel geeignet sein, in einem möglichst einfachen Diagnoseverfahren eingesetzt zu werden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch den Gegenstand der Ansprüche 1 bis 28 und insbesondere durch eine Vorrichtung zum immunologischen Nachweis von Antikörpern oder Antigenen gelöst, die aus mehreren Membranen besteht, von denen die erste Membran eine Basismembran bildet, auf der einseitig eine oder mehrere weitere Membranen fixiert sind.

Kurze Darstellung der Erfindung

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung zum immunologischen Nachweis von Antikörpern und Antigenen zur Verfügung gestellt, die aus mehreren Membranen besteht, auf die jeweils unterschiedliche Antigene und/oder Antigenspektren aufgebracht sind. Die erste Membran bildet eine Basismembran,

auf der einseitig eine oder mehrere weitere Membranen fixiert sind, wobei die Membranen jeweils aus demselben und/oder unterschiedlichen Materialien bestehen. Gemäß einer Ausführungsform dient eine Membran als Basismembran, wobei die weitere(n) Membran(en) aus demselben und/oder einem anderen Material bestehen wie die Basismembran.

Eine Membran, vorzugsweise die als Basismembran zum Einsatz kommende Membran, kann in einer Ausführungsform ein breites Antigenspektrum tragen, das nach seiner Auftrennung in einem Elektrophoresegel auf die Membran transferiert wurde. Als Antigenspektrum werden die Antigene, z.B. Proteine, Lipide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate und/oder zuckerhaltige Strukturen (wie z.B. komplexe Moleküle, die einen Kohlenhydrat- und/oder einen Lipid- und/oder Proteinanteil besitzen, wie Glykoproteine oder Protein/Kohlenhydratmischformen bzw. Glykolipide, wie z.B. Ganglioside etc.) eines Tieres, Gewebes, einer Zelllinie oder eines Infektionserregers, aus Lebensmitteln oder Pollen definiert.

Auf die weiteren Membranen sind entweder ebenfalls Antigenspektren (wie z.B. Vollextrakte), einzelne Antigene oder Mischungen derselben (z.B. als definiertes Gemisch) aufgetragen, wobei sich die Beladung der einzelnen Membranen der Vorrichtung voneinander unterscheidet. Die Antigene können rekombinant hergestellt oder aus natürlichen Quellen isoliert sein und sind gegebenenfalls aufgereinigt.

Die Einzelmembranen der Vorrichtung werden nach dem Transfer der Antigene oder Antigenspektren fest, d.h. irreversibel, miteinander verklebt. Die Vorrichtung wird als Ganzes wie eine Einzelmembran inkubiert, gewaschen, dem Detektionsverfahren unterzogen und ausgewertet.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zum immunologischen Nachweis von Antikörpern und Antigenen, die aus mehreren Membranen besteht, auf die jeweils unterschiedliche Antigene und/oder Antigenspektren aufgebracht sind, wobei die erste Membran eine Basismembran bildet, auf der einseitig eine oder mehrere weitere Membranen fixiert sind, wobei die Membranen jeweils aus demselben und/oder unterschiedlichen Materialien bestehen. Gemäß einer Ausführungsform dient eine Membran als Basismembran, wobei die weitere(n) Membran(en) aus demselben und/oder einem anderen Material bestehen wie die Basismembran. Die verwendeten Antigene werden rekombinant hergestellt, aus natürlichen Quellen isoliert oder sind eine Mischung mehrerer der vorgenannten Antigene, wobei die Antigene gegebenenfalls aufgereinigt sind.

Der Begriff Antigene, wie er hier verwendet wird, schließt neben den oben genannten Antigenen definitionsgemäß auch Antigene ein, die eine allergische Immunantwort auslösen können (Allergene). Weiterhin sind definitionsgemäß auch Antigenspektren, mit denen die Gesamtheit oder eine definierte Anzahl der Antigene aus einer Quelle (wie z.B. einem Tier, Organ oder Gewebe) bezeichnet wird, sowie Vollextrakte eingeschlossen.

Die erfindungsgemäß verwendeten Membranen sind Westernblotmembranen, Linienblotmembranen, Northernblotmembranen, Southernblotmembranen, Dot Blot-Membranen oder Slot Blot-Membranen und/oder Membranen, auf der Antigene anders als durch Blotten aufgebracht sind. Erfindungsgemäß bevorzugte Kombinationen bestehen aus Westernblotmembranen und Linienblotmembranen.

