DE2009343A1 - Verwendung von Lysolecithinen als immunologische Adjuvantien - Google Patents

Description

2008343

Dr.Cr/Kg
Oase 5/447

Dr. Karl Tliomae GmbH, Biberach an der Riss

Verwendung von LysolecitMnen als immunologische Adjuvantien -

Die zur Gruppe der Cholinphosphatide gehörenden Lysolecithine entsprechen den Formeln

CH₉-O-ACyI

I ■

CH-OH Ia

OS₉-O-P-O-OH₉-OH₉-N(CH,)~

ο o₍₎

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CH₂-OH

CH-0-Acyl Ib

0H₉-0-P-0-0H_o-CH₉-N(GEL· )_ O Of ^

CH_o-0-Acyl

I ² (+)

CH-O-P-O-CH₂-CH₂-1T(CH₃)₃ Ic,

o'

CH₂-OH

in denen Acyl den Rest einer aliphatischen Fettsäure bezeichnet. Da das ß-ständige Kohlenstoffatom des Glj.-erimaoleküls ein Asymetriezentrum darstellt, können diese Verbindungen jeweils in zwei stereoisomeren Formen vorkommen.

Die Herstellung der Lysolecithine kann auf chemischen oder enzymatisehen Wege erfolgen. Sie iat in der Literatur beschrieben, vergl. Gf.H. de Haas und L.L.M. van Deenen, Biochem* biophysica Acta, [Amsterdam] 106 (1965) 315 und D. Arnold, H.U. Weltzien und 0. Westphal, Liebigs Ann. Chem. 709 (1967) 231, 234. So kann man z.B. durch Einwirkung von Phospholipase A-, oder Phoepholipase Ap aus Lecithinen durch enzymatische Spaltung die Lysolecithine herstellen. Diese enzymatischen Reaktionen verlaufen stereospezifisch. Die Phospholipasen A-, und A₂ vermögen nur L-Lecithine anzugreifen. Bei Verwendung von racemischen Lecithinen erhält man bei der Spaltung mit Phospholipase A daher ein Gemisch aus L-Lysolecithin:und D-Lecithin, das man durch Chromatographie in die Einzelverbindungen zerlegen kann. Auf rein chemischen Wege können Lysolecithine der Formel Ia z.B., ausgehend vom 2-Benzyl-glycerin durch Acylierung Einführung des Phosphorcholinrestes und hydrogenolytische Ent- fenuv.vg. der Benzyls chut zgruppe entsprechend dem nachstehenden Reactionsschema hergestellt werden. Die Synthese kann auch zur

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BAD

Darstellung optisch aktiver Lysolecithine dienen.

CH-OH

CH₂-O CH₂-O
CH-O-Bz CH-C

1,3-Benzylidenglycerin 2-Benzyl-l,3-benzyliden-glycerin

CH₀-OH ²

CH-O-Bz I CH2-OH	—*	H9O
2-Benzyl- glycerin
CH2-0-Acyl CH-O-Bz
CH2-O-P-O-CH2-CH2-Br 0 Cl

CH₂-O-ACyI CH-O-Bz

CH₂-OH

Br(CH₂

1-Aeyl- 2-benzylglycerin

CH₂-O-ACyI

CH-O-Bz i
CH₂-O-P-O-CH₂-CH₂-Br (y OH

l-Acyl-2-!jensyl-glycerinphosphorsäure-(3)-ß-bromäthylester

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CH-O-Bz

¹ <ΐ> χ

CH₂-O-P-O-CH₂-CH₂-N(CH₅)

CH₂-0-Acyl CH-OH

-N(CH₃)

Lysolecithin Ia

Lysolecithine nehmen im'intermediären Phospholipidstoffwechsel der Zellmembranen eine bedeutende Schlüsselstellung ein. In einem dynamischen Stoffwechselgleichgewicht werden sie ständig aus Lecithinen gebildet und andererseits zu Lecithinen reacyliert bzw. zu Glycerophosphoryleholin abgebaut.

Lysolecithine sind Substanzen mit hoher Grenzflächenaktivität. Ihre hervorstechendste biologische Wirksamkeit ist die zytotoxiBChe Wirkung. Diese zeilschädigende Wirkung beruht im wesentlichen auf der Fähigkeit, Zellmembranen zu zerstören. Trotzdem zeigen diese Verbindungen im Tierversuch einen relativ hohen LDj-Q-Wert, was offensichtlich darauf zurückzuführen ist, daß die Verbindungen im Organismus schnell metaboliert und damit unschädlich gemacht werden.

Lysophosphatide sind jedoch keinesfalls nur schlechthin zytotoxische Substanzen, sondern sie haben - dosisabhängig - wichtige biologische Wirkungen, die sie wahrscheinlich vor allem aufgrund ihrer hohen Oberflächenaktivität an Grenzflächen entfalten. So ist z.B. bekannt, daß Lysophosphatide die wesentlichen Rezeptoren der Membranen für die Aufnahme von Fettsäuren aus Serum darstellen. Durch Vorbehandlung mit sublytischen Mengen Lysolecithin läßt sich sogar eine Verbesserung der Zellmembranen erreichen. Aus der wissenschaftlichen Literatur ist ferner bekannt, daß Lysolecithin Bakterien zu vermehrtem Wachstum anregt, die Phagozytose von Peritonealmakrophagen steigert und sogar das Wachstum von Zellen höherer Organismen zu fördern

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vermag. ■

Es wurde nun gefunden, daß Iiysolecithine der Formeln Ia, Ib, Ic hervorragende immunologische Adjuvantien sind.

