DE20022785U1 - Analyse kleiner Verbindungen bei erhöhtem Durchsatz unter Verwendung mehrerer zeitlich getrennter Injektionen - Google Patents
Analyse kleiner Verbindungen bei erhöhtem Durchsatz unter Verwendung mehrerer zeitlich getrennter InjektionenInfo
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Description
Deutsche GebrauchsmusteranmeltiuQg. Nr.; 230 22~~7S5.S*
case: PB9979 :::·::: * : :
ANALYSE KLEINER VERBINDUNGEN BEI ERHÖHTEM DURCHSATZ
UNTER VERWENDUNG MEHRER ZEITLICH GETRENNTER INJEKTIONEN
UNTER VERWENDUNG MEHRER ZEITLICH GETRENNTER INJEKTIONEN
Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Erhöhen des Durchsatzes der Analyse von Verbindungen eines diskreten Größenbereichs.
Die hierin erwähnten Bezugsstellen sind ausdrücklich durch den Bezug darauf einbezogen.
Die Trennung von Verbindungen ist der Schlüssel zur Probenanalyse in Biologie, Chemie und Physik. In zahlreichen Separationssystemen vom linearen (zweidimensionalen) Typ werden Verbindungen in ein Ende einer Separationslänge eingeführt und dann wird eine Flußkraft angelegt, welche die Verbindungen trennt. Sobald die Verbindungen getrennt sind, können die Verbindungen dann nachgewiesen, analysiert und möglicherweise isoliert werden. Solche Separationssysteme schließen Chromatographie, Elektrophorese und zentrifugale Trennungssysteme ein.
Die sehr große Anzahl von Verbindungen, welche separiert und analysiert werden müssen, hat zu einer wachsenden Bedeutung von Systemen mit hohem Durchsatz geführt. Systeme mit hohem Durchsatz wenden Automatisierung, Miniaturisierung und parallele Reaktionen oder Separationen an, um die Geschwindigkeit zu erhöhen, mit der Proben analysiert werden können. Dies gestattet einem Assay, die gewonnene Information zu maximieren, während die zur Bewirkung der Analyse erforderlichen Resourcen minimiert werden. Dies erzielt den Vorteil der Verringerung der Menge des für jede Reaktion erforderlichen Materials, die Maximierung des Nutzens von kostspieligen analytischen Geräten und die effiziente Nutzung der Zeit des Experimentators.
Eine Anzahl von Fachgebieten erfordert Systeme mit erhöhtem Durchsatz. Umweltproben, kombinatorische Chemie, Genom-Assays und andere Gebiete erfordern, daß sehr große
Zahlen von Proben analysiert werden. Die Analyse mit hohem Durchsatz ist auch zunehmend wichtig für die Analyse von Nukleinsäuresequenzen.
Die Entwicklung der Fähigkeit, sehr große Anzahlen von Oligonukleotiden diskreter Länge in Proben zu erzeugen, hat die Nachfrage nach Oligonukleotid-Analyse-Systemen mit hohem Durchsatz erhöht. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) (beschrieben im U.S.-Patent Nr. 4 683 202 von Mullis, K. et al.) offenbart ein Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäuresequenzen. In diesem Verfahren werden hohe Kopienzahlen von Einzelsträngen von Matrizen-Nukleinsäuresequenzen erzeugt. Ein kurzer Nukleinsäuresequenz-Primer wird an eine spezifische Sequenz der einzelsträngigen Matrizen-Nukleinsäure angelagert. Ein Initiator (DNA-Polymerase) fügt Nukleotidbasen aus Lösung an das 3'-Ende des Primers an. Durch Verwenden von zueinanderpassenden Sätzen aus zwei Primern können Oligonukleotid-Produkte von spezifischer bekannter Länge amplifiziert werden. Zusätzlich zur PCR wird der Einsatz von Restriktionsenzymen zum Zerschneiden von Nukleinsäuresträngen in Fragmente diskreter Länge angewandt, um spezifische Sequenzunterschiede in DNA nachzuweisen.
