DE202015009016U1

DE202015009016U1 - Pharmazeutische anti-TNFα Antikörperformulierung

Info

Publication number: DE202015009016U1
Application number: DE202015009016.8U
Authority: DE
Original assignee: Richter Gedeon Nyrt
Current assignee: Richter Gedeon Nyrt
Priority date: 2014-10-28
Filing date: 2015-10-28
Publication date: 2016-06-24
Anticipated expiration: 2025-10-29
Also published as: SI3212667T1; PT3212667T; EP3212667B1; EP3428189A1; US20220016244A1; HUP1400510A1; HUE040621T2; PL3212667T3; DK3212667T3; WO2016066688A1; DE202015009619U1; ES2703586T3; MX2017005575A; HRP20182006T1; CA2989930A1; TR201816518T4; RS58172B1; CY1120937T1; BR112017009021A2; DE202015009509U1

Abstract

Pharmazeutische Formulierung, die frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer ist und ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und nach Lagerung bei 5°C für 3 bis 6 Monate einen Gehalt an aggregierten Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 5 % aufweist; (b) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und nach Lagerung bei 25°C für 3 bis 6 Monate einen Gehalt an aggregierten Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 5 % aufweist; (c) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und nach Lagerung bei 25°C für 3 bis 6 Monate einen Gehalt an sauren Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 40 % aufweist; (d) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und unter Hitzestressbedingungen bei 55°C einen Gehalt an aggregierten Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 5 % aufweist; (e) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und unter Hitzestressbedingungen bei 55°C einen Gehalt an sauren Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 40 % aufweist; (f) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer Pufferlösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und eine verbesserte Stabilität von mindestens 6 Monaten bei einer Temperatur von etwa 5°C oder 25°C aufweist; und (g) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer Pufferlösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und nach Lagerung für 6 Monate bei einer Temperatur von etwa 5°C oder 25°C und/oder nachdem sie Hitzestress bei 55°C, Frost-Tau-Bedingungen bei –20°C bis 5°C und/oder mechanischem Stress ausgesetzt wurde, eine TNFα neutralisierende Aktivität von mindestens etwa 80 % beibehält.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der pharmazeutischen Formulierungen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung verbesserte lagerungsstabile flüssige pharmazeutische Antikörperformulierungen. Diese Erfindung wird anhand von stabilisierten flüssigen pharmazeutischen Formulierungen eines anti-TNFα Antikörpers veranschaulicht. Insbesondere offenbart die gegenwärtige Erfindung flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierungen von Adalimumab basierend auf alternativen Citrat/Phosphat-Puffersystemen und pharmazeutischen Behältern wie Autoinjektoren enthaltend dieselben.
Mehrere Dokumente werden in dem Text dieser Beschreibung zitiert. Auf die Inhalte aller zitierten Referenzen (umfassend Literaturangaben, erteilte Patente, veröffentlichte Patentanmeldungen wie in dieser Anmeldung zitiert und Herstellerangaben, Gebrauchsanleitungen, etc.) wird hiermit ausdrücklich verwiesen; jedoch gibt es kein Zugeständnis, dass eines der zitierten Dokumente tatsächlich Stand der Technik für die vorliegende Erfindung ist.
Hintergrund der Erfindung
Viele Proteine in Lösung sind marginal stabil, wobei sie sich Konformationsänderungen aufgrund von diversen Beanspruchungen während der Reinigung, Verarbeitung und Lagerung unterziehen. Solche Beanspruchungen können eine erhöhte Temperatur, Scherbelastung, Oberflächenadsorption und eine hohe Proteinkonzentration beinhalten (Arakawa T et al. 2006). Strukturell veränderte Proteine zeigen eine starke Tendenz zur Aggregation, was letztendlich oft zur Ausfällung führt. Irreversible Aggregation stellt ein Hauptproblem für die Langzeit-Lagerungsstabilität von therapeutischen Proteinen und für deren Transport und Gebrauch dar.
Als hochkomplexe Proteine sind Antikörper anfällig für eine Vielzahl von physikalischen und chemischen Abbauwegen. Antikörperaggregation tritt leicht während der Lagerung in einem flüssigen Zustand auf (Chen B et al. 2003), was zu einem Verlust von biologischer Aktivität und zunehmender Immunogenität führt, was wiederum schwerwiegende Nebenwirkungen wie einen anaphylaktischen Schock und andere Unverträglichkeiten verursachen kann. Daher ist es notwendig, pharmazeutische Antikörperformulierungen zu entwickeln, die Antikörperaggregation verhindern. Das wesentliche Ziel der Formulierung von Antikörpern als therapeutische Wirkstoffe ist die Aufrechterhaltung der Antikörperlöslichkeit, -stabilität und -bioaktivität, insbesondere bei hohen Antiköperkonzentrationen und die Kontrolle der Antikörperabbaurate, um eine annehmbare Haltbarkeit für den weltweiten Transport und die Lagerung bereitzustellen.
Zur Verhinderung der Bildung von Aggregaten, was unerwünschte Nebenwirkungen oder eine veränderte Halbwertszeit verursachen kann, enthalten pharmazeutische Antikörperformulierungen gewöhnlich einen oder mehrere Puffer, um einen gegebenen pH-Bereich aufrechtzuerhalten und ein isotonisches Mittel, um eine ähnliche Osmolarität wie physiologische Flüssigkeiten bereitzustellen. Es hat sich gezeigt, dass eine Vielzahl von Formulierungshilfsstoffen, darunter Zucker, Polyalkohole, Aminosäuren und Tenside, Antikörper unter verschiedenen Verarbeitungsbedingungen und während der Lagerung stabilisieren (Paborji M et al. 1994; Sarno MEC et al. 1990). Da die Aggregation in hohem Maße von der Antikörperkonzentration und dem pH-Wert der Formulierung abhängt, ist die Auswahl eines geeigneten Puffersystems ein entscheidender Schritt in Richtung einer stabilen Formulierung, insbesondere hinsichtlich hochkonzentrierter monoklonaler Antikörperformulierungen, die für subkutane (sc) Verabreichungen geeignet sind, wie in dem Fall von dem anti-TNFα Antikörper Adalimumab (HUMIRA^®, AbbVie Inc; 50 mg/mL), der in einem Citrat- und Phosphat-Puffer formuliert ist ( WO 2004/016286 ). Nachteile von Puffersystemen umfassend Citrat und/oder Phosphat sind hinsichtlich Schmerzen an der Injektionsstelle verursacht durch Citrat-Puffer (Kappelgaard A 2004, Frenken et al. 1993) und Phosphat-Puffer (Fransson et al. 1996) sowie pH-Instabilität von phosphatbasierten Puffern nach dem Einfrieren (Kolhe P et al. 2010) aus dem Stand der Technik wohlbekannt. Die Stabilität und Sicherheit eines pharmazeutischen Arzneimittelproduktes hängt daher von der Art und Konzentration des Puffermittels ab.
Bei chronischen Krankheiten wie beispielsweise rheumatoider Arthritis, Psoriasis oder Colitis ulcerosa, bei denen das Medikament letztendlich lebenslang verabreicht werden muss und Heim-(Selbst-)Medikation hinsichtlich Patienten-Compliance und Kostensenkung wünschenswert ist, ist die subkutane Verabreichung der bevorzugte Verabreichungsweg. Aufgrund des vom Gewebe ausgeübten Gegendrucks und des Injektionsschmerzes ist die Arzneimittelverabreichung durch den sc-Weg jedoch durch ein Injektionsvolumen von 1 mL bis zu 1,5 mL limitiert (Gatlin LA und Gatlin CAB 1999). Monoklonale Antikörperprodukte, die für die Behandlung von rheumatoider Arthritis, Psoriasis oder Colitis ulcerosa zugelassen sind, wie HUMIRA^®, erfordern relativ hohe klinische Dosen (5–700 mg pro Patient, verabreicht entweder als festgesetzte Dosis oder auf Basis des Körpergewichts (kg) oder der Körperoberfläche (m²), (Roskos LK et al. 2004).
Um diesen Anforderungen gerecht zu werden, insbesondere in Bezug auf die Eignung für eine (lebenslange) Selbstverabreichung und für die vollständige Ausschöpfung des klinischen Potenzials eines Antikörpers wie Adalimumab, besteht eine Notwendigkeit zur Entwicklung von flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierungen für hochkonzentrierte Antikörper mit verbesserter Lagerungsstabilität. Die vorliegende Erfindung adressiert die oben genannte Notwendigkeit durch Bereitstellen neuer hochkonzentrierter pharmazeutischer Formulierungen von Adalimumab mit verbesserter Stabilität in geeigneten pharmazeutischen Behältern (Autoinjektoren), die die Nachteile von Formulierungen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, überwinden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung offenbart eine stabile flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung, die frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer ist und eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, umfasst, wobei die stabile flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt besagte pharmazeutische Adalimumab-Formulierung nach Lagerung bei etwa 5°C für mindestens 6 Monate einen Aggregatgehalt von etwa weniger als 5 % +/– 0,5 % im Vergleich zu dem Aggregatgehalt, der zu Beginn der Experimente gemessen wurde.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt besagte pharmazeutische Adalimumab-Formulierung nach Lagerung bei etwa 25°C für mindestens 6 Monate einen Aggregatgehalt von etwa weniger als 5 % +/– 0,5 % im Vergleich zu dem Aggregatgehalt, der zu Beginn der Experimente gemessen wurde.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt besagte pharmazeutische Adalimumab-Formulierung nach Lagerung bei etwa 5°C für mindestens 6 Monate einen Gehalt an sauren Spezies von etwa weniger als 40 % +/– 0,5 % im Vergleich zu dem Gehalt an sauren Spezies, der zu Beginn der Experimente gemessen wurde.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt besagte pharmazeutische Adalimumab-Formulierung nach Lagerung bei etwa 25°C für mindestens 6 Monate einen Gehalt an sauren Spezies von etwa weniger als 40 % +/– 0,5 % im Vergleich zu dem Gehalt an sauren Spezies, der zu Beginn der Experimente gemessen wurde.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist besagte pharmazeutische Adalimumab-Formulierung eine verbesserte Stabilität von mindestens 3 bis 6 Monaten bei einer Temperatur von etwa 5°C oder 25°C auf. Grundlage der vorliegenden Erfindung ist die Beobachtung, dass flüssige, wässrige pharmazeutische Zusammensetzungen von Adalimumab, die frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer sind und die in L-Histidin basierten Puffersystemen formuliert sind, erhöhte Langzeitstabilität hinsichtlich Aggregatbildung und Bildung von sauren Spezies zeigen.
Wie durch HP-SEC-Analyse gezeigt und in den Tabellen, auf die in den Beispielen und Abbildungen verwiesen wird, demonstriert, haben die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen von Adalimumab, die frei von Phosphat-Puffer sind, einen Vorteil gegenüber der auf Citrat-Phosphat-Puffer basierten pharmazeutischen Adalimumab-Referenzformulierung, die gemäß der Formulierung des vermarkteten Produktes HUMIRA^® zusammengesetzt ist. Insbesondere waren die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Adalimumab-Formulierungen, die mit Histidin-Citrat- oder Histidin-Acetat-Puffer gepuffert wurden, stabiler als die Referenzformulierung von Adalimumab, die mit Citrat und Phosphat gepuffert wurde (#01).
In einer Ausführungsform zeigte die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung von Adalimumab, die mit Histidin-Citrat (#07) gepuffert wurde, nach Lagerung für 1, 2, 3, 6 Monate bei 5°C eine etwa 5 % bis 10 % geringere Menge an Aggregaten und nach entsprechender Lagerung bei 25°C etwa 10 % bis 20 % als die mit Citrat-Phosphat gepufferte pharmazeutische Referenzformulierung; siehe Tabellen 10 bis 13 in Beispiel 5.
In einer anderen Ausführungsform zeigte die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung von Adalimumab, die mit Histidin-Acetat (#10) gepuffert wurde, nach Lagerung für 1, 2, 3, 6 Monate bei 5°C eine etwa 5 % bis 10 % geringere Menge an Aggregaten und nach entsprechender Lagerung bei 25°C etwa 10 % bis 20 % als die mit Citrat-Phosphat gepufferte pharmazeutische Referenzformulierung; siehe Tabellen 10 bis 13 in Beispiel 5.
In einer Ausführungsform zeigte die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung von Adalimumab, die mit Histidin-Citrat (#07) gepuffert wurde, nach Lagerung für 3 bzw. 6 Monate bei 25°C eine etwa 2 % bis 5 % (ca. 4%) geringere Menge an sauren Spezies als die mit Citrat-Phosphat gepufferte pharmazeutische Referenzformulierung; siehe Tabelle 16 in Beispiel 7.
Gemäß einer anderen Ausführungsform zeigte die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung von Adalimumab, die mit Histidin-Acetat (#10) gepuffert wurde, nach Lagerung für 3 bzw. 6 Monate bei 25°C eine etwa 4 % bis 8 % (ca. 7 %) geringere Menge an sauren Spezies als die mit Citrat-Phosphat gepufferte pharmazeutische Referenzformulierung; siehe Tabelle 16 in Beispiel 7.
In einer Ausführungsform zeigte die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung von Adalimumab, die mit Histidin-Citrat (#07) gepuffert wurde, unter Hitzestressbedingungen (55°C) einen etwa 10 % bis 15 % (ca. 12,5 %) geringeren Aggregatgehalt im Vergleich zu der mit Citrat-Phosphat gepufferten pharmazeutischen Referenzformulierung; siehe Beispiel 6 und die Tabelle in .
In einer weiteren Ausführungsform zeigte die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung von Adalimumab, die mit Histidin-Acetat (#10) gepuffert wurde, unter Hitzestressbedingungen (55°C) einen etwa 4 % bis 8 % (ca. 7 %) geringeren Aggregatgehalt im Vergleich zu der mit Citrat-Phosphat gepufferten pharmazeutischen Referenzformulierung; siehe Beispiel 6 und die Tabelle in .
Gemäß einer anderen Ausführungsform zeigten die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen von Adalimumab, die mit Histidin-Citrat (#07) oder Histidin-Acetat (#10) gepuffert wurden, unter Hitzestress bei 55°C eine geringere Menge an sauren Spezies als die mit Citrat-Phosphat gepufferte pharmazeutische Referenzformulierung; siehe Beispiel 8 und die Tabelle in .
Zusätzlich hat in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die alternative pharmazeutische Adalimumab-Formulierung mindestens eine Eigenschaft ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: verbesserte Langzeitstabilität, bessere (Hitzestress-)Temperaturstabilität und/oder verminderte Bildung von Aggregaten und/oder verminderte Bildung von sauren Spezies im Vergleich zu einer Referenzformulierung umfassend ein Citrat-Phosphat-Puffersystem, vorzugsweise wie in den vorstehenden Ausführungsformen angegeben bzw. in den Beispielen und Abbildungen veranschaulicht.
Zusätzlich umfasst die erfindungsgemäße stabile flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung umfassend Adalimumab, welche frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer ist, zusätzlich einen Polyalkohol, ein Tensid und Natriumchlorid.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße stabile flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung umfassend Adalimumab, welche frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer ist, zusätzlich EDTA oder L-Arginin.
In verschiedenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können stabile flüssige (wässrige) pharmazeutische Formulierungen hergestellt werden, die 1–150 mg/mL an Adalimumab umfassen und einen Histidin-Citrat- oder Histidin-Acetat-Puffer mit einem gewünschten pH-Wert (z.B. in dem Bereich von pH 5 bis pH 5,5) aufweisen und weiter einen Polyalkohol (Mannitol 5–20 mg/mL), ein Tensid (Polysorbat 80 0,1–10 mg/mL), Natriumchlorid (5–7,5 mg/mL) mit oder ohne EDTA (1–50 mg/mL, vorzugsweise 10 mg/mL) oder L-Arginin (0,5–6,5 mg/mL) umfassen.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die pharmazeutische Adalimumab-Formulierung für eine parenterale Verabreichung hergerichtet, vorzugsweise für intravenöse Injektion oder für intramuskuläre Injektion, weiter bevorzugt für subkutane Verabreichung zur Verwendung in der Behandlung einer Krankheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Autoimmunerkrankungen und bösartigen Erkrankungen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine Fertigspritze oder einen Autoinjektor bereit, enthaltend eine der stabilen pharmazeutischen Adalimumab-Formulierungen, die in der vorliegenden Erfindung offenbart sind.
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung umfassend Adalimumab in einem vorgefüllten pharmazeutischen Behälter enthalten.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der vorgefüllte pharmazeutische Behälter eine Fertigspritze, ein Injektions-Pen, eine Ampulle, eine Flasche, ein Autoinjektor oder ein Infusionsbeutel, der die flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung gemäß des ersten Aspektes der Erfindung mit einem Gehalt an Adalimumab von etwa 20 mg oder etwa 40 mg oder etwa 80 mg umfasst.
Zum Beispiel stellt die Erfindung einen Autoinjektor bereit, umfassend eine flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung umfassend Adalimumab mit einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 150 mg/mL, einen Histidin-Citrat-Puffer oder einen Histidin-Acetat-Puffer, Natriumchlorid, Mannitol und Polysorbat 80, wobei der pH-Wert der pharmazeutischen Formulierung etwa pH 5,2 ist.
Im Einzelnen ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf:

[1] Eine Pharmazeutische Formulierung, die frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer ist und ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und nach Lagerung bei 5°C für 3 bis 6 Monate einen Gehalt an aggregierten Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 5 % aufweist; (b) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und nach Lagerung bei 25°C für 3 bis 6 Monate einen Gehalt an aggregierten Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 5 % aufweist; (c) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und nach Lagerung bei 25°C für 3 bis 6 Monate einen Gehalt an sauren Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 40 %, vorzugsweise weniger als 35 % aufweist; (d) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und unter Hitzestressbedingungen bei 55°C einen Gehalt an aggregierten Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 5 % aufweist; (e) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und unter Hitzestressbedingungen bei 55°C einen Gehalt an sauren Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 40 %, vorzugsweise weniger als 35 % aufweist; (f) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und eine erhöhte Stabilität von mindestens 6 Monaten bei einer Temperatur von etwa 5°C oder 25°C aufweist; und (g) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und sie ihre Aktivität des Neutralisierens der biologischen Aktivität von TNFα nach Lagerung für 6 Monate bei einer Temperatur von etwa 5°C und/oder 25°C, und/oder nachdem sie Hitzestress bei 55°C, Frost-Tau-Bedingungen/Stress bei –20°C bis 5°C und/oder mechanischem Stress ausgesetzt wurde, zu etwa 80 %, vorzugsweise zu etwa 85 %, weiter bevorzugt zu etwa 90 %, am meisten bevorzugt zu etwa 95 % beibehält.
[2] Formulierung nach [1], wobei die Konzentration des Antikörpers zwischen etwa 1 und 150 mg/mL liegt.
[3] Formulierung nach [1] oder [2], wobei die Konzentration des Antikörpers etwa 50 mg/mL ist.
[4] Formulierung nach einem von [1] bis [3], die zusätzlich einen Polyalkohol, ein Tensid und Natriumchlorid umfasst.
[5] Formulierung nach [4], wobei der Polyalkohol Mannitol ist und das Tensid Polysorbat 80 ist.
[6] Formulierung nach [5], die 5–20 mg/mL Mannitol, 0,1–10 mg/mL Polysorbat 80 und 5 bis 7,5 mg/mL Natriumchlorid enthält.
[7] Formulierung nach [6], die etwa 12 mg/mL Mannitol, etwa 1 mg/mL Polysorbat 80 und etwa 6,2 mg/mL Natriumchlorid enthält.
[8] Formulierung nach einem von [1] bis [7], die zusätzlich (f) L-Arginin umfasst.
[9] Formulierung nach einem von [1] bis [8], die zusätzlich EDTA umfasst.
[10] Formulierung nach einem von [1] bis [9], die zusätzlich für eine subkutane Einmal-Injektion geeignet ist und in einem pharmazeutischen Behälter enthalten ist.
[11] Vorgefüllter pharmazeutischer Behälter umfassend eine flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung mit einem pH-Wert von 5 bis 5,5, wobei die Zusammensetzung frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer ist und (a) Adalimumab; (b) einen Polyalkohol; (c) ein Tensid; (d) eine Pufferkomponente umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat; (e) Natriumchlorid umfasst.
[12] Behälter nach [11], wobei die Formulierung zusätzlich (f) L-Arginin umfasst.
[13] Behälter nach [11] oder [12], wobei die Formulierung zusätzlich EDTA umfasst.
[14] Behälter nach einem von [11] bis [13], wobei die Formulierung frei oder im Wesentlichen frei von Dicarbonsäuren, Monosacchariden, Oligosacchariden und/oder zusätzlichen Aminosäuren ist.
[15] Behälter nach einem von [11] bis [14], wobei die Formulierung (a) 20 bis 130 mg/mL Adalimumab; (b) 10–14 mg/mL Mannitol; (c) 0,1–5 mg/mL Polysorbat 80; (d) 0,1–0,5 mg/mL L-Histidin-HCl und 0,01–0,025 mg/mL L-Histidin-Base; (i) 0,1–1,5 mg/mL Zitronensäure-Monohydrat und 0,25–3,5 mg/mL Trinatriumcitrat-Dihydrat und/oder (ii) 0,1–0,5 mg/mL Natriumacetat-Trihydrat und 0,01–0,05 mg/mL Essigsäure; und (e) 6,0–6,4 mg/mL Natriumchlorid umfasst.
[16] Behälter nach [15], wobei die Formulierung zusätzlich (f) 0,5–6,5 mg/mL L-Arginin-Base und/oder (g) 1–50 mg/mL, vorzugsweise 10 mg/mL EDTA umfasst.
[17] Behälter nach einem von [11] bis [16], wobei die Formulierung 45 bis 55 mg/mL, vorzugsweise 50 mg/mL Adalimumab umfasst.
[18] Behälter nach einem von [11] bis [17], wobei die Formulierung zusätzlich für eine subkutane Einmal-Injektion geeignet ist.
[19] Behälter nach einem von [10] bis [18], der eine Fertigspritze, ein Injektions-Pen, eine Ampulle, eine Flasche, ein Autoinjektor oder ein Infusionsbeutel ist.
[20] Behälter nach einem von [10] bis [19], der unter Stickstoffschutzatmosphäre verschlossen wird.
[21] Behälter nach einem von [10] bis [19], wobei die Dosisstärke von Adalimumab 20, 40, 80 oder 160 mg ist.
[22] Set von mindestens zwei Behältern nach einem von [10] bis [21], wobei die Behälter eine unterschiedliche Dosisstärke von Adalimumab haben.
[23] Set von Behältern nach [22], wobei verschiedene Dosisstärken durch unterschiedliche Füllvolumen der gleichen Formulierung erzeugt werden.
[24] Set von Behältern nach [22] oder [23], wobei verschiedene Dosisstärken in den Fertigspritzen 20, 40 und/oder 80 mg sind.
[25] Formulierung nach einem von [1] bis [9], Behälter nach einem von [10] bis [21] oder Set von Behältern nach einem von [22] bis [24] zur Verwendung als ein Arzneimittel zur Verwendung in der Behandlung einer Erkrankung, in der TNFα-Aktivität schädlich ist.
[26] Formulierung, Behälter oder Set von Behältern zur Verwendung gemäß [25], wobei die Erkrankung, in der TNFα-Aktivität schädlich ist, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Autoimmun- oder entzündlichen Erkrankung.
[27] Formulierung, Behälter oder Set von Behältern zur Verwendung gemäß [25] oder [26], wobei die Formulierung so hergerichtet ist, um einem diesbezüglich bedürftigen menschlichen Patienten subkutan nach einem zweiwöchentlichen Dosierungsschema alle 13–15 Tage verabreicht zu werden.
[28] Behälter oder Set von Behältern zur Verwendung gemäß einem von [25] bis [27] mit einer Dosisstärke von Adalimumab von 20 oder 80 mg und wobei Adalimumab so hergerichtet ist, um mit einer Gesamtdosis von 20, 40 oder 80 mg verabreicht zu werden.
[29] Formulierung, Behälter oder Set von Behältern zur Verwendung gemäß einem von [25] bis [28], wobei die Formulierung in Kombination mit einem zusätzlichen Therapeutikum, das TNFα-Produktion oder -Aktivität hemmt, vorzugsweise Methotrexat, verabreicht werden soll.

Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden aus der Beschreibung und den nachfolgenden Beispielen offensichtlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
: Aggregatgehalt alternativer Adalimumab-Formulierungen in Relation zu der (den) Referenzformulierung(en) (ID Nrn.: #01–#03, für eine detaillierte Zusammenfassung der Pufferkomponenten siehe Tabellen 11 und 13). Die Stabilität der getesteten Adalimumab-Formulierungen hinsichtlich Aggregatbildung, gemessen durch HP-SEC während der Lagerung bei 5°C (A–C) und 25°C (D–E) über einen Zeitraum von 6 Monaten wird als relative %-Bereiche von aggregierten Peaks gezeigt. Proben-ID Nrn.: #01, #04, #07 und #10 repräsentieren Daten von Formulierungen ohne Zusätze (A, D), Proben-ID Nrn.: #02, #05, #08 und #11 repräsentieren Daten von EDTA-enthaltenden Formulierungen (B, E) und Proben-ID Nrn.: #03, #06, #09 und #12 repräsentieren Daten von L-Arginin(L-Arg)-enthaltenden Formulierungen (C, F; Stabilitätsdaten von nur 3 Monaten verfügbar für L-Arg-enthaltende Formulierungen). Histidin-Citrat (Proben-ID Nr.: #07) und Histidin-Acetat (Proben-ID Nr.: #10) gepufferte Adalimumab-Formulierungen haben offensichtlich eine geringere Aggregationsrate im Vergleich zu den auf Citrat-Phosphat basierten Referenzformulierungen. Von allen getesteten Adalimumab-Formulierungen sind solche basierend allein auf Citrat-Puffer am anfälligsten für Aggregation. Weder die Zugabe von EDTA (Proben-ID Nrn.: #02, #05, #08 und #11) noch von L-Arginin (Proben-ID Nrn.: #06, #09, #12; bei L-Arg nach 3 Monaten bestimmt) hat einen verhindernden oder stabilisierenden Effekt auf die Aggregatbildung in den alternativen Formulierungen. Schlussendlich ist die erfindungsgemäße, mit Histidin-Acetat gepufferte (gefolgt von Histidin-Citrat-Puffer) pharmazeutische Adalimumab-Formulierung eine stabilere Alternative zu der Adalimumab-Formulierung, die auf dem Markt verfügbar ist.
: Aggregatgehalt alternativer Adalimumab-Formulierungen unter Stressbedingungen (55°C) in Relation zu der Referenzformulierung. Die Aggregatbildung nach Erhitzen auf 55°C wurde in Formulierungen ohne Zusätze (B, Proben-ID Nrn.: #01, #04, #07 und #10) und mit EDTA (C, Proben-ID Nrn.: #02, #05, #08 und #11) unter Verwendung von HP-SEC bewertet. (A) Der Aggregatgehalt ist als Flächenprozent (linke Säulen) gezeigt. Die rechten Säulen (bezeichnet mit Δ) repräsentieren die Abweichungen von der Probe im Puffer der Referenzformulierung(en) (#01 und #02) für die ersten Ergebnisse bzw. die Differenz von dem ersten Ergebnis (Veränderung aufgrund von Beanspruchung) für die beanspruchten Proben. (A, B) Von allen getesteten Adalimumab-Formulierungen zeigte die pharmazeutische Formulierung #10, gepuffert mit Histidin-Acetat ohne einen zusätzlichen Stabilisator, die höchste Stabilität, d.h. die niedrigste Aggregationsrate bei 55°C. (A, C) Die Zugabe von EDTA zu dieser Pufferkombination erhöht offensichtlich die Aggregatbildung in der entsprechenden Formulierung während des Aufheizens auf 55°C (#11). Die pharmazeutische Adalimumab-Formulierung, die mit Histidin-Citrat gepuffert ist und EDTA enthält (#08), zeigt eine ähnliche Stabilität bei 55°C.
: Gehalt an sauren Verunreinigungen/Spezies alternativer Adalimumab-Formulierungen in Relation zu der (den) Referenzformulierung(en) (ID Nrn.: #01–#03), für eine detaillierte Zusammenfassung der Pufferkomponenten siehe Tabellen 15 und 17). Die Stabilität der getesteten Adalimumab-Formulierungen bezüglich der Bildung von sauren Spezies, gemessen durch SCX-HPLC während der Lagerung bei 5°C (A–C) und 25°C (D–F) über einen Zeitraum von 6 Monaten, wird als relative %-Bereiche von sauren Verunreinigungs-Peaks gezeigt. Proben-ID Nrn.: #01, #04, #07 und #10 repräsentieren Daten von Formulierungen ohne Zusätze (A, D), Proben-ID Nrn.: #02, #05, #08 und #11 repräsentieren Daten von EDTA-enthaltenden Formulierungen (B, E) und Proben-ID Nrn.: #03, #06, #09 und #12 repräsentieren Daten von L-Arginin(L-Arg)-enthaltenden Formulierungen (C, F; Stabilitätsdaten von nur 3 Monaten verfügbar für L-Arg-enthaltende Formulierungen). Alle getesteten, bei 5°C gelagerten alternativen pharmazeutischen Adalimumab-Formulierungen weisen offensichtlich einen leicht geringeren Gehalt an sauren Verunreinigungen auf als die Referenzformulierungen umfassend Citrat-Phosphat-Puffer, jedoch sind die Unterschiede nicht signifikant. Stabilitätsstudien bei 25°C zeigten, dass Histidin-Acetat und Histidin-Citrat basierte Formulierungen einen signifikant niedrigeren Gehalt an sauren Verunreinigungen nach Lagerung für 6 Monate im Vergleich zu den Formulierungen basierend auf dem Referenzpuffer (jeweils mindestens für 3 Monate im Fall von L-Arg-enthaltenden Formulierungen) aufweisen. Die getestete, mit Histidin-Acetat (#10) gepufferte pharmazeutische Adalimumab-Formulierung weist die höchste relative Reinheit auf (3,1 % geringerer Gehalt an sauren Verunreinigungen/Spezies im Vergleich zu der Referenzformulierung, wobei die allein auf Citrat-Puffer basierten Adalimumab-Formulierungen (#04) die höchste Menge an sauren Spezies zeigten. Weder die Zugabe von EDTA (Proben-ID Nrn.: #02, #05, #08 und #11) noch von L-Arginin (Proben-ID Nrn.: #03, #06, #09, #12; bei L-Arg nach 3 Monaten bestimmt) hat einen verhindernden oder stabilisierenden Effekt auf die Bildung von sauren Verunreinigungen in den alternativen Formulierungen.
: Gehalt an sauren Spezies alternativer Adalimumab-Formulierungen unter Stressbedingungen (55°C) in Relation zur der Referenzformulierung. Die Bildung von sauren Verunreinigungen stellt den Hauptabbauweg durch Deamidierung dar. Der Gehalt an saurer Verunreinigung nach Erhitzen auf 55°C wurde in Adalimumab-Formulierungen ohne Zusätze (B, Proben-ID Nrn.: #01, #04, #07 und #10) und mit EDTA (C, Proben-ID Nrn.: #02, #05, #08 und #11) unter Verwendung von SCX-HPLC bewertet. (A) Der Gehalt an saurer Verunreinigung ist als Flächenprozente gezeigt (linke Säulen). Die rechten Säulen (bezeichnet mit Δ) repräsentieren die Abweichungen von der Probe im Puffer des Referenzproduktes (#01, #02) für die ersten Ergebnisse bzw. die Abweichung von dem ersten Ergebnis (Veränderung aufgrund von Beanspruchung) für die beanspruchten Proben. (A, B) Unter allen getesteten pharmazeutischen Adalimumab-Formulierungen zeigt die mit Histidin-Acetat gepufferte Formulierung ohne einen zusätzlichen Stabilisator (Proben-ID Nr.: #10) die höchste Stabilität, d.h. die geringste Bildungsrate von sauren Spezies bei 55°C. (A–C) Alle verbleibenden Adalimumab-Formulierungen zeigen ähnliche Abbauraten für den untersuchten Stressfaktor.
: Biologische Aktivität alternativer Adalimumab-Formulierungen unter Stressbedingungen in Relation zu der Zeit bzw. zu der Referenzformulierung. Die Fähigkeit zur Verhinderung von Zelltod der Referenzlösung und der getesteten Proben-ID Nrn.: #01, #07, #09, #10 und #12 wurde anhand von L929 Zellen, die mit TNFα und Actinomycin-D unter mehreren verschiedenen Stressbedingungen behandelt wurden, d.h. nach 3 Monaten bei 5°C und 25°C, nach 6 Monaten bei 5°C und 25°C, nach einem Frost-Tau-Zyklus, nach mechanischem Stress sowie nach Hitzestress bei 55°C, verglichen. (A, B) In Relation zum Zeitpunkt 0 zeigte die mit Histidin-Acetat gepufferte Formulierung ohne einen zusätzlichen Stabilisator (Proben-ID Nr.: #10) die höchste Fähigkeit TNFα nach 6 Monaten bei 5°C und 25°C zu neutralisieren, gefolgt von Histidin-Acetat gepufferter Formulierung mit L-Arg (Proben-ID Nr.: #12). Weiter zeigte die mit Histidin-Acetat gepufferte Formulierung mit L-Arg (Proben-ID Nr.: #12) die beste Leistung nach 3 Monaten bei 5°C und 25°C, nach einem Frost-Tau-Zyklus sowie mechanischem Stress. Die mit Histidin-Citrat gepufferte Formulierung ohne einen zusätzlichen Stabilisator (Proben-ID Nr.: #07) zeigte die höchste TNFα-Neutralisierung nach 6 Monaten bei 5°C sowie nach Hitzestress bei 55°C. Alle verbleibenden Adalimumab-Formulierungen zeigten ähnliche Abbauraten hinsichtlich des untersuchten Stressfaktors. (A, C) In Relation zu der Referenzformulierung zeigte die mit Histidin-Acetat gepufferte Formulierung ohne einen zusätzlichen Stabilisator (Proben-ID Nr.: #10) die höchste Fähigkeit nach 6 Monaten bei 5°C und 25°C TNFα zu neutralisieren, gefolgt von Histidin-Citrat (Proben-ID Nr.: #07) nach 6 Monaten bei 5°C. Die mit Histidin-Acetat gepufferte Formulierung mit L-Arg (Proben-ID Nr.: #12) zeigte insgesamt die beste Leistung hinsichtlich der untersuchten Stressfaktoren. Die Experimente, die in zusammengefasst sind, wurden mit einem zweiten Satz von alternativen Adalimumab-Formulierungen durchgeführt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen langzeitstabile pharmazeutische Formulierungen eines anti-TNFα Antikörpers, insbesondere auf Histidin-Puffersystemen basiertes Adalimumab. Insbesondere werden gemäß der vorliegenden Erfindung Phosphat-Puffer-freie pharmazeutische Formulierungen von Adalimumab bereitgestellt, die mit Histidin-Citrat oder Histidin-Acetat-Puffer gepuffert sind und eine verbesserte Stabilität nach Lagerung bei 25°C über einen Zeitraum von mindestens drei bis sechs Monaten im Vergleich zu einer auf Citrat-Phosphat-Puffer basierten pharmazeutischen Referenzformulierung von Adalimumab, zusammengesetzt gemäß der Formulierung des vermarkteten Produktes HUMIRA^®, zeigen.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Beobachtung, dass flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierungen von Adalimumab, die frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer sind und die in L-Histidin basierten Puffersystemen formuliert sind, geeignete alternative pharmazeutische Adalimumab-Formulierungen mit verbesserter Langzeitstabilität hinsichtlich der Aggregatbildung und Bildung von sauren Spezies bereitstellen; siehe Beispiele 5 bis 9 und bis .
Zuvor wurden alternative Puffersysteme für Formulierungen von Adalimumab, u.a. umfassend Histidin entweder alleine oder in Kombination mit anderen Pufferkomponenten wie beispielsweise Acetat, Citrat und Phosphat vorgeschlagen; siehe Bender "Alternative buffers for pharmaceutical anti-TNFalpha monoclonal antibody formulations" (www.technik2day.net, veröffentlicht am 06. Februar 2013, Veröffentlichungsnummer PAPDEOTT002384). Jedoch wurden keine Daten oder Angaben hinsichtlich der Stabilität einer mit Histidin gepufferten Formulierung von Adalimumab angegeben, welche den Ausgangspunkt für die Entwicklung einer langzeitstabilen pharmazeutischen Formulierung von Adalimumab bilden könnten, d.h. eine konkrete Formulierung von der generischere, mit Histidin gepufferte Formulierungen abgeleitet werden könnten.
In der Tat wurden bisher kombinierte wässrige Pufferlösungen beinhaltend Histidin und zum Beispiel Acetat oder Citrat als nicht geeignet oder als minderwertig im Vergleich zu Histidin als die einzige Pufferkomponente oder in Kombination mit anderen verworfen. Zum Beispiel sind in der internationalen Anmeldung WO 2014/039903 auf Seite 88 und 89 in Tabelle H und H1 unter zahlreichen anderen, zwei Formulierungen, Formulierung 6 und 10, eines proprietären Adalimumab-Biosimilars mit Histidin-Acetat und Histidin-Citrat in einem Kurzzeitstabilitätstest für nur eine oder zwei Wochen beschrieben und für weitere Untersuchungen einer pharmazeutischen Formulierung unbeachtet gelassen. WO 2014/039903 lehrt eher die Vermeidung von beispielsweise Citrat aber die Verwendung von Histidin allein oder in Kombination mit einem Succinat-Puffer. Dennoch besteht in einer Ausführungsform die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung nicht aus einer Formulierung gemäß der Formulierung 6 oder 10 in Tabelle H und H1 auf Seite 88 und 89 WO 2014/039903 . Ebenso wird in einer neueren internationalen Anmeldung WO 2014/114651 Histidin als alleinige Pufferkomponente zum Formulieren von Adalimumab in einer pharmazeutischen Zusammensetzung unter Vermeidung von Acetat und Citrat gelehrt.
Daher konnten nur dank der gewissenhaften Arbeit und durchgeführten Experimente gemäß der vorliegenden Erfindung Parameter ermittelt werden, die ausreichend und notwendig sind um eine langzeitstabile Antikörperformulierung basierend auf einem kombinierten Histidin-Puffer zu erhalten, d.h. das Zusammenspiel von Histidin mit einer zweiten Pufferkomponente, insbesondere Citrat und Acetat, der pH-Wert und die Menge/Konzentration des Antikörpers, insbesondere Adalimumab in der Formulierung.
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung eine stabile flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung, die frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer ist und eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, vorzugsweise mit einem pH-Wert von etwa 5 bis 5,5 umfasst. Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(a) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und nach Lagerung bei 5°C für 3 bis 6 Monate einen Gehalt an aggregierten Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 5 % aufweist, siehe Beispiel 5 und –C;
(b) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und nach Lagerung bei 25°C für 3 bis 6 Monate einen Gehalt an aggregierten Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 5 % aufweist, siehe Beispiel 5 und –F;
(c) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und nach Lagerung bei 25°C für 3 bis 6 Monate einen Gehalt an sauren Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 40 % aufweist, siehe Beispiel 7 und –F;
(d) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und unter Hitzestressbedingungen bei 55°C einen Gehalt an aggregierten Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 5 % aufweist, siehe Beispiel 6 und ;
(e) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und unter Hitzestressbedingungen bei 55°C einen Gehalt an sauren Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 40 % aufweist, vorzugsweise weniger als 35 %, siehe Beispiel 8 und ;
(f) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und eine erhöhte Stabilität von mindestens 3 bis 6 Monaten bei einer Temperatur von etwa 5°C, 25°C und/oder 55°C aufweist, siehe Beispiele 5 bis 8 sowie bis ; und/oder
(g) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und nach Lagerung für 6 Monate bei einer Temperatur von etwa 5°C und/oder 25°C und/oder nachdem sie Hitzestress bei 55°C, Frost-Tau-Bedingungen bei –20°C bis 5°C und/oder mechanischem Stress ausgesetzt wurde, eine Aktivität bezüglich TNFα-Neutralisierung von etwa 80 %, vorzugsweise von etwa 85 %, weiter bevorzugt von etwa 90 %, am meisten bevorzugt von etwa 95 % beibehält; siehe Beispiele 9 sowie .

