DE202012101197U1

DE202012101197U1 - Glykoantigene mit Kohlenhydratdeterminanten

Info

Publication number: DE202012101197U1
Application number: DE201220101197
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Universitaet fuer Bodenkultur Wien BOKU
Priority date: 2012-04-02
Filing date: 2012-04-02
Publication date: 2012-04-26
Anticipated expiration: 2022-04-03

Abstract

Polymeres Glykoantigen bestehend aus kreuzreagierenden Kohlenhydratdeterminanten (CCD), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MUXF3, MMXF3, GnGnF3, MGnF3, GnMF3, MMF3, MUF3, GnGnX, MGnX, GnMX, MMX, MUX, GnGnXF3, MGnXF3, GnMXF3, MMF3, MGnGnF3, MGnF3 MMF3, MUF3, GnGnF3F6, MGnF3F6, GnMF3F6, MMF3F6, MUF3F6 und Glykane mit dem α1,3-Galaktose Epitop.

Description

GEBIET DER NEUERUNG
Die Neuerung betrifft polymere Glykoantigene mit kreuzreagierenden Kohlenhydratdeterminanten („cross-reactive carbohydrate determinant”, CCD) sowie Testvorrichtungen für die Diagnose von Allergie-Antigenen.
STAND DER TECHNIK
Allergene erzeugen üblicherweise ein spezifisches IgE, das für dieses einzigartig ist und nur mit diesem reagiert. Eine Person kann spezifisches IgE für mehr als eine Substanz aufweisen und daher auf mehr als eine Substanz allergisch sein. IgE-Tests sind üblicherweise als qualitative, halb-quantitative (mit einem Stufenergebnis je nach Schwere der Krankheit), oder quantitative Tests erhältlich. Dabei kommen oft gereinigte Extrakte, die aus den Haupt-Allergen-Quellen stammten, oder hochgereinigte oder rekombinante bzw. synthetische Allergene zum Einsatz.
Moderne Behandlungsmethoden von Allergien, wie die spezifische Immuntherapie erfordern die richtige Identifikation des Auslösers. Wo diese Allergenquelle, nicht so einfach erkannt werden kann, wie z. B. bei einer Katzen-Allergie, erfolgt diese Identifikation meist durch den Nachweis Allergen-spezifischer Antikörper der IgE-Klasse im Serum. Es gibt verschiedene Arten von in vitro-Methoden zur Diagnostizierung von Allergien, aufgrund des Vorhandenseins von IgE-Antikörpern in Proben von Blut oder Serum von möglichen Allergikern, darunter handelsübliche Immuntests, wie ELISA oder Westernblots unter Verwendung gereinigter oder rekombinanter Allergene.
Eine spezielle Art ist der Radio-Allergo-Sorbens-Test (RAST^®). Bei diesem Test wird ein spezifisches Allergen mit einem Träger, z. B. eine Papier-Scheibe oder ein Nitrozellulose-Streifen gekoppelt. Immunspezifisches IgE, sofern es im Test-Serum vorhanden ist, wird an den Träger gebunden. Die Detektion erfolgt mittels radioaktiv markiertem anti-IgE. Verschiedene Bewertungssysteme, die die Testergebnisse mit der absoluten Bindung einer negativen Kontrolle vergleichen, sind in Verwendung.
Sehr verbreitet ist ein weiterer Test, genannt UniCAP, für den natürliche oder rekombinante Allergene auf einer Festphasen-Struktur immobilisiert werden, wonach die Bindung von im Serum vorhandener Antikörper gegen die Allergene nachgewiesen wird. Die Detektion erfolgt hier durch Enzym-markiertes anti-IgE. Ein handelsüblicher Test wird z. B. von der Firma Phadia (Thermo Scientific/Phadia AB, Uppsala, Sweden) angeboten. Die Ergebnisse werden in kU/L angegeben und z. B. in 6 CAP-Klassen unterteilt.
Ein ähnliches Detektionsprinzip wird von Tests angewandt, bei denen mehrere Allergene streifen-, kreis-, oder punktförmig auf einen festen Träger aufgebracht werden. Ein Beispiel dafür ist der AllergyScreen Test (Mediwiss, Moers, Deutschland). Eine Neuentwicklung stellen Chip-basierte Testsysteme dar, bei Fluoreszenz-Messungen auf einem Biochip erfolgen, wie z. B. beim ImmunoCAP ISAC (Thermo Scientific/Phadia AB, Uppsala, Sweden).
Leider liefern diese Methoden oft falsche Ergebnisse. Die Zuckerstrukturen von Proteinen aus Insektengiften und Pflanzen weisen bemerkenswerterweise grosse Ähnlichkeit auf, was dazu führt, dass Antikörper gegen diese kreuzreaktiven Kohlenhydratdeterminanten, auch genannt CCD, an nahezu allen Glykoproteinen aus Pflanzen oder Insekten(-giften) binden. Diese CCDs lösen jedoch keine allergischen Reaktionen aus. In Proben vorhandenes anti-CCD IgE liefert aber bei der Allergie-Diagnostik aus Serum positive Messergebnisse, die somit als falsch-positive Ergebnisse eingestuft werden müssen (Mari A. (2002), Sturm et al. (2010)). Überdies reagiert ein solches Allergikerserum im Labor mit nahezu allen Allergenen. Um bei solchen Patienten den wahren Auslöser eine Allergie zu erkennen, muss man den Einfluss des anti-CCD IgEs ausschalten.
Die WO 2008/152040 A1 beschreibt ein Diagnoseverfahren zur Bestimmung von Allergen-spezischen Antikörpern in einer Probe, wobei vor der eigentlichen Bestimmung CCD spezifische Antikörper aus einer Probe entfernt werden, damit diese mit dem Test auf Allergen-reaktive Antikörper nicht interferieren. Die CCD spezifischen Antikörper werden an ein Trägermaterial adsorbiert, welches Glykoallergene aus glykomodifiziertem menschlichem Transferrin bzw. Fibrin-Glykopeptide enthält.
ImmunoCAP^® (Phadia, Freiburg, Deutschland) ist ein Test, bei dem zur Abklärung einer Kreuzreaktion mit CCD in einem CAP-Test die Allergenkomponente CCD MUXF3 als Marker zur Verfügung gestellt wird, sowie rekombinante Allergene, wie die Insektengift-Komponenten Bienengift oder Wespengift, die keine CCDs enthalten. Eine Reaktion mit dem Marker kann das Vorhandensein von CCD anzeigen.
Hemmer et al. (J Allergy Clin Immunol 2001; 108: 1045–52) beschreiben ein Verfahren zur Inhibition der CCD spezifischen Antikörper durch Inkubation der Probe mit einem CCD-Inhibitor vor der Bestimmung von Allergen-spezifischem IgE. Als CCD-Inhibitor werden Neoglykoproteine aus Bromelain oder Fibrin hergestellt, wobei die Proteine zuerst enzymatisch abgebaut und dann mit bovinem Serumalbumin (BSA) konjugiert werden.
Die oben Lösungsversuche erweisen sich jedoch als entweder zu zeitaufwendig, als bloße Indikatoren des Problems oder als potentiell unspezifisch aufgrund des möglichen Gehaltes an Protein-Determinanten, was zu unerwünschten Inhibitionen von IgE-Allergen Reaktionen führen könnte.
Die vorliegende Offenbarung stellt sich daher die Aufgabe, ein verbessertes Glykoantigen zur Verfügung zu stellen, das in einfacher und zuverlässiger Weise als Indikator sowie als Inhibitor für CCD-reaktive Antikörper in Allergie-Testsystemen verwendet werden kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER NEUERUNG
Die Aufgabe wird durch den beanspruchten Gegenstand gelöst und insbesondere durch ein polymeres Glykoantigen bestehend aus kreuzreagierenden Kohlenhydratdeterminanten (CCD), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MUXF³, MMXF³, GnGnF³, MGnF³, GnMF³, MMF³, MUF³, GnGnX, MGnX, GnMX, MMX, MUX, GnGnXF³, MGnXF³, GnMXF³, MMF³, MGnGnF³, MGnF³, MMF³, MUF³, GnGnF³F⁶, MGnF³F⁶, GnMF³F⁶, MMF³F⁶, MUF³F⁶ und Glykane mit dem α1,3-Galaktose Epitop, sowie eine Testvorrichtung zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gerichtet gegen ein Allergen in einer Probe, umfassend ein derartiges Glykoantigen und mindestens ein Allergen. Erfindungsgemäß wird also ein polymeres Glykoantigen zur Verfügung gestellt, das aus Kohlenhydratdeterminanten (CCD) besteht, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus MUXF³, MMXF³, GnGnF³, MGnF³, GnMF³, MMF³, MUF³, GnGnX, MGnX, GnMX, MMX, MUX, GnGnXF³, MGnXF³, GnMXF³, MMF³, MGnGnF³, MGnF³ MMF³, MUF³ GnGnF³F⁶, MGnF³F⁶, GnMF³F⁶, MMF³F⁶, MUF³F⁶ und Glykane mit dem α1,3-Galaktose Epitop, wie z. B. A⁴A^a3-4, A^a3-4A⁴ A^a3-4A^a3-4, A⁴A^a3-4F⁶, A^a3-4A⁴F⁶, A^a3-4A^a3-4F⁶. Bevorzugte Ausführungsformen hiervon und der Testvorrichtung sind in den Unteransprüchen beschrieben.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Die Erfindung wird nun zum besseren Verständnis anhand von Bespielen, Ausführungsformen und den Abbildungen beschrieben. Es zeigt.