Ein weiterer Bedarf nach Nukleinsäure-Analysesystemen mit hohem Durchsatz resultiert aus der sehr hohen Größe und Variabilität der Genome von verschiedenen Organismen. Zum Beispiel enthält das Genom des Menschen über drei Milliarden Nukleotidbasenpaare. Diese drei Milliarden Basen repräsentieren viele Tausende von Genen. Bei Analyse auf der Basenpaar-Ebene exisitieren Millionen von Einzelbasenmutationen in der menschlichen Population. Ein hoher Durchsatz wird für Systeme erfordert, welche verwendet werden, um genomische Variation eines Organismus zu analysieren oder Segregation innerhalb eines Genoms zu verfolgen.
Verschiedene Verfahren können angewandt werden, um genetische Variabilität nachzuweisen. Diese schließen Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP), Analyse von kurzen tandemartig wiederkehrenden Stellen (STR, short tandem repeat) und die Analyse von Einzel-Nukleotid-Polymorphismus ein.
RFLP ist ein Assay für die Variation in DNA-Sequenzen an einer Stelle, an der ein jeweiliges Restriktionsenzym schneidet. DNA-Varianten werden unterschiedliche Größen von DNA-Fragmenten nach einem Verdau mit einem spezifischen Restriktionsenzym ergeben. Die Verwendung von Sonden zum Nachweis bekannter Sequenzen erlaubt die Bestimmung von Restriktionsstellen-Variabilität in der Nähe eines spezifischen Ortes. RFLP kann mit PCR kombiniert werden, um Oligonukleotide eines diskreten Größenbereichs herzustellen. In "The use of capillary electrophoresis for point mutation screening" in Trends Biotechnol.,
November 1997; 15(11):448-51 von Mitchelson, K.; Cheng, J.; Kricka, L., beschrieben die Autoren die in weitem Umfang verwendete PCR-RFLP-Technik, worin die PCR-Reaktion erfolgt, um amplifizierte DNA-Fragmente aus einer Ziel-Matrizen-DNA zu erzeugen. Das amplifizierte Produkt wird durch eine Restriktionsendonuklease an spezifischen Spaltungsstellen gespalten, an welche die Endonuklease bindet, und die Größe der resultierenden Fragmente wird bestimmt. Die Gegenwart oder Abwesenheit einer Spaltungsstelle zeigt den Nachweis der Mutation von Interesse an.
Kurze Tandem-Wiederholungs-Stellen (Variation in der Anzahl von kurzen Tandem-Wiederholungs-Einheiten an einer Stelle, welche DNA-Längen-Variabilität zwischen Allelen an dieser Stelle verursacht) können verwendet werden, um DNA-Variabilität zu assayen. Die hochvariable Kopienzahl der kurzen Wiederholungen dient als ein genetischer Marker.
Distinkte polymorphe kurze Tandem-Wiederholungs(STR)-Stellen werden amplifiziert und analysiert. Das U.S.-Patent Nr. 5 843 660 an Schumm et al. beschreibt ein Verfahren zur Anwendung von PCR, um STR-Stellen zu amplifizieren. Das Amplifikations-Verfahren erzeugt einen Satz von Nukleinsäure-Fragmenten innerhalb eines diskreten Größenbereichs.
Die Nukleinsäuresequenzen des diskreten Größenbereichs können dann getrennt und analysiert werden. Zusätzlich zu RFLP und STR können Einzel-Nukleotid-Polymorphismen als Marker der genetischen oder phänotypischen Variabilität und als genetische Marker verwendet werden. Die Verwendung von Einzel-Nukleotid-Polymorphismus kann verschiedene Vorteile gegenüber entweder RFLP- oder STR-Analyse bieten.
Zahlreiche Vorteile werden durch Analyse eines Einzel-Nukleotid-Polymorphismus (SNP, single nucleotide polymorphism) geboten. Im allgemeinen erzeugen SNP-Analyse-Protokolle kleine Nukleinsäuresequenzen eines diskreten Größenbereichs. SNP-Analyse kann schnell und an Automatisierung anpassbar sein. Dies führt zu einer Reduktion der Menge an Reagenzien und anderer Materialien, die benötigt wird, um diese Analyse zu bewirken. SNP-Genotypierung ist in hohem Maße anpassbar an Hochdurchsatz-Systeme. Im menschlichen Genom existieren Millionen von individuellen Einzel-Nukleotid-Polymorphismen. Im Gegensatz dazu treten STR- oder RFLP-Varianten bei einer viel geringeren Häufigkeit auf.