Die oben genannten Eigenschaften der Formulierung des Aufweisens eines bestimmten Gehalts an aggregierten und/oder sauren Spezies des Antikörpers und/oder des Aufweisens einer erhöhten Stabilität von etwa 3 bis 6 Monaten soll gemäß den Beispielen und, wenn nicht anders angegeben, im Vergleich zu der in Tabelle 6 gezeigten Referenzformulierung von Adalimumab bestimmt werden. Im Hinblick auf den Zeitrahmen kann die Eigenschaft erfüllt sein, wenn der Gehalt an aggregierten und/oder sauren Spezies des Antikörpers und/oder eine erhöhte Stabilität der Formulierung in absoluten Werten und/oder gegenüber der Referenzformulierung für 3, 4, 5 und/oder 6 Monaten gegeben ist. Vorzugsweise ist die Eigenschaft für die 3-monatige Dauer, weiter bevorzugt zusätzlich oder alternativ für die 6-monatige Dauer erfüllt. Weiterhin kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung eines, zwei, drei, vier, fünf oder sechs von einem der Merkmale (a) bis (f) und gegebenenfalls (g) in jeder Kombination oder alle von ihnen erfüllen. Zusätzlich oder alternativ kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung, insbesondere hinsichtlich Merkmal (f) und/oder (g) ein Stabilitätsprofil anzeigen, das nahezu identisch oder sehr ähnlich zu den in einer oder allen der bis angegebenen Profilen für Formulierungen mit der ID Nr. (#0..): 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 ist. Der Begriff "sehr ähnlich" bedeutet, dass sich die Stabilitätswerte einer pharmazeutischen Formulierung eines anti-TNFα Antikörpers, vorzugsweise Adalimumab basierend auf einem Zwei-Komponenten-Puffersystem umfassend Histidin, um nicht mehr als 50 %, vorzugsweise nicht mehr als 40 %, weiter bevorzugt nicht mehr als 30 %, noch weiter bevorzugt nicht mehr als 20 % und am meisten bevorzugt nicht mehr als 10 % oder 5 % von den (relativen) Werten für Formulierungen mit ID Nrn.: 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 unterscheiden, wenn sie hinsichtlich eines von den oben genannten Merkmalen (a) bis (f) und gegebenenfalls (g), insbesondere gegenüber der Referenzformulierung gemäß den anhängigen Beispielen analysiert werden. Selbstverständlich werden typischerweise die Werte eines gegebenen Kandidaten für eine pharmazeutische Antikörperformulierung mit derjenigen pharmazeutischen Formulierung mit ID Nr.: 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 verglichen, welche die meisten Wirkstoffe mit dem Kandidaten für eine pharmazeutische Formulierung gemein hat. In einer Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung zusätzlich einen Polyalkohol, vorzugsweise Mannitol; ein Tensid, vorzugsweise Polysorbat 80; und/oder ein Alkalisalz, vorzugsweise Natriumchlorid.
Wie hier verwendet, bezieht sich "pharmazeutische Formulierung" auf eine Formulierung eines pharmazeutisch aktiven Arzneimittels wie beispielsweise ein biologisch aktives Protein (z.B. anti-TNFα Antikörper Adalimumab), das für die Behandlung einer Krankheit oder Erkrankung nützlich ist und das für parenterale Verabreichung (einschließlich aber nicht limitiert auf intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung) und/oder Injektion in einen diesbezüglich bedürftigen menschlichen Patienten geeignet ist.
Die "pharmazeutische Formulierung" gemäß der vorliegenden Erfindung wird in solch einer Form hergestellt, sodass dem aktiven Inhaltsstoff erlaubt wird, effektiv zu sein und beinhaltet ausschließlich pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe, Verdünnungsmittel und andere Zusatzstoffe, die von Zulassungsbehörden als unbedenklich erachtet werden, und welche keine zusätzlichen Bestandteile enthält, die für den Patienten, dem die Formulierung verabreicht werden würde, toxisch sind.
Die hier verwendete Phrase "flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung" bezieht sich auf eine wie oben definierte pharmazeutische Formulierung in einem flüssigen Zustand unter Verwendung von Wasser als einem Lösungsmittel und umfasst ein pharmazeutisch aktives Arzneimittel in Kombination mit einem oder mehreren Hilfsstoffen. In einer weiteren Ausführungsform ist die erfindungsgemäße flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung eine wie oben definierte pharmazeutische Formulierung, die die Stabilität nach Lagerung aufrecht erhält (z.B. chemische und/oder physikalische Stabilität/und/oder biologische Aktivität) ohne Bedarf an Lyophilisierung, Sprühtrocknung und/oder Einfrieren.
Die Phrasen "frei" oder "im Wesentlichen frei", wie sie in der Offenbarung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, geben den Ausschluss eines rezitierten Elementes oder einer Gruppe von Elementen an und gegebenenfalls die Einbeziehung anderer Elemente von ähnlichem oder unterschiedlichem Charakter als die rezitierten Elemente, die im Wesentlichen nicht die grundlegenden oder neuen Eigenschaften des angegebenen Dosierungsschemas, des Verfahrens oder der Zusammensetzung verändern.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezieht sich im pharmakologischen Sinne eine "therapeutisch wirksame Menge" oder "wirksame Menge" eines Antikörpers auf eine in der Vorbeugung oder Behandlung einer Krankheit wirksame Menge für die Behandlung, für die der Antikörper wirksam ist.
Der hier verwendete Begriff "Adalimumab" bezieht sich auf den vollständig humanen rekombinanten monoklonalen IgG1 Antikörper, der an humanes TNF-alpha (hTNFα) bindet und der bei dem Chemical Abstract Service (CAS) unter der Registrierungsnummer 331731-18-1 registriert ist. Adalimumab besteht aus 1330 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 148 kDa, das in Abhängigkeit von der Glykosylierung des Moleküls variieren kann. Es wird durch rekombinante DNA-Technologie in Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) hergestellt. Es wurde von dem murinen monoklonalen Antikörper MAK195 unter Verwendung von gerichteter Selektion durch Phagen-Display abgeleitet. Der vollständig humane affinitätsgereifte Klon (Klon ID: D2E7) umfasst humane variable Regionen der leichten und schweren Kette, deren Aminosäuresequenzen in dem US-Patent Nr. 6,090,382 entsprechend der internationalen Anmeldung WO 97/29131 offenbart sind und eine humane IgG1 konstante Kappa Region. Jedes IgG1 Antikörpermolekül umfasst zwei Kappa Leichtketten und zwei humane IgG1 schwere Ketten. Jede leichte Kette besteht aus 214 Aminosäureresten und jede schwere Kette besteht aus 451 Aminosäureresten. Adalimumab bindet spezifisch an TNFα und neutralisiert die biologische Funktion von TNF durch Blockieren seiner Interaktion mit den p55- und p57-TNF-Rezeptoren der Zelloberfläche. Adalimumab wird durch Abbott Laboratories US (jetzt AbbVie Inc. US) als flüssige pharmazeutische Formulierung für subkutane Verabreichung unter dem Handelsnamen HUMIRA^® vermarktet; siehe auch internationale Anmeldung WO 2004/016286 . Adalimumab wurde in 2002 durch die US-Bundesbehörde für Lebens- und Arzneimittel-Überwachung (FDA) und 2003 durch die europäische Arzneimittel-Agentur (EMA) für die Behandlung von rheumatoider Arthritis zugelassen. Seitdem erhielt es zusätzliche Zulassung für die Behandlung von anderen TNF-vermittelten chronischen entzündlichen Erkrankungen einschließlich Psoriasisarthritis, polyartikuläre juvenile idiopathische Arthritis, Psoriasis, Plaque-Psoriasis, Spondylitis ankylosans (AS), axiale Spondyloarthritis ohne radiographischen Hinweis auf AS, Morbus Crohn, pädiatrischer Morbus Crohn und Colitis ulcerosa. Adalimumab kann alleine oder in Kombination mit Methotrexat (MTX) oder anderen nicht-biologischen, krankheitsverändernden antirheumatischen Arzneimitteln (disease modifying anti-rheumatic drugs, DMARDs) verwendet werden. Für die Behandlung von rheumatischen Krankheiten wird Adalimumab typischerweise durch subkutane Injektion von 40 mg jede oder alle zwei Wochen verabreicht. Es wird in Glasfläschchen, vorgefüllten Glasspritzen und als ein Autoinjektor (HUMIRA^® Pen) als eine sterile konservierungsmittelfreie Lösung für subkutane Verabreichung geliefert. Die Lösung von HUMIRA^® ist klar und farblos mit einem pH-Wert von etwa 5,2. Die Fertigspritzen und der Autoinjektor (Pen) umfassen 40 mg Adalimumab in 0,8 mL einer gepufferten Lösung aus Mannitol, Zitronensäure-Monohydrat, Natriumcitrat, Dinatriumphosphat-Dihydrat, Mononatriumphosphat-Dihydrat, Natriumchlorid und Polysorbat 80.
Weiterhin schließt der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Adalimumab" auch Proteine ein, die "biosimilar" zu Adalimumab sind gemäß der Arbeitsdefinition, die in der veröffentlichten, durch die FDA und die EMA aufgesetzten Richtlinie angegeben ist, welche ein biosimilares Produkt als eines definiert, das trotz kleiner Unterschiede in klinisch inaktiven Bestandteilen "sehr ähnlich" zu einem Referenzprodukt ist ("Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: Quality Issues (Revision 1)", EMA/CHMP/BWP/247713/2012 ab 22.05.2014; "Guidance for Industry – Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product" (ENTWURF ANLEITUNG), U.S. Gesundheitsministerium, Bundesbehörde für Lebensmittel- und Arzneimittel-Überwachung ab Februar 2012). In der Praxis kann es keine klinisch bedeutsamen Unterschiede zwischen dem Referenzprodukt und dem biosimilaren Produkt hinsichtlich Unbedenklichkeit, Reinheit und Wirksamkeit geben (Gesundheitsdienst (PHS) Art. §262). In anderen Worten ist eine biosimilare Form / ein biosimilares Protein von Adalimumab ein Antikörper, welcher von einer Zulassungsbehörde als "sehr ähnlich" zu dem Referenzprodukt HUMIRA^® basierend auf einem verkürzten Zulassungsantrag erachtet wird.
In einer Ausführungsform verwenden das erfindungsgemäße biosimilare Adalimumab-Protein und das Referenzprodukt HUMIRA^® den gleichen Wirkungsmechanismus oder die gleichen Wirkungsmechanismen für die in der vorgeschlagenen Kennzeichnung vorgeschriebene(n), empfohlene(n) oder vorgeschlagene(n) Bedingung oder Bedingungen, aber nur soweit der Wirkungsmechanismus oder die Wirkungsmechanismen für den Pharmawirkstoff von HUMIRA^® bekannt ist (sind).
In einer anderen Ausführungsform ist die Nutzungsbedingung oder sind die Nutzungsbedingungen, die für das erfindungsgemäße biosimilare Adalimumab-Protein vorgeschrieben, empfohlen oder vorgeschlagen ist bzw. sind, die gleichen wie in der durch die EMA bzw. FDA zugelassenen Zusammenfassung der Produktmerkmale (SMPC) und Etiketteninformation für HUMIRA^®. In einer Ausführungsform sind der Verabreichungsweg, die Dosierungsform und/oder -stärke des erfindungsgemäßen biosimilaren Adalimumab-Proteins die gleichen wie in der durch die EMA bzw. FDA zugelassene Zusammenfassung der Produktmerkmale und Etiketteninformation für HUMIRA^® empfohlen.
Der in der vorliegenden Offenbarung der Erfindung verwendete Begriff "Referenzprodukt" bezieht sich auf den FDA/EMA zugelassenen kommerziell erhältlichen anti-TNFα Antikörper Adalimumab von Abbott/AbbVie, welcher als "hochkonzentrierte Formulierung" für subkutane Verabreichung unter dem Handelsnamen HUMIRA^® vermarktet wird. Die flüssige pharmazeutische Formulierung umfasst 50 mg/mL Adalimumab gepuffert mit Citrat-Phosphat (Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat, Natriumphosphat-Dihydrat, Natriumcitrat, Zitronensäure-Monohydrat) bei etwa pH 5,2 und enthält zusätzlich Natriumchlorid, Mannitol, Polysorbat 80 und Wasser zu Injektionszwecken; siehe internationale Anmeldung WO 2004/016286 .
Die in der vorliegenden Offenbarung der Erfindung verwendeten Begriffe "pharmazeutische Referenzformulierung" oder "Referenzformulierung" beziehen sich auf eine pharmazeutische Formulierung umfassend den anti-TNFα Antikörper Adalimumab, der mit einem wie in Beispiel 1 (Tabelle 6, Proben-ID Nrn.: #01, #02, #03) der vorliegenden Erfindung offenbarten Citrat-Phosphat-Puffersystem formuliert ist. Entsprechend bezieht sich der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Referenzpuffer" auf das Puffersystem umfassend Citrat und Phosphat in der Zusammensetzung und Konzentration der oben definierten Referenzformulierung.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "anti-TNFalpha Antikörper" oder "anti-TNFα Antikörper" bezieht sich auf monoklonale Antikörper und Fragmente davon (Fab und/oder (Fab)₂ Fragmente, Fv Fragmente, einzelkettige Fv (scFv) Fragmente und dergleichen) sowie auf Fc-Fusionsproteine, die gegen Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (humanes TNFalpha, hTNFalpha, hTNFα, TNFα) gerichtet sind, einem humanen Zytokin, das als 17 kDa sekretierte Form und als 26 kDa membranassoziierte Form, die biologisch aktive Form, die aus einem Trimer von nicht kovalent gebundenen 17 kDa Molekülen zusammengesetzt ist, existiert (Pennica D et al. 1984). In einer besonderen Ausführungsform bezieht sich der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "anti-TNFalpha Antikörper" oder "anti-TNFα Antikörper" auf Adalimumab (CAS Nr. 331731-18-1), definiert durch die Aminosäuresequenz der variablen Regionen der schweren und leichten Kette wie in US Patent Nr. 6,090,382 bzw. der internationalen Anmeldung WO 97/29131 offenbart und auf biologisch ähnliche Formen/Proteine von Adalimumab. Zum Beispiel sind Varianten von anti-TNF Antikörpern wie beispielsweise Adalimumab, die wohl eine erhöhte Bindung zu dem FcRn-Rezeptor oder eine erhöhte Halbwertszeit im Vergleich zu dem nativen Antikörper zeigen, in der internationalen Anmeldung WO 2014/114651 beschrieben. Der Tumor-Nekrose-Faktor Alpha ist an systemischen Entzündungsprozessen beteiligt, die für viele der klinischen Manifestationen, die mit Autoimmunerkrankungen wie beispielsweise rheumatoider Arthritis, Spondylitis ankylosans, entzündlicher Darmerkrankung, Psoriasis, Hidradenitis suppurativa, Colitis ulcerosa und refraktärem Asthma assoziiert sind, verantwortlich sind. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Konzentration des Antikörpers zwischen 1–150 mg/mL, vorzugsweise zwischen etwa 20–130 mg/mL, weiter bevorzugt zwischen etwa 30–100 mg/mL, noch weiter bevorzugt zwischen 45–55 mg/mL. Am meisten bevorzugt ist die Konzentration des Antikörpers von etwa 50 mg/mL.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführten Experimente zeigten, dass eine flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer Pufferlösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat mit einem pH-Wert von 5 bis 5,5 fähig ist, etwa 80 %, vorzugsweise etwa 85 %, weiter bevorzugt etwa 90 %, am meisten bevorzugt etwa 95 % der biologischen Aktivität von TNFα nach Lagerung für 6 Monate bei einer Temperatur von etwa 5°C und/oder 25°C, und/oder nachdem sie Hitzestress bei 55°C, Frost-Tau-Bedingungen bei –20°C bis 5°C und/oder mechanischem Stress ausgesetzt wurde, zu neutralisieren. In anderen Worten behält das in einer erfindungsgemäßen flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung formulierte Adalimumab sogar nach zahlreichen Lagerungs- und Stressbedingungen im Wesentlichen seine Aktivität des Reduzierens der biologischen Aktivität von TNFα, wie in Beispiel 9 beschrieben, zu mindestens 80 % oder mehr im Vergleich zu einer Kontrolle, die solchen Bedingungen nicht ausgesetzt wurde, bei oder ist sogar noch fähig, die biologische Aktivität von TNFα vollständig aufzuheben. Zum Beispiel kann die mit Histidin-Citrat gepufferte Formulierung ohne zusätzliche Stabilisatoren (Proben-ID Nr.: #07) für 6 Monate bei 5°C oder 25°C gelagert werden und ist immer noch fähig mehr als 90 % von TNFα zu neutralisieren, wohingegen die Zugabe von L-Arg (Proben-ID Nr.: #09) zu der mit Histidin-Citrat gepufferten Formulierung ihre Frost-Tau-Stabilität und mechanische Stressstabilität weiter verbessert. Wie aus Beispiel 9 und entnommen werden kann, ist in der Tat jede erfindungsgemäße Adalimumab-Formulierung der Referenzformulierung von Adalimumab in mindestens einer der getesteten Lagerungs- und Stressbedingungen überlegen. Die Lagerungs- und Stressbedingungen, beinhaltend Frost-Tau-Bedingungen, Hitzestressbedingungen und mechanischen Stress, d.h. Bewegungsstudien, sind in den Beispielen beschrieben. Zum Beispiel kann Hitzestress angewendet werden, indem die Probe einer Temperatur von etwa 5°C und/oder 25°C ausgesetzt wird und/oder nachdem sie einer Hitzebehandlung bei 55°C für 10 Minuten unterzogen wurde, werden die Proben von 5°C bis –20°C innerhalb 30 min. gefroren und bei –20°C für 1 Stunde gehalten, dann von –20°C bis 5°C innerhalb von 2 Stunden aufgetaut, wobei der Frost- und Tau-Zyklus 5 und 10 mal wiederholt wird und der mechanische Stress kann durch Schütteln der Proben für 24 Stunden bei 25°C auf einem planaren Schüttler mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 400 RPM angewendet werden. Vorzugsweise ist die Konzentration von Adalimumab in der Testformulierung im Wesentlichen die gleiche wie in den Beispielen verwendet, d.h. 50 mg/mL. Die TNFα-neutralisierende Aktivität einer erfindungsgemäßen flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung wird vorzugsweise wie in den Beispielen veranschaulicht bestimmt, d.h. durch den Effekt der Inhibierung des Zelltods von L929-Zellen, die mit TNFα und Actinomycin-D im Laufe der Zeit behandelt wurden und/oder im Vergleich zu der in Tabelle 6 gezeigten Referenzformulierung von Adalimumab, wobei zahlreiche Verdünnungen einer erfindungsgemäßen flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung wie in Beispiel 9 beschrieben hergestellt werden.
Der hier verwendete Begriff "Hilfsstoff" schließt therapeutisch inaktive Inhaltsstoffe der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierung ein. Abhängig von ihren individuellen Eigenschaften können die Hilfsstoffe in einer pharmazeutischen Formulierung für eine große Auswahl von Anwendungen enthalten sein, zum Beispiel Puffermittel zur Kontrolle des Puffermittel-pH-Wertes, Kohlenhydrate als Hilfsstoffe zur Lyophilisierung, Polymere zur Erhöhung der Viskosität der Lösung, Salze und Zucker zum Stabilisieren der Proteine und um als Tonizitätsmittel zu agieren um physiologische Tonizität und Osmolarität zu erhalten, Tenside zur Inhibierung der Adsorption von Proteinen an Grenzflächen, Konservierungsmittel zur Inhibierung des mikrobiellen Wachstums, Antioxidantien, Gefrierschutzmittel oder Verdünnungsmittel. Es hat sich gezeigt, dass eine Vielzahl von Formulierungshilfsstoffen Antikörper unter verschiedenen Prozessbedingungen und während der Lagerung stabilisieren, umfassend Zucker wie beispielsweise Saccharose, Laktose oder Dextrose, Polyalkohole (auch bekannt als Zuckeralkohole) wie beispielsweise Mannitol oder Sorbitol, Salze wie beispielsweise Natriumchlorid, Aminosäuren wie beispielsweise Arginin, Histidin, Lysin, Asparaginsäure oder Glutaminsäure, Tenside und Wasser als Lösungsmittel (Paborji M et al. 1994; Sarno MEC et al. 1999).
Die hier verwendeten Begriffe "Puffer" oder "gepufferte Lösung" beziehen sich auf eine wässrige Lösung bestehend aus einer Mischung aus einer schwachen Säure und ihrer konjugierten Base oder einer schwachen Base und ihrer konjugierten Säure, die Schwankungen im pH-Wert widersteht. Es ist bekannt, dass die Art und Konzentration eines Puffermittels eine Auswirkung auf die Stabilität von Proteinen haben kann (Wang W 1999). Daher ist die Auswahl des Puffermittels entscheidend, um eine pH-Kontrolle und gewünschte Stabilisierung der Antikörperformulierung zu erreichen. Bezüglich der Antikörperaggregation spielt die Wahl eines geeigneten Puffersystems und der pH-Wert eine wesentliche Rolle, da dies die Nettoladung der Protein-/Antikörperstruktur und anschließende elektrostatische Interaktionen (Chi EY et al. 2003) in Relation zu zunehmendem Säuregehalt oder zunehmender Basizität der Lösung bestimmt. Die zunehmende Ladungsabstoßung zwischen den geladenen Gruppen innerhalb des Antikörpers in Lösung kann seinen gefalteten oder nativen Zustand destabilisieren (Vermeer AWP und Norde W 2000). Generell scheinen schwach saure Bedingungen (pH 4,5–5,5) optimal für die meisten Antikörper zu sein, da die Aggregation in der Nähe von einem neutralen pH-Wert oder in der Nähe des isoelektrischen Punktes (pI) zunimmt (Moore JM et al. 1999, Szenczi A et al. 2006, Wan HZ et al. 2001). Es ist generell ratsam, den pH-Wert der Formulierung durch mehr als eine Einheit von dem isoelektrischen Punkt des Proteins zu unterscheiden. IgG Antikörper aus Säugetieren haben typischerweise relativ hohe pIs in dem Bereich von pH 6–9. Daher werden die meisten pH-Werte von Formulierungen in einem sauren Bereich gewählt (pH 4–6), um den Antikörper in einem löslicheren kationischen Zustand zu halten.
Die flüssige "hochkonzentrierte Formulierung" (50 mg/mL) zur subkutanen Verabreichung des derzeit am Markt erhältlichen entzündungshemmenden Medikaments Adalimumab (HUMIRA^®, AbbVie Inc, WO 2004/016286 ) wird mit Citrat und Phosphat bei pH 5,2 gepuffert. Die Nachteile von pharmazeutischen Formulierungen, die auf Puffersystemen umfassend Citrat und/oder Phosphat basiert sind, sind hinsichtlich durch Citrat-Puffer (Kappelgaard A 2004, Frenken et al. 1993) und Phosphat-Puffer (Fransson et al. 1996) induzierten Schmerz an der Injektionsstelle aus dem Stand der Technik bekannt. In einigen wenigen Fällen hat sich Phosphat-Puffer als schädlich erwiesen. Zum Beispiel beschleunigte Phosphat-Puffer die Deamidierung eines IgG1 im Verhältnis zu Citrat-Puffer bei sowohl pH 6,5 als auch 7,0 während der Lagerung bei 25°C (Zheng JY und Janis LJ 2005). Und wie von Son und Kwon 1995 gezeigt werden konnte, werden etwa 38 % des hEGF bei 0,5 mg/L in Tris-HCl bei pH 7,0 im Verlaufe der Inkubation bei 60°C für 2 Tage deamidiert und die Mengen an deamidiertem hEGF erhöhen sich auf 83, 63, 52, 51 bzw. 49 % in PBS-, Natriumphosphat-, Natriumborat-, Natriumcitrat-, und Natriumacetat-Puffer (Son K und Kwon C 1995). Darüber hinaus scheinen phosphatbasierte Puffer eine schlechte Wahl bezüglich ihrer pH-Instabilität nach dem Gefrieren zu sein (Kolhe P et al. 2010), da Phosphat die größte Veränderung im pH-Wert beim Übergang von 25 zu 30°C zeigt. Wobei andere Puffer wie Histidin-Hydrochlorid, Natriumacetat, Histidin-Acetat, Citrat und Succinat eine Veränderung von weniger als einer pH-Einheit (Erhöhung) in dem Temperaturbereich von 25–30°C zeigten. Die Frost-Tau-Instabilität von Phosphat ist konzentrationsabhängig, wie beispielsweise in einer Studie gezeigt, in der Frost-Tau-induzierte Aggregation eines chimären Antikörpers (L6) mit steigender Phosphat-Pufferkonzentration (0,01 vs. 0,05) höher wurde (Paborji M et al. 1994).
Daher ist in einer bevorzugten Ausführungsform die erfindungsgemäße flüssige, wässrige pharmazeutische Adalimumab-Formulierung frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer.
Das bevorzugte erfindungsgemäße Puffersystem puffert den pH-Wert einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung in dem Bereich von etwa 5 bis 8; vorzugsweise in dem Bereich von etwa pH 5 bis etwa 5,5. Vorzugsweise ist der pH-Wert etwa 5,1 bis 5,4, weiter bevorzugt 5,15 bis 5,3 und am meisten bevorzugt etwa 5,2 wie für die Formulierungen in den angefügten Beispielen veranschaulicht. Daher weist in einer bevorzugten Ausführungsform die erfindungsgemäße flüssige, wässrige pharmazeutische Adalimumab-Formulierung einen pH-Wert von 5,2 auf. Puffer, die den pH-Wert in diesem Bereich regeln, sind im Stand der Technik wohlbekannt und werden häufig in Flüssigformulierungen beinhaltend Acetat (z.B. Natriumacetat), Succinat (beispielsweise Natriumsuccinat), Glukonat, Histidin, Citrat und andere organische Säurepuffer verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße flüssige, wässrige pharmazeutische Adalimumab-Formulierung frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer und ist mit L-Histidin in Kombination mit entweder Citrat oder Acetat gepuffert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße flüssige, wässrige pharmazeutische Adalimumab-Formulierung zusätzlich ein Polyalkohol, ein Tensid und Natriumchlorid.
Gemäß der in der vorliegenden Erfindung offenbarten Definition ist ein "Polyalkohol" eine Substanz mit vielfachen Hydroxylgruppen und beinhaltet Zucker (reduzierende und nicht-reduzierende Zucker), Zuckeralkohole und Zuckersäuren. Im Hinblick auf die Entwicklung von pharmazeutischen Antikörperformulierungen mit verbesserter Frost-Tau-Stabilität, kristallisieren bevorzugte Polyalkohole nicht bei Minustemperaturen (z. B. –20°C), sodass sie den Antikörper in der Formulierung destabilisieren. Der Polyalkohol kann auch als Tonizitätsmittel wirken. Bevorzugte erfindungsgemäße Polyalkohole sind Zuckeralkohole wie beispielsweise Mannitol, Xylitol, Erythritol, Threitol, Sorbitol und Glycerol. Ein bevorzugter erfindungsgemäßer Polyalkohol ist ein Zuckeralkohol und insbesondere Mannitol. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Konzentration von Mannitol in der pharmazeutischen Formulierung 5 bis 20 mg/mL. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Konzentration von Mannitol in der pharmazeutischen Formulierung 10 bis 14 mg/mL, weiter bevorzugt ist die Konzentration von Mannitol in der pharmazeutischen Formulierung 12 mg/mL.
Die hier verwendeten Begriffe "Tonizitätsmittel" oder "isotonisierendes Mittel" oder "Mittel zum Einstellen der Tonizität" oder "Tonisierer" oder "tonisierendes Mittel" beziehen sich auf ein Mittel, das dazu dient, eine flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung hinsichtlich osmotischer Eigenschaften physiologischen Flüssigkeiten anzugleichen, in anderen Worten hat die somit isotonische pharmazeutische Formulierung von Interesse im Wesentlichen den gleichen osmotischen Druck wie menschliches Blut. Tonizitätsmittel, die typischerweise verwendet werden, umfassen Dextrose, Mannitol, Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Glycerin. Isotonische oder physiologische Formulierungen werden im Allgemeinen einen osmotischen Druck von etwa 275–325 mOsm aufweisen. Ein bevorzugtes, in der erfindungsgemäßen flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Adalimumab-Formulierung umfasstes isotonisierendes Mittel ist Natriumchlorid. In einer Ausführungsform ist die Konzentration von Natriumchlorid in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierung 5 bis 7,5 mg/mL, vorzugsweise 5,5 bis 6,5 mg/mL Natriumchlorid. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die Konzentration von Natriumchlorid in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierung etwa 6,2 mg/mL Natriumchlorid und vorzugsweise 6,16 mg/mL Natriumchlorid.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die pharmazeutische Adalimumab-Formulierung zusätzlich ein Tensid. Grundsätzlich gibt es zwei Arten von Tensiden, nicht-ionische und ionische. Diese Tenside senken die Oberflächenspannung von Proteinlösungen und vermindern die Anfälligkeit für Proteinadsorption und/oder Aggregation an hydrophoben Oberflächen. Nicht-ionische Tenside sind im Allgemeinen bei der Proteinstabilisierung bevorzugt. Geringe Konzentrationen von nicht-ionischen Tensiden sind oft ausreichend um aufgrund ihrer relativ geringen "kritischen Mizellbildungskonzentration" (CMC) die Proteinadsorption an Oberflächen und/oder Aggregation zu verhindern oder zu reduzieren (Bam et al. 1995). Der Begriff "Tensid", wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich daher insbesondere auf nicht-ionische Tenside, die weit verbreitet sind um Proteine zu stabilisieren, um Aggregation zu unterdrücken und um die Proteinrückfaltung zu fördern (Chi EY et al. 2003). Besagtes Tensid ist vorzugsweise ein Polysorbat, was ein Emulgator ist, der von mit Fettsäuren verestertem PEGylierten Sorbitan (ein Derivat von Sorbitol) abgeleitet ist. Polysorbat 80 und Polysorbat 20, auch als Tween 80 bzw. Tween 20 bekannt, sind häufig zwischen 0,0003 und 0,3 % in vermarkteten Protein-Pharmazeutika verwendet worden. Ein bevorzugtes Tensid, das in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Adalimumab-Formulierung umfasst ist, ist Polysorbat 80 (Polyoxyethylen(20)-Sorbitan-Monooleat). Der bevorzugte Konzentrationsbereich von Polysorbat 80 in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Adalimumab-Formulierung ist etwa 0,1–10 mg/mL. Weiter bevorzugt umfasst die erfindungsgemäße pharmazeutische Adalimumab-Formulierung Polysorbat 80 in einer Konzentration von etwa 0,5–1,5 mg/mL, am meisten bevorzugt bis etwa 1 mg/mL von Polysorbat 80.
Daher ist gemäß der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Formulierung enthaltend 5–20 mg/mL Mannitol, 0,1–10 mg/mL Polysorbat 80 und 5–7,5 mg/mL Natriumchlorid unbedenklich und gut verträglich für die Verwendung als ein unterstützendes Mittel für die Lagerung und Verabreichung von Adalimumab. Am meisten bevorzugt enthält die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung etwa 12 mg/mL Mannitol, etwa 1 mg/mL Polysorbat 80 und etwa 6,2 mg/mL Natriumchlorid; siehe auch die Beispiele.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße flüssige, wässrige pharmazeutische Adalimumab-Formulierung zusätzlich einen Stabilisator ausgewählt aus L-Arginin und EDTA. Der hier verwendete Begriff "Stabilisator(en)" bezieht sich auf Hilfsstoffe, die die native Konformation des Proteins, z.B. Adalimumab, stabilisieren. Beispiele für Proteinstabilisatoren umfassen Polyalkohole, Zucker, Aminosäuren, Amine und Salze. Saccharose und Trehalose sind die am häufigsten verwendeten Zucker und große Polyalkohole sind im Allgemeinen bessere Stabilisatoren als kleine Polyalkohole. Aminosäuren wie Arginin, Histidin und Glycin, Methionin, Prolin, Lysin, Glutaminsäure sind unter den bevorzugten erfindungsgemäßen Stabilisatoren. Aminosäuren stabilisieren Proteine durch eine Vielzahl von Mechanismen einschließlich präferiertem Ausschluss direkter Proteinbindung, Pufferkapazität und anti-oxidativer Eigenschaften. L-Histidin zum Beispiel wurde als ein wie oben beschriebenes Puffermittel für Antikörperformulierungen und als ein Antioxidans, das Hydroxylradikale in Lösung abfängt, verwendet (Wade AM und Tucker HN, 1998).
Arginin wurde häufig als ein Lösungsmittel während Reinigungsschritten, als Bestandteil einer mobilen Phase in analytischer HPLC und als Hilfsstoff verwendet. Es wurde gezeigt, dass L-Arginin (Arg) höchst effektiv im Unterdrücken von Aggregation ist. Während Rückfaltungsvorgängen erhöht Arginin die Wiederherstellung durch Unterdrückung der Aggregation von gefalteten Zwischenprodukten. Arginin reduziert auch Proteinaggregation während Hitze- oder Harnstoff-induzierter Denaturierung, aber es erhöht nicht die thermische Stabilität des Proteins. Zusätzlich wurde herausgefunden, dass Arginin die Proteinlöslichkeit erhöht und die Viskosität von hochkonzentrierten Antikörperformulierungen reduziert und somit eine kürzere Verabreichungszeit erlaubt. Ungeachtet des Unverständnisses der zahlreichen Mechanismen, durch die Arginin mit betreffenden Proteinlösungen interagiert, wächst die Anwendung von Arginin in biologischen Präparaten aufgrund seiner Fähigkeit, die Aggregation zu unterdrücken und seiner Unbedenklichkeit in der Anwendung im Menschen schnell an. Vorzugsweise umfasst die erfindungsgemäße pharmazeutische Adalimumab-Formulierung L-Arginin (Arg) in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 20 mg/mL, 0,2 bis 15 mg/mL, 0,3 bis 10 mg/mL, 0,4 bis 7,5 mg/mL und am meisten bevorzugt in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 6,5 mg/mL.
Der Metallion-Komplexbildner Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) ist eine Aminopolycarbonsäure, die divalente Metallionen "fängt" und dadurch Komplexbildung von Schwermetallen verhindert, die sonst das in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierung umfasste Adalimumab inaktivieren würden. Vorzugsweise umfasst die erfindungsgemäße pharmazeutische Adalimumab-Formulierung EDTA (hier in Form von seinem Dinatriumsalz verwendet, siehe auch Beispiele 1 bis 4) in einer Konzentration von etwa 1 bis 50 mg/mL EDTA, 5 bis 15 mg/mL, 7,5 bis 12,5 mg/mL und am meisten bevorzugt in einer Konzentration von etwa 10 mg/mL EDTA, was äquivalent zu einer molaren Konzentration von 29,74 mM ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine flüssige, wässrige pharmazeutische Adalimumab-Formulierung mit einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 8, vorzugsweise von 5–5,5, die frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer ist und

