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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Extrakts zur
Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung und/oder zur Behandlung der
Influenza, sowie eine Tablette und ein Aerosol, enthaltend den Extrakt.
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Die
Influenza, auch unter der Bezeichnung Grippe bekannt, ist eine ansteckende
virale Erkrankung, die sich in saisonalen Epidemien um die Welt verbreitet.
Man unterscheidet drei Virentypen A, B und C. B und C sind auf den
Menschen beschränkt, während Typ
A sich über
Säugetiere
und Vögel
erstreckt.
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Die
Weltgesundheitsorganisation WHO warnt vor einer globalen Influenza-Pandemie
in den kommenden Jahren. Epidemien und Pandemien werden am ehesten
von Influenzaviren des Typs A verursacht. Große genetische Änderungen
des Influenzavirenerbguts haben drei Pandemien im 20. Jahrhundert
verursacht, deren Erreger alle vom Typ A waren.
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Gegenwärtig stellt
insbesondere die Vogelgrippe (avian flu), ebenfalls ein Typ A Virus,
eine Gefahr hinsichtlich einer Pandemie dar. Besonders in Südostasien
ist sie in den letzten Jahren verstärkt aufgetreten. Ihre Verbreitung
wird dadurch begünstigt,
dass wilde Vögel
als resistente Träger
der Krankheit fungieren können.
Experten befürchten,
das Vogelgrippevirus könnte
sich mit einem Erreger der Humangrippe kreuzen. Dies ist prinzipiell
möglich,
wenn Schweine oder Menschen gleichzeitig mit diesem und einem Erreger
der Humangrippe infiziert sind. Dies könnte zu einem für den Menschen
höchst
ansteckenden und tödlichen
Virus führen,
welches eine globale Pandemie zur Folge haben könnte. Bisher ist die Übertragung
der Vogelgrippe auf den Menschen nur lokal erfolgt. Eine Übertragung
der Vogelgrippe zwischen Menschen wurde jedoch nicht beobachtet.
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Die
Impfung stellt das wichtigste Mittel zur Vorbeugung einer viralen
Erkrankung dar. Im Rahmen der Prävention
ist die Impfung jedoch darauf angewiesen, dass ein Impfstoff gegen
ein bestimmtes Virus hergestellt wird. Dies setzt voraus, dass der
Virus bereits existieren muss. Dies und die lange Zeit für die Entwicklung
des Impfstoffs (ca. 4 Mona te) führen
zu einer wesentlichen Einschränkung
seines Einsatzes bei einer globalen Pandemie. In einem solchen Fall
ist der Einsatz von Impfstoffen nur durch die vorangehende und begleitende
Anwendung antiviraler Wirkstoffe gewährleistet. (WHO Guidelines
on the Use of Vaccines and Antivirals during Influenza Pandemics;
World Health Organization 2004)
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Zu
den antiviralen Wirkstoffen, die zur Behandlung der Influenza wirksam
sind, zählen
Amantadine, Rimantadine, Zanamivir, Oseltamivir und Ribavirin. Alle
aufgeführten
Medikamente weisen Nebenwirkungen auf, die z.T. schwerwiegend sein
können.
Oseltamivir beispielweise, das unter der Bezeichnung Tamiflu® vertrieben
wird, zeigt als häufige Nebenwirkungen Übelkeit,
Erbrechen, und Magenschmerzen. Seine Anwendung ist erst ab dem 13.
Lebensjahr indiziert, da bei Jugendlichen unterhalb der Altersgrenze
zum Teil schwere Nebenwirkungen, wie Ohrenentzündungen, Lungenentzündungen,
Entzündungen
der Nasennebenhöhlen,
Bronchitis, Lymphknotenschwellungen und Bindehautentzündungen beobachtet
wurden. (Rote Liste, Arzneimittelverzeichnis für Deutschland 2004).
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Antivirale
Medikamente sind wirksam bei der Prophylaxe einer viralen Erkrankung
sowie bei ihrer Behandlung. Die direkte medizinische Heilung einer Viruserkrankung
ist bisher noch nicht gelungen.