1 ein Schema mit den Strukturen der eingesetzten Glykane und Zucker;
2 ein Schema mit den Substraten und Produkten der alpha1,3-Galaktosyltransferase – das Trisaccharid Galα1,3-Galβ1,3/4-GlcNAcβ1- kann aber auch in einer Reihe anderer Oligosaccharide enthalten sein;
3 fotographische Abbildungen zur Anwendung des CCD-Inhibitors auf Streifen mit Lebensmittelantigenen.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER NEUERUNG
Zur Struktur der Glykane siehe 1 (Oligo-saccharidstruktur in Pflanzen und Insekten) und 2 (Oligosaccharidstrukturen mit α1,3-Galaktose). Gemäß einer besonderen Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Glykoantigen zumindest MUXF³ und/oder MMXF³, und gegebenenfalls weitere CCD.
Diese CCD sind von nicht-menschlichen Glykoproteinen abgeleitet und etwa natürlichen, z. B. tierischen oder pflanzlichen^Ursprungs oder aber synthetisch hergestellt, und natürlicherweise für den Menschen xenogen. Diese CCD werden nachweislich vom menschlichen Immunsystem als immunogen erkannt.
Die CCD treten üblicherweise in Verbindung mit Allergen auf und unterscheiden sich von autogenen Determinanten, die z. B. mit menschlichen Proteinen, sog. „self” Proteine, Autoimmunerkrankungen oder Krebserkrankungen in Verbindung gebracht werden. Ferner kommen diese CCD auch im Zusammenhang mit mindestens zwei verschiedenen Allergenen vor und kreuzreagieren daher mit Serum bzw. Immunglobulinen eines Humanserum von Allergikern.
Das Glykoantigen wird insbesondere mit einer Reinheit von mindestens 96%, vorzugsweise mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% zur Verfügung gestellt, beispielsweise als Glykopeptid oder einer alternativen Struktur bestehend aus einem Träger und den Glykanen. Damit sind Verunreinigungen eines erfindungsgemäßen Glykopeptid-Präparates durch andere Epitope, z. B. Peptid-Epitope, praktisch ausgeschlossen. In einem reinen erfindungsgemäßen Präparat finden sich beispielsweise weniger als 4% (w/w) Verunreinigungen.
Insofern das Glykoantigen als Glykopeptid vorliegt, kann die Reinheit mittels Aminosäure-Analyse bestimmt werden, wobei jene Aminosäuren, die im Bereich des glykosylierten Asparagins, etwa ein oder zwei Reste vor oder nach dem glykosylierten Asparagin vorkommen können, mindestens 96%, vorzugsweise mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% aller enthaltenen (bestimmbaren) Aminosäuren darstellen müssen.
Glykopeptide erhältlich aus Bromelain, deren Sequenz um die Glykosylierungsstelle folgende ist: ARVPRNNESSMMYAVSK (SEQ ID 1) können vor allem die folgenden Bestandteile enthalten: die glykosylierte Aminosäure Asparagin (Asn) und in Folge Glutaminsäure (Glu) und gegebenenfalls weiter ein oder zwei Serin (Ser), wie man mittels ”Matrix-assisted laser-desorption ionization time-of-flight” (MALDITOF) Massenspektroskopie nachweisen kann. In einem erfindungsgemäßen Glykoantigen hoher Reinheit kann die Reinheit z. B. nach Hydrolyse bei 100°C über 16 h bestimmt werden, durch Bestimmung des Gehalts an den Aminosäuren des Peptidanteils. Beispielsweise werden in einem reinen Glykopeptid-Präparat aus Bromelain die Aminosäuren Asp (aus Asn), Glu, und Ser zu mindestens 96%, vorzugsweise mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% aller erhaltenen (bestimmbaren) Aminosäuren gefunden.
Glykopeptid-Präparate aus anderen Quellen mit unterschiedlichen Aminosäurenzusammensetzungen können gleichermaßen auf deren Reinheit untersucht werden.
Eine besondere Ausführungsform bezieht sich auf ein erfindungsgemäßes Glykoantigen bestehend aus Glykopeptiden, z. B. enthaltend als glykosylierte Aminosäure Asparagin (Asn), vorzugsweise in einem Präparat mit hoher Reinheit, sodass in einem Allergietest keine falsch-positiven Resultate erhalten werden, die auf eventuell vorhandene Peptid- oder Proteinepitope zurückzuführen sind.
Das erfindungsgemäße Glykoantigen zeichnet sich weiter durch den polymeren Charakter aus. Es hat sich herausgestellt, dass CCD-Monomere nur wenig reaktiv mit Patientenseren sind und daher für die Inhibition von relevanten Immunglobulinen bzw. Indikation von falsch-positiven Ergebnissen wenig geeignet sind. Polymere, z. B. mit einem Gehalt von mindestens drei CCD pro Molekül und somit mindestens drei Valenzen zeigen eine viel höhere Reaktivität, was einerseits die Inkubationszeit mit dem Probenmaterial erheblich verkürzt, etwa auf unter 10 min, vorzugsweise, weniger als 5, 4, 3 oder 2 min. Andererseits wird die Immunkomplex-Bildung mit dem Polymer durch dessen Avidität in vollständiger Weise erreicht, sodass in der Regel bei einem Überschuss an Glykoantigenen der Immunkomplex und nicht die Mischung der Bindungspartner (Antigen und Antikörper) vorliegt.
Insbesondere enthält das Glykoantigen mindestens drei CCD, vorzugsweise mindestens 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10. Üblicherweise wird in einer erfindungsgemäßen Glykoantigen-Präparation eine Verteilung erhalten, wobei mindestens 50% der enthaltenen Glykoantigene die Mindestanzahl der CCD enthalten. Der Gehalt an Glykoantigenen (und somit die Polyvalenz) kann mit MALDI-TOF Massenspektrometrie ermittelt werden.
Ein erfindungsgemäßes Glykoantigen enthält beispielsweise im Mittel 7 Monomere eines Glykopeptids, etwa des Glykopeptids MUXF³-Asn-R (R = 1 – max 3 andere Aminosäuren, wie Glu und gegebenenfalls in weiterer Folge ein oder zwei Ser). Weitere Beispiele sind ein Glykoantigen, das 4 Monomere von MMXF³-Asn-R und 3 Monomere von MMX-Asn-R (R = 1 – max 3 andere Aminosäuren) enthält; ein weiteres Beispiel kann je 2 Monomere von MMXF³, MGnXF³, GnMXF³ und GnGnXF³, jeweils mit – Asn-R enthalten. Ein weiteres beispielhaftes erfindungsgemäßes Glykoantigen kann im Mittel 7 oder mehr Monomere eines Glykopeptids mit α1,3-Galaktose enthalten.
Das erfindungsgemäße Polymer enthält jedenfalls eine Verbindung von Monomeren und ist entweder als Homopolymer oder als Heteropolymer mit einem Gehalt an unterschiedlichen Monomeren ausgestaltet. Die Verbindung wird üblicherweise über eine kovalente Bindung erreicht, z. B. durch Konjugation der Monomere mittels Dinitrodifluorobenzol, durch Einführung von reaktiven Gruppen (Vinylgruppen) und Co-Polymerisation mit Acrylamid, oder aber auch durch kovalente Bindung an einem festen, voraktivierten Träger wie z. B. NHS- oder CNBr-aktivierte Agarose. Dabei können beispielsweise Glykopeptid-Monomere miteinander zu einem Polymer verbunden werden, gegebenenfalls auch mithilfe eines festen Trägers. Alternativ können auch Glykan- oder CCD-Monomere mithilfe einer Trägerstruktur miteinander verbunden werden, z. B. an einem molekularen oder festen Träger immobilisiert werden.