Der Begriff &ldquor;Blotten" bezeichnet den Transfer eines Moleküls aus einem Elektrophoresegel auf eine Membran, die &ldquor;Blotmembran". Neben dieser Definition im engeren Sinne werden in der

vorliegenden Erfindung aber auch solche Membranen als Blotmembran bezeichnet, auf die Antigene mit anderen Verfahren als dem Blotverfahren aufgebracht werden bzw. sind.

Zu diesen Verfahren zählen auch das &ldquor;Dot Blot"- und das &ldquor;Slot Blot"-Verfahren, bei denen das Antigen durch Auftropfen direkt auf die Membran aufgetragen wird und eine runde bzw. länglichovale Fläche bedeckt. Beim &ldquor;Linienblot"-Verfahren werden Antigene entweder mit Hilfe eines Stempels als homogene Linie oder berührungsfrei mit Hilfe einer Düse als eine Abfolge eng beieinander liegender Tropfen auf eine Membran aufgetragen, so daß sich für das Auge die Form einer scharf abgegrenzten Linie ergibt.

Bei der oben genannten Basismembran kann es sich um eine selbstklebende Membran handeln, die auf der Rückseite mit einem reversiblen Kleber versehen ist.

Die Fixierung der Membranen auf der Basismembran kann erfindungsgemäß so erfolgen, daß sich die Membranen entweder nur über einen Teil der Fläche der Basismembran (siehe Figur la bis Id) oder über deren Ausmessung hinaus erstrecken (siehe Figur Ie).

Eine Membran, vorzugsweise die Basismembran, ist gemäß einer besonderen Ausführungsform mit Antigenen aus einem Elektrophoresegel beschichtet. Erfindungsgemäß können Westernblotmembranen, Southernblotmembranen und Northernblotmembranen verwendet werden, die das komplette Antigenspektrum eines Tieres, Menschen, Gewebes, einer Zelllinie oder eines Infektionserregers, aus Lebensmitteln oder Pollen (Allergene) tragen, welches elektrophoretisch entsprechend seinen Molekularmassen in einem Elektrophoresegel aufgetrennt und auf die Membran transferiert wurde. Die Proteine und Nukleinsäuren sind mit im Stand der Technik bekannten Verfahren durch Transfer aus einem Elektro-

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phoresegel auf die Westeriiblotmembran, Southernblotmembran bzw. Northernblotmembran als Antigene aufgebracht.

Erfindungsgemäß unterscheiden sich die Antigene und/oder Antigenspektren, die auf die einzelnen Membranen aufgebracht wurden, die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung miteinander kombiniert werden. In einer besonderen Ausführungsform tragen zwei oder mehrere Membranen das gleiche Antigen, jedoch jeweils in einer anderen Form. So kann z.B. eine Membran ein Antigen in denaturierter Form, die andere Membran das native Antigen tragen. Jede Membran als Teil der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist somit mit einem Antigen oder Antigenspektrum beschichtet, die sich entweder in der Form oder in der Art unterscheiden.

Erfindungsgemäß kann unter anderem das Antigenspektrum eines Tieres eingesetzt werden. Bevorzugt handelt es sich bei den Tieren um Insekten und besonders bevorzugt um Bienen und Wespen, deren Gift Proteine enthält, die bei manchen Menschen zu äußerst allergischen Reaktionen führen. Die Proteine aus den Giften können nach im Stand der Technik hinreichend bekannten Verfahren, z.B. durch Giftsackextraktion nach Gefriertrocknen von Wespen, oder durch Elektrostimulation lebender Bienen, gewonnen werden.

Bei den Geweben kann es sich erfindungsgemäß beispielsweise um Gewebe hepatischen (Lebergewebe) oder neuronalen Ursprungs, z.B. aus dem Kleinhirn, bzw. um Gewebe aus dem Pankreas, der Niere, dem Auge, dem Innenohr oder der Haut handeln. Diese Gewebe können nach im Stand der Technik hinreichend bekannten Verfahren aus Säugetieren, beispielsweise aus Primaten oder Menschen, isoliert werden. Die Isolierung der Antigene erfolgt z.B. durch eine Lyse der Zellen oder durch Homogenisieren des Gewebes und Aufnahme in einen Puffer sowie einer anschließen-

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den Aufreinigung der gewünschten Antigene, z.B. durch Zentrifugation und/oder elektrophoretische Trennung.