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Ferner
ist ein Holunderbeerenextrakt für
seine Wirkung bekannt, die Dauer der Influenza unter Umständen zu
verkürzen,
ohne jedoch eine nennenswerte präventive
Wirkung zu zeigen (Zakay-Rones, Z.; Varsano, N.; Zlotnik, M.; Manor,
O.; Regev, L.; Schlesinger, M.; Mumcuoglu, M. J. Altern. Complement.
Med. 1995, 1 (4), 361–9).
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Eine
keimtötende
Wirkung ist auch bei Extrakten aus Pflanzen der Gattung Cistus bekannt.
Die Cistus Art incanus und ihre Unterspezies tauricus, welche beide
im Mittelmeer-Raum verbreitet sind, haben bereits in der traditionellen
Heilkunde dieser Region Verwendung gefunden. Cistus incanus wird
in der Tierhaltung als natürliches
Heilmittel sowie allgemein zur Steigerung des Gesundheitszustands
der Tiere (Pieroni, A.; Howard, P.; Volpato, G.; Santoro, R. F.
Vet. Res. Commun. 2004, 28 (1), 55–80) verwendet. In nördlichen
Teilen Griechenlands wurde Cistus incanus ssp. tauricus traditionell zur
Behandlung von Hauterkrankungen verwendet (Petereit F., Kolodziej
H., Nahrstedt A. Phytochemistry 1991, 30 (3), 981–985).
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Cistus
Spezies enthalten unter anderem Flavanoide und Proanthocyanidine
(Petereit F., Kolodziej H., Nahrstedt A. Phytochemistry 1991, 30
(3), 981–985),
die im Körper
als Antioxidationsmittel fungieren können (Attaguile, G.; Russo,
A.; Campisi, A.; Savoca, F.; Acquaviva, R.; Ragusa, N.; Vanella,
A. Cell Biol Toxicol. 2000, 16 (2), 83–90). Extrakte der Blätter von
Cistus incanus wirken antibakteriell und antimykotisch (Bouamama,
H. et al. Therapie 1999, 54 (6), 731–3).
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Als
präventive
Maßnahme
für den
Fall einer drohenden Pandemie, welche durch die Vogelgrippe verursacht
werden könnte,
setzen die Staaten der Weltgemeinschaft auf antivirale Medikamente.
Beispielsweise wurde das oben bereits aufgeführte Medikament Oseltamivir
(Tamiflu®;
Hoffman La Roche) in erheblichen Mengen von einigen Staaten als
Vorrat für
den Fall einer Pandemie bestellt, wobei befürchtet wird, dass das Medikament
im Ernstfall schnell aufgebraucht werden könnte. Die immense Nachfrage hat
außerdem
zu großen
Engpässen
in der Produktion geführt.
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Außerdem ist
die Verwendung (bekannter) antiviraler Wirkstoffe zunehmend dadurch
gefährdet, dass
diese als Breitbandmedikamente in der Tierhaltung verwendet werden.
Ungeachtet internationaler Verbote haben solche Praktiken beispielsweise
in China zu einer Resistenz mancher Stämme der Vogelgrippe gegen letztere
geführt.
Hinzu kommen die häufigen
Nebenwirkungen dieser Mittel, die zum Teil schwer sein können. Ferner
sind diese Medikamente in manchen Fällen nur für bestimmte Altersgruppen indiziert,
wie beispielsweise Oseltamivir (Tamiflu®), das
erst ab dem 13. Lebensjahr angewandt werden kann.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein antivirales Medikament
zur Prophylaxe und/oder zur Behandlung von Influenza zur Verfügung zu
stellen, das kostengünstig
hergestellt werden kann und keinerlei Nebenwirkungen bei der Verabreichung
hervorruft.
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Diese
Aufgabe wird durch die Verwendung eines Extrakts aus Pflanzen der
Gattung Cistus zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe und/oder
Behandlung von Influenza gelöst.
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Der
Extrakt wird aus einer Pflanze der Gattung Cistus gewonnen. Von
der Gattung Cistus sind 20 Arten bekannt:
- C. albidus L.
- C. chinamadensis Banares & P.
Romero
- C. clusii Dunal
- C. crispus L.
- C. heterophyllus Desf.
