DE20213551U1 - Elisa-Kit zum Nachweis von Prokollagenase 3 in Körperflüssigkeiten und Zellkulturüberständen - Google Patents

Elisa-Kit zum Nachweis von Prokollagenase 3 in Körperflüssigkeiten und Zellkulturüberständen

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Description

ELISA-Kit zum Nachweis von Prokollagenase 3 in Körperflüssigkeiten und Zellkulturüberständen
Die Erfindung betrifft einen ELISA-Kit zum Nachweis von Prokollagenase 3 in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Serum und Gelenkflüssigkeit des Menschen sowie in Zellkulturüberständen, und monoklonale Antikörper, die Prokollagenase 3 spezifisch erkennen.
Anwendungsgebiete sind die Medizin und hier besonders die medizinische Diagnostik.
Die enzyme-linked immunosorbend assay (ELISA)-Technik ist gegenwärtiger Technologiestandard in klinischen Labors. Mit dieser Technologie können u.a. Markerproteine für bestimmte Krankheiten in Körperflüssigkeiten von Patienten bestimmt werden.
Matrix Metalloproteinasen (MMPs) bilden eine Familie aus sezernierten und membrangebundenen Endoproteinasen, die extrazelluläre Matrixproteine hydrolisieren (Nagase, H. and Woessner, F. Jr., J. Biol. Chem. 1999, 274, 21491-21494). Auf der Grundlage ihrer bevorzugten Substrate und struktureller Merkmale kann man MMPs in Kollagenasen, Gelatinasen, Stromelysine und Membran-Typ Metalloproteasen einteilen.
Kollagenase 3 (MMP-13) wird von Zellen als inaktives Zymogen , der Prokollagenase 3 (Pro-MMP-13), freigesetzt und extrazellulär durch die Abspaltung eines Propeptids aktiviert.
Sowohl Kollagenase 3 als auch Prokollagenase 3 sind typischerweise im ausdifferenzierten, adulten Gewebe nicht nachweisbar. Ihr Vorkommen ist jedoch im Zusammenhang mit einer ganzen Reihe von destruktiven Krankheitsbildern beschrieben: Bei der Ausbildung von Brustcarcinomen (Nielsen BS et al., Cancer Res.
2001 61:7091-7100), Rheumatoider Arthritis (Westhoff CS et al., Arthritis Rheum. 1999 42:1517-1527) und Osteoarthrose (Shlopov BV et al. Arthritis Rheum. 1997 40:2065-2074) ist der Gehalt an Prokollagenase 3-mRNA in den betroffenen Gewebetypen stark hochreguliert. Diese Erkenntnisse machen deutlich, dass
• ·
Prokollagenase 3 ein für die medizinische Diagnostik hochinteressantes Markerprotein ist.
Bisher existieren jedoch für keinen Krankheitsverlauf, auch nicht für Rheumatoide Arthritis, Untersuchungen zum tatsächlichen Gehalt von Prokollagenase 3 in Körperflüssigkeiten, wie Serum oder Gelenkflüssigkeit, da bis dato keine zufriedenstellende technologische Lösung auf dem Markt verfügbar war, die solche Messungen erlaubt hätte.
Zur Zeit werden zwei Produkte angeboten, mit denen prinzipiell der Gehalt an Prokollagenase 3 bestimmt werden kann.
1. Biotrak® Matrix Metalloproteinase-13 ELISA system
Der erste Test, das Biotrak Matrix Metalloproteinase-13 ELISA system, ist für die Körperflüssigkeiten Serum und Plasma validiert. Das Problem des Testes ist die sehr geringe Sensitivität. Außerdem ist der Test nicht für Untersuchungen von Gelenkflüssigkeit validiert und kann somit für diesen Zweck nicht verwendet werden.
2. Quantikine pro-MMP-13 Immunoassay
Das zweite Testsystem auf dem Markt ist ausschließlich für den Gebrauch in der Zellkultur bestimmt und kann somit nicht für Untersuchungen von Prokollagenase 3 in Körperflüssigkeiten eingesetzt werden.
Der Erfindung lag demzufolge die Aufgabe zugrunde, einen ELISA-Kit zur Verfügung zu stellen, der sich im Gegensatz zu den auf dem Markt befindlichen Tests durch eine hohe Sensitivität auszeichnet und sowohl für den Nachweis der Prokollagenase 3 in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Serum und Gelenkflüssigkeit des Menschen, als auch in Zellkulturüberständen geeignet ist.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.