Die Vorteile einer SNP-Analyse haben diese Analyse zu einem bevorzugten genomischen Marker-Assay gemacht. SNP-Analyse ist nützlich zur Genotypierung oder zur Ermöglichung einer Mutationsbewertung, genetischen Kartierung, pharmakogenetischen Typisierung, phylogenetischen Typisierung und ist anpassbar an forensische und Identitäts-Analysen. Einzel-Nukleotid-Polymorphismen können mit phänotypischer Expression korrelieren, und manche SNP-Varianten könnten als Marker für Krankheitsbefunde dienen, was eine
vereinfachte Diagnostik ermöglicht. Eine relativ große Anzahl von SNP-Varianten liegt im menschlichen Genom vor, welche an die Millionen zählt. An spezifischen Stellen kann die Variation zwischen zwei Nukleotiden bestehen: eine Nukleotid-Variante vom üblichen Typ (übliche Allel-Variante) und eine Nukleotid-Variante vom seltenen Typ (seltene Allel-Variante). Diese binäre Variation (diallelisch) ermöglicht eine Allel-Analyse, in der eine Variante entweder als hauptsächlicher oder varianter Typ kategorisiert werden kann. Anders als STR-Variation kann SNP-Variation schneller binäre Allel-Benennungen ergeben. RFLP-Varianten sind binär, aber arbeitsaufwendig und kostspielig.
Eine Zahl von Techniken ist beschrieben worden, um den Einzel-Nukleotid-Polymorphismus in der genetischen Analyse zu verwenden. Ein solches Verfahren ist die Einzel-Nukleotid-Primerverlängerung (SNuPE; singe nucleotide primer extension). Ein Beispiel ist in U.S.Patent Nr. 5 888 819, von Goelet et al., ersichtlich, welches die Verwendung eines PCR-artigen Analysesystems beschreibt, um Information über genetische Variation zu gewinnen. In diesem Verfahren wird eine einzelsträngige Matrizen-Nukleinsäuresequenz erhalten und ein Primer wird auf eine passende Matrizen-Sequenz hybridisiert, um einen Matrizen-Primer-Doppelstrang zu bilden. Eine DNA-Polymerase verlängert den Nukleinsäure-Primer-Doppelstrang um ein Nukleotid. Dies kann unter Verwendung eines Terminators, wie einem radioaktiv markierten oder Fluoreszenz-markierten Didesoxynukleotid ermöglicht werden, um sicherzustellen, daß nur eine einzelne Base an das 3'-Ende des Primers angeheftet wird. Dieses Protokoll verlängert den Primer um eine Base. Die Bestimmung, welcher Typ von Nukleotid auf dem 3'-Ende des Primers eingebaut wurde, wird durch die Gegenwart des nachweisbaren Markierungstyps ermöglicht.