- C. incanus (auch als C. creticus bezeichnet)
- C. inflatus Pourr. Ex Demoly (auch als C. hirsutus Lam. oder
C. psilosepalus Sweet bezeichnet)
- C. ladanifer L.
- C. laurifolius L.
- C. libanotis L.
- C. monspeliensis L.
- C. munbyi Pomel
- C. ochreatus Chr. Sm. ex Buch
- C. osbeckiifolius Webb ex Christ.
- C. parviflorus Lam.
- C. populifolius L.
- C. pouzolzii Delile
- C. salviifolius L.
- C. sintenisii Litard. (auch als C. albanicus E.F. Warburg ex
Heywood bezeichnet)
- C. symphytifolius Lam.
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Bevorzugt
wird der Extrakt aus der Art C. incanus gewonnen. C. incanus umfasst
zwei Unterarten, C. incanus ssp. tauricus sowie C. incanus ssp. undulatus.
Von diesen wird besonders bevorzugt die Unterart C. incanus ssp.
tauricus zur Extraktion verwendet.
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Der
Extrakt wird aus den oberirdischen Teilen der Pflanzen gewonnen.
Bevorzugt werden die im selben Jahr nachgewachsenen oberirdischen
Triebe der Pflanzen verwendet. Die Pflanzenteile werden direkt nach
der Ernte, also in rohem Zustand, einer Extraktion unterworfen.
Alternativ werden die Pflanzenteile vor der Extraktion getrocknet.
Anschließend werden
die Blätter
der Pflanze in geeigneter Weise zerkleinert, indem sie beispielsweise
gerieben oder geschnitten werden.
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Die
Extraktion erfolgt mit einem geeigneten Lösungsmittel. Geeignete Lösungsmittel
sind Wasser, Alkohole, wie Methanol, Ethanol oder Isopropanol, oder
chlorierte Lösungsmittel,
wie Dichlormethan, sowie Aceton, Acetylacton, Ammoniak oder Eisessig.
Es können
auch Mischungen der genannten Lösungsmittel
eingesetzt werden. Bevorzugt wird ein Gemisch aus Wasser mit Methanol
oder Ethanol eingesetzt.
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Die
Extraktion wird üblicherweise
bei Raumtemperatur durchgeführt.
Es ist jedoch auch möglich, die
Extraktion bei erhöhten
Temperaturen von 25°C bis
gegebenenfalls zum Siedepunkt des eingesetzten Lösungsmittel durchzuführen. Bevorzugt
ist eine Extraktion bei Raumtemperatur.
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Weiterhin
können
auch Fette, wie Schweineschmalz, Wachse, wie Bienenwachs, oder Öle, wie Olivenöl und Mandelöl, zur Extraktion
verwendet werden. Bevorzugt wird Mandelöl eingesetzt.
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Um
eine möglichst
hohe Ausbeute zu erreichen, kann das Pflanzenmaterial mehrfach extrahiert werden.
Hierbei können
in den verschiedenen Extraktionsschritten auch unterschiedliche
Lösungsmittel
zum Einsatz kommen oder einer Extraktion mit einem Lösungsmittel
kann eine Extraktion mit einem Fett, Wachs oder Öl folgen und umgekehrt.
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Durch
die Extraktion wird ein flüssiges
oder halbfestes Rohprodukt erhalten, das in dieser Form zur Herstellung
eines Medikamentes zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Influenza
eingesetzt werden kann.
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Das
Rohprodukt kann vor der Verarbeitung zu einem Medikament auch aufkonzentriert
und/oder getrocknet und/oder weiter aufgearbeitet werden. Die Aufarbeitung
kann bei spielsweise dem Fachmann geläufige Reinigungsschritte, wie
Zentrifugation, Filtration und Dekantieren, einschließen, um
suspendierte Stoffe aus dem Extrakt zu entfernen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft daher weiterhin einen Trockenextrakt.
Zur Herstellung des Trockenextrakts kann dem flüssigen Rohextrakt, dem aufkonzentrierten
Extrakt oder dem gereinigten Extrakt das Lösungsmittel beispielsweise
durch Sprühtrocknung,
Gefriertrocknung oder Vakuumtrocknung entzogen werden.
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Der
beschriebene Extrakt wird zur Prophylaxe und/oder Behandlung von
Influenza eingesetzt.