Der erfindungsgemäße ELISA-Kit zum Nachweis von Prokollagenase 3 umfaßt in separater Verpackung wenigstens:
a) einen festen Träger mit daran gebundenen monoklonalen Antikörpern, die sensitiv und spezifisch humane Prokollagenase 3 binden;
b) humane rekombinante Prokollagenase 3 als Standard zur quantitativen Bestimmung dieses Enzyms in Körperflüssigkeiten und Zellkulturüberständen;
c) einen Puffer zum Herstellen einer Standardreihe der rekombinanten Prokollagenase 3;
d) einen Puffer zum Verdünnen der zu untersuchenden Proben;
e) ein detektierbar markiertes Konjugat, das an Prokollagenase 3 bindet; und
f) ein Substrat, das die Sichtbarmachung des detektierbar markierten Konjugats erlaubt,
wobei es sich bei den unter a) genannten monoklonalen Antikörpern vorzugsweise um Anti-MMP-13 Klon M34 (mouse) handelt, und besonders bevorzugt um monoklonale Antikörper, die von dem Hybridom mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2572 gebildet werden.
Als detektierbar markiertes Konjugat wird entweder eine Kombination von zwei Komponenten eingesetzt, wobei es sich bei der ersten Komponente um biotinylierte Antikörper handelt, die an Prokollagenase 3 binden; und als zweite Komponente um ein hochpolymeres Streptavidin-Konjugat, das an die biotinylierten Antikörper bindet.
Alternativ dazu können auch konjugierte Antikörper eingesetzt werden, die an Prokollagenase 3 binden.
Die Antikörper, die als Konjugat fungieren, können monoklonale und/oder polyklonale Antikörper sein.
Humane rekombinante Prokollagenase 3, die in eukaryontischen Zellen (Sf9-Zellen) exprimiert wurde, wird als Standard zur quantitativen Bestimmung der Prokollagenase 3 in Körperflüssigkeiten und Zellkulturüberständen eingesetzt. Sie liegt entweder in Lösung oder in gefriergetrockneter Form vor, in der sie mehrere Monate ohne Qualitätsverlust haltbar ist. Bei Vorliegen in gefriergetrockneter Form muß die rekombinante Prokollagenase 3 vor Benutzung zunächst durch Zugabe von destilliertem Wasser rekonstituiert werden.
Der für die Verdünnung von zu untersuchenden Proben vorgesehene Puffer enthält neben blockierenden und stabilisierenden Substanzen unter anderem Natriumeitrat. Es zeigte sich überraschenderweise, dass dieses Reagenz für die Vorbereitung von Serum des Menschen zur Messung von Prokollagenase 3 besonders gut geeignet ist.
Der Puffer zum Herstellen einer Standardreihe der rekombinanten Prokollagenase 3 zur Messung dieses Markers in Serum enthält humanes Serum.
Als feste Träger werden vorzugsweise Mikrotiterplatten verwendet, an die der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper gebunden ist. Diese Mikrotiterplatten werden so produziert, dass sie mehrere Monate ohne Qualitätsverlust gelagert werden können.
Gegenstand der Erfindung sind auch monoklonale Antikörper, die Prokollagenase 3 spezifisch erkennen und binden, wobei diese monoklonalen Antikörper von der Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2572 produziert werden bzw. Eigenschaften wie die monoklonalen Antikörper aus der Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2572 aufweisen.
Zur Erfindung gehören ebenso Antikörper, die Eigenschaften wie die monoklonalen Antikörper aus der Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2572 aufweisen, die jedoch biochemisch oder molekularbiologisch verändert oder synthetisch sein können, wobei dem Antikörper ggf. Teile, die für die Erkennung der Prokollagenase 3 nicht notwendig sind, ganz oder teilweise fehlen bzw. diese Teile durch andere ersetzt sind.
Die Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2572 ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
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Durch den erfindungsgemäßen ELISA-Kit wird der Nachweis von Prokollagenase 3 in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Serum und Gelenkflüssigkeit des Menschen, sowie in Zellkulturüberständen mit hoher Sensitivität ermöglicht und damit dieser potentielle Krankheitsmarker der medizinischen Diagnostik besser zugänglich gemacht.