Bei der Zelllinie kann es sich um jede etablierte Zelllinie handeln, die ein oder mehrere ausgewählte Antigene, wie beispielsweise Proteine, bildet. Bevorzugt handelt es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung um humane Zelllinien. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Zelllinie um eine humane Epitheliomzelllinie, insbesondere um die humane Epitheliomtyp 2-Zelllinie HEp-2 (ATCC CCL 23, Moore et al. (1955) Cancer Res. 15, 598). Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Zelllinie um HeLa-Zellen. (ATCC CCL 2, Gey et al. (1952) Cancer Res. 12, 264; ScHEPER et al. (2002) Auto immunity reviews, Vol.1, Issues 1-2, S. 17 &ldquor;Anti-Mi-2 Westernblot: A new test for serological detection of myositis aütoantibodies") Die Gewinnung der Antigene aus diesen Zelllinien erfolgt nach im Stand der Technik hinreichend bekannten Verfahren.

Bei den Infektionserregern kann es sich um einen beliebigen pathogenen Infektionserreger, wie Bakterien, Viren oder Eukaryonten, handeln. Vorzugsweise sind diese Infektionserreger oder Antikörper gegen diese Infektionserreger in Körperflüssigkeiten, wie Serum, Blut, Liquor, Plasma, Urin und Gelenkpunktat nachweisbar. Besonders bevorzugt handelt es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung um humanpathogene Borrelien, wie z.B. Borrelia burgdorferi sensu lato (Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii und Borrelia afzelii) sowie andere humanpathogene Infektionserreger, wie z.B. Echinococcus granulosus, Epstein-Barr-Virus (EBV), Helicobacter pylori, Hepatitis-Viren, Herpes simplex-Virus (HSV), Humanes Immundefizienz-Virus (HIV), Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica oder das Zytomegalie-Virus (CMV). Die Gewinnung der Antigene

aus diesen Infektionserregern erfolgt nach, im Stand der Technik hinreichend bekannten Verfahren.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform verwendet man erfindungsgemäß eine Membran, vorzugsweise in Form der oben genannten Basismembran, auf der ein Antigenspektrum (z.B. ein elektrophoretisch aufgetrennter Vollextrakt) aufgebracht ist. Die weitere(n) Membran(en), die mit dieser Membran erfindungsgemäß kombiniert wird (werden), sind mit weiteren Antigenen und/oder Antigenspektren beschichtet. Bevorzugt ist unter anderem eine Kombination aus einer Westernblotmembran und einer oder mehreren weiteren Membranen aus der Gruppe bestehend aus Southernblotmembran, Northernblotmembran, Westernblotmembran, Dot Blot-Membran, Slot Blot-Membran oder Linienblotmembran und/ oder einer Membran, auf die die Antigene anders als durch Blotten aufgebracht sind, wobei gemäß einer Alternative die Kombination Westernblotmembran/Linienblotmembran besonders bevorzugt ist (siehe Figur 1).

Ein Beispiel für diese erfindungsgemäße Kombination ist die Verwendung einer Westernblotmembran als Basismembran, auf die ein elektrophoretisch aufgetrennter Antigenvollextrakt aus HEp-2-Zellen aufgetragen ist. Auf diese Basismembran wurde eine weitere Membran aufgeklebt, die das rekombinante 52kDa und das native 6OkDa SS-A-Protein in nicht denaturierter Form als Antigen trägt. Erfindungsgemäß lassen sich Antikörper gegen SS-A nur präzise nachweisen, wenn man diese zusätzlichen nativen SS-A Antigene verwendet, da aufgrund der denaturierenden Probenvorbereitung für die Elektrophorese und den Westernblot antigene Epitope des SS-A nachteilig beeinflußt werden.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung tragen die weitere(n) Membran(en) das (die) Vollextrakt(e) eines (verschiedener) Infektionserreger(s) in bekannter Konzentration, welche(s) durch einen Stempel als homogene Linie(n) oder be-

rührungsfrei mit einer Art Düse als eng beieinander liegende Tropfen in Form einer Linie auf die Membran(en) aufgebracht sein kann.