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Influenza-Erreger
sind Viren des Typs A, B und C. Beim Menschen auftretende saisonale
Influenza wird durch den Influenza Typ A Virus mit den Subtypen
H1, H2 und H3 verursacht, sowie durch den Influenza Typ B Virus.
Die Vogelgrippe wird hauptsächlich
durch die Subtypen H5, H7 und H9 hervorgerufen.
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Der
beschriebene Extrakt ist besonders zur Prophylaxe und/oder Behandlung
der Vogelgrippe geeignet. Insbesondere kann der Extrakt zur Prophylaxe
und/oder Behandlung von Vogelgrippe, die durch den Subtyp H7 hervorgerufen
wird, eingesetzt werden.
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Der
Extrakt kann in jeder dem Fachmann geläufigen galenischen Applikationsform
angewendet werden, z.B. als Tabletten, Filmtabletten, Kapseln, Pulver,
Granulate, Dragees, Salben, Cremes, Gele, Lösungen oder Sprays. Der Extrakt
kann auch in Form eines Pulvers zur Beimischung in Lebensmittel, insbesondere
in Tierfutter, verwendet werden.
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Der
Extrakt kann hierbei mit den üblichen
galenischen Hilfsmitteln, wie Tablettenbindern, Füllstoffen,
Konservierungsmitteln, Tablettensprengmitteln, Fließregulierungsmitteln,
Weichmachern, Netzmitteln, Dispergiermitteln, Emulgatoren, Lösungsmitteln, Retardierungsmitteln,
Antioxidantien, Konsistenzgeber, Penetrationsverbesserer und/oder
Treibgasen, verarbeitet werden.
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Der
Extrakt kann auch gemischt mit anderen Pflanzenextrakten, insbesondere
mit Pflanzenextrakten von gleichartiger oder synergetischer Wirkung, verwendet
werden.
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Je
nach Art der Applikation variiert die Konzentration des Extraktes
in der Anwendungsform. In der Regel beträgt die Menge des Extraktes
zwischen 1 bis 1000 mg pro Dosierungseinheit bei festen Applikationsformen.
Bevorzugt beträgt
die Menge an Extrakt zwischen 5 bis 500 mg pro Einheit. In flüssigen Applikationsformen
kann der Extrakt in einer Konzentration von 1 μg/ml bis 100 mg/ml vorhanden
sein, bevorzugt von 25 μg/ml
bis 50 mg/ml. Bei halbfesten Applikationsformen beträgt der Gehalt
an Extrakt 1 bis 90 Gew.-%, bevorzugt 5 bis 75 Gew.-%.
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Bevorzugt
wird der Extrakt in Form einer Tablette verabreicht, wobei der Extrakt
als Trockenextrakt vorliegt.
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Es
ist weiterhin bevorzugt, den Extrakt in Form von Salben oder Cremes
zur topischen Applikation zu verabreichen. Hierbei wird bevorzugt
ein Extrakt eingesetzt, in welchem die Wirkstoffe durch Extraktion
mit einem Fett, Wachs oder Öl
der Pflanze entzogen worden sind. Es ist außerdem bevorzugt, dass der
Trockenextrakt mit einem Fett, Wachs oder Öl vermischt oder in diesen
gelöst
wird.
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Außerdem ist
es bevorzugt, dass der Extrakt als Aerosol vorliegt. Das Aerosol
kann zur Desinfektion von Gegenständen und Räumlichkeiten verwendet werden,
mit denen Influenza-Erreger in Kontakt gekommen sind oder potentiell
in Kontakt treten könnten,
insbesondere von Tierhaltungsanlagen sowie Verkehrsmitteln jeder
Art, in denen Menschen, Tiere und/oder Lebensmittel transportiert
werden. Beispielsweise kann ein Flugzeug vor dem Start mit dem erfindungsgemäßen Aerosol
ausgesprüht
werden, um eine Verbreitung der Vogelgrippeviren zu unterbinden
und somit die Ansteckungsgefahr für den Menschen zu minimieren.
Das erfindungsgemäße Aerosol
kann auch in Gegenwart von Menschen, z.B. in Warteräumen, versprüht werden,
da es keinerlei toxische Wirkungen beim Menschen hervorruft.