Das U.S.-Pat. Nr. 5 846 710 an Bajaj beschreibt eine ähnliche Technologie zur Einzel-Nukleotid-Polymorphismus-Analyse. Ein einzelsträngiges Probenoligonukleotid wird mit einem markierten Nukleotid, einem Primer mit einer Sequenz, komplementär zu einer bekannten Sequenz auf dem Matrizen-Oligonukleotid, und einem Mittel zur Herbeiführung der DNA-Verlängerung (wie einer DNA-Polymerase) gemischt. Außer dem markierten Nukleotid werden keine anderen Nukleotide in die Mischung eingeschlossen. Die Mischung wird dann Bedingungen unterworfen, unter welchen der Primer sich an das einzelsträngige Proben-Oligonukleotid anlagert. Die DNA-Polymerase baut dann das markierte Nukleotid, wenn eine zu dem markierten Nukleotid komplementäre Base an der Stelle auf dem Proben-Oligonukleotid an der Einzelbase vorhanden ist, gegenüber der Base unmittelbar stromaufwärts vom 3'-Ende des Primers ein. Ein Artikel mit dem Titel "Capillary Electrophoresis for the Detection of Known Point Mutations by Single-Nucieotide Primer Extension and Laser-Induced Fluorescence Detection" von Piggee, C. et al., in Journal of
Chromatography A 781 (1997), S. 367-375, beschreibt die Trennung von DNA-Fragmenten in einem Kapillarelektrophorese-Format in Verbindung mit einem Nachweis von Laserinduzierter Fluoreszenz (LIF). LIF wurde angewandt, um Einzel-Nukleotid-Polymorphismus unter Anwendung eines Verfahrens der Einzel-Nukleotid-Primerverlängerung nachzuweisen, welches in den vorstehenden zwei Literaturbezugsstellen beschrieben ist. Der markierte Terminator wurde mit fluoreszenten Farbstoffen markiert.
Eine Anzahl verschiedener Verfahren zur Analyse von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen durch Einsetzen von Einzel-Nukleotid-Primerverlängerungs-Reaktionen unter Nachweis der resultierenden Reaktionsprodukte ist beschrieben worden. In Human Genetics (1999) 104:89-93, Autor Hoogendoorn, B. et al., in einem Artikel mit dem Titel "Genotyping Single Nucleotid Polymorphism by Primer Extension and High Performance Liquid Chromatography" wird eine SNuPE-Reaktionsprodukt-Analyse unter Anwendung von Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) beschrieben. Diese Bezugsstelle beschreibt eine "Minisequenzierungs"-Typ-Analyse, worin eine DNA-Sequenz, enthaltend einen Einzel-Nukleotid-Polymorphismus, durch die Verlängerung eines Oligonukleotidprimers amplifiziert wird, welcher angrenzend an den Polymorphismus angelagert wird. In Gegenwart eines markierten Terminators wird der Primer um mindestens eine Base verlängert. In der PCR-Reaktionsmischung werden mindestens drei der vier Nukleotide und ein Terminator-Nukleotid eingeschlossen.
Eine DNA-Polymerase wird Nukleotide an das 3'-Ende des Primers bis zu einer Stelle auf der Proben-DNA, komplementär zur Terminatorbase, anfügen. Die HPLC-Analyse der Primerverlängerungs-Reaktionsprodukte aus einer derartigen Reaktion führt zu chromatographischen Daten, aus denen der Genotyp der polymorphen Stelle, mit Genotyp-Zellen als Wildtyp oder als mutanter Typ, folgt.
Das U.S.-Patent Nr. 5 885 775 von Haff et al., beschreibt Verfahren zur Einzel-Nukleotid-Polymorphismus-Analyse durch Massenspektrometrie. Wie bei den vorausgehenden Verfahren erzeugt eine PCR-Reaktion, welche einen Nukleotidterminator einschließt, ein Primerverlängerungsprodukt eines diskreten Größenbereichs. Die Basenzusammensetzung des verlängerten Primers wird durch Massenspektrometrie bestimmt. Die unterschiedlichen Gewichte der verschiedenen Nukleosidbasen gestatten die Unterscheidung der Basen.
In vielen dieser DNA-Analyseverfahren wird eine große Anzahl von Oligonukleotiden eines diskreten Größenbereichs erzeugt und analysiert. Verschiedene Techniken können angepaßt werden, um den Durchsatz der Analyse der Verbindungen zu erhöhen. Die Anwendung von Hochdurchsatz-Techniken gestattet die Analyse von Nukleinsäuresequenzen bei einer schnelleren Rate.