Das erfindungsgemäße Glykoantigen kann entweder als isolierter Bestandteil, z. B. zwecks Inhibition der unerwünschten Glykoantigen-IgE Bindungen, oder als Komponente eines Testsystems zur Verfügung gestellt werden, oder in Verbindung mit mindestens einem weiteren immuntoleranten Bestandteil. Ein solcher immuntoleranter Bestandteil ist üblicherweise nicht immunogen, daher finden sich auch keine entsprechenden Antikörper in humanem Normalplasma (von gesunden Patienten).
Ein Test zur Bestimmung der Immuntoleranz einer Substanz wird beispielsweise über die Bestimmung der Reaktivität mit Immunglobulinen aus menschlichem Plasma vorgenommen, etwa Normalplasma, mit geeigneten ELISA-Tests. Normalplasma wird üblicherweise aus einem großen Pool von Plasmaspendern hergestellt, und enthält eine standardisierte Menge an Immunglobulinen mit standardisierter Spezifität. Da von gesunden Plasmaspendern ausgegangen wird, finden sich nur solche Immunglobuline, die durch Kontakt mit Immunogenen aufgrund einer früheren Exposition, z. B. mit Krankheitserregern, entstanden sind. Keinesfalls finden sich Autoantikörper, z. B. gegen körpereigene Proteine. Normalplasma oder ähnliches Material kann daher als Negativkontrolle in einem Allergietest eingesetzt werden. Eine Substanz wird beispielsweise als immuntolerant im Sinne der gegenständlichen Erfindung betrachtet, wenn eine IgE-Reaktivität geringer als 0.10 IU/mL gemessen wird. (1 IU/mL = 3.4 ng IgE pro ml gemessen mit dem WHO Referenz Reagens für humanes Serum IgE, lot 75/502, NIBSC, Hertfordshire, UK).
Da nicht völlig auszuschliessen ist, dass Normalplasma Antikörper mit Reaktivität mit einem oder mehreren CCDs enthält, kann der Test auch mit den immuntoleranten Einzelkomponenten oder nach enzymatischer Entfernung der Glykoantigene mit Peptid:N-Glykosidase A oder in Gegenwart von nicht-gekoppeltem Glykoantigen (z. B. Glykopeptide aus einer anderen Quelle als der zu testenden, sodass nur der Glykan-Teil, nicht aber der Peptidteil gleiche Determinanten tragen) in entsprechender Konzentration (z. B. 50 μg/mL) durchgeführt werden.
Als weiterer immuntoleranter Bestandteil werden etwa Peptidsequenzen bestehend aus 1-4, vorzugsweise 2-4 Aminosäuren eingesetzt. Diese sind synthetischer Natur oder werden durch enzymatischen Abbau von gereinigten, natürlicherweise vorkommenden Proteinen erhalten, wie z. B. Bromelain, Ascorbat Oxidase, Patatin, Phospholipase A2 aus Bienengift, Rinderfibrin oder anderen Glykoproteinen. Peptid-Epitope werden üblicherweise von Peptidsequenzen mit einer Länge von mindestens 7 Aminosäuren ausgebildet. Kürzere Verbindungen von Aminosäuren weisen keine Reaktivität mit Antikörpern auf, und sind in der Regel immuntolerant.
Der erfindungsgemäß eingesetzte immuntolerante Bestandteil kann auch ein menschliches Protein, dessen Derivat oder Fragment enthalten. Aufgrund der autologen Herkunft des „self”-Proteins gelten diese auch als immuntolerant. Beispielsweise kann humanes Serumalbumin (HSA), humanes Serumtransferrin oder humanes α1-Antitrypsin eingesetzt werden, oder dessen Derivate, zB. Konjugate, oder Fragmente, die nachweislich in einem immunologischen Testsystem nicht-immunogen sind bzw. keine Reaktion mit menschlichem Normalplasma zeigen.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Glykoantigen auf einem festen Träger aufgebracht, beispielsweise ein Träger ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus synthetischen Polymeren, Nanopartikeln, Kügelchen, Streifen, Scheibchen, Plättchen oder Stäbchen oder Gefäßoberflächen. Der Träger kann eventuell als Behälter zur Aufnahme von Probenflüssigkeit ausgestaltet sein, z. B. mit entsprechenden Kavitäten, Näpfchen oder Mikrotiterplatten. Diese erlauben den einfachen Kontakt mit dem Glykoantigen während der Inkubation mit dem Probenmaterial. Eine weitere Ausführungsform bezieht sich auf Träger, auf die das Glykoantigen etwa mit einer saugfähigen Schicht zur Aufnahme von Probenflüssigkeit aufgebracht ist. Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Glykoantigen das zur vereinfachten Dosierung auf einen Träger aufgebracht ist, und sich dann für den Kontakt mit dem Probenmaterial vom Träger löst.
Üblicherweise wird das erfindungsgemäße Glykoantigen auf den Träger aufgebracht und in getrockneter Form zur Verfügung gestellt. Die bevorzugte Ausführungsform betrifft ein lagerstabiles Präparat des Glykoantigens. Dieses kann Stabilisatoren, Konservierungsmittel oder Farbstoffe enthalten, und/oder durch Trocknen erhalten werden, z. B. Trocknen in einem Trockenschrank, Sprühtrocknen oder Lyophilisieren. Üblicherweise enthält ein lagerstabiles Trockenpräparat eine Restfeuchte von weniger als 2% (w/w).
Ein erfindungsgemäßes Glykoantigen-Präparat, das üblicherweise für eine Allergie-Testung eingesetzt wird, enthält eine geeignete Menge an Glykoantigenen, die einen Überschuss im Verhältnis zur erwarteten Menge an Antikörpern darstellt. Beispielsweise wird als Inhibitor mindestens eine Menge von 2 μg pro mL, vorzugsweise mindestens 5, 10, 15, 20, 25 oder 30 μg pro mL verwendet. Beispielsweise werden 20 μg pro mL eingesetzt. Diese Konzentration des Inhibitors wird beispielsweise erreicht, indem zu 490 μL Patientenserum 10 μL einer Inhibitorlösung, welche 1 mg Glykoantigen-Präparat pro mL enthält zugesetzt wird.
Eine geeignete Menge als CCD-Indikator, zur Bestimmung des Vorhandenseins von CCD-Antikörper in einer Probe bzw. einer Kreuzreaktivität, die für die Bestimmung der Allergie nicht relevant ist, wird beispielsweise erreicht, indem mit dem CCD-Indikator etwa in Form eines Glykopeptids oder gekoppelten Glykans oder Glykopeptids ähnlich verfahren wird wie mit Allergenen oder Allergenextrakten. Beispielsweise wird eine Lösung des Glykoantigens (2 bis 100 μg/mL) mit dem für die IgE-Bestimmung vorgesehenen, chemisch aktivierten festem Träger inkubiert, um eine Immobilisierung zu erreichen.
Es hat sich herausgestellt, dass die relevante Menge durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Polymers mit einer Mindestanzahl von CCD bzw. einer Mindestanzahl von Glykanen und damit einer Polyvalenz reduziert werden kann. So konnte in vielen Fällen die Konzentration des Inhibitors in einem CAP-Test auf 20 μg/mL oder weniger verringert werden. Der Polyvalenz-Effekt, also die räumliche Nähe der Glykanepitope, kann etwa durch die höhere Anzahl der Monomere im Polymer erhöht werden, oder aber durch die Bindung an einen festen Träger, der zur Aufnahme von einer Vielzahl von Glykoantigenen geeignet ist. So können gleichartige oder verschiedene Glykoantigene entweder auf einem Trägermaterial aufgebracht werden, um die Valenz zu erhöhen, z. B. an einem Kügelchen oder Partikel. Die erfindungsgemäßen Glykoantigene können aber auch miteinander durch chemische Reaktion, z. B. durch Einführung von reaktiven Gruppen (Vinylgruppen) und Co-Polymerisation mit Acrylamid vernetzt werden, mit oder ohne Bindung an weitere Bestandteile, z. B. immuntolerante oder inerte Stoffe, wie. zB. humane Proteine.
Ein bevorzugtes Glykoantigen-Präparat besteht etwa aus den Glykopeptiden MUXF³- X, wobei X ein Asn mit einer Glykosylierungsstelle ist und gegebenenfalls in weiterer Folge eine Peptid-Sequenz, beispielsweise X=Asn-Glu, Asn-Glu-Ser oder Asn-Glu-Ser-Ser (SEQ ID 2), gegebenenfalls konjugiert an HSA.