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Das
folgende Beispiel erläutert
die vorliegende Erfindung.
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Der
Extrakt wurde hinsichtlich seiner Zelltoxizität und -viabilität sowie
auf seine antivirale Aktivität gegenüber Influenza
Viren getestet. Zu diesem Zweck wurde der Extrakt in PBS (steril)
unter Erhitzen (1h/100°C)
gelöst
(Stock-Lösung
1 mg/ml). Die Dosierungen für
die in vitro Studien betrugen jeweils 2, 10, 25 und 50 μg/ml System.
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Als
Virusisolate diente der Influenza A Virus A/Bratislava/79 (H7N7)
(FPV) (aviär)
sowie der Influenza A Virus A/Ruerto-Rico/8/34 (H1N1) (PR8) (human).
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Als
Wirtszelllinien dienten Madin-Darby canine kidney (MDCK) Zellen,
Hundenierenpithelzelllinie A549 Zellen und humane Lungenepithelzelllinien.
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Zur
Bestimmung der Eigenschaften des Extraktes wurden die folgenden
Untersuchungsmethoden herangezogen.
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Mikroskopische Untersuchungen:
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Bei
den mikroskopische Untersuchungen wurden A549 Lungenepithelzellen
und MDCK Hundenierenepithelzellen für verschiedene Zeitpunkte (9h,
24h, 32h, 48h) mit verschiedenen Konzentrationen des Extrakts (2,
10, 25, 50 μg/ml)
behandelt und danach lichtmikroskopisch untersucht. Die Experimente
wurden zweifach kontrolliert durchgeführt.
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Viabilitätstests:
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Bei
den Viabilitätstests
wurden A549 Lungenepithelzellen und MDCK Hundenierenepithelzellen für verschiedene
Zeitpunkte (24h, 48h, 56h, 72h) mit verschiedenen Konzentrationen
des Extrakt (2, 10, 25, 50 μg/ml)
behandelt und danach mit Propidiumiodide angefärbt, um das Verhältnis toter
und lebender Zellen durchflußzytometrisch
zu bestimmen. Die Experimente wurden insgesamt viermal durchgeführt.
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Untersuchung der apoptotischen
Caspaseaktivierung:
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Zur
Untersuchung der apoptotischen Caspaseaktivierung wurden zusätzlich zu
den vereinbarten Experimenten A549 Zellen für 48h mit 25 und 50 μg/ml des
Extraktes behandelt. Die Zellen wurden darauf hin lysiert, die zellulären Proteine
gelelektrophoretisch aufgetrennt und im Westem Blot mit einen anti-PARP
Antikörper
(Poly (ADP-Ribose)
Polymerase, Caspase Substrat) auf die apoptotische Spaltung dieses
Proteins durch Caspasen hin untersucht. Als positiver Kontrollstimulus
diente der Apoptose-Induktor
Staurosporin. Die Experimente wurden in zwei parallelen Ansätzen durchgeführt.
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Untersuchungen zur antiviralen
Aktivität:
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Für die Untersuchungen
zur antiviralen Aktivität
wurden A549 Lungenepithelzellen und MDCK Hundenierenepithelzellen
für verschiedene
Zeitpunkte mit verschiedenen Kon zentrationen des Extrakt (2, 10,
25, 50 μg/ml)
für 30
min. vorbehandelt und danach mit den Influenza Virus Stämmen A/FPV/Bratisava/79
(H7N7) und A/PR8/34 (H INI) in Anwesenheit des Extraktes infiziert.
Zu verschiedenen Zeitpunkten nach Infektion (8h bzw. 9h, 24h, 36h
bzw. 48h) wurden die Mediumüberstände gewonnen
und auf neu gebildete Influenza Viren im Plaque Assays untersucht.
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Untersuchung der Wirkungskinetik:
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Zur
Untersuchung der Wirkungskinetik wurden MDCK Zellen für verschiedene
Zeitpunkte mit 50 μg/ml
des Extraktes behandelt (30 min. Vorinkubation, direkt nach der
Infektion, bzw. 2h, 4h und 8h nach Infektion). Nach 24h wurden die
Mediumüberstände auf
Nachkommenviren hin untersucht.