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Verschiedene Techniken sind angepaßt worden, um den Durchsatz der Analyse von kleinen Verbindungen (z.B. Nukleinsäuresequenzen in einem diskreten Größenbereich) zu erhöhen. In Proceedings of the National Academy of Sciences, Band 95, Seiten 2256-2261, März 1998, in einem Artikel mit dem Titel "High-throughput genetic analysis using microfabricated 96-sample capillary electrophoresis microplates" von Simpson, P. et al., offenbaren die Autoren ein Kapillarenfeldanordnungs-Elektrophoresesystem, welches 96 Proben in einem parallelen Elektrophorese-Verfahren rasch analysieren kann. Dieses System verwendet eine 96-Probenvertiefungs-Glas-Sandwich-Mikroplatte mit 48 Trennungskanälen. Zwei eingearbeitete Kapillaren fließen in jeden Kanal. Die Proben werden in zwei Öffnungen auf zwei Kapillarenlängen injiziert, welche zu einem Zentraldetektor fuhren. Dies gestattet die Reihenanalyse von zwei verschiedenen Proben in jeder assoziierten Kapillare mit einem Nachweis durch einen Zentraldetektor. Diese Technik erfordert eine spezialisierte Mikroplatten-Probenvertiefung mit Injektionseinheit, um den erhöhten Durchsatz zu erzeugen. Mehrere Injektionsreservoirs und Kapillaren werden für die serielle Injektion von zwei Proben, die durch einen Detektor abgelesen werden sollen, benötigt.
Zusätzliche Verfahren zur Erhöhung des Durchsatzes einer Genomanalyse sind beschrieben in Human Molecular Genetics, Band 1, Nr. 6, Seiten 391-395, in einem Artikel mit dem Titel "Rapid and Simultaneous Detection of Multiple Mutations by Pooled and Multiplexed Single Nucleotide Primer Extension: Application of the Study of Insulin-Responsive Glucose Transporter and Insulin Receptor Mutations in Non-Insulin-Dependent Diabetes" von Krook, A. et al. In dieser Veröffentlichung beschreiben die Autoren zwei Techniken, eingesetzt in Einzel-Nukleotid-Primerverlängerungsreaktionen, welche einen größeren Durchsatz durch gleichzeitiges Untersuchen mehrerer Allele an mehreren Orten gestatten.
Die erste beschriebene Technik besteht in der Vereinigung von Proben. Durch Zusammengeben einer großen Anzahl von Proben vor der Durchführung von PCR-Reaktionen für einen einzelnen Ort wird die Analyse einer großen Menge an Proben in einer Einzel-Nukleotid-Primerverlängerungsreaktion gestattet. Diese Technik ist am nützlichsten für die Analyse von seltenen Alleltypen. Wenn eine Analyse der Vereinigungsmenge bzw. des Pools die Gegenwart einer Zielsequenz innerhalb des Pools von Proben anzeigt, können individuelle Proben später analysiert werden, um die Einzelne zu bestimmen, welche die Sequenz von Interesse enthält.
Die zweite Anpassung zur Erhöhung des Durchsatzes ist die Verwendung von mehreren Primern verschiedener Länge während der Primerverlängerung. Jeder Primer ist ausgelegt, um
an eine spezifische bekannte Sequenz mit einer polymorphen genetischen Variante, positioniert an der Base, lokalisiert unmittelbar stromabwärts gegenüberliegend dem 3'-Ende des Primers, zu binden. Unter Verwendung mehrerer Primer von unterscheidbar verschiedenen Längen wird eine Erhöhung des Durchsatzes gestattet. Eine ähnliche Technik zur Erhöhung des Durchsatzes wird beschrieben in Nature Biotechnology, Band 16, Dez. 1998, in einem Artikel mit dem Titel "High Level Multiplex Genotyping by MAODI-TOF Mass Spectrometry" von Ross, E. et al. Diese Bezugsstelle beschreibt die Verwendung eines 12-Primer-Systems zur Analyse von Einzel-Nukleotid-Polymorphismus an 12 verschiedenen Stellen. Die zwölf Primer werden in einer einzelnen PCR-Reaktion kombiniert. Die Reaktionsprodukte werden durch Massenspektrometrie analysiert. Die Primer sind von ausreichend verschiedener Länge, um zu gestatten, daß sie durch Massenspektrometrie unterschieden werden können.