Unter Adjuvantien versteht man in der Immunologie Substanzen, welche die Immunantwort des Organismus auf einen antigenen Reiz, also die Antikörperbildung, verstärken. Mit Hilfe von Adjuvantien gelingt es z.B. die sog. Immunparalyse aufzuheben, d.h. die Bildung von Antikörpern auch m±t solchen Antigenen auszulösen, die sonsthin vom Organismus toleriert werden.

Die rein praktische Nutzanwendung dieser Stoffe liegt z.B. in ._,. der Steigerung der Antikörpertiter von Seren.

Die Adjuvantswirkung der Lysolecithine der 3?ormeln Ia, Ib und Ic wurde wie folgt geprüft:

1. Die Prüfung erfolgte in Anlehnung an die Methode von Dresser (Immunology 9, (1965) 26l)„ Die Grundlage der Versuchsanordnung besteht in der Induktion von Toleranz durch ein lösliches Protein. In dieser Versuchsanordnung wird die Fähigkeit von Substanzen untersucht, im Organismus die Immunantwort gegenüber dem äußerst schwachen immunogenen bovinem » Gammaglobulin (BGG) so zu verstärken, daß Antikörper gegen dieses Protein einwandfrei nachgewiesen werden können. Mäuse erhalten hierbei eine intraperitoneale Injektion von abzentrifugiertem aggregatfreien BGG in einer Dosis von 5 mg. !formal ewe is e-si&d· bei dieser Dosis nach 8 bis IO Tagen keine Antikörper nachweisbar. Die Tiere sind also nicht immunisiert. Sie sind unter diesen Bedingungen unfähig, gegen das BGG eine Immunantwort zu. geben. Gibt man dagegen das BGG in Kombination mit einem Adjuvans, so wird die vorübergehende Toleranzaus-

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bildung verhindert und die Eiere bilden nun Antikörper gegen das sonst tolerogene BGGr. 10 Ms 12 Tage nach Gabe des tolerogenen Proteins wird den Sieren erneut BGG eingespritzt, das mit Jod-125 markiert ΐεΐ* Sind die Tiere tolerant, so wird das markierte Antigen wie eigenes Gammaglobulin langsam abgebaut. Sind die Tiere dagegen immun, so kommt es zu einer sog. Immunelimination, d.h.. das markierte Antigen wird wesentlich schneller aus dem Kreislauf entfernt. Als Maß für die gebildeten Antikörper dient daher die Eliminationsgeschwindigkeit von mit Jod-125 markiertem BGG.

Bei Versuchen mit natürlichem Itysolecithin konnte festgestellt werden, daß gegenüber einer lediglich mit Kochsalzlösung vorinjizierten Kontrollgruppe die Eilt BGG und Lysolecithin behandelten Tiere das Tracer-Pro+ein etwa zelrn- Tr-Is einhundertmal schneller aus dem Kreislauf eliminieren.

2. Eine weitere immunologische Bestimmungsmethode für Antikörper, mit deren Hilfe Adjuvaneeigenscliaften bestimmt werften können, beruht darauf, daß das Imaunogea. (BGG) an Erythrozyten gekoppelt w.ii'd und die so behandelten Zellen mit dem Serum in einer geometrischen Verdiimiungsxeihe während ::0 Stunden bei ^ 4⁰C inkubiert werden. Ist das Serum antikörperhaltig» so ' werden die Erythrozyten agglutiniert. Die höchste Serumverdünnung, bei der dieses !Phänomen noch zu beobachten ist, wird als Antikörpertiter des Serums bezeichnet.

Auch mit dieser, wesentlich ungenaueren Methode läßt sich einwandfrei nachweisen, daß Xysolecithine hochwirksame Adjuvantien sind.

Die Lysoleclthine der Formeln Ia bis Ic können auf übliche Weise appliziert werden. Besonders bevorzugt i0t die intraperitoi*c*l<5 Injektion. Die Dosis kann innerhalb weiter Gxen-

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zen schwanken. Je nach dem gewünschten Grad der Potenzierung der Immunantwort können Dosen von 0,5 "bis IO mg/kg verabreicht werden.

- Patentansprüche -

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Claims (2)

Patentansprüche

1. Verwendung von Lysolecithinen der Formeln

OH₂-O-ACyI GH-OH

ΟΗρ-Ο-Ρ-Ο-ΟΗο-ΟΗ

V-JT(CH,, )_v j J

O O₁

Ia

GII₂-OH CH-0-Acyl CH₂-O-P-O-CH₂-CH₂-IiC CH₅) ~ ^{0 0}C-)

CH₉-0-Acyl CH-O-P-O-CH₂-OH₂-Ii ( CH₅ )₅ 0 0,

Ib Ic

als immunologische Adjuvantien.

2. Immunologische Adjuvantien, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer oder mehreren Verbindungen der Formeln Ia bis Ic.

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