In einer besonderen Ausführungsform wird ein Antigenvollextrakt von Borrelia burgdorferi elektrophoretisch nach Molekularmasse aufgetrennt und auf eine Blotmembran transferiert. Diese Membran dient als Basismembran und wird mit einer weiteren Membran beklebt, auf die linienförmig ein Antigenvollextrakt von Treponema pallidum aufgetragen worden ist. Die Membran mit dem Treponema pallidum-Vollextrakt dient zum Ausschluß von Kreuzreaktionen.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform wird ein Allergenvollextrakt der Biene elektrophoretisch nach Molekularmasse aufgetrennt und auf eine Blotmembran transferiert. Diese Membran dient als Basismembran und wird mit einer weiteren Membran beklebt, auf die linienförmig ein Allergenvollextrakt der Wespe aufgetragen worden ist. Die weiteren Membran mit dem Allergenvollextrakt der Wespe erweitert das diagnostische Spektrum des Tests.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform trägt die (jede) weitere Membran der erfindungsgemäßen Kombination einzelne bis wenige aufgereinigte, spezifische Antigene, die z.B. rekombinanten Ursprungs sein können. Verfahren zur Herstellung rekombinanter Antigene und deren Aufreinigung sind im Stand der Technik bekannt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Antigene humanen Ursprungs.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung besteht aus mehreren Membranen, von denen die erste Membran eine Basismembran bildet, auf der einseitig eine oder mehrere weitere Membranen fixiert sind. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Fixierung der. Membranen durch festes Verkleben, bei-

spielsweise durch Verwendung von doppelseitigem Klebeband (siehe Figur 1).

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung unterschiedlicher Materialien für die einzelnen Komponenten (d.h. die jeweiligen Membranen) der erfindungsgemäßen Vorrichtung, die beliebig miteinander kombiniert werden können. Erfindungsgemäß sind alle kommerziell erhältlichen Membranen verwendbar und werden für die verwendeten Antigene gezielt ausgewählt. Bevorzugt handelt es sich hierbei um Membranen aus Nitrozellulose, Nylon, Polyethersulfon oder Polyvinylidenfluorid. Im Fall von z.B. Westernblotmembranen mit zusätzlichen Linienblots ist die Auswahl zusätzlicher Antigene durch die erfindungsgemäße Kombination verschiedener Membranen im Vergleich zum Stand der Technik nicht mehr beschränkt, da die für die jeweiligen, aufgereinigten Antigene optimale Membran verwendet werden kann und man nicht mehr auf das Material der Westernblotmembran festgelegt ist.

Die Membranen können erfindungsgemäß zur Erhöhung ihrer Stabilität und zur verbesserten Handhabung vliesverstärkt und/oder auf einen entsprechend geeigneten Träger, wie z.B. ein Polymer, laminiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nitrozellulose (ggf. mit Vlies verstärkt) auf eine Polymerfolie laminiert.

Im Rahmen der Erfindung werden auch unterschiedliche Membranen verwendet, deren Oberfläche modifiziert ist. Bevorzugt werden Membranen verwendet, deren Ladung den Antigenen angepaßt ist, wodurch eine verbesserte Bindung der Antigene an die Membranen gewährleistet ist. Durch Verwendung von positiv oder negativ geladenen Membranen wird die Bindung von entsprechend negativ oder positiv geladenen Antigenen verbessert, während ungeladenen Membranen Antigene ladungsunabhängig und somit auch Antigengemische mit verschiedenen Ladungen zu binden vermögen.

Weiterhin können die verwendeten Membranen hydrophob sein oder durch eine variable Porengröße unterschiedliche Bindungseigenschaften für verschiedene Antigene aufweisen.

In einer weiteren Ausführungsform bestehen die Membranen aus einem Material, an das Antigene kovalent binden (z.B. die Immunodyne ABC Membran (PaIl), eine Nylonmembran mit kovalenter Bindungsaktivität bzw. die UltraBind -Membran (PaIl) , eine Polyethersulfonmembran mit funktioneilen Aldehydgruppen zur Ausbildung von Schiffschen Basen mit primären Aminogruppen in Proteinen). Die kovalente Bindung der Antigene an die Membranen erfolgt mit im Stand der Technik bekannten Verfahren.