Eine Konjugation der Monomere untereinander bzw. der Glykane an einem Träger kann etwa auch unter Verwendung eines geeigneten Linkers vorgenommen werden, dies jedoch unter der Voraussetzung der Immuntoleranz des Linkers. Dafür werden beispielsweise Materialien oder Sequenzen eingesetzt, die im menschlichen System nachweislich nicht immunogen sind bzw. die mit einer Negativkontrolle z. B. Normalplasma keine Immunkomplexe bilden.
Ein geeignetes Trägermaterial ist etwa Agarose, Dextran, Zellulose oder Nitrozellulose, aber auch Kunststoffe, die üblicherweise als Träger für diagnostische Zwecke eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Glykoantigen wird vorteilhafterweise in einem Testsystem oder in einer Testvorrichtung eingesetzt, etwa in einer Testvorrichtung zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gerichtet gegen ein Allergen in einer Probe, umfassend das erfindungsgemäße Glykoantigen und mindestens ein Allergen. Als Allergen wird etwa eine Substanz mit mindestens einem für das Allergen spezifischen Epitop eingesetzt.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung enthält vorteilhafterweise, insbesondere für Reihenversuche, mindestens vier verschiedene Allergene, vorzugsweise mindestens 5, 6, 7, 8, 9, 10, aber auch eine höhere Anzahl von etwa mindestens 20, 30, 40, 50, sogar mindestens 100 Allergenen, je nach Ausformung der Testvorrichtung.
Geeignete Testvorrichtungen enthalten ein oder mehrere Allergene, beispielsweise mindestens ein Allergen oder Protein, ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Insektengift, wie Bienen-, Wespen- oder Hummelgift, Inhalationsallergene wie beispielsweise Stäube aus pflanzlichem Material wie Holz oder Mehl, aber vor allem Pollen von beispielsweise Lieschgras (Phleum pratense), Wesenrispengras (Poa pratensis), Birke, Erle, Haselnuss, Esche, Hainbuche, Roggen, Beifuss (Ambrosia vulgaris), Traubenkraut (Artemisia artemisiifolia), Spitzwegerich und andere, aber auch Tierhaare (Katze, Hund) oder Milben, Kontaktallergene wie insbesondere Latex, und Nahrungsmittelallergene wie beispielsweise Erdnuss, Haselnuss, Karotte, Sellerie, Ei, Milch, Weizenmehl, Soja, Apfel, Sellerie, Kuhmilch, Hühnerei, Fisch. Die verwendeten Allergene werden als Rohextrakte, in mehr oder weniger gereinigter Form und/oder als rekombinante Proteine eingesetzt.
Üblicherweise enthält die Testvorrichtung jene Glykoantigene, deren CCDs natürlicherweise gemeinsam mit den zu bestimmenden Allergenen auftreten können, etwa aufgrund der gleichen Quelle. Ein sehr breit einsetzbares Glykoantigen könnte MUXF³ oder MMXF³ enthalten für Insektengifte, Milben und alle pflanzlichen Allergene. Insbesondere für Insektengifte geeignet ist der Einsatz von MMF³ und/oder MMF³F⁶ – Glykoantigenen. Für pflanzliche Allergene kann der Einsatz von MUXF³, MMXF³, oder auch MUXF³ und MMXF³ sowie GnGnF³, MGnF³, GnMF³, MMF³, MUF³, GnGnX, MGnX, GnMX, MMX, MUX, GnGnXF³, MGnXF³, GnMXF³, MMF³, MGnGnF³, MGnF³ MMF³, MUF³, GnGnF³F⁶, MGnF³F⁶, GnMF³F⁶, MMF³F⁶, MUF³F⁶ (1) sinnvoll sein. Für Allergene von Säugetieren kann ein Glykoantigen mit α1,3-Galaktose gewählt werden, welches das Disaccharid Gal-α1,3-Gal-β1- enthält, beispielsweise A⁴A^a3-4, A^a3-4A⁴, A^a3-4A^a3-4, A⁴A^a3-4F⁶, A^a3-4A⁴F⁶ und A^a3-4A^a3-4F⁶ (2).
Die erfindungsgemäße Testvorrichtung kann das oder die Allergene in einer Form enthalten, die für die Reaktion mit dem Probenmaterial unmittelbar geeignet ist. Hier sind beispielhaft, wie zuvor für die Glykoantigene beschrieben, die geeigneten festen Träger, Behälter und insbesondere Streifen zu nennen.
Insbesondere weist die Testvorrichtung einen Träger zur Aufnahme des Glykoantigens und/oder des Allergens auf. Geeignete Träger sind etwa ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Polymeren, Nanopartikeln, Kügelchen, Streifen, Scheibchen, Plättchen oder Stäbchen oder Gefäßoberflächen.
Dabei kann ein Gehalt an Glykoantigen und Allergen in einer Mischung vorteilhaft sein, etwa bei Verwendung des Glykoantigens als Inhibitor.
Eine weitere Ausführungsform sieht allerdings die räumliche Trennung des Glykoantigens und eines Allergens vor, beispielsweise das Glykoantigen an einem Referenzort und das Allergen an einem Bestimmungsort.
Gemäß einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung weist ein fester Träger das Glykoantigen und das Allergen an unterschiedlichen Orten auf.
Bei Verwendung von mehreren verschiedenen Allergenen kann es von Vorteil sein, dass auch diese an unterschiedlichen Bestimmungsorten zur Verfügung gestellt werden. Die räumliche Trennung kann etwa durch das Aufbringen an unterschiedlichen Trägern erreicht werden, z. B. Partikeln oder Streifen, oder an einem einzigen Träger an vorbestimmten Positionen für den Referenzort und den (die) Bestimmungsort(e). Dafür können etwa Mikrotiterplatten, Sektoren auf flächigen Trägern oder Kompartimente auf Streifen dienen. Diese Ausführungsform ist beispielsweise für die Verwendung des Glykoantigens als Indikator (auch Referenz genannt) geeignet, da damit die simultane und/oder parallele Bestimmung der Reaktion des Probenmaterials mit dem Indikator und den Allergenen in einem Ansatz ermöglicht wird.
Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Streifen zur Durchführung eines Streifentests, mit dem erfindungsgemäßen Glykoantigen als Indikator oder Referenz und mindestens vier verschiedenen Allergenen an unterschiedlichen Positionen.
Eine Ausführungsform betrifft einen Streifen, der weiter eine Positiv- und/oder Negativkontrolle an verschiedenen Positionen aufweist.
Gemäss einer weiteren besonderen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der Testvorrichtung um eine Mikrotiterplatte, bei der mindestens ein Teil der Kavitäten mit dem Glykoantigen und einem oder mehreren verschiedenen Allergenen beschichtet ist. Damit sind insbesondere Reihenversuche möglich zur Bestimmung einer Reihe von Allergen-spezifischen Antikörpern in einer Probe, oder auch zur Bestimmung einer Reihe von Proben in einem Ansatz.
Das erfindungsgemäße Glykoantigen bzw. die erfindungsgemäße Testvorrichtung werden vorteilhafterweise in einem Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Allergenen in Probenmaterial von möglichen Allergikern zur Unterstützung einer Diagnose eingesetzt, etwa für die Bestimmung des gesamten Immunglobulins und insbesondere IgE. Dafür können etwa übliche Testsysteme, wie CAP-Tests oder Streifentests herangezogen werden.
Dafür wird üblicherweise eine zu analysierende Probe mit dem Allergen in Kontakt gebracht, und inkubiert. Eine eventuelle Reaktion mit einem vorhandenen Immunglobulin weist auf eine Allergie hin, wenn die Reaktion mit CCD ausgeschlossen ist. Die Menge an gebundenem IgE wird in iU/mL auf einer Skala von 0 bis 100 ausgedrückt, wobei Ergebnisse ab 0.35 iU/mL als positiv betrachtet werdend.
Dieser Ausschluss der falsch-positiven Ergebnisse wird dabei in geeigneter Form durch vorheriger oder gleichzeitiger Inkubation der Probe mit dem Glykoantigen als Inhibitor erreicht. Hier bewirkt die Inkubation eine Unterdrückung der Bindung der irrelevanten anti-CCD Antikörper an die gebundenen Allergene, z. B. in kompetitiver Weise. Der erfindungsgemässe Inhibitor ist beispielsweise in der Lage, die Reaktion von Patienten IgE mit den CCDs von Allergenen soweit abzuschwächen, dass das Ergebnis kleiner 0.35 iU/mL und somit negativ wird.