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Untersuchung der antiviralen
Aktivität
nach Vorinkubation der Viren mit Extrakt:
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Zur
Untersuchung der antiviralen Aktivität nach Vorinkubation der Viren
mit Extrakt wurden virushaltige Infektionslösungen (FPV) mit 50 μg/ml des Extrakts
für 2h
vorinkubiert. Mit dieser Infektionslösung wurde dann vergleichend
mit nicht behandelten Viren ein Infektionsexperiment in A549 Zellen
durchgeführt
und die neu gebildeten Viren nach 24h in einer Virustitration bestimmt.
Während
dieser Zeit befand sich kein Extrakt mehr im Überstand. Darüber hinaus
wurden die zur Infektion genutzten vorbehandelten Viren im Vergleich
zu nicht behandelten Viren unmittelbar in einem Plaque Assay in
MDCK Zellen auf ihre Infektiösität hin untersucht.
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Immunofluoreszenzmikroskopische
Untersuchungen mit vorbehandelten Viren:
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Virushaltige
Infektionslösungen
(FPV) wurden mit 50 μg/ml
des Extrakts für
30 min. bzw. über Nacht
vorinkubiert. Zum Vergleich dienten nicht behandelte Viren sowie
Infektion von vorbehandelten Zellen mit nicht vorbehandelten Viren.
Es wurde dann vergleichend mit nicht behandelten Viren ein Infektionsexperiment
mit einer hohen Infektionsdosis (MOI = 200) durchgeführt und
nach 1h mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers gegen ein Virusprotein
(Nukleoprotein (NP)) die infizierenden Viren bzw. neugebildetes
Protein in der Immunfluoreszenz delektiert. Der frühe Detektionszeitpunkt
und die hohe Infektionsdosis erlaubt auch die Detektion infizierender
Viren bzw. von Virusaggregaten.
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Die
Ergebnisse aus den oben beschriebenen Untersuchungen sind in den 1 bis 9 graphisch
dargestellt.
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Beispiel
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Herstellung eines Extraktes
aus Cistus incanus ssp. tauricus
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Zur
Extraktion werden die nachgewachsenen oberirdischen Triebe (Blätter, Blüten und
Stengel) verwendet. Das Pflanzenmaterial wird bei Raumtemperatur
im Schatten bis zu einem Restwassergehalt von maximal 10% im Freien
getrocknet. Anschließend
werden die Pflanzenteile auf eine Größe von ≤ 8 mm geschnitten.
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Die
geschnittenen Pflanzenteile werden einer Perkolation bei 95°C mit der
zehnfachen Menge an gereinigtem Wasser Ph. Eur. für 4 bis
5 Stunden unterworfen. Die gewonnene Lösung wird mittels eines Plattenverdampfers
bei einer Dampftemperatur von 75 bis 80°C auf 18 bis 19% des ursprünglichen Volumens
aufkonzentriert. Der Gehalt an Trockensubstanz beträgt ca. 45%.
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Mittels
eines Rührwerksverdampfers
wird der Gehalt an Trockensubstanz auf 50 bis 51% erhöht, indem
der Extrakt für
4 Stunden bei 110 bis 114°C
unter reduziertem Druck (0,6 bar) erhitzt wird. Anschließend wird
der Extrakt für
1 Stunde bei 100,3°C
aufgekocht, um einen Gehalt an Trockensubstanz von ca. 53% zu erhalten.
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Schließlich wird
eine Vakuumband-Trocknung bei 16 mbar mit absteigendem Temperaturgradienten
(140°C,
120°C, 90°C, 20°C) durchgeführt. Der
Gehalt an Trockensubstanz beträgt
92 bis 93%. Abschließend
wird der Extrakt vermahlen. Aus diesem Extrakt wird dann die vorstehend
beschriebene Stock-Lösung
hergestellt.
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Mikroskopische Untersuchungen
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Bei
den Mikroskopaufnahmen der Untersuchungsreihen mit MDCK Zellen und
A549 Zellen konnten bei keiner der verwendeten Konzentrationen des
Extrakts und der untersuchten Zeitwerte signifikanten Veränderungen
hinsichtlich Zellzahl und Zellmorphologie im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollproben
festgestellt werden.