(a) Adalimumab in einer Konzentration von 1 bis 150 mg/mL, 20 bis 130 mg/mL, 30 bis 100 mg/mL, vorzugsweise von etwa 50 mg/mL;
(b) Mannitol in einer Konzentration von etwa 10–14 mg/mL, vorzugsweise 12 mg ± 0,5 mg;
(c) Polysorbat 80 in einer Konzentration von etwa 0,1–5 mg/mL;
(d) L-Histidin-HCl in einer Konzentration von 0,1–0,5 mg/mL und L-Histidin-Base in einer Konzentration von 0,01–0,025 mg/mL, vorzugsweise zusammen mit (i) Zitronensäure-Monohydrat in einer Konzentration von 0,1–1,5 mg/mL und Trinatriumcitrat-Dihydrat in einer Konzentration von 0,25–3,5 mg/mL und/oder (ii) Natriumacetat-Trihydrat in einer Konzentration von 0,1–0,5 mg/mL und Essigsäure in einer Konzentration von 0,01–0,05 mg/mL; und
(e) Natriumchlorid in einer Konzentration von 6,0–6,4 mg/mL; gegebenenfalls zusätzlich enthaltend einen Stabilisator ausgewählt aus (f) L-Arginin oder (g) EDTA, umfasst.

Wie oben erwähnt und in den Beispielen dargestellt stellen flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierungen von Adalimumab, die frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer sind und die in L-Histidin basierten Puffersystemen formuliert sind geeignete alternative pharmazeutische Adalimumab-Formulierungen mit verbesserter Langzeitstabilität bezüglich Aggregatbildung und Bildung von sauren Spezies bereit. Insbesondere zeigen die von Phosphat-Puffer freien pharmazeutischen Formulierungen von Adalimumab, die mit erfindungsgemäßem Histidin-Citrat oder Histidin-Acetat-Puffer gepuffert wurden, eine verbesserte Stabilität nach Lagerung bei 25°C über einen Zeitraum von mindestens 3 bis 6 Monaten im Vergleich zu einer auf Citrat-Phosphat-Puffer basierten pharmazeutischen Adalimumab-Referenzformulierung, die gemäß der Formulierung des vermarkteten Produktes HUMIRA^® zusammengesetzt ist. Insbesondere weist die erfindungsgemäße, mit Histidin-Citrat und Histidin-Acetat gepufferte Adalimumab-Formulierung weniger Aggregatbildung auf, wie durch Größenausschlusschromatografie bestimmt, sogar wenn die Formulierung für bis zu 6 Monate bei 25°C ± 3°C wie in Beispiel 5 und –F gezeigt, gelagert wurde und auch nach Hitzestress bei 55°C wie in Beispiel 6 und gezeigt im Vergleich zu der mit Citrat-Phosphat gepufferten pharmazeutischen Referenzformulierung.
Zusätzlich zeigt die erfindungsgemäße, mit Histidin-Citrat oder Histidin-Acetat gepufferte Adalimumab-Formulierung eine verringerte Deamidierung hinsichtlich einer, mittels starker Kationenaustauschchromatografie bestimmten, verringerten Bildung von sauren Spezies, sogar dann wenn die Formulierung für bis zu 6 Monate bei 25°C ± 3°C gelagert wurde wie in Beispiel 7 und –F gezeigt, und auch nach Hitzestress bei 55°C wie in Beispiel 8 und gezeigt, im Vergleich zu der mit Citrat-Phosphat gepufferten pharmazeutischen Referenzformulierung.
Die Phrase "stabile pharmazeutische Formulierung" ist gemäß der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Formulierung, wobei der Antikörper von Interesse z.B. Adalimumab seine physikalische Stabilität und/oder chemische Stabilität und/oder biologische Aktivität nach Lagerung bei der beabsichtigten Lagerungstemperatur (z. B. 5°C und/oder 25°C) beibehält wie von einer Zulassungsbehörde für dessen Zulassung verlangt. Zum Beispiel ist eine stabile pharmazeutische Zusammensetzung eine Formulierung, die sich zwischen der Zeit, in der sie hergestellt wurde und der Zeit, in der sie genutzt wird (oder das Ende ihrer beabsichtigen Haltbarkeit erreicht), keinen Veränderungen in ihren physikalischen, chemischen oder biologischen Eigenschaften unterzieht, die sie unsicher oder ineffektiv für ihre beabsichtige pharmazeutische Verwendung gemäß den Standards, etabliert in ICH Q5C, "Quality of Biotechnological Products: Stability Testing of Biotechnological/Biological Products" der "International Conference on Harmonization of Technical Requirements of Pharmaceuticals for Human Use" machen. Die Stabilität eines Proteins, z.B. Adalimumab kann durch Detektion und Quantifizierung von chemisch veränderten Formen des Proteins bestimmt werden. Die Menge an monomeren Antikörpern in der pharmazeutischen Formulierung ist ein wesentliches Qualitätsmerkmal für die Bestimmung einer geeigneten pharmazeutischen Formulierung. Da Aggregate eine Hauptursache für (schwere) Nebenwirkungen sind, zeigt der Gehalt an Monomeren die tatsächliche pharmazeutisch aktive Menge des Arzneimittels an, bzw. des Antikörpers. Wie oben diskutiert, gilt dies insbesondere für pharmazeutische Formulierungen zur Selbstverabreichung, bei denen das Risiko einer unsachgemäßen Lagerung wie bei hohen Temperaturen besteht.
Die flüssige(n), wässrige(n) pharmazeutische(n) Formulierung(en) oder der (die) Puffer mit "verbesserter Stabilität" oder der/die "stabiler" ist (sind) im Vergleich zu einer pharmazeutischen Referenzformulierung bezieht (beziehen) sich auf flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung(en) oder Puffer, wobei das Protein, d.h. der Antikörper quantitative Unterschiede zwischen zwei Zuständen (z.B. physikalische Stabilität und/oder chemische Stabilität und/oder biologische Aktivität des Proteins z.B. des Antikörpers) bezugnehmend auf mindestens statistisch signifikante Unterschiede zwischen den beiden Zuständen kennzeichnet.
Der hier verwendete Begriff "Aggregation" umfasst die Begriffe "Proteinaggregation" und "Antikörperaggregation" und bezieht sich auf die Bildung von höhermolekularen Proteinspezies wie zum Beispiel Oligomeren oder Multimeren, anstelle der gewünschten definierten Spezies des biopharmazeutischen Arzneimittels (z.B. ein Monomer). Proteinaggregation ist daher ein universeller Begriff für die Bildung aller Arten von nicht weiter definierten multimeren Spezies (aggregierten Spezies), die durch kovalente Bindungen oder nicht-kovalente Interaktionen gebildet werden. Proteinaggregation ist eine der drei gebräuchlichsten Proteinabbauwege neben Deamidierung und Oxidation (Cleland JL et al. 1993). Proteinaggregation in Lösung wird vor allem durch die Lösungsmittelumgebung (pH, Salz, Kosolvente, etc.), Temperatur oder Oberflächeninteraktionen verursacht. Aggregationsprobleme sind in Zusammenhang mit Nebenwirkungen und anderen Sicherheitsaspekten seit dem Beginn von klinischen Anwendungen von Proteinpharmazeutika gebracht worden. Es ist seit langem bekannt, dass Immunoglobinaggregate anaphylaktische Reaktionen verursachen (Cleland JL et al. 1993, Carpenter JF et al. 1999). Um solche Risiken von therapeutischen Proteinen in klinischen Anwendungen zu minimieren, besteht die Notwendigkeit pharmazeutische Formulierungen zu optimieren, um Aggregation während Lagerung, Handhabung und Transport zu reduzieren (Remmele RL et al. 2006).
Der hier verwendete Begriff "Deamidierung" bezieht sich auf die Deamidierung von Asparagin-Resten des erfindungsgemäßen anti-TNFα Antikörpers Adalimumab. Deamidierung ist ein vorherrschender Proteinabbauweg und normalerweise enthalten gereinigte Antikörperpräparationen viele saure Formen. Lagerung kann leicht große Mengen an sauren Produkten erzeugen. Deamidierung von Asparagin-Resten ist eine der häufigsten post-translationalen Modifizierungen, die in therapeutischen Proteinen, die unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden, vorkommt. Deamidierung des Proteins resultiert in der Umwandlung hauptsächlich eines Asparagin-Restes in eine Mischung von Isoaspartat und Aspartat. Deamidierung von Glutamin-Resten kommt auch vor, aber in geringerem Maße (Chelius D et al. 2005).
Die hier verwendeten Begriffe "saure Spezies", "saure Verunreinigung (Verunreinigungen)" und "saure Variante(n)" beziehen sich auf eine Variante oder Varianten des Ziel-Proteins, das saurer (z.B. bestimmt durch starke Kationenaustauschchromatografie (SCX-HPLC)) als das Ziel-Protein ist. Ein Beispiel einer sauren Spezies/Verunreinigung/Variante ist eine deamidierte Spezies/Verunreinigung/Variante.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung geeignet für subkutane Einmal-Injektion und ist in einem pharmazeutischen Behälter enthalten. Subkutane Verabreichung ist der bevorzugte Verabreichungsweg in therapeutischen Behandlungen, die wiederholte Behandlungen erfordern, wie es der Fall bei vielen chronischen Krankheiten wie beispielsweise Autoimmunerkrankungen (z.B. rheumatoide Arthritis, Spondylitis ankylosans, chronisch-entzündliche Darmerkrankung, Psoriasis, Akne inversa, Colitis ulcerosa und refraktäres Asthma) ist, bei denen das Medikament letztendlich lebenslang verabreicht werden muss und Heim-(Selbst-)Medikation wünschenswert ist bezüglich der Patienten-Compliance und Kostenreduktion.
Wie in Beispielen 1 bis 9 gezeigt und in bis dargestellt, ist in erfindungsgemäßen pharmazeutischen Formulierungen, wobei die Zusammensetzung frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer ist, die Anwesenheit von Inhaltsstoffen mit Ausnahme von dem therapeutischen Antikörper (a) und den Bestandteilen (b) einen Polyalkohol; (c) ein Tensid; (d) eine Pufferkomponente umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat; und (e) Natriumchlorid; und gegebenenfalls (f) L-Arginin und/oder (g) EDTA, die zusätzlich oben beschrieben sind, überflüssig. Daher ist in einer Ausführungsform die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung frei oder im Wesentlichen frei von Dicarbonsäuren, Monosacchariden, Oligosacchariden und/oder zusätzlichen Aminosäuren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierung eine wässrige Formulierung, die aus den Komponenten (a) bis (e), gegebenenfalls zusammen mit (f) und/oder (g) besteht mit den zusätzlichen Anforderungen für diese Merkmale, die oben offenbart bzw. in den Beispielen dargestellt sind.
In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen vorgefüllten pharmazeutischen Behälter umfassend eine von den flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierungen, die gemäß des oben offenbarten bzw. in den Beispielen dargestellten ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung formuliert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße vorgefüllte pharmazeutische Behälter eine flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung mit einem pH-Wert von 5 bis 5,5, wobei die Zusammensetzung frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer ist und