Alternativ oder ergänzend dazu kann das erfindungsgemäße Glykoantigen auch als Indikator für falsch-positive Ergebnisse herangezogen werden, z. B. wenn in einer parallelen Anordnung das Probenmaterial mit dem Indikator inkubiert wird und eine eventuelle Reaktion mit CCD angezeigt wird. In diesem Fall kann eine Reaktion mit dem Allergen nicht eindeutig identifiziert werden, und weitere Tests zur Bestimmung des wahren Allergens wären angezeigt.
Als geeignetes Probenmaterial steht etwa Blut, Serum, Urin oder Saliva zur Verfügung, insbesondere werden Blut- oder Serumproben eingesetzt. Je nach Testvorrichtung reicht üblicherweise eine Menge von 5 bis 1000 μL aus.
Sofern Immunglobuline des Probenmaterials mit dem erfindungsgemäßen Glykoantigen und/oder einem Allergen reagiert, kann der entsprechende Immunkomplex durch übliche Detektionsmethoden bestimmt werden. Vorzugsweise werden. Enzym- (z. B. Phosphatase, Peroxidase, Galaktosidase) oder Radioimmunoassays vorgenommen.
Nach Inkubation mit dem Probenmaterial und/oder Indikator und/oder einer Kontrolle, werden Antigen-gebundene Antikörper mittels geeigneter Substanzen nachgewiesen. Diese Substanzen können weitere Antikörper, Fragmente von Antikörpern oder hochaffine Liganden wie z. B. Avidin, das eine Biotin-Markierung bindet, sein. Weiter können Enzyme zum Einsatz kommen, beispielsweise die Peroxidase, alkalische Phosphatase, beta-Galaktosidase, Urease oder Glucoseoxidase. Durch Zugabe eines chromogenen Substrats können die gebundenen Enzyme und damit beispielsweise die gebundenen Antikörper quantifiziert werden.
Dieser immunologische Nachweis kann mittels bekannter Methoden durchgeführt werden, wobei zur Detektion der Antikörper gegen ein CCD und/oder ein Allergen jedes beliebige direkte oder indirekte Verfahren zur Anwendung kommen kann. Dabei sind sowohl Flüssigphasenimmunassays als auch Festphasenimmunoassays denkbar (vgl. auch Price, C. P. und Newman, D. J., a. a. O. Principles and Practice of Immunoassay, 2nd Ed., 1997, Stockton Press, New York).
Dazu werden beispielsweise das Glykoantigen und/oder das Allergen an eine feste Phase gebunden, mit dem Probenmaterial, die die nachzuweisenden Immunglobuline, insbesondere die spezifischen IgE-Antikörper enthalten, inkubiert und die Bindung über enzym- oder fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper gegen die Antikörper des Patienten, z. B. Anti-IgE- und/oder Anti-IgG-Antikörper nachgewiesen. Als Detektionssystem werden etwa die Enzyme Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Galaktosidase und die entsprechenden Substrate bevorzugt.
Die Erfindung betrifft ferner ein Set zur Durchführung des genannten in vitro-Verfahrens zur Bestimmung von Allergen-spezifischen Antikörpern in einer Probe, das das erfindungsgemäße Glykoantigen und gegebenenfalls ein oder mehrere der Allergene und gegebenenfalls einen geeigneten festen Träger, und/oder weitere zur Durchführung des Diagnose- bzw. Nachweisverfahrens erforderliche oder nützliche Reagenzien und Hilfsmittel.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen weiter beschrieben.
BEISPIELE
1) Präparation eines Glykopeptids mit CCD-Strukturen
Eine Präparation des erfindungsgemäßen Glykoantigens wird derart hergestellt, dass der mögliche Gehalt an Epitopen, die nicht die bewussten Kohlenhydrat-Epitope darstellen, minimiert wird. Daher wird bereits zu Beginn der Präparation von einem Glykoprotein mit einem Reinheitsgrad von über 90% ausgegangen. Im Falle von Glykoproteinen, die als Gemisch von Isoformen auftreten, ist die Summe der Isoformen als Glykoproteinen zu betrachten und nicht die einzelnen Isoformen.
1a) Bromelain Glykopeptide
Bromelain wird als Rohpräparat „Pineapple stem bromelain” z. B. von Sigma-Aldrich oder von AppliChem bezogen. Das Präparat (30 g) wird in 200 mL 0,05 M Kaliumdihydrogenphosphat Puffer pH 6.1 für 1 h bei 4°C gelöst. Unlösliche Bestandteile werden abzentrifugiert bei 15.000 x g. Der Überstand wird auf 300 mL eine 5 × 17 cm Säule mit SP-Sephadex C-50 (GE Healthcare) aufgetragen. Dieser Kationentauscher wurde vorher mit 0.05 M KH₂PO₄ pH 6.1 (Startpuffer) äquilibriert.
Nicht-bindende Bestandteile werden mit 3 Säulenvolumen Startpuffer ausgewaschen. Anschließend wird das gebundene Bromelain mit 0.3 M NaCl in Startpuffer eluiert. Die Fraktionen werden zunächst auf UV Extinktion bei 280 nm geprüft und können einer Analyse mittels SDS-PAGE unterzogen werden (dazu siehe Punkt 4), um eine Reinheit der Proteinfraktion von über 90% zu erzielen.
Die Bromelain-haltigen Fraktionen werden vereint und Bromelain wird daraus durch Fällung mit Aceton gewonnen. Dazu wird die eisgekühlte Proteinlösung mit demselben Volumen Aceton versetzt. Nach 30 min wird mit 8000 rpm (Sorvall GSA Rotor) zentrifugiert. Das Zentrifugat wird in Wasser aufgenommen.
Das getrocknete Bromelain (lyophilisierter Niederschlag der Acetonfällung) wird nun in 0.15 M Tris/HCL pH 7.8 1 mM CaCl₂ gelöst (100 mL Puffer pro g Bromelain). Das gelöste Bromelain wird nun im Wasserbad bei 80°C für 30 min denaturiert. Dann wird Pronase (aus Streptomyces griseus, Sigma Protease Typ XIV) im Verhältnis 1:50 zugesetzt und der Ansatz bei 37°C über Nacht inkubiert. Alternativ kann das Bromelain auch durch Proteinase K (Tritirachium album), Pepsin oder eine andere unspezifisch wirkenden Protease verdaut werden.
Die entstandenen Glykopeptide werden von Peptiden und Aminosäuren durch Gelpermeationschromatographie auf Sephadex G-25 coarse, GE Healthcare (2.5 × 120 cm Säule) mit 1% Essigsäure als Laufmittel getrennt. Kohlenhydrat-hältige Fraktionen im Bereich des Ausschlussvolumens der Säule werden vereinigt und mittels Rotavapor konzentriert.
Die Glykopeptid-Fraktion wird getrocknet und einem nochmaligen Pronase-Abbau unterzogen. Diesmal wird Pronase allerdings nur im Massenverhältnis 1:200 bezogen auf die ursprüngliche Proteinmenge zugegeben. Die Probe wird nun zur Abtrennung auch höhermolekularer Bestandteile mittels Gelfiltration über Sephadex G-50 superfine, GE Healthcare (2.5 × 120 cm Säule) mit 1% Essigsäure gereinigt.
Die Glykopeptid-Fraktion wird nach diesem Schritt mittels Massenspektroskopie analysiert und enthält als Hauptkomponente das Tripeptid Asn(glykan)-Glu-Ser. Pentapeptide machen höchstens 5% der Peakhöhe des Tripeptids aus.
Die Glykopeptide werden nun durch Anionenaustausch-Chromatographie weiter gereinigt. Dazu wird Sephadex DEAE A-25 (GE Healthcare) mit 50 mM Ammoniumacetat von pH 8.8 äquilibriert und in einer Säule (2.5 × 20 cm) vorbereitet. Die Hauptfraktion des Glykopeptids eluiert nach dem Durchbruch und wird nun gefriergetrocknet.
Zur sicheren Entfernung höhermolekularer Komponenten wird das Glykopeptid nun noch über poröses, graphitisches Carbon gereinigt. Dazu werden Carbon SPE Kartuschen (z. B. Superclean ENVI-Carb SPE, 250 mg, Sigma-Aldrich) verwendet, die vor dem Probenauftrag mit 20% Acetonitril in Wasser gewaschen werden und dann mit Wasser vorbereitet werden. Nach dem Probenauftrag wird nicht-bindendes Material mit 4 mL Wasser ausgespült. Das gebundene Glykopeptid wird mit 20% Acetonitril eluiert und gefriergetrocknet. Das Material ist nun fertig für die Kopplung an einen Träger.
Alternative Reinigungsschritte:

– Hochmolekulare Komponenten können auch durch Ultrafiltration entfernt werden, z. B. mit einem Amicon-Filter mit einer Ausschlussgrenze von 10 kDa.
– Glykopeptide werden spezifisch angereichert, wenn man die Fraktion nach Anionenaustausch-Chromatographie mit Ammoniumacetat (siehe oben) nochmals über Sephadex DEAE A-25 (GE Healthcare) reinigt, aber diesmal mit 0.02 M Natriumborat pH 8,8 als Startpuffer. Dieses reagiert mit den Zuckern unter Bildung anionischer Komplexe. Die Elution erfolgt mit 0.3 M NaCl in obigem Startpuffer. Die Entsalzung erfolgt anschliessend mittels Gelfiltration auf Sephadex G25 (wie oben beschrieben).

1b) Glykopeptide aus anderen natürlichen Quellen
Durch ähnliche Verfahren können Glykopeptide aus anderen Materialien hergestellt werden. Diese können dann andere Glykanstrukturen aufweisen, wie z. B. MMXF³- oder GnGnXF³-Glykane (siehe 1). Aus Kartoffeln wird mittels Anionenaustauschchromatographie Patatin gewonnen, welches hauptsächlich die MMXF³ Struktur enthält.
Eine weitere Glykanstruktur von Interesse ist GnGnXF³, das man aus Proteinen des Karfiols in vergleichsweise hoher Konzentration isolieren kann. Wiederum andere Quellen könnten als Hauptkomponenten GnMXF³ oder MGnXF³ enthalten. In diesen Fällen ist eine Reinigung eines bestimmten Glykoproteins bzw. Glykopeptids nicht möglich, daher muss grösseres Augenmerk auf die Reinigung der Glykopeptid-Fraktion gelegt werden. Diese erfolgt – zusätzlich zu den oben genannten Maßnahmen – durch differentielle Anionenaustausch-Chromatographie. Dabei wird vor oder nach der Anionenaustauschreinigung in Ammoniumacetat der Schritt mit Ammoniumborat-Puffer durchgeführt. Dadurch erhält man eine spezifische Anreicherung der mit Borat einen anionischen Komplex bildenden Glykopeptide gegenüber nicht-glykosylierten Peptiden.
Dazu bindet man das Glykopeptid an einen Anionenaustauscher mit 0.02 M Natriumborat pH 8,8 als Startpuffer in einer Säule (2.5 × 20 cm) mit Sephadex DEAE A-25 (GE Healthcare). Der Elutionspuffer enthält 0.3 M NaCl in obigem Startpuffer.
Wiederum andere Glykanstrukturen, nämlich MMF³ und MMF³F⁶ (Difukosylierung) findet man auf der Phospholipase des Bienengifts, die sich durch Gelfiltration auf in bereits sehr reiner Form gewinnen lässt.
1c) Künstliche Glykopeptide als CCD-Indikator bzw. CCD-Inhibitor
Man geht aus von Glykopeptiden mit GnGn- oder GnGnF⁶-Struktur, die z. B. aus bovinem Fibrin (GnGn) oder porcinem Fibrin (GnGnF⁶-Struktur) gemäss dem Reinigungsschema unter Punkt 1a) isoliert werden, wobei hauptsächlich Peptide mit der Struktur Gly-Glu-Asn(CHO) entstehen.
Parallel exprimiert man rekombinante core α1,3-Fukosyltransferase aus Pflanzen oder Insekten (Z. B. entsprechend der Sequenz Uniprot Q9ST51, Q9LJK1, QOVH31 aus Pflanzen oder Q05GU3 und Q9VUL9 aus Insekten entweder mit oder ohne Transmembran-Domäne. Geeignete Expressionssysteme sind Hefezellen (z. B. Pichia pastoris), Insektenzellen (z. B. Sf9 Zellen) oder Säugetierzellen. Insbesondere wird man die Fukosyltransferase mit einem Tag für die Reinigung versehen (Bencurova et al., 2004).
Durch Inkubation von GnGn- oder GnGnF⁶-Peptiden mit der Fukosyltransferase und GDP-Fukose (Kyowa Hakko Europe GmbH, Düsseldorf) entstehen GnGnF³ bzw. GnGnF³F⁶. Daraus kann mithilfe von β-N-Acetylglucosaminidase aus Schwertbohnen (Europa Bioproducts EU223) MMF³ bzw. MMF³F⁶ hergestellt werden, aber auch die Zwischenprodukte GnMF³/MGnF³ bzw. GnMF³F⁶/MGnF³F⁶.
Analog zur Fukosyltransferase kann man Xylosyltransferase in Gegenwart von UDP-Xylose (Complex Carbohydrate Research Center, Athens, GA) verwenden um GnGnX bzw. MMX und die Zwischenprodukte zu erhalten. Bei Einsatz beider Enzyme erzeugt man GnGnXF³ bzw. MMXF³.
1d) Präparation eines Glykopeptides mit α1,3-Galaktosyl-Determinanten (Galili-Epitop)
Bovines oder porcines Fibrin, humanes Fibrin(ogen) oder auch Hühnereigelb können als Quelle für die Isolierung von dianntennären Glykopeptiden dienen (Bencurova et al., 2004). Triantennäre N-Glykane können z. B. aus bovinem Fetuin gewonnen werden. Es kommen die oben genannten Verfahren zur Entfernung von Peptid-Determinanten und Verunreinigungen zur Anwendung.
Die so gewonnenen Glykopeptide werden nun durch Anwendung von α1,3-Galaktosyltransferase und UDP-Gal zu Produkten mit 1, 2 oder 3 Gal-α1,3-Gal-β1,4-GlcNAc- Gruppen umgesetzt. In der Regel sind dies beispielsweise nicht nur die Glykoantigene A⁴A^a3-4, A^a3-4A⁴, A^a3-4A^a3-4, A⁴A^a3-4F⁶, A^a3-4A⁴F⁶ und A^a3-4A^a3-4F⁶ (2).
Die α1,3-Galaktosyltransferase bzw. eine nicht-membrangebundene Form derselben kann man z. B. mithilfe der Maus cDNA M26925 (EMBL databank) herstellen. Dies gelingt durch Expression in Spodoptera frugiperda Sf9 bzw. Sf21 Zellen mithilfe von Baculovirus.
Die so erzeugten Glykopeptide mit α1,3-Galaktose können durch Koppeln an ein Polymer zu einem polyvalenten Inhibitor umgewandelt werden.
2) HERSTELLUNG VON POLYVALENTEN KONJUGATEN
2a) Kopplung an ein Protein mithilfe von z. B. Difluoro-dinitrobenzol
Diese Kopplungsmethode erlaubt einen vergleich sweise hohen Anteil des eingesetzten Glykopeptides auch an das Trägerpolymer zu koppeln (Wilson et al., 1998).
Das Glykopeptid werden an ein humanes und somit möglichst inertes Trägerprotein mit einer Konzentration von 10 mg, z. B. humanes Serumalbumin (HSA) (Calbiochem, 12668, > 95% lyophilized powder) gekoppelt. 1.4 μmol trockenes Glykopeptid wird in 100 μL 0.1 M K-Phosphat-Puffer von pH 7.2 gelöst. Bei Raumtemperatur werden 500 μL DFDNB-Lösung (6% 1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenzol in Methanol) und 70 μL 7 M Guanidin-HCl zugesetzt. Nach einer Inkubation von 15 min bei Raumtemperatur erfolgt eine dreimalige Extraktion mit jeweils 2 ml Diethylether um das überschüssige DFDNB zu entfernen, die organische obere Phase wird verworfen. (Die Abtrennung kann aber auch nach einer einmaligen Extraktion mit Diethylether durch Gelfiltration mit Sephadex G-25 fine (GE Healthcare) und 30% Methanol als Laufmittel erfolgen, Säule 1 × 50 cm.) Die wässrige Phase wird in der Vakuumzentrifuge getrocknet und mit 100 μL 10% humanem Serumalbumin (HSA) in 0.4 M Natriumborat pH 10.0 versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Am darauf folgenden Tag wird das Kopplungskonjugat durch eine Gelfiltration mit Sephadex G-50 superfine (GE-Healthcare) in 50 mM Ammoniumacetat pH 5.5 als Laufmittel abgetrennt (Säule 1.5 × 50 cm).
Die Kopplungseffizienz wird mithilfe von SDS-PAGE und MALDI-TOF-MS überprüft. Bei der SDS-PAGE muss das Konjugat eine eindeutig kürzere Wanderungsstrecke aufweisen als unmodifiziertes HSA.
Für die MALDI-TOF-MS wird die Proteinlösung, die vorzugsweise 0.2 oder mehr mg Protein pro ml enthält, im Verhältnis 1:4 mit Matrixlösung gemischt (1% Sinapinsäure oder Ferulasäure in 70% Acetonitril). 1 Mikroliter des Gemischs wird auf die MALDI-Trägerplatte (polierter Stahl) aufgetragen und trocknen gelassen. Die Probe wird im linearen Modus gemessen, z. B. mit einem Bruker Autoflex III. Das konjugierte Produkt (MUXF-HSA) hat vorzugsweise eine mittlere Molmasse von über 76000 g/mol.
2b) Kopplung mittels anderer Reagentien
Alternative Kopplungsvarianten sind z. B.: N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC), vorzugsweise in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid (NHS) oder Sulfo-N-Hydroxysuccinimid (sulfo-NHS).