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Viabilitätstest
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Resultate
der Viabilitätstest
sind in 1 und 2 gezeigt,
in denen vergleichend die Anzahl der lebenden Zellen aus den jeweiligen
Proben im Mittelwert aus den vier durchgeführten Bestimmungen zusammenfassend
dargestellt sind. Im Ergebnis war im gesam ten Beobachtungszeitraum
von 72h kein negativer Einfluss des Extraktes auf das Überleben
von MDCK oder A549 Zellen festzustellen.
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Untersuchung der apoptotischen
Caspaseaktivierung
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Ergebnisse
aus der Untersuchung der apoptotischen Caspaseaktivierung sind in 3 gezeigt, in
der Ergebnisse der Westem Blot Analyse zur Bestimmung der Caspaseaktivität dargestellt
sind. Während
der Kontrollstimulus Staurosporin (Stauro) zu einer effizienten
Spaltung des Caspase Substrats Poly (ADP-Ribose) Polymerase führt (Bande
PARP cleaved), ist eine solche Aktivität weder in unbehandelten (mock)
noch in extraktbehandelten Zellen (25 μg/ml, 50 μg/ml) nachzuweisen. Ein Kontrollblot
gegen das Protein ERK2 diente als Kontrolle für einheitliche Proteinbeladung.
Im Ergebnis ist zu folgern, dass Behandlung mit Pflanzenextrakt
in den verwendeten Konzentrationen und im Beobachtungszeitraum nicht
zur Caspaseaktivierung und Apoptoseinduktion führt.
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Untersuchungen zur antiviralen
Aktivität
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Bei
den Untersuchungen zur antiviralen Aktivität des Extrakts zeigen 4–7 exemplarisch die
Ergebnisse von je zwei unabhängigen
Experimenten mit mehrfacher Titerbestimmung. Die Virustiter sind
im Vergleich zu den Titern aus unbehandelten Infektionsproben gezeigt.
Bei FPV infizierten A549 Zellen kommt es nach 9h und 24h bereits
bei kleineren Konzentrationen zu einer signifikanten Abnahme der
Virustiter, die bei der höchsten
Wirkstoffkonzentration um mehr als zwei Zehnerpotenzen reduziert
sind. Aufgrund der hohen Infektionsdosis befindet man sich nach
48h in den unbehandelten Proben bereits in einer Plateauphase des
Viruswachstums, so dass die hemmenden Effekte nicht mehr so klar
darstellbar sind. Allerdings ist auch hier bei der höchsten Wirkstoffkonzentration
noch eine Reduktion der Virustiters zu erkennen. Mit dem gleichen
Virusisolat konnten auch in MDCK Zellen die größte Reduktion der Virustiter
bei Behandlung der Proben mit 25–50 μg/ml des Extrakts gefunden werden,
wobei ebenfalls eine Hemmung um mehrere Zehnerpotenzen erreicht
wird. Überraschender
Weise sieht man in einigen Ansätzen
bei kleineren Wirkstoffkonzentrationen eine leichte Erhöhung der
Virustiter. Da dies jedoch nicht durchgehend bei allen Proben auftrat
und vor allem innerhalb des längsten
Beobachtungszeitraums von 36h nicht zu erkennen war, ist davon auszugehen,
dass es sich hier um einen experimentellen Artefakt handelt.
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Auch
für das
alternativ genutzte humane Virusisolat PR8 ist in MDCK Zellen eine
konzentrationsabhängige
Hemmung der Virusvermehrung bei allen untersuchten Zeitwerten zu
beobachten. Hier zeigt sich auch übereinstimmend mit den vorhergehenden
Experimenten eine Reduktion der Virustiter bei der höchsten Wirkstoffkonzentration
von 50 μg/ml.
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Zusammenfassend
lässt sich
die Aussage treffen, dass vor allem bei Konzentrationen des Extraktes
von 25 μg/ml
und 50 μg/ml
eine stark hemmende Wirkung auf die Virusvermehrung von verschiedenen
Influenza Viren in den zwei Wirtszelllinien zu erkennen ist.