Durch die erfindungsgemäße Kombination verschiedener Membranen kann das Spektrum der Antigene auf den Membranen zusätzlich zu Proteinen um Lipide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate und/oder zuckerhaltige Strukturen (wie z.B. komplexe Moleküle, die einen Kohlenhydrat- und/oder einen Lipid- und/oder Proteinanteil besitzen, wie Glykoproteine oder Protein/Kohlenhydratmischformen bzw. Glykolipide, wie z.B. Ganglioside etc.) erweitert werden. In einer Ausführungsform der Erfindung trägt eine der Membranen Nukleinsäuren als Antigene. In dieser Ausführungsform ist die Membran eine positiv geladenen Nylonmembran. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Nukleinsäuren um Desoxyribonukleinsäuren (DNA).

Die zusätzliche Verwendung weiterer aufgereinigter Antigene in Form einer gesonderten, z.B. auf einem Westernblot fixierten weiteren Membran, erlaubt eine Absicherung oder eine Erweiterung der Diagnose. So können Antigene aus anderen Organismen, Geweben oder anderen Zelllinien, die für einzelne Krankheiten von diagnostischer Bedeutung sind, im Antigenspektrum auf einer Westernblotmembran jedoch nicht enthalten sind, in die Diagnose einbezogen werden. Dies wird unter anderem dadurch

erreicht, daß die einzelnen Membranen mit unterschiedlichen Antigenen oder Antigengemisehen beschichtet wurden.

Die Kombination einer Westernblotmembran und einer Linienblotmembran erhöht zudem die Anwenderfreundlichkeit und erleichtert die Auswertung. Die Vielzahl der bei der Auswertung eines Westernblots erhaltenen unspezifischen und spezifischen Signale kann mit der Ergänzung durch ausgewählte, spezifische Antigene auf einem Linienblot deutlich verbessert werden, da zusätzlich zum Signalspektrum des Westernblots durch den Linienblot eindeutige und spezifische Signale für die Auswertung zur Verfügung stehen. Ferner erfolgt die Beurteilung der Laborergebnisse anhand eines einzelnen Blotstreifens und nicht anhand mehrerer Streifen, was die Anwendungsfreundlichkeit zusätzlich erhöht. Außerdem werden Verwechslungen vermieden, da jeder Probe bzw. jedem Patienten nur ein Blotstreifen zugeordnet wird.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen beschrieben:

Beispiele Nachweis von Autoantikörpern gegen Proteine und DNA

Bei der Diagnose von rheumatischen Krankheiten werden nicht nur Autoantikörper gegen Proteine nachgewiesen, sondern auch gegen andere Antigene wie DNA oder Lipide. Diese Molekülarten binden jedoch erfahrungsgemäß schlecht an Membranen, wie sie für Proteine verwendet werden. So wird beispielsweise als Basismembran eine Nitrozellulosemembran verwendet, auf die ein Extrakt aus HEp-2-Zellen nach erfolgter gelelektrophoretischer Auftrennung übertragen wird. Zum Nachweis von Antikörpern gegen DNA, die mit diesem Westernblot nicht nachgewiesen werden, da diese Moleküle in der Elektrophorese bei den gewählten Be-

dingungen nicht aufgetrennt werden, wurde doppelsträngige DNA an eine positiv geladene Nylonmembran gebunden. Anschließend wurde der HEp-2-Westernblot unter Verwendung von doppelseitigem Klebeband mit der Nylonmembran beklebt, die eine Linie mit DNA trägt (siehe Figur la). Dadurch erweitert sich das diagnostische Spektrum des HEp2-Westernblots erheblich, da beispielsweise über 50% der Patienten mit Systemischem Lupus erythematodes Antikörper gegen doppelsträngige DNA besitzen. Der Nachteil der Variante, bei der die DNA direkt auf die Nitrozellulose der Westernblotmembran aufgebracht wird, wo sie nicht optimal bindet und daher zu mangelhafter Signalintensität bei der Auswertung führt, wird durch die erfindungsgemäße Vorrichtung vermieden.

Serodiagnostik der Lyme-Borreliose

Bei der gewöhnlichen Serodiagnostik der Lyme-Borreliose werden Westernblots eingesetzt, die elektrophoretisch aufgetrennte Vollextrakte von Borrelia burgdorferi sensu lato tragen. Für die Auswertung der Signale ist eine erfahrene Fachkraft erforderlich, die dank ihrer Erfahrung in der Lage ist, unspezifische von spezifischen Signalen zu unterscheiden. Der Zusatz von ausgewählten und aufgereinigten, nativen und rekombinanten Borrelien-Antigenen als Linien direkt auf der Westernblotmembran erleichtert die Auswertung, da bei den zusätzlich aufgetragenen Antigenen keine unspezifischen Signale durch Kreuzreaktionen zu erwarten sind.