Im Vergleich zu dem Biotrak® Matrix Metalloproteinase-13 ELISA system ist die Sensitivität des erfindungsgemäßen ELISA-Kits um den Faktor fünf höher. Bei Untersuchungen von humanem Serum mit dem erfindungsgemäßen ELISA-Kit läßt sich die Sensitivität sogar auf mehr als zehnfach steigern. In Zahlen ausgedrückt, liegt die untere Nachweisgrenze des ELISAs bei 6 pg Prokollagenase 3 / ml Probe.
Die bei der Messung ermittelte Standardkurve durch Untersuchung einer mitgeführten humanen rekombinanten Prokollagenase 3 ist über den gesamten Messbereich linear und erlaubt eine schnelle Berechnung des Kollagenasegehaltes in Proben mit Hilfe der dem Standardverlauf zugrunde liegenden Regressionsgeraden. Ein weiterer entscheidender Vorteil ist, dass der ELISA-Kit im Kühlschrank gelagert werden kann, was die Handhabbarkeit und Verbraucherfreundlichkeit wesentlich verbessert.
Der erfindungsgemäße ELISA-Kit zum Nachweis von Prokollagenase 3 weist insgesamt für den Endverbraucher eine mindestens einmonatige Haltbarkeit auf. Die Produktion erfolgt nach Standards der EN 46001 und EN ISO 9001. Der ELISA-Kit bietet erstmals die Möglichkeit zur Untersuchung von Gelenkflüssigkeit.
Die Erfindung soll nachstehend durch Beispiele und Abbildungen näher erläutert werden.
Beispiel 1: Herstellung und Screening der monoklonalen Antikörper
Zur Immunisierung wurden Mäuse verwendet. Als Antigen diente humane rekombinante Prokollagenase 3, die in Sf9-Zellen exprimiert wurde. Das Antigen wurde folgendermaßen vorbereitet: 50 &mgr;g MMP-13 in 100 &mgr;&idiagr; PBS + 100 &mgr;&idiagr; 6&Mgr; Harnstoff wurden vorgelegt. Zu dieser Lösung wurden 100 &mgr;&idiagr; CFA oder IFA gegeben.
Die Injektion wurde nach folgendem Schema durchgeführt:
Tag 0: 50 &mgr;g MMP-13 intraperitoneal in CFA
Tag 13: 50 &mgr;g intraperitoneal in IFA
Tag A\:5Q\ig intravenös in 1 ml PBS
Tag 44: Hybridisierung von Pre-Lymphozyten mit Milz- und SP 2/0 Myelomzellen.
Es wurden drei Hybridisierungen aus ein und derselben Milz mit verschiedenen Lymphozytenmengen durchgeführt. Die dritte Hybridisierung war erfolgreich.
Überstände der ausgewachsenen Hybridome wurden im ELISA getestet. Dazu wurden 100 &mgr;&idiagr; rekombinante humane Prokollagenase 3 (1 &mgr;g/ml in PBS) in den Näpfen einer Titerplatte über Nacht bei 4 0C immobilisiert und nach 3 Wasch-Schritten (PBS mit 0,05 % Tween® 20) mit einem Blockierungspuffer (1 % BSA in PBS) zwei Stunden blockiert. Jeweils 50 &mgr;&idiagr; der Zellkulturüberstände sowie Positiv- und Negativkontrollen wurden für eine Stunde (37 0C) in die Näpfe gegeben. Nach dieser Inkubation wurde die Platte dreimal gewaschen und für eine weitere Stunde (37 0C) 100 &mgr;&idiagr; Anti-Maus IgG(H+L)-POD-Konjugat zugegeben. Nach weiteren fünf Waschungen wurde der POD-Gehalt in den Näpfen mit je 100 &mgr;&idiagr; TMB Substrat (20 min, RT) detektiert. Die Reaktion wurde mit 50 &mgr;&idiagr; 2 M H2SO4 gestoppt und die Absorption bei 450 nm gemessen.
Die im ELISA positiven Hybridomüberstände wurden bis zur Monoklonalität kloniert und rekloniert. Es wurden 5 unabhängige monoklonale Antikörper erhalten, aus denen insgesamt 12 Subklone mit teilweise veränderten Affinitäten gewonnen wurden. Eine Hybridomzellinie, die die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper Anti-MMP-13 Klon M34 (mouse) produziert (IgGl), wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) in Braunschweig unter der Nummer DSM ACC2572 am 27.08.2002 hinterlegt.