Ein weiteres Verfahren zur Erhöhung des Durchsatzes besteht in der Verwendung von mehreren Farbstoffmarkierungen. Das Anheften eines Farbstoffs mit einer spezifischen charakteristischen Anregungs- und Emissions-Wellenlänge an jeden Nukleotidterminator, der in einer SNuPE-Reaktion verwendet wird, gestattet die gleichzeitige Analyse von Nukleotidvariation. Ein optischer Detektor kann gleichzeitig die verschiedenen Wellenlängen von jedem Farbstoff unterscheiden, wodurch das spezifische Nukleotid, welches in das analysierte Oligonukleotid eingebaut wurde, nachgewiesen wird.
Es ist das Ziel der Erfindung, eine Vorrichtung zur weiteren Erhöhung des Durchsatzes von Analysesystemen zu beschreiben, welche entworfen sind, um kleine Verbindungen, insbesondere DNA-Sequenzen eines diskreten Größenbereichs, zu analysieren.
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Es ist ein weiteres Ziel, diese Erhöhung des Durchsatzes mit einer begrenzten Änderung an einer existierenden Vorrichtung zu bewerkstelligen.
Die obenstehenden Ziele sind durch eine Vorrichtung nach Schutzanspruch 1 erzielt worden.
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung für die Ultrahochdurchsatz-Analyse von kleinen Verbindungen. Die Vorrichtung schließt eine Kapillarenfeldanordnung ein, wobei jede Kapillare der Feldanordnung mit einem Separationsmedium gefüllt ist. Das Separationsmedium kann eine Siebmatrix einschließen oder kann ein freies Lösungs-Kapillarelektrophorese-Medium sein. Elektroden können in elektrische Verbindung mit den
entgegengesetzten Enden jeder Kapillare gebracht werden, wobei ein elektrischer Fluß durch die Kapillare angelegt wird. Eine Injektionseinrichtung ist konfiguriert, um Proben aus einer Mehrfachvertiefungs-Probenplatte in ein Injektionsende von jeder der Kapillaren in der Feldanordnung zu injizieren. In jede Kapillare kann eine diskrete gewählte Menge der Probe dann mittels einer Injektionseinrichtung geladen werden. Assoziiert mit der Injektionseinrichtung ist ein Zeitgeber, welcher die Injektionseinrichtung periodisch anweist, weitere Proben aus weiteren Mehrfachvertiefungsplatten in die Kapillaren der Kapillarenfeldanordnung zu injizieren. Die Zeitgebung der Injektion ist so ausgelegt, daß wenn Proben den Detektor erreichen, die Proben nachweisbar getrennt sind, und die Verbindungen innerhalb jeder Probe in ähnlicher Weise nachweisbar getrennt sind. Die Injektionen erfolgen in eine Separationslänge in solch einem zeitlichen Abstand, daß die separaten Injektionen nachweisbar an einer Nachweis-Stelle entlang der Separationslänge, distal von der Probeninjektionsstelle, getrennt sind. Die Kapillarenfeldanordnung besitzt einen Nachweisbereich, der mit den Kapillaren der Kapillarenfeldanordnung an einem zum Injektionsende distalen Ende assoziiert ist. Ein Laser in der Vorrichtung richtet kohärentes Licht auf den Nachweisbereich, welches eine Fluoreszenz aus markierten Proben innerhalb der Kapillaren anregt. Ein optischer Mehrkanal-Detektor ist positioniert, um diese angeregte Fluorezenz nachzuweisen.
Der Zeitgeber, der bei der Vorrichtung beinhaltet ist, kann auch so mit den Elektroden assoziiert sein, daß bevor der Zeitgeber die Injektionseinrichtung anweist, weitere Proben in die Kapillarfeldanordnung zu injizieren, der Zeitgeber zuerst die Elektroden anweist, den Stromfluß durch die Kapillarfeldanordnung zu unterbrechen. Dieses Zeitgebungssystem kann ein Schaltkreis, ein Zeitgebungsalgorithmus oder irgendeine andere Zeitgebungseinrichtung sein.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst eine Mehrzahl von Probenaufnahmegefäß-Behältern, von denen jeder eine Mehrzahl von Probenhalte-Aufhahmegefaßen zum Halten der Probe besitzen. Ein Beispiel eines Probenaufnahmegefäß-Behälters ist eine 96-Vertiefungs-Mikroplatte. In die genannte Mehrzahl von Probenaufnahmegefaß-Behältern können hergestellte oder amplifizierte Proben überführt werden. Jede Kapillare in der Kapillaren-Feldanordnung kann in Kontakt mit einer Probe in dem Probenaufnahmegefaß-Behälter gebracht werden.