Die alleinige Verwendung der in Linienform aufgetragenen Antigene ist für die Auswertung des Frühstadium der Lyme-Borreliose wegen mangelnder Sensitivität unzureichend (Habermann et al. (1999) VIII. International Conference on Lyme Borreliosis, München, Abstract book, Seite 15) .

Dieser mangelnden Sensitivität kann erfindungsgemäß begegnet werden, indem jeweils ein oder mehrere Membranstücke mit einer größeren Anzahl ausgewählter, z.B. rekombinant hergestellter Antigene beschichtet werden und diese auf die Westernblotmembran als Basismembran geklebt werden (siehe Figur Ib). Zu diesen ausgewählten Antigenen von Borrelien gehören bevorzugt die Antigene plOO/83, p58, p41 (Flagellin), bmp A, p41i (internes Fragment Flagellin), Osp B, Osp A, Osp C, pl8 und pl7. Angaben zu der Spezifität sind in der Technik bekannt (Ma et al. (1992) J". Clin. Microbiol. Feb., 370-376; Tilton & Ryan (1993) J". Clin. Immunoassay 16, 208-214; Hauser et al. (1997) J. Clin. Microbiol. June, 1433-1444; Wilske et al. (2000) MiQ 12/2000 Qualitätsstandards in der mikrobiologisch-infektiologischen Diagnostik: Lyme-Borreliose. Urban & Fischer Verlag).

Erfindungsgemäß sind mindestens ein, vorzugsweise jedoch 2, 3, 4, 5 oder mehr als 5 der ausgewählten Borrelia-Antigene auf eine oder mehrere Linienblotmembranen aufgebracht, die mit einer Westernblotmembran als Basismembran kombiniert sind.

Eine direkte Beschichtung der Westernblotmembran mit mehreren Antigenen ist zwar prinzipiell durchführbar, aber sehr problematisch, da idealerweise eine Zahl von fünf oder mehr Antigenen eingesetzt wird und nicht jede Linie bei direkter Beschichtung auf die Westernblotmembran den benötigten Mindestanforderungen an die Qualität entspricht. Selbst bei einer geringen Fehlerrate von ca. 10% beim Auftrag einer Linie auf eine Membran entstünden beim Auftrag von fünf Linien auf eine Membran eine große Menge fehlerhafter und somit unbrauchbarer Membranen.

Dieser Nachteil wird durch die erfindungsgemäße Vorrichtung vermieden, da aufgrund der linienförmigen Beschichtung von gesonderten Membranstücken mit den Antigenen und des nachträglichen Verkleben dieser Membranstücke mit der Westernblotmembran

kein Verlust durch unbrauchbar gewordene Westernblotmembranen entsteht.

Bezugszeichenliste für die Figuren

Figur 1 Membran auf Membran

a) Eine zusätzliche Membran auf Westernblot-Membran

b) Mehrere Membranen auf Westernblot-Membran

c) Westernblot-Membran auf Dot- bzw. Linienblot-Membran

d) Westernblot-Membran auf Westernblot-Membran

e) Blotmembran auf Blotmembran überlappend; als Blotmembran können sowohl Westernblot-Membranen, Dot-Blot-Membranen oder Linienblot-Membranen verwendet werden.

1 Kontrollbande

2 Anlegemarkierung

3 Chargen-Nummer

4 Westernblot-Membran

5 zweite Membran

6 weitere Membran

7 Dot- bzw. Linienblot

8 Blot-Membran 1

9 Blot-Membran 2

Claims

1. Vorrichtung zum immunologischen Nachweis von Antikörpern oder Antigenen, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus mehreren Membranen besteht, auf die jeweils unterschiedliche Antigene und/oder Antigenspektren aufgebracht sind, wobei die erste Membran eine Basismembran bildet, auf der einseitig eine oder mehrere weitere Membranen fixiert sind, wobei die Membranen jeweils aus demselben und/oder unterschiedlichen Materialien bestehen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigene rekombinant hergestellt, aus natürlichen Quellen isoliert oder eine Mischung mehrerer der vorgenannten Antigene sind, wobei die Antigene gegebenenfalls aufgereinigt sind.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Membranen aus der Gruppe aus Westernblotmembran, Linienblotmembran, Northernblotmembran, Southernblotmembran, Dot Blot-Membran, Slot Blot-Membran ausgewählt und/oder Membranen sind, auf die Antigene anders als durch Blotten aufgebracht sind.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Kombination aus der Gruppe