Beispiel 2: Durchführung des ELISAs
Das Prinzip des ELISAs ist in Abbildung 1 dargestellt. Zur Durchführung des ELISAs wird aus der humanen rekombinanten Prokollagenase 3 eine Verdünnungsreihe als Standard erstellt, die die rekombinante Prokollagenase 3 in folgenden Konzentrationen enthält: 2000 pg/ml, 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,25 pg/ml, 0 pg/ml. Wenn der Prokollagenase 3 Gehalt in Serum bestimmt werden soll, wird die Standardverdünnung mit einem speziellen Puffersystem hergestellt, das 33 % humanes Serum enthält. Jeweils 100 &mgr;&idiagr; dieser Standardverdünnungen werden in Doppelbestimmung in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte, an die monoklonale Antikörper aus der Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2572 gebunden sind, pipettiert. Die zu messenden Proben (Zellkulturmedium, Gelenkflüssigkeit oder Serum) werden mit dem für die Probenvorbereitung
♦ *
vorgesehenen Puffer verdünnt. Von den verdünnten Proben werden dann ebenfalls jeweils 100 &mgr;&idiagr; in Doppelbestimmung aufgetragen.
Nach 90 Minuten Inkubation auf einem Schüttler bei Raumtemperatur wird die Mikrotiterplatte mit dem Waschpuffer vier Mal gewaschen und danach durch Ausschlagen auf Papierhandtüchern die verbliebene Flüssigkeit entfernt. Es folgt der Eintrag von jeweils 100 &mgr;&idiagr; Detektionslösung 1, die biotinylierte Antikörper enthält, in alle benutzten Wells der Mikrotiterplatte. Hierbei handelt es sich entweder um polyklonale Antikörper oder aber um einen monoklonalen Antikörper oder einen Cocktail aus mehreren monoklonalen Antikörpern. Nach weiteren 90 Minuten Inkubation wird die Mikrotiterplatte wiederum vier Mal gewaschen und auf einem Papiertuch ausgeschlagen. Die Detektionslösung 2, bestehend aus einem Streptavidin-Peroxidasekonjugat und einem Verdünnungspuffer, wird gemäß Anweisung hergestellt und wiederum jeweils 100 &mgr;&idiagr; in die entsprechenden Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettiert. Es folgt eine weitere Inkubation von 30 Minuten. Danach wird die Mikrotiterplatte sechs Mal gewaschen und ausgeschlagen, mit 100 &mgr;&idiagr; pro Vertiefung Substratlösung (Tetramethylbenzidin) versehen und im Dunkeln für 15 Minuten inkubiert. Nach Ablauf der Zeit werden 100 &mgr;&idiagr; Stopplösung (0,5 M Schwefelsäure) den Vertiefungen zugesetzt und die Mikrotiterplatte bei 450 nm in einem Mikrotiterplattenreader gemessen. Die Intensität der optischen Dichte entspricht dem Gehalt an Prokollagenase 3.
Beispiel 3: Untersuchung von Körperflüssigkeiten mit dem ELISA-Kit
In Abbildung 2 werden die Ergebnisse der Untersuchung von Serum (2A) und Gelenkflüssigkeit (2B) von Patienten mit diagnostizierter Osteoarthrose dargestellt. Der ELISA-Kit detektiert unterschiedliche Konzentrationen in diesen Proben. Es zeigt sich, dass etwa 20 % der Serumproben und 40 % der Gelenkflüssigkeitsproben Prokollagenase 3 positiv sind. In Abbildung 3 sind Messergebnisse in Patientenseren mit diagnostizierter rheumatischer Erkrankung dargestellt. Auch hier detektiert der ELISA-Kit in etwa 20 % der Fälle einen erhöhten Prokollagenase 3 Gehalt in den Proben.
Beim direkten Vergleich zwischen dem erfindungsgemäßen ELISA-Kit und dem Biotrak® Matrix Metalloproteinase-13 ELISA system zeigt sich, dass nur der
beanspruchte ELISA-Kit in den untersuchten Proben in der Lage ist, Prokollagenase 3 zu detektieren (Abbildung 4).
Legende zu den Abbildungen
Abbildung 1: Prinzip des Nachweisverfahrens
Schritt 1: Inkubation von Standards oder Proben auf der Titerplatte. Spezifische Bindung von Prokollagenase 3 (MMP-13) (Dauer: 90 Minuten)
Schritt 2: Detektion der gebundenen Prokollagenase 3 (MMP-13) mit biotinyliertem Antikörper (Dauer: 90 Minuten) Schritt 3: Zugabe von Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Dauer: 30 Minuten) Schritt 4: Farbentwicklung nach Zugabe von TMB-Substrat (Dauer: 15 Minuten) Abbildung 2A:
Messung des Gehaltes an MMP-13 im Serum von Patienten mit diagnostizierter Osteoarthrose
Abbildung 2B:
Messung des Gehaltes an MMP-13 in der Gelenkflüssigkeit von Patienten mit diagnostizierter Osteoarthrose.