Die Vorrichtung kann auch einen Mehrfachvertiefungs-Probenplatten-Transporter, wie ein Förderband oder einen Roboterarm, einschließen, um weitere Mehrfachvertiefungs-Probenplatten zu der Injektionseinrichtung zu bringen, und ein Magazin für die Zuführung der Mehrfachvertiefungs-Probenplatten zu dem Transporter einschließen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Fig. 1 ist ein Fließdiagramm der Schritte einer Probenanalyse von hohem Durchsatz, wie sie in einem erfindungsgemäßen Kapillarenfeldanordnungs-Elektrophoresesystem ausgeführt werden kann.
Die Fig. 2 ist ein Fließdiagramm, welches die Schritte der Hochdurchsatz-Probenanalyse unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Kapillarenfeldanordnungs-Elektrophoresesystems zeigt, um Einzel-Nukleotid-Primerverlängerungs-Reaktionsprodukte zu analysieren.
Die Fig. 3 ist ein Schema, welches die Einzel-Nukleotid-Primerverlängerung der Probenherstellung veranschaulicht.
Die Fig. 4 besteht aus Daten der Detektion von Laser-induzierter Fluoreszenz in einem Kapillarelektrophorese-System von verschiedenen allelischen Zuständen, welche aus mehreren über die Zeit erfolgten Injektionen gemessen wurden.
Die Fig. 5 zeigt Daten aus einer 10-Injektions-Kapillarelektrophorese-Analyse von Proben, wobei die Proben zwei Verbindungen, jeweils markiert mit einer optisch nachweisbaren Markierung, und einen dritten optisch nachweisbaren Qualitätsmessungs-Standard enthalten.
Die Fig. 6A zeigt Daten, erfaßt bei einer ersten Wellenlänge aus einer 10-Injektions-Kapillarelektrophorese-Analyse.
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Die Fig. 6B zeigt Daten, erfaßt bei einer zweiten Wellenlänge, wie in Fig. 6A.
Die Fig. 6C zeigt Daten, erfaßt bei einer dritten Wellenlänge, wie in Fig. 6A.
Die Fig. 6D zeigt eine Überlagerung der Daten der Figs. 6A, 6B und 6C.
Die Fig. 6D zeigt eine Überlagerung der Daten der Figs. 6A, 6B und 6C.
Die Fig. 7 ist eine Planansicht einer Vorrichtung mit einem Zeitgeber, um die Injektionen über die Zeit hinweg in ein Feld-Kapillarelektrophoresesystem zu bewirken.
Die Fig. 8 ist eine Planansicht für ein Roboter-Transfersystem, welches Probenbehälter aus einem Magazin zu der Kathodenbühne bewegt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung sollte unter Heranziehung der nachfolgenden Definitionen verstanden werden.
AUeI: Eine der zwei oder mehr alternativen genetischen Sequenzen, welche denselben chromosomalen Ort besetzen.
Homozygot: Zwei identische Allele in einem Paar homologer Chromosomen aufweisend. Heterozygot: Zwei verschiedene Allele in einem Paar homologer Chromosomen aufweisend.
Elektrophoretisches Medium: Eine Flüssigkeit oder ein Gel, durch welche(s) elektrischer Strom fließen kann und Verbindungen elektrophoretisch aufgetrennt werden können.
Freies Lösungs-Kapillarelektrophorese-Medium: Elektrophoresemedium, im wesentlichen ohne Matrixeffekte, Polymernetzwerk, auferlegten pH-Gradient oder sekundäre Phase, so daß mehr als 90 % der Auftrennung ein Ergebnis der Nettoladung der Verbindung ist.