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Untersuchung der Wirkungskinetik
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Ergebnisse
aus den Untersuchungen zur antiviralen Aktivität nach Vorinkubation der Viren
mit Extrakt sind in 8 graphisch dargestellt. Diese
Untersuchung der Wirkungskinetik vergleichender Virustiter zeigt,
dass nur bei Vorinkubation der Zellen mit dem Extrakt eine stark
hemmende Wirkung auf die Virusvermehrung zu erkennen war. Bei Zugabe > 2h nach Infektion
zeigte der Extrakt keine Wirkung mehr.
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Untersuchung der antiviralen
Aktivität
nach Vorinkubation der Viren mit Extrakt
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Mit
einer Infektionslösung,
welche 2h mit Extrakt vorinkubiert war, wurde vergleichend mit nicht behandelten
Viren ein Infektionsexperiment durchgeführt und die neu gebildeten
Viren nach 24h in einer Virustiration bestimmt (9B).
Darüber
hinaus wurden die vorbehandelten Viren im Vergleich zu nicht behandelten
Viren unmittelbar in einem Plaque Assay auf ihre Infektiösität hin untersucht
(9A). Es zeigte sich, dass die Vorinkubation
bereits einen Effekt bei der direkten Bestimmung der Infektiösität im Plaque
Assay hatte. Dies wurde noch evidenter, wenn man den mit Extrakt
behandelten versus nicht behandelten Viren eine Infektionsrunde
für 24h
gestattete. Hier sind Titerreduktionen von ca. einer Zehnerpotenz
erkennbar. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Vorinkubation
der Viren mit Extrakt bereits in erheblichem Maß zur Reduktion der Infektiösität der Viren
beiträgt.
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Immunofluoreszenzmikroskopische
Untersuchungen mit vorbehandelten Viren:
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Bei
den immunfluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen mit vorbehandelten
Viren war bereits nach einer Stunde eine vermehrte Nukleoprotein
(NP) Konzentration im Zellkern erkennbar, was anzeigt, dass bereits
ein Großteil
der NP-haltigen viralen Ribo nukleoproteinkomplexe in den Zellkern
gewandert ist bzw. die Produktion neuer Virusproteine bereits eingesetzt
hat. Während
sich diese Verteilung in infizierten Zellen, welche mit Extrakt
vorbehandelt wurden, nur marginal unterschied, war vor allem nach
Vorinkubation der infizierenden Viren über Nacht eine signifikante
Veränderung
erkennbar. Hier werden nur punktuell Viruspartikel oder Aggregate angefärbt und
es ist kaum eine Konzentration der Färbung im Zellkern zu finden.
Hieraus kann man schließen,
dass die vorbehandelten Viren nur unzureichend in der Lage sind
die Zellen zu infizieren bzw. in die Zellen aufgenommen zu werden.
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Die
Untersuchungen zur Morphologie, Viabilität und Caspase Aktivierung der
mit Extrakt behandelten Zellen zeigen, dass Konzentration bis zu
50 μg/ml
des Extraktes keine signifikant toxische Wirkung auf die hier genutzten
Wirtszellen A549 und MDCK ausweisen und weder vermehrt nekrotischen noch
apoptotischen Zelltod induzieren. Darüber hinaus konnte keine signifikante
Reduktion der Zellzahlen erkannt werden, so dass auch das Zellwachstum durch
die Extraktwirkung nicht eingeschränkt ist. Die zusammenfassende
Bewertung der Ergebnisse zur antiviralen Aktivität des Extraktes unter Berücksichtigung
experimenteller Varianzen erlaubt die Aussage, dass der Extrakt
in Konzentrationen von 25–50 μg/ml eine
signifikante und starke antivirale Wirkung auf die Vermehrung von
Influenza Viren in Zellkultur aufweist.
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Der
getestete Pflanzenextrakt wies in Zellkultur eine antivirale Aktivität gegen
Influenza Viren auf ohne für
die Wirtszellen signifikant toxisch zu sein. Auf molekularer Ebene
wird die antivirale Aktivität
vermutlich größtenteils über eine
direkte physikalische Wechselwirkung der Extraktbestandteile mit dem
Viruspartikel vermittelt, wobei weitere zusätzliche Effekte des Extrakts
auf die Zelle nicht ausgeschlossen werden können.