Abbildung 3:
Messung des Gehaltes an MMP-13 im Serum von Patienten mit diagnostizierter rheumatischer Erkrankung. 18 % der Patienten sind im Test eindeutig positiv.
Abbildung 4:
Messung des Gehaltes an MMP-13 im Serum von Patienten mit diagnostizierten rheumatischen Erkrankungen. Die Messung der gleichen Proben wurden mit dem Biotrak® Matrix Metalloproteinase-13 ELISA system bzw. dem beanspruchten ELISA (InviLISA) durchgeführt. Das Produkt des Wettbewerbers ist nicht in der Lage, MMP-13 in der Konzentration bis zu 500 pg/ml in humanem Serum nachzuweisen.
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Claims (13)

1. ELISA-Kit zum Nachweis von Prokollagenase 3 in Körperflüssigkeiten, insbesondere in Serum und Gelenkflüssigkeit des Menschen, sowie in Zellkulturüberständen, umfassend in separater Verpackung wenigstens:
a) einen festen Träger mit daran gebundenen monoklonalen Antikörpern, die sensitiv und spezifisch humane Prokollagenase 3 binden;
b) humane rekombinante Prokollagenase 3 als Standard zur quantitativen Bestimmung dieses Enzyms in Körperflüssigkeiten;
c) einen Puffer zum Herstellen einer Standardreihe der rekombinanten Prokollagenase 3;
d) einen Puffer zum Verdünnen der zu untersuchenden Probe;
e) ein detektierbar markiertes Konjugat, das an Prokollagenase 3 bindet;
f) und ein Substrat, das die Sichtbarmachung des detektierbar markierten Konjugats erlaubt.
2. ELISA-Kit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den monoklonalen Antikörpern, die an den festen Träger gebunden sind, vorzugsweise um monoklonale Antikörper handelt, die von dem Hybridom mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2572 gebildet werden.
3. ELISA-Kit nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass
als detektierbar markiertes Konjugat eine Kombination von zwei Komponenten eingesetzt wird, wobei es sich bei der ersten Komponente um einen biotinylierten Antikörper handelt, der an Prokollagenase 3 bindet;
und als zweite Komponente ein hochpolymeres Streptavidin-Konjugat eingesetzt wird, das an die biotinylierten Antikörper bindet.
4. ELISA-Kit nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass als detektierbar markiertes Konjugat ein konjugierter Antikörper eingesetzt wird, der an Prokollagenase 3 bindet.
5. ELISA-Kit nach Anspruch 1, 2 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper, die als Konjugat fungieren, monoklonale und/oder polyklonale Antikörper sind.
6. ELISA-Kit nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass die als Konjugate eingesetzten Substanzen mit allen üblichen Substanzen konjugiert werden können, vorzugsweise mit:
- Meerrettichperoxidase
- alkalischer Phosphatase.
7. ELISA-Kit nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die als Standard eingesetzte humane rekombinante Prokollagenase 3 in eukaryontischen Zellen exprimiert wurde und in Lösung oder lyophilisiert vorliegt.
8. ELISA-Kit nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass der Puffer zum Verdünnen der zu untersuchenden Körperflüssigkeiten und Zellkulturüberstände Natriumcitrat enthält.
9. ELISA-Kit nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Träger vorwiegend Mikrotiterplatten eingesetzt werden.
10. Monoklonale Antikörper, die Prokollagenase 3 spezifisch erkennen und binden, wobei diese monoklonalen Antikörper Eigenschaften wie die monoklonalen Antikörper aus der Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2572 aufweisen.
11. Monoklonale Antikörper nach Anspruch 10, wobei die monoklonalen Antikörper biochemisch oder molekularbiologisch verändert oder synthetisch sein können, wobei den Antikörpern ggf. Teile, die für die Erkennung der Prokollagenase 3 nicht notwendig sind, ganz oder teilweise fehlen bzw. diese Teile durch andere ersetzt sind.
12. Monoklonale Antikörper nach Anspruch 10-11, die von der Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2572 produziert werden.
13. Hybridomzelllinie mit der Hinterlegungsnummer DSM ACC2572.
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