a) Westernblotmembran als Basismembran mit einer oder mehreren weiteren auf ihr fixierten Westernblotmembran(en),

b) Westernblotmembran als Basismembran mit einer oder mehreren weiteren auf ihr fixierten Linienblotmembran(en),

c) Linienblotmembran als Basismembran mit einer oder mehreren weiteren auf ihr fixierten Westernblotmembran(en) und

d) Dot Blot-Membran als Basismembran mit einer oder mehreren weiteren auf ihr fixierten Westernblotmembran(en) enthält.

5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran eine Westernblotmembran ist, die das Antigenspektrum eines Tieres, eines Menschen, eines Gewebes, einer Zelllinie oder eines Infektionserregers, aus Allergenen, wie Lebensmitteln oder Pollen, trägt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe Lebergewebe, neuronales Gewebe, z. B. aus dem Kleinhirn, Gewebe aus dem Pankreas, der Niere, dem Auge, dem Innenohr oder der Haut ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelllinie eine humane Epitheliomzelllinie oder die He- La-Zelllinie ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die humane Epitheliomzelllinie die humane Epitheliomtyp 2- Zelllinie (HEp-2) ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Infektionserreger humanpathogene Borrelien sowie andere humanpathogene Infektionserreger umfaßt.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den humanpathogenen Borrelien um Borrelia burgdorferi sensu lato (Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii und Borrelia afzelii) handelt.

11. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den humanpathogenen Infektionserregern um Echinococcus granulosus, Epstein-Barr-Virus (EBV), Helicobacter pylori, Hepatitis-Viren, Herpes simplex-Virus (HSV), Humanes Immundefizienz-Virus (HIV), Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica oder Zytomegalie-Virus (CMV) handelt.

12. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Material einer oder mehrerer Membranen Nitrozellulose, Nylon, Polyethersulfon oder Polyvinylidenfluorid ist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Membran eine Basismembran bildet, deren Material Nitrozellulose, Nylon, Polyethersulfon oder Polyvinylidenfluorid ist.

14. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran(en) oder die Basismembran auf einen Polymerträger laminiert sind (ist).

15. Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Nylon oberflächenmodifiziert ist.

16. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere Membran aus einem Material bestehen, an das die Antigene kovalent binden.

17. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Membran eine Basismembran ist, die aus einem Material besteht, an das die Antigene kovalent binden.

18. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das oder die auf den Membranen aufgebrachte(n) Antigen(e) Proteine, Lipide, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate und/oder zuckerhaltige Strukturen sind.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure DNA ist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Fixierung der Basismembran und der (den) weiteren Membran(en) aufeinander irreversibel durch Verkleben erfolgt.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das Fixierung der Membranen mit doppelseitigem Klebeband erfolgt.

22. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Basismembran eine Westernblotmembran ist, die das Antigenspektrum von humanen Epitheliomtyp 2- Zellen (HEp-2) trägt und die weitere Membran eine Linienblotmembran ist, auf die das rekombinante SS-A-Protein des Menschen mit einer Molekularmasse von 52 kDa und das aufgereinigte native SS-A-Protein des Menschen mit einer Molekularmasse von 60 kDa aufgebracht ist.

23. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Basismembran eine Westernblotmembran ist, die das Antigenspektrum von humanen Epitheliomtyp 2- Zellen (HEp-2) trägt und die weitere Membran eine Linienblotmembran ist, auf die aufgereinigte, doppelsträngige DNA aufgebracht ist.

24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Material der Basismembran Nitrozellulose ist und das Material der weiteren Membran positiv geladenes Nylon ist.

25. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Basismembran eine Westernblotmembran ist, die das Antigenspektrum von Borrelia burgdorferi trägt und die weitere Membran eine Linienblotmembran ist, auf die mindestens ein aufgereinigtes oder rekombinant hergestelltes Antigen aus der Gruppe p100/83, p58, p41, bmp A, p4li, Osp B, Osp A, Osp C, p18 und pl7 aufgebracht ist.

26. Vorrichtung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens fünf Antigene aufgebracht sind.

27. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß es die Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 26 enthält.

28. Kit nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Kit zur Durchführung eines in vitro-Verfahrens zur immunologischen Diagnose von Krankheiten geeignet ist.