(a) Adalimumab;
(b) einen Polyalkohol;
(c) ein Tensid;
(d) eine Pufferkomponente umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat;
(e) Natriumchlorid; siehe auch oben, umfasst.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die oben genannte Zusammensetzung in dem Behälter zusätzlich (f) L-Arginin und/oder (g) EDTA.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der vorgefüllte pharmazeutische Behälter eine Fertigspritze, ein Injektions-Pen, eine Ampulle, eine Flasche, ein Autoinjektor oder ein Infusionsbeutel, der die flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung gemäß des ersten Aspektes der Erfindung umfasst. Vorzugsweise wird der Behälter unter Stickstoffschutzatmosphäre verschlossen.
Der hier verwendete Begriff "Schutzatmosphäre" bezieht sich auf eine Schutzatmosphäre mit erhöhtem Stickstoffgehalt. Schutzgasatmosphären (auch bekannt als geschützte/modifizierte Atmosphäre oder geschütztes/modifiziertes Gas) werden häufig zum Verlängern der Haltbarkeit von Produkten wie beispielsweise Lebensmittel oder Medikamente/Arzneimittel in einer gasdichten Verpackung verwendet, um mikrobielle, enzymatische und biochemische nachteilige physikalische Prozesse, die zu der schnellen Vernichtung der Ware während der Lagerung führen, zu verlangsamen oder sogar zu stoppen. Typischerweise werden Gasmischungen aus Kohlenstoffdioxid und Stickstoff als Schutzgas verwendet, wobei Kohlenstoffdioxid eine hemmende Wirkung auf das Wachstum von Mikroorganismen wie beispielsweise Bakterien und Pilze vermittelt, während Stickstoffgas vor allem als Unterstützung zur Verhinderung des Zusammenbruchs der Verpackung dient. Weiterhin wird in den meisten Schutzgasatmosphären die Sauerstoffkonzentration im Vergleich zur Luft reduziert, um Wachstum von Mikroorganismen zu vermeiden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Dosisstärke des in der pharmazeutischen Formulierung bereitgestellten Adalimumabs vorzugsweise 20, 40, 80, 120 oder 160 mg. Vorzugsweise werden die unterschiedlichen Dosisstärken von Adalimumab in dem Behälter bereitgestellt, vorzugsweise in den erfindungsgemäßen Fertigspritzen, wobei die unterschiedlichen Dosisstärken in den Fertigspritzen 20, 40 und/oder 80 mg sind, vorzugsweise mit einer Dosisstärke von Adalimumab von 20 oder 80 mg und vorzugsweise wobei Adalimumab so hergerichtet ist, um mit einer Gesamtdosis von 20, 40 oder 80 mg verabreicht zu werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Set, z.B. Kit von mindestens zwei Behältern bereit, wobei die Behälter eine unterschiedliche Dosisstärke von Adalimumab aufweisen, vorzugsweise 20 und 80 mg. In einer weiteren Ausführungsform werden die unterschiedlichen Dosisstärken durch unterschiedliche Füllvolumen derselben flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Adalimumab-Formulierung erzeugt. In noch einer weiteren Ausführungsform sind die unterschiedlichen Dosisstärken in den Fertigspritzen 20, 40, 80 und/oder 160 mg. Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Set, z.B. Kit mindestens einen Behälter mit einer Dosisstärke von 20, 80 und/oder 160 mg.
Bisher war die geläufige Gesamtdosis von Adalimumab 40 mg für die Behandlung von erwachsenen Patienten, die an rheumatoider Arthritis (RA), Spondylitis ankylosans (AS) oder Psoriasisarthritis (PsA) leiden. Jedoch wird für pädiatrische Patienten (2 bis < 4 Jahre alt), die an juveniler idiopathischer Arthritis (JIA) leiden, eine Gesamtdosis von 20 mg empfohlen, die auf ein Maximum von 40 mg erhöht werden kann. Die empfohlene Induktionsdosis für pädiatrische Patienten (< 40 kg Körpergewicht), die an Morbus Crohn (MC) leiden, beinhaltet 40 mg Adalimumab gefolgt von einer Erhaltungsdosis von 20 mg des Antikörpers. Im Gegensatz dazu ist die empfohlene Dosis für pädiatrische Patienten (≥ 40 kg Körpergewicht), die an schwerem MC leiden, 80 mg Adalimumab, gefolgt von 40 mg Adalimumab. Um ein schnelles Ansprechen auf die Therapie gegen schweren MC zu erreichen, kann eine Induktionsdosis von 160 mg, gefolgt von einer Erhaltungsdosis von 80 mg Adalimumab gewählt werden. Dementsprechend ist in einer Ausführungsform die Dosisstärke von Adalimumab in den Fertigspritzen vorzugsweise 20 mg oder ein mehrfaches Integral davon in dem zugehörigen Behälter, vorzugsweise 2 × 20 mg, 4 × 20 mg oder 8 × 20 mg.
Das empfohlene Dosierungsschema für Adalimumab für erwachsene Patienten mit Colitis ulcerosa ist zunächst 160 mg an Tag 1, gefolgt von 80 mg an Tag 15. An Tag 29 wird eine Erhaltungsdosis von 40 mg jede zweite Woche verabreicht. Die empfohlene Dosis von Adalimumab für erwachsene Patienten mit Plaque-Psoriasis (Ps) ist eine Anfangsdosis von 80 mg, gefolgt von 40 mg, die jede zweite Woche, beginnend eine Woche nach der Anfangsdosis, verabreicht wird. Dementsprechend ist in einer anderen Ausführungsform die Dosisstärke von Adalimumab in den Fertigspritzen vorzugsweise 40 mg oder ein mehrfaches Integral davon in dem zugehörigen Behälter, vorzugsweise 2 × 40 mg, 4 × 40 mg.
Weiterhin ist das erfindungsgemäße Set von Behältern, insbesondere mit einer Dosisstärke umfassend 20 mg, 80 mg, 120 mg und/oder 160 mg sowie gegebenenfalls umfassend zusätzlich 40 mg vorteilhaft für gleichaltrige Patienten, die unterschiedliche Dosierungsschemen benötigen aber es gewohnt sind ihre Therapie gemeinsam oder unter einer gemeinsamen Kontrolle eines Arztes zu erhalten. Zusätzlich hat sich die niedrige 20 mg Dosisstärke als nützlich für Patienten erwiesen, die an Hautreizungen leiden, wenn sie eine höhere Dosisstärke verwenden, sodass sie es vorziehen, eine niedrigere Dosis zweimal zu erhalten. Andererseits zeigen einige Patienten eine Präferenz für eine hohe Dosisstärke von 80, 120 oder sogar 160 mg, wenn sie zum Beispiel ein Paar oder Freunde sind, die wünschen, die Adalimumab-Therapie aus derselben Charge, d.h. Spritze oder Pen zu erhalten. Somit bedient das erfindungsgemäße Set von Behältern mit unterschiedlichen Dosisstärken von Adalimumab ein Bedürfnis von Patienten, was bisher noch nicht erkannt worden ist und was im Hinblick auf die Anwendbarkeit für gemeinsame Behandlungen helfen kann, die Angst der Patienten vor der Behandlung zu überwinden, wodurch die Therapie komfortabler für die Patienten gemacht wird. Da das Set von Behältern in unterschiedlichen Zusammensetzungen der Dosisstärken, die an den Patienten oder die Gruppe von Patienten adaptiert ist, geliefert werden kann, wird die Therapie zusätzlich u.a. Kosten reduzieren, da es weniger Überschuss des Arzneimittels geben wird, falls es einen gibt, im Vergleich zu einem Set mit einzelnen Dosisstärken von 40 mg und folglich auch weniger Abfall und Kontamination der Umwelt.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Erkrankung" bezeichnet irgendeinen Zustand, der von der Behandlung mit dem Antikörper, d.h. von Adalimumab profitieren würde. Dies umfasst chronische und akute Erkrankungen oder Krankheiten einschließlich der pathologischen Zustände, die den Patienten zu der betreffenden Erkrankung prädisponieren. Gemäß einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung bereit, z.B. in einem wie oben definierten Behälter oder Set von Behältern zur Verwendung als ein Arzneimittel zur Verwendung in "der Behandlung einer Erkrankung, in der TNFα-Aktivität schädlich ist". Solche Erkrankungen umfassen, sind aber nicht limitiert auf Sepsis, Infektionskrankheiten, Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßung, bösartige Tumoren, Lungenerkrankungen, Herzerkrankungen, Darmerkrankungen, Graft-versus-Host-Reaktion, Erkrankungen des Nervensystems und dergleichen.
Autoimmunerkrankungen, die für die Behandlung mit der erfindungsgemäßen flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Adalimumab-Formulierung, z.B. in einem wie oben definierten Behälter oder Set von Behältern geeignet sind, umfassen, sind aber nicht limitiert auf arthritische und rheumatische Erkrankungen, wie rheumatoide Arthritis (RA), Psoriasisarthritis (PsA), polyartikuläre juvenile idiopathische Arthritis, Psoriasis, Plaque-Psoriasis (Ps), Spondylitis ankylosans (AS), axiale Spondyloarthritis, axiale Spondyloarthritis ohne radiographischen Nachweis von AS, Morbus Crohn (MC), pädiatrischer Morbus Crohn und Colitis ulcerosa.
Entzündungserkrankungen die für die Behandlung mit der erfindungsgemäßen flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Adalimumab-Formulierung, z.B. in einem wie oben definierten Behälter oder Set von Behältern geeignet sind, umfassen, sind aber nicht limitiert auf entzündliche Knochenerkrankungen und Knochenresorptionserkrankung, Hepatitis, umfassend alkoholische Hepatitis und virale Hepatitis, Gerinnungsstörungen, Reperfusionsschaden, Keloidbildung, Narbengewebsbildung, Fieber, Parodontose, Fettleibigkeit und Strahlungstoxizität.
Geeignete Infektionserkrankungen sind virale und/oder bakterielle Infektionen. Geeignete Erkrankungen des Nervensystems sind unter anderen neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson, Alzheimer, Multiple Sklerose, Huntington-Krankheit oder amyotrophe Lateralsklerose.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung (und der Behälter oder das Set von Behältern zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung) so hergerichtet, um subkutan einem dafür bedürftigen menschlichen Patienten nach einem zweiwöchentlichen Dosierungsschema alle 13 bis 15 Tage verabreicht zu werden. Vorzugsweise hat der Behälter oder das Set von Behältern zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung eine Dosisstärke von 20 oder 80 mg, wobei Adalimumab vorzugsweise so hergerichtet ist, um mit einer Gesamtdosis von 20, 40 oder 80 mg verabreicht zu werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung zur Verabreichung in Kombination mit einem zusätzlichen Therapeutikum, das TNFα-Produktion oder -Aktivität hemmt, vorzugsweise, aber nicht auf Methotrexat limitiert, vorgesehen.
Die folgenden Beispiele 1 bis 9 und entsprechende bis verdeutlichen zusätzlich die Erfindung, aber sollten nicht so ausgelegt werden, um den Umfang der Erfindung in irgendeiner Art und Weise zu limitieren. Detaillierte Beschreibungen von konventionellen Verfahren, wie beispielsweise solche die hier verwendet werden, können in der zitierten Literatur gefunden werden.
BEISPIELE
Es existieren zahlreiche Formulierungen umfassend alternative Puffersysteme für die mit Citrat-Phosphat gepufferte vermarktete Formulierung von Adalimumab, umfassend Mono- oder Dicarbonsäuren oder Salze davon zusammen mit einem Aminosäure- oder Polyalkohol-Stabilisator (siehe z.B. internationale Anmeldung WO 2012/089778 ), Puffer ausgewählt aus Histidin-Puffern, Arginin-Puffern, Succinat-Puffern, Citrat-Puffern oder Acetat-Puffern und Stabilisatoren ausgewählt aus Aminosäuren und Cyclodextrinen (siehe z.B. internationale Anmeldungen WO 2013/164837 und WO 2014/039903 ) oder Formulierungen von Adalimumab, die bei einem unterschiedlichen pH-Wert gepuffert sind (mindestens 5,5, vorzugsweise bei 6,25 +/– 0,5) wie in der internationalen Anmeldung WO 2013/186230 . Jedoch besteht angesichts der Anforderungen an eine stabile flüssige, pharmazeutische Formulierung, insbesondere im Hinblick auf die Eignung für lebenslange Selbstverabreichung und für die vollständige Ausnutzung des klinischen Potenzials eines Antikörpers wie im Falle von Adalimumab, immer noch die Notwendigkeit für die Entwicklung von weiteren flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierungen von Adalimumab mit verbesserter Lagerungsstabilität.
Für das Screening von Puffersystemen, die als Alternativen besser geeignet sind als solche, auf dem Markt verfügbare, mit Citrat-Phosphat gepufferte Adalimumab-Formulierungen wurden weitere pharmazeutische Adalimumab-Formulierungen in 4 verschiedenen Puffersystemen hergestellt: a) Citrat (Mono-Puffersystem), b) Histidin-Citrat, c) Histidin-Acetat und in d) Citrat-Phosphat (Referenzpuffer). Für die Bewertung des Effektes von zusätzlichen Stabilisatoren beinhalteten die vier erfindungsgemäßen alternativen Adalimumab-Formulierungen zusätzlich einen der Stabilisatoren L-Arginin oder EDTA. Alle anderen Inhaltsstoffe (Natriumchlorid, Mannitol, Polysorbat 80) wurden qualitativ und quantitativ gemäß der Adalimumab-Formulierung des vermarkteten Produktes HUMIRA^® beibehalten. Die Stabilität der verschiedenen Adalimumab-Formulierungen wurde während Langzeitlagerung bei 5°C und 25°C über einen Zeitraum von 6 Monaten und unter Stressbedingungen wie Erhitzen auf 55°C getestet. Eine Zusammenfassung aller getesteten Formulierungen ist in Tabelle 1 bereitgestellt. Tabelle 1. Getestete alternative pharmazeutische Adalimumab-Formulierungen und ihre Chargennummern (Proben-ID Nr. 1 bis 12)

Die Experimente, die das verwendete Material umfassen und die gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführten Verfahren und ihre Ergebnisse sind im Folgenden zusammengefasst. Tabelle 2. Equipment

Equipment	Hersteller	Modell	Seriennummer
UHPLC	Shimadzu Corp.	Nexera	L20234975345
pH-Meter	Radiometer	PHM220	657R012N015
HPLC	Agilent Biosystems Inc.	1200	DE63059747

Tabelle 3. HPLC-Säulen

Säule	Hersteller	Artikelnummer	Chargennummer
Acquity UPLC BEH300 C18 1,7 μm 2,1 × 100 mm	Waters Corp.	186003686	0124332941
Yarra 3u SEC-3000 300 × 4,6 mm	Phenomenex	00H-4513-E0	5623-17
YMC-BioPro SP-F 100 × 4,6 mm I.D. S-5μm	YMC	SF00S05-1046WP	10183

Tabelle 4. Liste der Materialien/Reagenzien

Materialien/Reagenzien	Hersteller	Artikelnummer	Chargennummer
2-(N-Morpholin)ethansulfonsäure-Monohydrat BioUltra	Fluka	69889	BCBK9895V
2-(N-Morpholin)ethansulfonsäure Natriumsalz BioPerformance	Sigma	M3058	SLBB6703V
Natriumchlorid BioXtra	Sigma-Aldrich	S7653	SLBC3215V
Kaliumphosphat zweibasig, für HPLC, ≥ 99,0 %	Fluka	17835	AM0419904327
Kaliumphosphat einbasig, für HPLC, ≥ 99,5 %	Fluka	60221	B0691108221
Kaliumchlorid, BioXtra, ≥ 99,0 %	Sigma-Aldrich	P9333	BCBK9830V
Phosphat-gepufferte Saline	Sigma	P4417	SLBJ2117V

Table 5. Liste der Chemikalien

Name	Hersteller/Lieferant	Reinheit	Chargennummer
L-Arginin (freie Base)	Merck KGaA	99,8 %	k42667842150
Essigsäure (100 %) (IN)	Celanese Gmbh	100 %	R46162199
Zitronensäure-Monohydrat	Jungbunzlauer	100,2 %	1135667
Dinatriumhydrogenphosphat-Dodekahydrat	Merck KGaA	100,4 %	K93244173
Dinatrium EDTA (wasserfrei)	Merck KGaA	99,3 %	D00104170
Salzsäure
L-Histidin-Base	Ajinomoto	98,5 %	R016E013
L-Histidin-HCl	Merck KGaA	100,1 %	K43128954
Mannitol	Roquette Freres	98,9 %	E636Y
Polysorbat 80	Croda Chocques SAS	-	1702NP3483
Natriumacetat-Trihydrat hohe Qualität	Merck KGaA	99,5 %	A0337312
Natriumchlorid	Salinen Austria AG	99,97 %	CRS171212
Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat	Honeywell Speciality Chemicals Seelze Gmbh	100,0 %	C0130
Trinatriumcitrat-Dihydrat	Honeywell Speciality Chemicals Seelze Gmbh	100,4 %	A3330

Herstellung/Reinigung von Adalimumab
Der hier verwendete aktive pharmazeutische Inhaltsstoff war Adalimumab, der in einem von CHO-Zellen (DG44) abgeleiteten Klon hergestellt und durch Protein-Affinitätschromatographie-, Kationenaustauschchromatographie(CEX)- und Anionenaustauschchromatographie(AEX)-Schritte gereinigt wurde. Nach dem letzten Reinigungsschritt wurde der Antikörper auf eine Endkonzentration von etwa 50 mg/mL in dem gewünschten Puffer konzentriert und bei einer Temperatur unter –60°C gelagert.
Herstellung der pharmazeutischen Adalimumab-Formulierungen
Adalimumab wurde durch Protein A Antikörper-Affinitätschromatographie gereinigt und dann wurden Kationen- und Anionenaustauschchromatographie während des nachgeschalteten Prozesses verwendet. Nach diesen Reinigungsschritten wurden unterschiedliche Formulierungen durch Diafiltration hergestellt. Die unterschiedlichen diafiltrierten Lösungen wurden unter Verwendung von Mannitol und Natriumchlorid enthaltenden Puffern hergestellt, während die stabilisierenden Hilfsstoffe Arginin, EDTA und Tween 80 in nachfolgenden Schritten hinzugefügt wurden. Nach Diafiltration wurde die Proteinlösung auf ungefähr 65 mg/mL konzentriert. Tween 80 wurde aus einer konzentrierten Lösung (10-fach konzentriert), die die gleichen Pufferlösungen mit Mannitol und Natriumchlorid enthält, hinzugefügt. Die Proteinkonzentration und der pH-Wert wurden in den erhaltenen Proben der Formulierung gemessen. Die Zielkonzentration der Proben war 55 ± 2,5 mg/mL. Die Proteinkonzentration und der pH-Wert der Proben wurden bestimmt und dann wurden die Lösungen durch einen Sterilfilter mit einer Porengröße von 0,22 µm in sterile Einweg-Polycarbonat-Röhrchen gefiltert.
Die Hilfsstoffe Arginin oder EDTA wurden zu den Mannitol und Natriumchlorid enthaltenden Pufferlösungen hinzugefügt. Die unterschiedlichen pharmazeutischen Formulierungen wurden durch Verdünnung der Proteinlösung auf 50 mg/mL hergestellt. Die Proteinlösung wurde mit den verschiedenen Pufferlösungen alleine oder zusammen mit den EDTA oder L-Arginin enthaltenden Pufferlösungen verdünnt. Wenn die Konzentration der Proben aus dem gewünschten Bereich fiel, wurde diese durch Verdünnen auf die Zielkonzentration eingestellt.
Die hergestellten Proben wurden durch einen Sterilfilter mit einer Porengröße von 0,22 µm gefiltert. Die Aliquots der Proben wurden in sterile Zentrifugations-Röhrchen unter Verwendung von sterilem Equipment unter laminarer Luftströmung überführt und die Röhrchen wurden unter Stickstoffgasfluss verschlossen. Dann waren die Proben der Adalimumab-Formulierung fertig für die Stabilitätsexperimente.
Langzeitstabilitätsstudien
Die verschiedenen Proben der Adalimumab-Formulierung wurden für 6 Monate bei 5°C ± 3°C und 25°C ± 2°C gelagert. Die Proben wurden nach 1, 2, 3 und 6 Monaten analysiert.
Frost-Tau-Bedingungen
Die Frost-Tau-Proben wurden am Tag der Analyse hergestellt, um mit t = 0 übereinzustimmen. Frost-Tau-Stress der Proben wurde in einem Telstar Liobeta 15 Gefriertrocknungsgerät angewandt. Die Proben wurden von 5°C bis –20°C innerhalb von 30 min gefroren und bei –20°C für 1 Stunde belassen. Die Proben wurden von –20°C auf 5°C innerhalb von 2 Stunden aufgetaut. Der Frost- und Tau-Zyklus wurde 5- bzw. 10-mal für jede Probe wiederholt.
Hitzestressbedingungen
Hitzestress wurde durch Inkubation der Proben für 10 Minuten bei 55°C, einer Temperatur nahe des Schmelzpunktes des Proteins, angewandt.
Bewegungsstudien
Mechanischer Stress wurde durch Schütteln der Proben für 24 Stunden bei 25°C auf einem planaren Schüttler mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 400 RPM angewandt.
Einmonatige Lagerung bei erhöhter Temperatur
Die Proben wurden bei 40 ± 2°C für einen Monat bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 75 ± 5 % gelagert. Die mechanisch beanspruchten, die durch Einfrieren und Auftauen, sowie durch hohe Temperaturen beanspruchten Proben, wurden für einen zusätzlichen Monat bei 25 ± 2°C gelagert und erneut analysiert.
Proteingehalt durch RP-UHPLC-UV₂₈₀
Umkehrphasen-Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie mit UV-Detektor (RP-UHPLC-UV) unter Verwendung eines Absorptionsgrades bei 280 nm wurde zur Messung der Adalimumab-Konzentration in den verschiedenen Formulierungsproben verwendet.
pH-Messungen
Der pH-Wert jeder Probe wurde unter Verwendung einer Mikro-pH-Sonde gemessen. Vor dem Beginn der Analyse wurde die pH-Sonde mit drei pH-Standards kalibriert. Die pH-Werte der Stabilitätsproben wurden durch Überführen von 500 µL jeder Stabilitätsprobe in ein 1000 µL PCR-Gefäß gemessen. Die Mikro-pH-Sonde wurde dann in die Probe eingetaucht und nachdem sich der Wert stabilisiert hatte, wurde er erfasst.
Größenaustauschchromatographie (HP-SEC)
Die Stabilität der alternativen Adalimumab-Formulierungen hinsichtlich Reinheit/Aggregation und Fragmentierung wurde unter Verwendung von Größenaustausch-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HP-SEC), die die Moleküle basierend auf ihrer Größe trennt, gemessen. Die früh-eluierenden Peaks entsprechen den hochmolekularen Spezies oder %-Aggregaten. Der Hauptpeak (intaktes Protein) entspricht dem %-Monomer. Der späteluierende Peak entspricht den niedermolekularen Spezies oder %-Fragmenten. Die SEC-Methodenparameter sind nachstehend kurz zusammengefasst:

– Probenvorbereitung: 50× Verdünnung mit Wasser
– Säuleninformation: Yarra 3u SEC-3000 300 × 4,6mm
– Analysepuffer: 200 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH ≈ 7,0 beinhaltend 100 mM Kaliumchlorid
– Flussrate: 0,35 mL/min
– Säulentemperatur: 30°C
– Detektion: UV, λ = 215 nm
– Injektionsvolumen: 2 µL
– Probentemperatur: 5°C

Die SEC-Daten wurden unter Verwendung der "Empower2" Software basierend auf relative %-Bereiche der Haupt-, aggregierten und fragmentierten Peaks analysiert.
Starke-Kationenaustauschchromatographie (SCX-HPLC)
Ladungsheterogenitäten und post-translationale Modifikationen von intakten verdauten Proben der Adalimumab-Formulierung wurden durch Starke-Ionenaustausch(SCX)-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (SCX-HPLC) analysiert. Methodenparameter der SCX-Chromatographie sind nachfolgend kurz zusammengefasst:
Intakt-Messung:

– Probenvorbereitung: 50× Verdünnung mit Wasser
– Säuleninformation: YMC-BioPro SP-F 100× 4,6 mm I.D. S-5 µm
– mobile Phase A: 10 mM MES Puffer (pH ≈ 6,0)
– mobile Phase B: 200 mM Natriumchlorid in mobiler Phase A
– Flussrate: 0,85 mL/min
– Säulentemperatur: 25°C
– Detektion: Fluoreszenz, λ_EX = 280 nm, λ_EM = 350 nm
– Injektionsvolumen: 5 µL
– Probentemperatur: 5°C
– Gradientenprogramm:

Zeit [min]	mobile Phase A [%]	mobile Phase B [%]
0	56,6	43,4
18	33,6	66,4
19	33,6	66,4
19,5	56,6	43,4
25	56,6	43,4

Die folgenden nicht-limitierenden Beispiele repräsentieren zahlreiche alternative Adalimumab-Formulierungen, die die vorliegende Erfindung veranschaulichen.
Beispiel 1: Pharmazeutische Adalimumab-Formulierung umfassend Citrat-Phosphat-Puffer (Referenzformulierung)

Adalimumab wurde gemäß der im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt. In diesem Beispiel wurde das gereinigte Adalimumab in Gegenwart von Citrat-Phosphat-Puffer zusammen mit Mannitol, Natriumchlorid und Polysorbat 80 mit oder ohne (#01) einem der zusätzlichen Stabilisatoren EDTA (#02) und L-Arginin (#03) mit Konzentrationen wie in Tabelle 6 gezeigt formuliert. Der pH-Wert der Formulierung wurde auf etwa pH 5,2 eingestellt. Hilfsstoffe wurden zu der Proteinlösung aus entsprechenden Stammlösungen hinzugefügt, um die Endkonzentration einzustellen und das Volumen wurde auf das gewünschte Niveau mit sterilem Wasser oder mit Wasser für Injektionszwecke aufgefüllt. Die formulierte Bulkware wurde in einem geeigneten Behälter (wie Röhrchen, Spritzen etc.) zur Lagerung unter normalen und Stressbedingungen verteilt. Stabilität hinsichtlich Aggregatbildung und Deamidierung/Bildung von sauren Verunreinigungen (Spezies) der entsprechenden Formulierungen wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten durch HP-Größenausschlusschromatographie bzw. nach Hitzeeinwirkung durch HP-SCX gemessen. Die Ergebnisse sind in bis gezeigt. Tabelle 6: #01 Citrat-Phosphat-Puffer (Referenzformulierung)*.

Bestandteile	Konzentration
Bestandteile	mg/mL	mmol/L
Adalimumab	50,00
Natriumchlorid	6,16	105,45
Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat	0,86	5,53
Dinatriumhydrogenphosphat-Dodekahydrat	3,07	8,57
Trinatriumcitrat-Dihydrat	0,30	1,02
Zitronensäure-Monohydrat	1,30	6,19
Mannitol	12,00	65,87
Polysorbat 80	1,00
* ±10,00 mg/mL Dinatrium EDTA (#02) oder ±4,36 mg/mL L-Arginin freie Base (#03)

Beispiel 2: Adalimumab-Formulierung umfassend Citrat-Puffer (Monopuffer)

Adalimumab wurde gemäß der im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt. In diesem Beispiel wurde das gereinigte Adalimumab in Gegenwart von Citrat-Puffer als Monopuffersystem zusammen mit Mannitol, Natriumchlorid und Polysorbat 80 mit oder ohne (#04) einem der zusätzlichen Stabilisatoren EDTA (#05) und L-Arginin (#06) mit Konzentrationen wie in Tabelle 7 gezeigt formuliert. Der pH-Wert der Formulierung wurde auf etwa pH 5,2 eingestellt. Hilfsstoffe wurden zu der Proteinlösung aus entsprechenden Stammlösungen hinzugefügt, um die Endkonzentration einzustellen und das Volumen wurde auf das gewünschte Niveau mit sterilem Wasser oder mit Wasser für Injektionszwecke aufgefüllt. Die formulierte Bulkware wurde in einem geeigneten Behälter (wie Röhrchen, Spritzen etc.) zur Lagerung unter normalen und Stressbedingungen verteilt. Stabilität hinsichtlich Aggregatbildung und Deamidierung/Bildung von sauren Verunreinigungen (Spezies) der entsprechenden Formulierungen wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten durch HP-Größenausschlusschromatographie bzw. nach Hitzeeinwirkung durch HP-SCX untersucht. Die Ergebnisse sind in bis gezeigt. Tabelle 7: #04 Citrat-Puffer *.

Bestandteile	Konzentration
Bestandteile	mg/mL	mmol/L
Adalimumab	50,00
Natriumchlorid	6,16	105,45
Trinatrium-Dihydrat	3,17	10,77
Zitronensäure-Monohydrat	0,83	3,97
Mannitol	12,00	65,87
Polysorbat 80	1,00
* ±10,00 mg/mL Dinatrium EDTA (#0 5) oder ±4,36 mg/mL L-Arginin freie Base (#06)

Beispiel 3: Pharmazeutische Adalimumab-Formulierung umfassend Histidin-Citrat-Puffer

Adalimumab wurde gemäß der im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt. In diesem Beispiel wurde das gereinigte Adalimumab in Gegenwart von Histidin-Citrat-Puffer zusammen mit Mannitol, Natriumchlorid und Polysorbat 80 mit oder ohne (#07) einem der zusätzlichen Stabilisatoren EDTA (#08) und L-Arginin (#09) mit Konzentrationen wie in Tabelle 8 gezeigt formuliert. Der pH-Wert der Formulierung wurde auf etwa pH 5,2 eingestellt. Hilfsstoffe wurden zu der Proteinlösung aus den entsprechenden Stammlösungen hinzugefügt um die Endkonzentration einzustellen und das Volumen wurde auf das gewünschte Niveau mit sterilem Wasser oder mit Wasser für Injektionszwecke aufgefüllt. Die formulierte Bulkware wurde in einem geeigneten Behälter (wie Röhrchen, Spritzen etc.) zur Lagerung unter normalen und Stressbedingungen verteilt. Stabilität hinsichtlich Aggregatbildung und Deamidierung/Bildung von sauren Verunreinigungen (Spezies) der entsprechenden Formulierungen wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten durch HP-Größenausschlusschromatographie bzw. nach Hitzeeinwirkung durch HP-SCX untersucht. Die Ergebnisse sind in bis gezeigt. Tabelle 8: #07 Histidin-Citrat-Puffer*.

Bestandteile	Konzentration
Bestandteile	mg/mL	mmol/L
Adalimumab	50,00
Natriumchlorid	6,16	105,45
L-Histidin-Base	0,02	1,11
L-Histidin-HCl	0,24	11,20
Trinatriumcitrat-Dihydrat	1,58	5,38
Zitronensäure-Monohydrat	0,42	1,98
Mannitol	12,00	65,87
Polysorbat 80	1,00
* ±10,00 mg/mL Dinatrium EDTA (#08) oder ±4,36 mg/mL L-Arginin freie Base (#09)

Beispiel 4: Pharmazeutische Adalimumab-Formulierung umfassend Histidin-Acetat-Puffer

Adalimumab wurde gemäß der im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt. In diesem Beispiel wurde das gereinigte Adalimumab in Gegenwart von Histidin-Acetat-Puffer zusammen mit Mannitol, Natriumchlorid und Polysorbat 80 mit oder ohne (#10) einem der zusätzlichen Stabilisatoren EDTA (#11) und L-Arginin (#12) mit Konzentrationen wie in Tabelle 9 gezeigt formuliert. Der pH-Wert der Formulierung wurde auf etwa pH 5,2 eingestellt. Hilfsstoffe wurden zu der Proteinlösung aus der entsprechenden Stammlösung hinzugefügt um die Endkonzentration einzustellen und das Volumen wurde auf das gewünschte Niveau mit sterilem Wasser oder mit Wasser für Injektionszwecke aufgefüllt. Die formulierte Bulkware wurde in einem geeigneten Behälter (wie Röhrchen, Spritzen etc.) zur Lagerung unter normalen und Stressbedingungen verteilt. Stabilität hinsichtlich Aggregatbildung und Deamidierung/Bildung von sauren Verunreinigungen (Spezies) der entsprechenden Formulierungen wurde zu verschiedenen Zeitpunkten durch HP-Größenausschlusschromatographie bzw. nach Hitzeeinwirkung durch HP-SCX untersucht. Die Ergebnisse sind in bis gezeigt. Tabelle 9: #10 Histidin-Acetat-Puffer*.

Bestandteile	Konzentration
Bestandteile	mg/mL	mmol/L
Adalimumab	50,00
Natriumchlorid	6,16	105,45
L-Histidin-Base	0,02	1,11
L-Histidin-HCl	0,24	11,20
Natriumacetat-Trihydrat (hohe Qualität)	0,28	20,76
Essigsäure (100 %) (IN)	0,03	5,52
Mannitol	12,00	65,87
Polysorbat 80	1,00
* ±10,00 mg/mL Dinatrium EDTA (#11) oder ±4,36 mg/mL L-Arginin freie Base (#12)

Beispiel 5: Aggregatgehalt alternativer Adalimumab-Formulierungen in Relation zu der Referenzformulierung

Die Stabilität der getesteten Adalimumab-Formulierungen bezüglich Aggregatbildung wurde durch HP-SEC während der Lagerung bei 5°C (Tabellen 10 und 11) und 25°C (Tabellen 12 und 13) über einen Zeitraum von 6 Monaten gemessen. Die Werte repräsentieren die Unterschiede in Flächenprozenten der aggregierten Peaks [Δ Flächen-%] der getesteten Adalimumab-Formulierungen im Vergleich zu den aggregierten Peaks, die in den entsprechenden, mit Citrat-Phosphat gepufferten Adalimumab-Referenzformulierungen gemessen wurden. Bezüglich der L-Arginin enthaltenden Formulierungen sind nur Stabilitätsdaten von 3 Monaten erhältlich. Nach 6-monatiger Lagerung bei 25°C haben die mit Histidin-Citrat und Histidin-Acetat gepufferten pharmazeutischen Adalimumab-Formulierungen offensichtlich eine geringere Aggregationsrate im Vergleich zu den auf Citrat-Phosphat basierten Referenzformulierungen. Auf Citrat-Puffer allein basierte Adalimumab-Formulierungen scheinen anfälliger für Aggregation zu sein. Weder die Zugabe von EDTA noch von L-Arginin (bei L-Arg nach 3 Monaten bestimmt) hat einen verhindernden oder stabilisierenden Effekt auf die Aggregatbildung in den alternativen Formulierungen. Zusammenfassend ist die mit Histidin-Acetat gepufferte, gefolgt von der mit Histidin-Citrat gepufferten erfindungsgemäßen pharmazeutischen Adalimumab-Formulierung eine stabilere Alternative zu der mit Citrat-Phosphat gepufferten Adalimumab-Formulierung, die auf dem Markt ist. Tabelle 10: Aggregatgehalt alternativer Adalimumab-Formulierungen in absoluten Werten bei 5°C.

Formulierung			Aggregate [Flächen-%] bei 5°C
ID	Puffer	Stabilisator	Anfänglich	1 Monat	2 Monate	3 Monate	6 Monate
01	Citrat-Phosphat	-	4,10	3,89	3,94	3,90	4,76
04	Citrat	-	3,65	3,95	3,78	3,98	4,68
07	Histidin-Citrat	-	3,63	3,68	3,49	3,68	4,35
10	Histidin-Acetat	-	4,02	3,67	3,64	3,65	4,28

02	Citrat-Phosphat	EDTA	4,10	3,80	3,81	3,78	4,56
05	Citrat	EDTA	3,82	3,82	3,83	3,87	4,62
08	Histidin-Citrat	EDTA	3,77	3,63	3,60	3,72	4,29
11	Histidin-Acetat	EDTA	3,94	3,66	3,66	3,62	4,30

03	Citrat-Phosphat	L-Arg	3,84	3,93	3,97	4,51	-
06	Citrat	L-Arg	3,90	3,94	4,02	4,54	-
09	Histidin-Citrat	L-Arg	3,67	3,86	3,78	4,37	-
12	Histidin-Acetat	L-Arg	3,65	3,75	3,83	4,33	-

Tabelle 11: Aggregatgehalt alternativer Adalimumab-Formulierungen in Relation zu der Referenzformulierung bei 5°C.

Formulierung			Aggregate [Δ Flächen-%] bei 5°C
ID	Puffer	Stabilisator	Anfänglich	1 Monat	2 Monate	3 Monate	6 Monate
04	Citrat	-	–0,45	0,06	–0,16	0,08	–0,08
07	Histidin-Citrat	-	–0,47	–0,21	–0,45	–0,22	–0,41
10	Histidin-Acetat	-	–0,08	–0,22	–0,30	–0,25	–0,48

05	Citrat	EDTA	–0,28	0,02	0,02	0,09	0,06
08	Histidin-Citrat	EDTA	–0,33	–0,17	–0,21	–0,06	–0,27
11	Histidin-Acetat	EDTA	–0,16	–0,14	–0,15	–0,16	–0,26

06	Citrat	L-Arg	0,06	0,01	0,05	0,03	-
09	Histidin-Citrat	L-Arg	–0,17	–0,07	–0,19	–0,14	-
12	Histidin-Acetat	L-Arg	–0,19	–0,18	–0,14	–0,18	-

Tabelle 12: Aggregatgehalt alternativer Adalimumab-Formulierungen in absoluten Werten bei 25°C.

Formulierung			Aggregate [Flächen-%] bei 25°C
ID	Puffer	Stabilisator	Anfänglich	1 Monat	2 Monate	3 Monate	6 Monate
01	Citrat-Phosphat	-	4,10	4,15	4,37	4,34	5,87
04	Citrat	-	3,65	3,88	4,40	4,53	5,92
07	Histidin-Citrat	-	3,63	3,73	3,90	3,90	4,87
10	Histidin-Acetat	-	4,02	3,74	3,86	3,86	4,83

02	Citrat-Phosphat	EDTA	4,10	3,93	4,15	4,06	5,39
05	Citrat	EDTA	3,82	3,95	3,95	4,10	5,57
08	Histidin-Citrat	EDTA	3,77	3,73	3,81	3,71	4,74
11	Histidin-Acetat	EDTA	3,94	3,71	3,79	3,64	4,75

03	Citrat-Phosphat	L-Arg	3,84	4,09	4,36	5,17	-
06	Citrat	L-Arg	3,90	3,99	4,27	5,53	-
09	Histidin-Citrat	L-Arg	3,67	3,82	3,93	4,50	-
12	Histidin-Acetat	L-Arg	3,65	3,87	4,08	4,51	-

Tabelle 13: Aggregatgehalt alternativer Adalimumab-Formulierungen in Relation zu der Referenzformulierung bei 25°C.

Formulierung			Aggregate [Δ Flächen-%] bei 25°C
ID	Puffer	Stabilisator	Anfänglich	1 Monat	2 Monate	3 Monate	6 Monate
04	Citrat	-	–0,45	–0,27	0,03	0,19	0,05
07	Histidin-Citrat	-	–0,47	–0,42	–0,47	–0,44	–1,00
10	Histidin-Acetat	-	–0,08	–0,41	–0,51	–0,48	–1,04

05	Citrat	EDTA	–0,28	0,02	–0,20	0,04	0,18
08	Histidin-Citrat	EDTA	–0,33	–0,20	–0,34	–0,35	–0,65
11	Histidin-Acetat	EDTA	–0,16	–0,22	–0,36	–0,42	–0,64

06	Citrat	L-Arg	0,06	–0,10	–0,09	0,36	-
09	Histidin-Citrat	L-Arg	–0,17	–0,27	–0,43	–0,67	-
12	Histidin-Acetat	L-Arg	–0,19	–0,22	–0,28	–0,66	-

Beispiel 6: Aggregatgehalt alternativer Adalimumab-Formulierungen unter Stressbedingungen (55°C) in Relation zu der Referenzformulierung
Die Aggregatbildung nach Erhitzen der verschiedenen Proben der Adalimumab-Formulierung auf 55°C wurde unter Verwendung von HP-SEC bewertet. In ist der Aggregatgehalt als Flächenprozente gezeigt (linke Säulen). Die rechten Säulen (bezeichnet mit Δ) repräsentieren die Unterschiede von den entsprechenden mit Citrat-Phosphat gepufferten Referenzformulierungen für die ersten Ergebnisse bzw. den Unterschied von den ersten Ergebnissen (Veränderung aufgrund von Stress) für die beanspruchten Proben. Unter allen getesteten Adalimumab-Formulierungen zeigte die mit Histidin-Acetat gepufferte Formulierung ohne einen zusätzlichen Stabilisator die höchste Stabilität, d.h. die geringste Aggregationsrate bei 55°C; siehe auch , zur Beachtung, die Referenzlinie der mit Citrat-Phosphat gepufferten Formulierung für 55°C liegt bei Δ 0,34, d.h. über ID #10 (Histidin-Acetat) und ID #08 (Histidin-Citrat + EDTA). Zugabe von EDTA zu der Histidin-Acetat-Pufferkombination erhöht scheinbar die Aggregatbildung in der entsprechenden pharmazeutischen Formulierung (#11) während des Erhitzens auf 55°C. Die mit Histidin-Citrat gepufferte und EDTA-enthaltende pharmazeutische Adalimumab-Formulierung zeigt eine ähnliche Stabilität bei 55°C.
Beispiel 7: Gehalt an sauren Spezies alternativer Adalimumab-Formulierungen in Relation zu den Referenzformulierungen

Die Stabilität der getesteten Adalimumab-Formulierungen bezüglich der Bildung von sauren Spezies wurde durch SCX-HPLC während der Lagerung bei 5°C (Tabellen 14 und 15) und 25°C (Tabellen 16 und 17) über einen Zeitraum von 6 Monaten gemessen ( ). Die Werte repräsentieren die Unterschiede in Flächenprozenten [Δ Flächen-%] der sauren Verunreinigungs-Peaks (Summe der ersten und zweiten sauren Regionen) der getesteten Adalimumab-Formulierungen im Vergleich zu den sauren Verunreinigungs-Peaks, die in den entsprechenden, mit Citrat-Phosphat gepufferten Adalimumab-Referenzformulierungen gemessen wurden. Bezüglich der L-Arginin enthaltenden Formulierungen sind nur Stabilitätsdaten von 3 Monaten verfügbar. Alle getesteten, bei 5°C gelagerten alternativen pharmazeutischen Adalimumab-Formulierungen weisen offensichtlich einen leicht geringeren Gehalt an sauren Verunreinigungen auf als die Referenzformulierungen umfassend Citrat-Phosphat-Puffer, jedoch sind die Unterschiede nicht signifikant ( –C). Stabilitätsstudien bei 25°C zeigten, dass mit Histidin-Acetat und Histidin-Citrat gepufferte pharmazeutische Adalimumab-Formulierungen einen signifikant geringeren Gehalt an sauren Spezies nach Lagerung für 6 Monate im Vergleich zu den Referenzformulierungen basierend auf Citrat-Phosphat-Puffer aufweisen ( –F; das gilt auch entsprechend für die 3-Monatsdaten im Fall von L-Arginin enthaltenden Formulierungen). Die mit Histidin-Acetat ohne einen zusätzlichen Stabilisator (#10) gepufferte Adalimumab-Formulierung weist die höchste relative Reinheit auf (3,1 % geringerer Gehalt an sauren Verunreinigungen im Vergleich zu der mit Citrat-Phosphat gepufferten Referenzformulierung), wobei die alleine auf Citrat-Puffer basierten Adalimumab-Formulierungen die höchste Menge an sauren Verunreinigungen zeigten. Weder die Zugabe von EDTA noch von L-Arginin (bei L-Arg nach 3 Monaten bestimmt) hatte einen verhindernden oder stabilisierenden Effekt auf die Bildung von sauren Spezies in den alternativen Adalimumab-Formulierungen. Tabelle 14: Saure Verunreinigungen (d.h. Gehalt an sauren Spezies) alternativer Adalimumab-Formulierungen in absoluten Werten bei 5°C.