– Disuccinimidylsuberat
– Diethylsquarat
– Glutardialdehyd
– Diethyl-adipimidat.

Kopplung an ein organisches Polymer, wie z. B. Acrylamid.
Zu diesem Zweck wird z. B. an der Aminogruppe des Glykopeptids eine Allylfunktion (= Doppelbindung) eingeführt, welche eine Copolymerisation mit Acrylamid erlaubt.
Eine andere Möglichkeit ist es, die Glykopeptide an Dendrimere zu koppeln in Analogie zu Peptid-Determinanten.
2c) Kopplung an Partikel oder Nano-Partikel
Mittels der unter Punkt 2a) und 2b) genannten Verfahren können die Glykopeptide an funktionalisierte Partikel oder Nanopartikel gebunden werden.
3) MODIFIZIERTE HUMANE GLYKOPROTEINE:
Eine weitere Methode zur Herstellung hochspezifischer CCD-hältiger Glykoproteine geht von ganzen humanen Glykoproteinen aus, die vorzugsweise diantennäre N-Glykane tragen, wie z. B. Serotransferrin oder α1-Antitrypsin. Diese kann man mittels Neuraminidase (z. B. aus Clostridium perfringens, Roche) desialylieren. Die nun terminalen Galaktose-Reste werden mit β-Galaktosidase aus Aspergillus oryzae, Schwertbohne oder Rinderniere entfernt. Das humane Glykoprotein präsentiert nun GnGn-Strukturn, welche mit rekombinanter α1,3-Fukosyltransferase (siehe Punkt 1c) und GDP-Fukose. Die entstehenden GnGnF³ Strukturen kann man nun mit N-Acetylglucosaminidase in MMF³ Strukturen umwandeln (Bencurova et al., 2004).
Ebenso wie in Punkt 1c kann man auch hier zusätzlich oder anstatt der Fukosyltransferase eine Xylosyltransferase einsetzen (Bencurova et al., 2004).
4) VERFAHREN ZUR ELEKTROPHORETISCHEN ANALYSE VON BROMELAIN
Die Analyse von Bromelain nach den Standard-Verfahren mittels reduzierender oder nicht-reduzierender SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gelingt nicht, da sich die Thiol-Protease beim Erhitzen und/oder in Gegenwart von Detergens (z. B. SDS) selbst verdaut. Es werden 20 μL Probe mit 2 μl einer 2% Iodessigsäure-Lösung versetzt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Hernach werden 8 μL der inaktivierten Probe in der üblichen Weise mit 8 μL zweifach-konzentriertem Probenpuffer versetzt und einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen.
5) EINSATZ VON CCD-INDIKATOR UND CCD-INHIBITOR
5a) Anwendung des CCD-Indikators
Die Reagenzien können in jedem zurzeit verwendeten Bestimmungssystem für spezifisches IgE eingesetzt werden. Eine typische Anwendung wäre die in ELISA-artigen Systemen, bei denen der CCD-Indikator während der Beschichtung der Platte parallel zu den Allergenlösungen in ein Näpfchen eingebracht wird. Die verschiedenen CCD-Indikatoren können entweder einzeln oder gemeinsam eingesetzt werden. Eine weitere Anwendung wäre die Auftragung des CCD-Indikators als Punkt oder Strich auf einem Multi-Allergen-Testarray bzw. Teststreifen. Eine andere Anwendung wäre die Aufbringung auf Allergenträger-Scheibchen.
5b) Anwendung des CCD-Inhibitors
Das für die Messung von spezifischem IgE vorgesehene Serum wird so mit dem CCD-Inhibitor gemischt, dass die Endkonzentration z. B. 10 oder 20 μg/mL beträgt. Dies wird z. B. durch Zugabe von 5 bzw. 10 μL einer Lösung von MUXF-HSA mit einer Konzentration von 2 mg/mL zu 1 ml Serum erreicht.
Nach Mischen der Probe, z. B. mit einem Vortex-Mischer oder per Hand, wird das Serum so wie für das jeweilige Testsystem vorgesehen, weiterverwendet.
Im Folgenden ist die Anwendung des Teststreifensystem „AllergyScreen” von Mediwiss Analytic GmbH (Moers, Deutschland) beschrieben, die völlig mit der vom Hersteller empfohlenen Vorgangsweise übereinstimmt.
Die Allergene sind an die Oberfläche von Nitrocellulosemembranen gebunden, welche in einen Kunststoff-Reaktionstrog eingebettet sind. Der Teststreifen AllergyScreen Panel 2A HOLZ (Art. No. A 0180) enthält folgende 18 Allergene bzw. Antigene: Positivkontrolle (Anti-Ziege IgG vom Kaninchen), Erle, Birke, Hasel, Grasmischung, Beifuß, Ambrosia (Ragweed), Wegerich (Pollen), Hausstaubmilbe (Dermatophagoides pteronyssinus), Hausstaubmilbe II (Dermatophagoides farinae), Katze, Hund (Epithelien), Küchenschabe, Alternaria alternata, Cladosporium, Aspergillus (Schimmelpilze), Pferd, Kaninchen (Epithelien), CCD-Mischung, Negativkontrolle (kein Allergen). Der Teststreifen AllergyScreen Panel 3A HOLZ (Art. No. A 0181) enthält folgende 14 Allergene bzw. Antigene: Positivkontrolle (Anti-Ziege IgG vom Kaninchen), Haselnuß, Erdnuß, Walnuß, Weizenmehl, Roggenmehl, Sojabohne, Orange, Apfel, Sellerie, Karotte, Eiweiß, Milch, Kabeljau, Krabbe/Shrimp-Mischung, Bromelain (CCD1), Horseradish (CCD2, Ascorbat Oxidase (CCD3), Negativkontrolle (kein Allergen).
Das Waschpuffer-Konzentrat (25-fach konzentriert; Tris/NaCl, enthält 0,099% NaN₃, 20 ml) wird in einen 500-ml-Meßzylinder gegeben, auf 500 ml mit destilliertem Wasser aufgefüllt und anschließend in eine Spritzflasche umgefüllt. Die Reaktionströge mit den Nitrocellulosemembranen werden mit dem verdünnten Waschpuffer kurz abgespült (ca. 1–2 sek) und mit 250 μl Patientenserum mittels einer Pipette gefüllt. Anschließend werden die Reaktionströge 45 min bei Raumtemperatur auf dem „ScreenShaker” Mediwiss Analytic GmbH (Moers, Deutschland) inkubiert.
Die Reaktionströge werden danach kurz (5 sec) mit dem zuvor hergestellten Waschpuffer abgespült. Eine mehrmalige Einwirkung des Waschpuffers in den Reaktionströgen über einige Sekunden und ein mehrmaliges Hin- und Herschwenken des Puffers verbessert die Waschleistung. Die Reaktionströge werden auf einem Filterpapier ausgeschlagen um Restpuffer zu entfernen.
Nach dem Waschen werden 200 μl Detektor-Antikörper (mit Biotin konjugierter anti-human-IgE Antikörper, polyclonal, gebrauchsfertig, enthält 0,099% NaN₃, 10 ml) in jeden Reaktionstrog gefüllt und 45 min bei Raumtemperatur auf dem ScreenShaker inkubiert. Die Reaktionströge werden danach kurz (5 sec) mit dem hergestellten Waschpuffer abgespült und auf einem Filterpapier ausgeschlagen. Anschließend werden 250 μl Streptavidin-Konjugat (mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Streptavidin, gebrauchsfertig, enthält 0,02% Methylisothiazolon und 0,02% Bromonitrodioxan, 10 ml) in jeden Raktionstrog gefüllt und 20 min bei Raumtemperatur auf dem ScreenShaker inkubiert. Die Reaktionströge werden danach kurz (5 sec) mit dem hergestellten Waschpuffer abgespült und auf einem Filterpapier ausgeschlagen. Anschließend werden 250 μl Farbstofflösung (Bromochloroindolylphosphat/Nitro-Blue Tetrazolium 10 ml) in jeden Reaktionstrog gefüllt. Die Reaktionströge werden 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur auf dem Screenshaker inkubiert. Nach der Inkubation wird die Farbreaktion durch kurzes Abspülen der Teststreifen unter fließendem Wasser beendet. Die Streifen werden an der Luft oder mit Hilfe eines handelsüblichen Föns getrocknet. Erst nach vollständiger Trocknung des Teststreifens im Reaktionstrog darf eine Auswertung erfolgen.
Die Farbintensität auf den Testfeldern ist direkt proportional der Menge an spezifischen IgE-Antikörpern im Serum des Patienten für das jeweilige Allergen. Die quantitative Auswertung erfolgt mittels des CubeScreen, des Improvio oder RapidReaders. Dabei handelt es sich um ein System, das ein Foto des Streifens erstellt. Die Software des Readers/Scanners analysiert die Grauwerte der Streifen und gruppiert sie in eine gespeicherte Standardkurve ein. Es werden Klassen berechnet, die einen Bezug zum spezifischen IgE-Gehalt der Probe haben.
5c) Gemeinsame Anwendung von CCD-Indikator und CCD-Inhibitor
Testsysteme, welche neben den interessierenden Allergenen auch den CCD-Indikator tragen, können auf zwei Arten eingesetzt werden:

I. Ohne CCD-Inhibition. In diesem Falle weist ein positives Ergebnis beim Indikator auf das Vorhandensein von anti-CCD IgE im Patientenserum hin. Anders als bei bisherigen Indikatoren sind zum einen Falsch-Positive Reaktionen aufgrund von Peptidepitopen hier mit maximaler Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen. Andererseits erlaubt die Verwendung von Konjugaten den Einsatz verschiedener Glykanstrukturen – einzeln oder im Gemisch. Dadurch können auch ungewöhnliche IgE-Spezifitäten erfasst und, wenn gewünscht auch erkannt werden.
II. Mit CCD-Inhibition. Bei Seren, die mit CCD-Inhibitor versetzt wurden, ist das Ergebnis für den CCD-Indikator im Regelfall negativ ist. Das bedeutet, dass auch alle aufgrund kreuzreaktiver Kohlenhydrate falsch-positiven Reaktionen mit Allergenen erfolgreich unterdrückt wurden. Ein positives Ergebnis für den CCD-Indikator weist auf fehlerhafte Anwendung des Inhibitors hin (Zugabe vergessen, falsche Dosierung, unsachgemässe Lagerung).

Das unten dargestellte Beispiel zeigt das Ergebnis der Analyse eines möglicherweise Nahrungsmittel-allergischen, jugendlichen Patienten. Bei ”normaler” Durchführung erkennt man auf dem Teststreifen positive Reaktionen gegen nahezu alle pflanzlichen Nahrungsmittel, insbesondere gegen F4, F5, F85 und F31 = Weizenmehl, Roggenmehl, Sellerie und Karotte. Weiters erkennt man eine mittelstarke Färbung bei Milch. Die drei deutlich gefärbten Streifen rechts sind pflanzliche Glykoproteine, die als CCD-Indikator dienen.
Bei Durchführung in Gegenwart von Inhibitor färben nur mehr die Positiv-Kontrolle und Milch. Dieses Ergebnis entspricht wesentlich besser dem anamnestischen Befund des Patienten.
Literatur:

Bencurova, M., Hemmer, W., Focke-Tejkl, M., Wilson, I. B., and Altmann, F. (2004) Specificity of IgG and IgE antibodies against plant and insect glycoprotein glycans determined with artificial glycoforms of human transferrin. Glycobiology 14, 457–466.
Wilson, I. B., Harthill, J. E., Mullin, N. P., Ashford, D. A., and Altmann, F. (1998) Core alpha1,3-fucose is a key part of the epitope recognized by antibodies reacting against plant N-linked oligosaccharides and is present in a wide variety of plant extracts. Glycobiology 8, 651–661.
Mari, A. (2002) IgE to cross-reactive carbohydrate determinants: analysis of the distribution and appraisal of the in vivo and in vitro reactivity. Int Arch Allergy Immunol 129, 286–295.
Sturm, G. J., Jin, C., Kranzelbinder, B., Hemmer, W., Sturm, E. M., Griesbacher, A., Heinemann, A., Vollmann, J., Altmann, F., Crailsheim, K., Focke, M., and Aberer, W. (2011) Inconsistent results of diagnostic tools hamper the differentiation between bee and vespid venom allergy. PLoS One 6, e20842.

SEQUENCE LISTING
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2008/152040 A1 [0008]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Mari A. (2002), Sturm et al. (2010) [0007]
Hemmer et al. (J Allergy Clin Immunol 2001; 108: 1045–52) [0010]
Price, C. P. und Newman, D. J., a. a. O. Principles and Practice of Immunoassay, 2nd Ed., 1997, Stockton Press, New York [0063]
Bencurova et al., 2004 [0082]
Bencurova et al., 2004 [0085]
Wilson et al., 1998 [0089]
Bencurova et al., 2004 [0097]
Bencurova et al., 2004 [0098]
Standard-Verfahren mittels [0099]

Claims

Polymeres Glykoantigen bestehend aus kreuzreagierenden Kohlenhydratdeterminanten (CCD), ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MUXF³, MMXF³, GnGnF³, MGnF³, GnMF³, MMF³, MUF³, GnGnX, MGnX, GnMX, MMX, MUX, GnGnXF³, MGnXF³, GnMXF³, MMF³, MGnGnF³, MGnF³ MMF³, MUF³, GnGnF³F⁶, MGnF³F⁶, GnMF³F⁶, MMF³F⁶, MUF³F⁶ und Glykane mit dem α1,3-Galaktose Epitop.
Glykoantigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens drei CCD enthält.
Glykoantigen nach Anspruch 1 oder 2, in Verbindung mit mindestens einem weiteren immuntoleranten Bestandteil.
Glykoantigen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der immuntolerante Bestandteil Peptidsequenzen bestehend aus 1 bis 4 Aminosäuren enthält.
Glykoantigen nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass der immuntolerante Bestandteil ein menschliches Protein, dessen Derivat oder Fragment enthält.
Glykoantigen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es auf einem festen Träger aufgebracht ist.
Glykoantigen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus synthetischen Polymeren, Nanopartikeln, Kügelchen, Streifen, Scheibchen, Plättchen oder Stäbchen oder Gefäßoberflächen.
Testvorrichtung zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Antikörpers gerichtet gegen ein Allergen in einer Probe, umfassend ein Glykoantigen nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und mindestens ein Allergen.
Testvorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass diese mindestens vier verschiedene Allergene enthält.
Testvorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Allergen ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Insektengift, Pollen, Inhalationsallergene, Kontaktallergene und Nahrungsmittelallergene.
Testvorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Glykoantigen und das Allergen in einer Mischung zur Verfügung gestellt sind.
Testvorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Glykoantigen an einem Referenzort und das Allergen an einem Bestimmungsort zur Verfügung gestellt ist.
Testvorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine Reihe von verschiedenen Allergenen an unterschiedlichen Bestimmungsorten zur Verfügung gestellt sind.
Testvorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass diese weiter einen Träger zur Aufnahme des Glykoantigens und/oder des Allergens aufweist.
Testvorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ausgesucht ist aus der Gruppe bestehend aus Polymeren, Nanopartikeln, Kügelchen, Streifen, Scheibchen, Plättchen oder Stäbchen oder Gefäßoberflächen.
Testvorrichtung nach Anspruch 14 oder 15, enthaltend einen Streifen zur Durchführung eines Streifentests, mit dem Glykoantigen als Referenz und mindestens vier verschiedenen Allergenen an unterschiedlichen Positionen.
Testvorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Streifen weiter eine Positiv- und/oder Negativkontrolle aufweist.