Formulierung			Saure Verunreinigungen [Flächen-%] bei 5°C
ID	Puffer	Stabilisator	Anfänglich	1 Monat	2 Monate	3 Monate	6 Monate
01	Citrat-Phosphat	-	32,25	32,32	-	32,98	33,17
04	Citrat	-	32,34	32,55	-	32,84	32,97
07	Histidin-Citrat	-	32,34	32,43	-	33,32	33,03
10	Histidin-Acetat	-	32,26	32,35	-	32,54	32,79

02	Citrat-Phosphat	EDTA	32,30	32,39	-	32,89	33,03
05	Citrat	EDTA	32,38	32,38	-	33,01	32,68
08	Histidin-Citrat	EDTA	32,31	32,37	-	33,75	32,94
11	Histidin-Acetat	EDTA	32,30	32,25	-	32,55	32,80

03	Citrat-Phosphat	L-Arg	32,64	32,99	32,47	33,01	-
06	Citrat	L-Arg	33,04	33,03	32,55	32,92	-
09	Histidin-Citrat	L-Arg	32,96	32,99	32,36	32,86	-
12	Histidin-Acetat	L-Arg	32,87	32,90	32,30	32,77	-

Tabelle 15: Saure Verunreinigungen (d.h. Gehalt an sauren Spezies) alternativer Adalimumab-Formulierungen in Relation zu der Referenzformulierung bei 5°C.

Formulierung			Saure Verunreinigungen [Δ Flächen-%] bei 5°C
ID	Puffer	Stabilisator	Anfänglich	1 Monat	2 Monate	3 Monate	6 Monate
04	Citrat	-	0,09	0,23	-	–0,14	–0,20
07	Histidin-Citrat	-	0,09	0,11	-	0,34	–0,14
10	Histidin-Acetat	-	0,01	0,03	-	–0,44	–0,38

05	Citrat	EDTA	0,08	–0,01	-	0,12	–0,35
08	Histidin-Citrat	EDTA	0,01	–0,02	-	0,86	–0,09
11	Histidin-Acetat	EDTA	0,00	–0,14	-	–0,34	–0,23

06	Citrat	L-Arg	0,40	0,04	0,08	–0,09	-
09	Histidin-Citrat	L-Arg	0,32	0,00	–0,11	–0,15	-
12	Histidin-Acetat	L-Arg	0,23	–0,09	–0,17	–0,24	-

Tabelle 16: Saure Verunreinigungen (d.h. Gehalt an sauren Spezies) alternativer Adalimumab-Formulierungen in absoluten Werten bei 25°C.

Formulierung			Saure Verunreinigungen [Flächen-%] bei 25°C
ID	Puffer	Stabilisator	Anfänglich	1 Monat	2 Monate	3 Monate	6 Monate
01	Citrat-Phosphat	-	32,25	33,92	-	38,29	44,82
04	Citrat	-	32,34	33,84	-	38,02	46,68
07	Histidin-Citrat	-	32,34	33,55	-	36,93	42,84
10	Histidin-Acetat	-	32,26	33,44	-	36,69	41,71

02	Citrat-Phosphat	EDTA	32,3	33,59	-	37,96	44,15
05	Citrat	EDTA	32,38	33,79	-	38,22	45,68
08	Histidin-Citrat	EDTA	32,31	33,44	-	36,97	42,92
11	Histidin-Acetat	EDTA	32,3	33,18	-	36,94	41,43

03	Citrat-Phosphat	L-Arg	32,64	34,76	36,00	38,21	-
06	Citrat	L-Arg	33,04	35,02	36,85	39,40	-
09	Histidin-Citrat	L-Arg	32,96	34,57	35,48	37,80	-
12	Histidin-Acetat	L-Arg	32,87	34,33	35,14	37,28	-

Tabelle 16: Saure Verunreinigungen (d.h. Gehalt an sauren Spezies) alternativer Adalimumab-Formulierungen in Relation zu der Referenzformulierung bei 25°C.

Formulierung			Saure Verunreinigungen [Δ Flächen-%] bei 25°C
ID	Puffer	Stabilisator	Anfänglich	1 Monat	2 Monate	3 Monate	6 Monate
04	Citrat	-	0,09	–0,08	-	–0,27	1,86
07	Histidin-Citrat	-	0,09	–0,37	-	–1,36	–1,98
10	Histidin-Acetat	-	0,01	–0,48	-	–1,60	–3,11

05	Citrat	EDTA	0,08	0,20	-	0,26	1,53
08	Histidin-Citrat	EDTA	0,01	–0,15	-	–0,99	–1,23
11	Histidin-Acetat	EDTA	0,00	–0,41	-	–1,02	–2,72

06	Citrat	L-Arg	0,40	0,26	0,85	1,19	-
09	Histidin-Citrat	L-Arg	0,32	–0,19	–0,52	–0,41	-
12	Histidin-Acetat	L-Arg	0,23	–0,43	–0,86	–0,93	-

Beispiel 8: Gehalt an sauren Spezies alternativer Adalimumab-Formulierungen unter Stressbedingungen (55°C) in Relation zu den Referenzformulierungen
Saure Verunreinigungen nach Erhitzen der verschiedenen Proben der Adalimumab-Formulierung auf 55°C wurden unter Verwendung von HP-SCX bewertet ( ). Der Grad der Bildung von sauren Spezies ist als Flächenprozente gezeigt (linke Säulen). Die rechten Säulen (bezeichnet mit Δ) repräsentieren die Unterschiede von den entsprechenden, mit Citrat-Phosphat gepufferten Referenzformulierungen für die ersten Ergebnisse bzw. den Unterschied von den ersten Ergebnissen (Veränderung aufgrund von Stress) für die beanspruchten Proben. Unter allen getesteten Adalimumab-Formulierungen zeigte die mit Histidin-Acetat gepufferte Formulierung ohne einen zusätzlichen Stabilisator (#10) die höchste Stabilität, d.h. die geringste Bildungsrate von sauren Verunreinigungen bei 55°C. Die Zugabe von EDTA zu dieser Pufferkombination erhöhte scheinbar leicht die Bildung von saurer Verunreinigung in der entsprechenden Formulierung während des Erhitzens auf 55°C.
Beispiel 9: Biologische Aktivität alternativer Adalimumab-Formulierungen unter Stressbedingungen in Relation zu der Referenzformulierung
Prinzip des Verfahrens
Die biologische Aktivität der getesteten Probe wird in Abhängigkeit der Zeit unter verschiedenen Stressbedingungen im Vergleich zu der biologischen Aktivität der HUMIRA^®-Referenzlösung bestimmt. Der Effekt des Hemmens von Zelltod durch die Referenzlösung und der Testprobe wird basierend auf L929 Zellen, behandelt mit TNFα und Actinomycin-D, welches mit AlamarBlue^® Reagenz detektiert wird, verglichen. Während der Behandlung wird ein Medium, das L929 Zellen in der gleichen Konzentration enthält, in die entsprechenden Vertiefungen einer 96-Well Mikrotiterplatte hinzugefügt und für 48 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation werden 9-Punkt Verdünnungsserien in drei Replikaten von der Referenzlösung und der Testprobe in der gleichen Konzentration auf einer Verdünnungsplatte vorbereitet, dann wird die TNFα-Lösung hinzugefügt und die Mischungen werden für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Während der Inkubationszeit wird die Actinomycin-D-Lösung in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte, die die Zellen enthält, hinzugefügt, dann wird die TNFα-Lösung und die Referenzlösung oder die Testprobe zu den Zellen hinzugefügt. Nach 24 Stunden wird das AlamarBlue^® Reagenz zu den Zellen hinzugefügt, dann werden nach Inkubation für weitere 24 Stunden die Fluoreszenzsignale detektiert, die proportional zu der Anzahl von lebensfähigen Zellen sind. Die Bewertung der biologischen Aktivität der Testprobe in Relation zu der Referenzlösung basiert auf dem Vergleich der 5-Parameter sigmoiden Kurven, die von den Punkten der Verdünnungsserie erhalten werden. Nach Analyse der Eigenschaften der Anpassung (Regression, Linearität und Parallelität) wird die relative biologische Aktivität der Probe von den Abständen der Kurven errechnet; der Optimalwert ist 100 %.
Notwendige Materialien und Equipment
Materialien

– Actinomycin-D (Sigma A9415)
– AlamarBlue^® (Invitrogen DAL 1025)
– DMEM, High Glucose, GlutaMAX, HEPES (Gibco 32430)
– Ethanol (Merck 1.00983.1000)
– FKS, Fetales Kälberserum (Hitze-inaktiviert) (Gibco 10500-056)
– HUMIRA^® Referenz-Stammlösung (Abbott, 50 mg/mL)
– Kanamycinsulfat, Streptomyces kanamyceticus, Zellkultur-getestet (Calbiochem, 420411)
– PBS pH 7,4
– Rekombinantes humanes TNFα (R&D Systems, 210TA/CF)
– TrypLETM Express (1x), Phenolrot (Gibco, 12605-010)
– Trypanblau-Lösung (Sigma T8154)
– Stammlösung der Testprobe
– Wasser, gereinigt, HPLC Qualität

Equipment

– Zellkulturflasche (TPP 711090076)
– 96-Well Mikrotiterplatte (BD Falcon 3072)
– 50-mL Zentrifugen-Röhrchen (BD Falcon 352070)
– Eppendorf Research^® Pipetten
– Cat. No.: 3111 000.130 (Volumenbereich: 2–20 μL, Fehlerhaftigkeit: ±1,2 %, Ungenauigkeit: ≤ 0,6 %)
– Cat. No.: 3111 000.157 (Volumenbereich: 20–200 μL, Fehlerhaftigkeit: ±1,0 %, Ungenauigkeit: ≤ 0,3 %)
– Cat. No.: 3111 000.165 (Volumenbereich: 100–1000 μL, Fehlerhaftigkeit: ±0,6 %, Ungenauigkeit: ≤ 0,2 %)
– Eppendorf Multikanalpipette
– Cat. No.: 3114 000.131 (Volumenbereich: 10–100 μL, Fehlerhaftigkeit: ±0,8 %, Ungenauigkeit: ≤ 0,3 %)
– Eppendorf-Röhrchen (Eppendorf 0030 108.116 Protein LoBind Röhrchen, 1,5 mL, "PCR clean")
– Millex-GV Filtereinheit, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, (Millipore SLGV033RB)
– Sicherheitswerkbank Klasse II
– CO2 Inkubator
– Biotek Synergy 2 Plattenlesegerät, Gen5 Secure Software
– Beckman Coulter Allegra X-22R Tischzentrifuge mit austauschbarem Rotor
– Sigma Pasteur Pipette (Sigma-Aldrich, S6018-250EA)
– Serologische Pipette, 10 mL (TPP 94010)
– Serologische Pipette, 25 mL (TPP 94024)
– Bürker Kammer (0,0025 mm2, Hirscmann)
– Nucleocounter automatischer Zellzähler
– Agilent Bravo Roboter zur Handhabung von Flüssigkeiten
– Wasseraufbereiter (Sartorius Arium 611VF)
– Analysenwaage (Mettler Toledo AX205)
– Magnetrührer (IKA Ret basic)
– Materialien und Equipment derselben Qualität kann auch verwendet werden.

Herstellung von Lösungen
Vollmedium

– 90 mL DMEM Medium
– 10 mL FKS
– 200 µL Kanamycin-Lösung (50 mg/mL, wässrige Lösung mit gereinigtem Wasser)

Das Medium kann nicht länger als eine Woche nach der Herstellung verwendet werden, die Bestandteile werden nicht durch den Lieferanten sterilisiert; das Medium muss durch Filtration sterilisiert werden.

– 10× PBS
– 40 g NaCl
– 5,8 g Na2HPO4
– 1 g KH2PO4
– 1 g KCl

Herstellung der TNFα-Stammlösung
Stelle eine Stammlösung mit einer Konzentration von 1 mg/mL von TNFα her. Füge 50 µL sterilfiltrierter PBS zu 50 µg lyophilisiertes, bei –20°C gelagertes TNFα hinzu und löse es anschließend durch leichtes Schütteln. Die bei –70°C gelagerte TNFα-Stammlösung kann für 3 Monate nach Herstellung verwendet werden.
Herstellung von Actinomycin-D-Stammlösung
Stelle eine Stammlösung mit einer Konzentration von 1 mg/mL von Actinomycin-D her. Füge 2 mL Ethanol zu 2 mg lyophilisiertem Actinomycin-D hinzu und löse es dann mit einem Vortex. Die bei –20°C gelagerte Actinomycin-D-Stammlösung kann für 3 Monate nach Herstellung verwendet werden.
Verdünnung von TNFα
Stelle eine Lösung mit einer Konzentration von 112 pg/mL von der bei –70°C gelagerten 1 mg/mL TNFα-Stammlösung in vier Verdünnungsschritten her, die in den Vertiefungen nochmals vierfach verdünnt wird; die Endkonzentration beträgt 28 pg/mL.
Verdünnungsschritte:

1. 100× (198 µL Vollmedium + 2 µL TNFα-Stammlösung)
2. 100× (990 µL Vollmedium + 10 µL des vorherigen Verdünnungsschrittes)
3. 10× (900 µL Vollmedium + 100 µL des vorherigen Verdünnungsschrittes)
4. 89× (in 3 Platten: 19,8 mL Vollmedium + 225 µL des vorherigen Verdünnungsschrittes)

Verdünnung von Actinomycin-D
Stelle eine Lösung mit einer Konzentration von 4 µg/mL von der bei –20°C gelagerten 1 mg/mL Actinomycin-D-Stammlösung durch 250× Verdünnung her (20 µL Stammlösung +5 mL Vollmedium in jeder Platte), welches in den Vertiefungen nochmals vierfach verdünnt wird; die Endkonzentration beträgt 1 µg/mL.
Herstellung der Referenzlösung und Testlösung
Verdünne die HUMIRA^® Referenz-Stammlösung (50 mg/mL) auf 7,2 µg/mL in drei Schritten. Beginnend mit dem Minimum von 10 µL Stammlösung sind die folgenden Verdünnungsschritte: 10x, 100x, und 6,94x. Transferiere 50 µL der auf eine Konzentration von 7,2 µg/mL verdünnten Lösung in entsprechende Vertiefungen der Verdünnungsplatte, wo die Endkonzentration der Referenzlösung 2,4 µg/mL beträgt.
Verdünnungsschritte:

1. 10× (90 µL Vollmedium + 10 µL HUMIRA^® Referenz-Stammlösung oder Testlösung)
2. 100× (990 µL Vollmedium + 10 µL des vorherigen Verdünnungsschrittes)
3. 6,94× (178,2 µL Vollmedium + 30 µL des vorherigen Verdünnungsschrittes)

Die nominelle Konzentration der HUMIRA^® Referenz-Stammlösung ist 50 mg/mL; stelle von dieser eine Lösung mit einer Konzentration von 7,2 µg/mL her, sodass der Unterschied zwischen der tatsächlichen Konzentration und der nominellen Konzentration in dem letzten Verdünnungsschritt korrigiert wird. Bestimme somit die Menge der in dem zweiten Verdünnungsschritt erhaltenen Lösung, sodass die Konzentration der dritten Lösung 7,2 µg/mL ist (Anfangskonzentration (µg/mL)/1000 = Konzentration nach den ersten beiden Verdünnungsschritten (µg/mL); Grad des dritten Verdünnungsschrittes = Konzentration nach den ersten beiden Verdünnungsschritten (µg/mL)/7,2 (µg/mL); Wiegen: Gesamtvolumen der dritten Lösung (µL)/ Grad des dritten Verdünnungsschrittes = × (µL) von der zweiten Verdünnung). Verdünne die Stammlösung der Testprobe auf 7,2 µg/mL ähnlich zu der Referenzlösung.
Durchführung des Tests, Testbedingungen
Führe jeden Schritt unter sterilen Bedingungen durch.
Ausplattieren von Zellen – Tag 1
Herstellung einer Zelllösung
Transferiere drei Tage vor dem Ausplattieren der Zellen etwa 2,5 × 10⁶ Zellen in 25 mL Vollmedium in eine Zellkulturflasche. An dem Tag des Ausplattierens der Zellen, nach Abziehen des Mediums, löse die an der Oberfläche angehefteten Zellen mit 3 mL TrypLE^TM Express-Lösung und dann suspendiere sie in 7 mL Vollmedium. Bestimme die Zellzahl und die Lebensfähigkeit unter Verwendung der Bürker-Kammer mit Trypanblau-Färbung (BTCH-BIOASSAY-BÜRKER-01) oder mit dem Nucleocounter (BTCH-BIOASSAY-SEJTSZ-01). Wenn der Anteil an lebensfähigen Zellen geringer als 90 % ist, verwende die Zellkultur nicht. Stelle die Zellzahl auf 1,6 × 10⁵ Zellen/mL in dem für die Untersuchung notwendigen Medium ein. 6 mL der Zellsuspension werden für eine Platte benötigt, 50 µL pro Zelle. Verwende die Zellsuspension innerhalb von 1 Stunde. Inkubiere die Platte für 48 Stunden bei 37°C in 5 % CO₂ 85 % RH-Atmosphäre.
Behandlung der Zellen – Tag 3
Tabelle 17 Bestandteile der Lösungen und ihre Verteilung auf der Platte.
Medium: Vollmedium 200 µL/Vertiefung (Vertiefungen: A 1-12, H 1-12, B-G 1, B-G 12);
Zell-Kontr.: Zellsuspension 50 µL/Vertiefung + Vollmedium 150 µL/Vertiefung (11 B-C);
ActD-Kontr.: Zellsuspension 50 µL/Vertiefung + Actinomycin-D (4 µg/mL) 50 µL/Vertiefung + Vollmedium 100 µL/Vertiefung (11 D-E);
TNFα-Kontr.: Zellsuspension 50 µL/Vertiefung + TNFα-Lösung (112 pg/mL) 100 µL/Vertiefung + Actinomycin-D (4 µg/mL) 50 µL/ Vertiefung (11 F-G);
Referenz: Lösungen der Verdünnungsserien hergestellt aus der Referenzlösung 50 µL/Vertiefung + Zellsuspension 50 µL/Vertiefung + TNFα-Lösung (112 pg/mL) 50 µL/ Vertiefung + Actinomycin-D (4 µg/mL) 50 µL/Vertiefung, 1–3: Verdünnungsserien hergestellt aus den unabhängigen Verdünnungsserien;
Probe: Lösungen der Verdünnungsserien hergestellt aus der Testlösung 50 µL/Vertiefung + Zellsuspension 50 µL/Vertiefung + TNFα-Lösung (112 pg/mL) 50 µL/Vertiefung + Actinomycin-D (4 µg/mL) 50 µL/Vertiefung, 1–3: Verdünnungsserien hergestellt aus unabhängigen Verdünnungsserien.
Behandlungsverfahren
Stelle unabhängige Verdünnungsserien der HUMIRA^®-Referenzlösung und der Testlösung her, drei Replikate von jeder Lösung. Messe 100 µL des Vollmediums von der 2ten bis zur 9ten Spalte der Mikrotiterplatte und füge dann 50 µL der vorher verdünnten 7,2 µg/mL Lösungen in die 2te Spalte abwechselnd hinzu, sodass in Vertiefungen B, D und F HUMIRA^®-Referenzlösung mit einer Konzentration von 2,4 µg/mL sein wird und in Vertiefungen C, E und G die Testlösung mit einer Konzentration von 2,4 µg/mL sein wird. Transferiere die konzentrierten Lösungen in Paaren in die Vertiefungen, eine Referenzlösung und dann eine Testlösung, etc. Stelle Ausgehend von diesen Lösungen 9-Punkt-Verdünnungsserien für die Herstellung von dreifachen Verdünnungen her. Transferiere für diesen Zweck 50 µL der Lösung von dem nächsten, einen Grad stärker konzentrierten Verdünnungspunkt, suspendiere anschließend und verwerfe die überschüssigen 50 µL von der letzten Vertiefung. Transferiere 100 µL der TNFα-Lösung (112 pg/mL) zu jedem 100-µL Punkt in der hergestellten Verdünnungsserie und inkubiere sie anschließend für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Transferiere während der Inkubationszeit 50 µL der Actinomycin-D-Lösung in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte, die die Zellen enthalten, transferiere dann die Kontrolllösung ebenfalls in die entsprechenden Vertiefungen. Pipettiere nach der Inkubationszeit 100 µL von jedem Punkt der TNFα-Verdünnungsserie in die entsprechenden Vertiefungen der die Zellen enthaltenden Mikrotiterplatte und dann inkubiere die Platte anschließend für 24 Stunden bei 37°C in 5 % CO2, 85 % RH-Atmosphäre.
Färbung – Tag 4
Transferiere 25 µL des AlamarBlue^® Reagenz in jede Kammer der Platte und inkubiere die Platte anschließend für 24 Stunden bei 37°C in 5 % CO2, 85 % RH-Atmosphäre.
Test – Tag 5
Detektiere die Fluoreszenzintensität der Proben auf der Platte mit einem Multimode-Plattenlesegerät im Fluoreszenzmodus bei 530 nm Extinktions- und 590 nm Emissions-Wellenlängenwerten (Sensitivität: 45 nm).
Bewertung
Führe die Bewertung unter Verwendung der PLA 2.0 (Stegman System, Deutschland) Software, basierend auf dem "5 parameter logistic curve (full curve)" Modell durch. Verwende die folgende Einstellung in der Software:

– Analyse: "5 parameter logistic curve (full curve)"
– Testen der Hypothese: ANOVA basierend auf reiner Fehlertrennung
– Parallelität: (95 % Vertrauen)
– Konfiguration: Lineare Detektionsart / komplette Bandbreite

^®

Zusätzlich bestimmt die Software die folgenden Systemeignungskriterien basierend auf dem F-Test:
Für parallele Messungen: CV % < 15 %
In dem Fall CV > 15 %, wenn es durch den Ausreißtest gemäß des Arzneibuches erwiesen ist, dass ein Punkt von den Parallelen ein Ausreißer ist, kann er manuell ausgeschlossen werden und dann wird die Platte neu bewertet.
Regression: Fregression > Fkritisch (95 %)
Linearität: Fnicht-linear < Fkritisch (95 %)
Parallelität: Fnicht-parallel < Fkritisch (95 %)
Relatives Konfidenzintervall: zwischen 74 % und 136 %
Andere Systemeignungskriterien:

– Mittelwert der Zellkontrollwerte / Mittelwert der ActD-Kontrollwerte sollte zwischen 1–1,5 liegen;
– Mittelwert der TNFα-Kontrollwerte sollte in jedem Fall geringer sein als der Mittelwert entsprechend der geringsten Behandlungskonzentration der Referenzlösung;
– Mittelwert der Zellkontrollwerte sollte in jedem Fall mehr sein als der Mittelwert entsprechend der höchsten Behandlungskonzentration der Referenzlösung.

Die Bestimmung der biologischen Aktivität der Testprobe in Abhängigkeit der Zeit unter verschiedenen Stressbedingungen zeigte im Vergleich mit der biologischen Aktivität der HUMIRA^®-Referenzlösung, dass jede erfindungsgemäße Adalimumab-Formulierung besser in Relation zur Zeit ( ) oder zur HUMIRA^®-Referenzlösung ( ) in mindestens einer der getesteten Lagerungs-/ und Stressbedingungen ist, d.h. nach 3 Monaten bei 5°C und 25°C, nach 6 Monaten bei 5°C und 25°C, nach einem Frost-Tau-Zyklus, nach mechanischer Beanspruchung sowie nach Hitzestress bei 55°C ( –C). Zum Beispiel zeigte die mit Histidin-Acetat gepufferte Formulierung ohne einen zusätzlichen Stabilisator (Proben-ID Nr.: #10) die höchste Fähigkeit TNFα nach 6 Monaten bei 5°C und 25°C zu neutralisieren, gefolgt von der mit Histidin-Acetat gepufferten Formulierung mit L-Arg (Proben-ID Nr.: #12) in Relation zum Zeitpunkt 0. Zusätzlich zeigte die mit Histidin-Acetat gepufferte Formulierung mit L-Arg (Proben-ID Nr.: #12) nach 3 Monaten bei 5°C und 25°C, nach einem Frost-Tau-Zyklus sowie mechanischem Stress die beste Leistung in Relation zum Zeitpunkt 0. Die mit Histidin-Citrat gepufferte Formulierung ohne einen zusätzlichen Stabilisator (Proben-ID Nr.: #07) zeigte nach 6 Monaten bei 5°C sowie nach Hitzestress bei 55°C die höchste TNFα-Neutralisierung in Relation zum Zeitpunkt 0. Alle verbleibenden Adalimumab-Formulierungen zeigen ähnliche Abbauraten hinsichtlich des untersuchten Stressfaktors ( , B). In Relation zu der Referenzformulierung zeigte die mit Histidin-Acetat gepufferte Formulierung ohne einen zusätzlichen Stabilisator (Proben-ID Nr.: #10) die höchste Fähigkeit TNFα nach 6 Monaten bei 5°C und 25°C zu neutralisieren, gefolgt von Histidin-Citrat (Proben-ID Nr.: #07) nach 6 Monaten bei 5°C. Die Histidin-Acetatpuffer-Formulierung mit L-Arg (Proben-ID Nr.: #12) zeigte insgesamt die beste Leistung hinsichtlich aller untersuchten Stressfaktoren ( , C). Die in Beispiel 9 und zusammengefassten Experimente wurden mit einem zweiten Satz an alternativen Adalimumab-Formulierungen durchgeführt. Die prozentuale TNFα Neutralisierung der erfindungsgemäßen alternativen Adalimumab-Formulierung wird relativ zu der Fähigkeit der HUMIRA^®-Referenzlösung TNFα zu neutralisieren ausgedrückt, d.h. Werte > 100 % zeigen an, dass die relative TNFα-Neutralisierungsaktivität, die durch die erfindungsgemäße Adalimumab-Formulierung beibehalten wird, höher ist als diejenige, die durch die Referenzlösung unter den gegebenen Bedingungen beibehalten wird.
Zusammenfassend stellt jede erfindungsgemäße Adalimumab-Formulierung hinsichtlich ihrer biologischen Aktivität eine verbesserte lagerungsstabile, flüssige pharmazeutische Antikörperformulierung dar.
Literaturverweise

Arakawa T, Philo JS, Ejima D, Tsumoto K, and Arisaka F (2006). Aggregation analysis of therapeutic proteins, part 1. Bioprocess International 4 (10), 42–49.
Chen B, Bautista R, Yu K, Zapata GA, Chamow SM, et al. (2003). Influence of histidine on the stability and physical properties of a fully human antibody in aqueous and solid forms. Pharm Res 20: 1952–1960.
Paborji M, Pochopin NL, Coppola WP, Bogardus JB (1994). Chemical and physical stability of chimeric L6, a mouse-human monoclonal antibody. Pharm Res 11: 764–771.
Sarno MEC, Vasquez RA, Yung S-G, Graf CR (1999). Stable intravenously-administrable immune globulin preparation. Baxter International Inc, US patent US 5945098 .
EMA/CHMP/BWP/247713/2012 (22.05.2014). Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: quality issues (revision 1)
U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration (February 2012). Guidance for Industry – Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product" (DRAFT GUIDANCE).
Public Health Service (PHS) Act §262. Public Health Service Act, Title 42: The Public Health And Welfare, Chapter 6a: Public Health Service, Subchapter II: General Powers and Duties, Part F: Licensing of Biological Products and Clinical Laboratories, Subpart 1 – Biological Products: §262 Regulation of Biological Products (http://www.fda.gov/regulatoryinformation/legislation/ucm148717.htm).
Kappelgaard AM, Bojesen A, Skydsgaard K, Sjögren I, Laursen T (2004). Liquid growth hormone: preservatives and buffers. Horm Res.62 Suppl 3: 98–103.
Frenken LA1, van Lier HJ, Jordans JG, Leunissen KM, van Leusen R, Verstappen VM, Koene RA (1993). Identification of the component part in an epoetin alfa preparation that causes pain after subcutaneous injection. Am J Kidney Dis. 22(4): 553–6.
Fransson J, Espander-Jansson A. Local tolerance of subcutaneous injections (1996). J Pharm Pharmacol. 48(10): 1012–5.
Kolhe P, Amend E, Singh SK (2010). Impact of freezing on pH of buffered solutions and consequences for monoclonal antibody aggregation. Biotechnol Prog. 26(3): 727–33.
Gatlin LA and Gatlin CAB (1999). Formulation and administration techniques to minimize injection pain and tissue damage associated with parenteral products. In Injectable Drug Development: Techniques to Reduce Pain and Irritation (Gapta PK and Brazeau GA eds) Interpharm Press, Denver 401–425.
Roskos LK, Davis CG and Schwab GM (2004). The clinical pharmacology of therapeutic monoclonal antibodies. Drug Devel Res 62(3): 108–120.
Pennica D, Nedwin GE, Hayflick JS, Seeburg PH, Derynck R, Palladino MA, Kohr WJ, Aggarwal BB, Goeddel DV (1984). Human tumour necrosis factor: precursor structure, expression and homology to lymphotoxin. Nature 312 (5996): 724–729
Wang W (1999). Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. Int J Pharm 185: 129–188.
Chi EY, Krishnan S, Randolph TW and Carpenter JF (2003). Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation. Pharmaceutical Research 20: 1325–1336.
Vermeer AWP and Norde W (2000). The thermal stability of immunoglobulin: Unfolding and aggregation of a multi-domain protein. Biophys J 76: 394–404.
Moore JM, Patapoff TW and Cromwell ME (1999). Kinetics and thermodynamics of dimer formation and dissociation for a recombinant humanized monoclonal antibody to vascular endothelial growth factor. Biochemistry 38 (42): 13960–13967.
Szenczi A, Kardos J, Medgyesi G and Zavodszky N (2006). The effect of solvent environment on the conformation and stability of human polyclonal IgG in solution. Biologicals 34(1): 5–14.
Wan HZ, Kaneshiro S, Frenz J and Cacia J (2001). Rapid method for monitoring galactosylation levels during recombinant antibody production by electrospray mass spectrometry with selective-ion monitoring. J Chrom A 913(1-2): 437–446.
Zheng JY, Janis LJ (2005). Influence of pH, buffer species, and storage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonal antibody LA298. Int J Pharm 308: 46–51.
Son K, Kwon C.Stabilization of human epidermal growth factor (hEGF) in aqueous formulation (1995). Pharm Res.12(3): 451–4.
Bam NB, Randolph TW, Cleland JL (1995). Stability of protein formulations: investigation of surfactant effects by a novel EPR spectroscopic technique. Pharm Res. 12(1): 2–11.
Wade AM and Tucker HN (1998). Antioxidant characteristics of L-histidine. J Nutr Biochem 9 (6): 308–315.
International Conference on Harmonization of Technical Requirements of Pharmaceuticals for Human Use. Quality of Biotechnological Products. Stability Testing of Biotechnological/Biological Products (ICH Q5C).
Cleland JL, Powell MF and Shire SJ (1993). The development of stable protein formulations: A close look at protein aggregation, deamidation, and oxidation. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4): 307–377.
Carpenter JF, Kendrick BS, Chang BS, Manning MC and Randolph TW (1999). Inhibition of stress-induced aggregation of protein therapeutics. Meth Enzymol 309: 236–255.
Remmele RL Jr, Callahan WJ, Krishnan S, Zhou L, et al (2006). Active dimer of Epratuzumab provides insight into the complex nature of an antibody aggregate. J Pharm Sci 95(1): 126–145.
Chelius D, Rehder DS, Bondarenko PV (2005). Identification and characterization of deamidation sites in the conserved regions of human immunoglobulin gamma antibodies. Anal Chem. 77(18): 6004–11.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2004/016286 [0005, 0050, 0054, 0060]
WO 2014/039903 [0041, 0041, 0041, 0099]
WO 2014/114651 [0041, 0056]
US 6090382 [0050, 0056]
WO 97/29131 [0050, 0056]
WO 2012/089778 [0099]
WO 2013/164837 [0099]
WO 2013/186230 [0099]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Arakawa T et al. 2006 [0003]
Chen B et al. 2003 [0004]
Paborji M et al. 1994 [0005]
Sarno MEC et al. 1990 [0005]
Kappelgaard A 2004 [0005]
Frenken et al. 1993 [0005]
Fransson et al. 1996 [0005]
Kolhe P et al. 2010 [0005]
Gatlin LA und Gatlin CAB 1999 [0006]
Roskos LK et al. 2004 [0006]
"Guideline on similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: Quality Issues (Revision 1)", EMA/CHMP/BWP/247713/2012 ab 22.05.2014 [0051]
"Guidance for Industry – Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product" (ENTWURF ANLEITUNG), U.S. Gesundheitsministerium, Bundesbehörde für Lebensmittel- und Arzneimittel-Überwachung ab Februar 2012 [0051]
Pennica D et al. 1984 [0056]
Paborji M et al. 1994 [0058]
Sarno MEC et al. 1999 [0058]
Wang W 1999 [0059]
Chi EY et al. 2003 [0059]
Vermeer AWP und Norde W 2000 [0059]
Moore JM et al. 1999 [0059]
Szenczi A et al. 2006 [0059]
Wan HZ et al. 2001 [0059]
Kappelgaard A 2004 [0060]
Frenken et al. 1993 [0060]
Fransson et al. 1996 [0060]
Zheng JY und Janis LJ 2005 [0060]
Son und Kwon 1995 [0060]
Son K und Kwon C 1995 [0060]
Kolhe P et al. 2010 [0060]
Paborji M et al. 1994 [0060]
Bam et al. 1995 [0067]
Chi EY et al. 2003 [0067]
Wade AM und Tucker HN, 1998 [0069]
Cleland JL et al. 1993 [0077]
Cleland JL et al. 1993 [0077]
Carpenter JF et al. 1999 [0077]
Remmele RL et al. 2006 [0077]
Chelius D et al. 2005 [0078]

Claims

Pharmazeutische Formulierung, die frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer ist und ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und nach Lagerung bei 5°C für 3 bis 6 Monate einen Gehalt an aggregierten Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 5 % aufweist; (b) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und nach Lagerung bei 25°C für 3 bis 6 Monate einen Gehalt an aggregierten Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 5 % aufweist; (c) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und nach Lagerung bei 25°C für 3 bis 6 Monate einen Gehalt an sauren Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 40 % aufweist; (d) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und unter Hitzestressbedingungen bei 55°C einen Gehalt an aggregierten Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 5 % aufweist; (e) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer gepufferten Lösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und unter Hitzestressbedingungen bei 55°C einen Gehalt an sauren Spezies von Adalimumab von etwa weniger als 40 % aufweist; (f) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer Pufferlösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und eine verbesserte Stabilität von mindestens 6 Monaten bei einer Temperatur von etwa 5°C oder 25°C aufweist; und (g) einer flüssigen, wässrigen pharmazeutischen Formulierung umfassend eine therapeutisch wirksame Menge an Adalimumab in einer Pufferlösung umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat, wobei besagte Formulierung einen pH-Wert von 5 bis 5,5 aufweist und nach Lagerung für 6 Monate bei einer Temperatur von etwa 5°C oder 25°C und/oder nachdem sie Hitzestress bei 55°C, Frost-Tau-Bedingungen bei –20°C bis 5°C und/oder mechanischem Stress ausgesetzt wurde, eine TNFα neutralisierende Aktivität von mindestens etwa 80 % beibehält.
Formulierung nach Anspruch 1, wobei die Konzentration des Antikörpers zwischen etwa 1 und 150 mg/mL liegt.
Formulierung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Konzentration des Antikörpers etwa 50 mg/mL ist.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die zusätzlich einen Polyalkohol, ein Tensid und Natriumchlorid umfasst.
Formulierung nach Anspruch 4, wobei der Polyalkohol Mannitol ist und das Tensid Polysorbat 80 ist.
Formulierung nach Anspruch 5, die 5–20 mg/mL Mannitol, 0,1–10 mg/mL Polysorbat 80 und 5 bis 7,5 mg/mL Natriumchlorid enthält.
Formulierung nach Anspruch 6, die etwa 12 mg/mL Mannitol, etwa 1 mg/mL Polysorbat 80 und etwa 6,2 mg/mL Natriumchlorid enthält.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, die zusätzlich (f) L-Arginin umfasst.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, die zusätzlich EDTA umfasst.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, die zusätzlich für subkutane Einmal-Injektion geeignet ist und in einem pharmazeutischen Behälter enthalten ist.
Vorgefüllter pharmazeutischer Behälter umfassend eine flüssige, wässrige pharmazeutische Formulierung mit einem pH-Wert von 5 bis 5,5, wobei die Zusammensetzung frei oder im Wesentlichen frei von einem Phosphat-Puffer ist und (a) Adalimumab; (b) einen Polyalkohol; (c) ein Tensid; (d) eine Pufferkomponente umfassend L-Histidin und (i) Citrat und/oder (ii) Acetat; (e) Natriumchlorid umfasst.
Behälter nach Anspruch 11, wobei die Formulierung zusätzlich (f) L-Arginin umfasst.
Behälter nach Anspruch 11 oder 12, wobei die Formulierung zusätzlich EDTA umfasst.
Behälter nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Formulierung frei oder im Wesentlichen frei von Dicarbonsäuren, Monosachariden, Oligosaccharide und/oder zusätzlichen Aminosäuren ist.
Behälter nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei die Formulierung (a) 20 bis 130 mg/mL Adalimumab; (b) 10–14 mg/mL Mannitol; (c) 0,1–5 mg/mL Polysorbat 80; (d) 0,1–0,5 mg/mL L-Histidin-HCl und 0,01–0,025 mg/mL L-Histidin-Base; (i) 0,1–1,5 mg/mL von Zitronensäure-Monohydrat und 0,25–3,5 mg/mL Trinatriumcitrat-Dihydrat und/oder (ii) 0,1–0,5 mg/mL Natriumacetat-Trihydrat und 0,01–0,05 mg/mL Essigsäure; und (e) 6,0–6,4 mg/mL Natriumchlorid umfasst.
Behälter nach Anspruch 15, wobei die Formulierung zusätzlich (f) 0,5–6,5 mg/mL L-Arginin-Base und/oder (g) 1–50 mg/mL, vorzugsweise 10 mg/mL EDTA umfasst.
Behälter nach einem der Ansprüche 11 bis 16, wobei die Formulierung 45 bis 55 mg/mL, vorzugsweise 50 mg/mL Adalimumab umfasst.
Behälter nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei die Formulierung zusätzlich für subkutane Einmal-Injektion geeignet ist.
Behälter nach einem der Ansprüche 10 bis 18, der eine Fertigspritze, ein Injektions-Pen, eine Ampulle, eine Flasche, ein Autoinjektor oder ein Infusionsbeutel ist.
Behälter nach einem der Ansprüche 10 bis 19, der unter Stickstoffschutzatmosphäre verschlossen wird.
Behälter nach einem der Ansprüche 10 bis 19, wobei die Dosisstärke von Adalimumab 20, 40, 80 oder 160 mg ist.
Ein Set von mindestens zwei Behältern nach einem der Ansprüche 10 bis 21, wobei die Behälter unterschiedliche Dosisstärken von Adalimumab haben.
Set von Behältern nach Anspruch 22, wobei verschiedene Dosisstärken durch unterschiedliche Füllvolumen der gleichen Formulierung erzeugt werden.
Set von Behältern nach Anspruch 22 oder 23, wobei verschiedene Dosisstärken in den Fertigspritzen 20, 40 und/oder 80 mg sind.
Formulierung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, Behälter nach einem der Ansprüche 10 bis 21 oder Set von Behältern nach einem der Ansprüche 22 bis 24 zur Verwendung als ein Arzneimittel zur Verwendung in der Behandlung einer Erkrankung, in der TNFα-Aktivität schädlich ist.
Formulierung, Behälter oder Set von Behältern zur Verwendung gemäß Anspruch 25, wobei die Erkrankung, in der TNFα-Aktivität schädlich ist, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Autoimmun- oder entzündlichen Erkrankung.
Formulierung, Behälter oder Set von Behältern zur Verwendung gemäß Anspruch 25 oder 26, wobei die Formulierung so hergerichtet ist, um einem diesbezüglich bedürftigen menschlichen Patienten subkutan nach einem zweiwöchentlichen Dosierungsschema alle 13–15 Tage verabreicht zu werden.
Behälter oder Set von Behältern zur Verwendung gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27 mit einer Dosisstärke von Adalimumab von 20 oder 80 mg und wobei Adalimumab so hergerichtet ist, um mit einer Gesamtdosis von 20, 40 oder 80 mg verabreicht zu werden.
Formulierung, Behälter oder Set von Behältern zur Verwendung gemäß einem der Ansprüche 25 bis 28, wobei die Formulierung in Kombination mit einem zusätzlichen Therapeutikum, das TNFα-Produktion oder -Aktivität hemmt, vorzugsweise Methotrexat, verabreicht werden soll.