Medium geringer Viskosität: Medium mit einer Viskosität von 5000 Centipoise oder weniger. 20
Kleine Verbindungen/kleine Moleküle: Eine Verbindung oder Moleküle mit einem Gewicht von 33 000 Dalton oder weniger.
Allel-Benennungen: Bestimmung des Allel-Zustands an spezifischen Stellen. 25
Einzel-Nukleotid-Polymorphismus: Variation in einem einzelnen Nukleotid an einer spezifischen Stelle.
Wissenschaftliche Analysegeräte, einschließlich zentrifugaler, chromatographischer und elektrophoretischer Separationssysteme, beruhen auf der Trennung von Verbindungen entlang einer Separationsstrecke. Sobald die Proben durch eine Separationskraft getrennt worden sind, können die Zielverbindungen innerhalb der Probe nachgewiesen und/oder aufgefangen werden. Die Erhöhung des Systemdurchsatzes ermöglicht die effiziente Nutzung von Instrumenten und der Zeit des Experimentators. In der vorliegenden Erfindung wird der Durchsatz durch Injizieren mehrerer Proben auf die Separationsstrecke erhöht, wobei die Injektion von Proben in die Separationsstrecke so zeitlich getrennt erfolgt, daß wenn die Proben einen Detektor erreichen, die Zielverbindungen innerhalb der Probe nachweisbar
getrennt sind. Darüber hinaus muß das Injektionsintervall ausreichend sein, um zu verhindern, daß eine Probe in eine andere Probe hineinwandert. Eine solche Festlegung kann vorgenommen werden, wenn die Probenwanderungsgeschwindigkeit entlang der Strecke bekannt ist.
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Kapillarelektrophorese ist ein Beispiel eines analytischen Verfahrens, das zur Anwendung mit mehreren Injektionen über die Zeit anpaßbar ist. Dieses Verfahren ist für die Hochdurchsatz-Analyse von kleinen Verbindungen, wie Nukleinsäuren, Proteinen oder anderen hergestellten Verbindungen, welche einen kleinen diskreten bekannten Größenbereich aufweisen, am nützlichsten. Weil der relative Größenbereich der Verbindungen bekannt ist, können die Wanderungsgeschwindigkeiten der Verbindungen festgestellt werden. Zum Beispiel kann die elektrophoretische Beweglichkeit eines Teilchens in einem freien Lösungs-Kapillarelektrophorese-System durch die Formel:
&mgr;-q/f
ermittelt werden, worin
&mgr; = elektrophoretische Beweglichkeit,
q = Teilchen-Nettoladung,
f = Translations-Reibungskoeffizient.
Durch Heranziehen dieser Formel kann die elektrophoretische Beweglichkeit der Zielverbindung eingeschätzt werden, was eine Messung der Wanderungsgeschwindigkeit gestattet. Sobald die Wanderungsgeschwindigkeit bekannt ist, kann der minimal erforderliche Abstand zwischen Proben festgestellt werden. Es ist auch möglich, die Minimal-Probeninjektion experimentell zu bestimmen.
Das Fließdiagramm in der Fig. 1 veranschaulicht eine Möglichkeit zur Abstandgebung von Injektionen in ein Kapillaren-Feldanordnungs-Elektrophoresesystem über die Zeit, um den analytischen Durchsatz zu erhöhen. Die Kapillarenfeld-Elektrophorese besteht aus einer Mehrzahl von Kapillaren, wobei jede Kapillare mit einem Separationsmedium gefüllt ist. Ein erstes Ende jeder Kapillare in der Feldanordnung ist für die Probeninjektion angepaßt. Die Injektionsenden der Kapillare werden in einem Kathodenblock bei einem definierten Abstand zu einem Nachweis-Bereich gehalten, welcher mit jeder Kapillare, lokalisiert am distalen Ende jeder Kapillare, assoziiert ist. Das System bewirkt eine Elektrophorese, indem das Injektionsende jeder Kapillare in elektrische Verbindung mit einer Kathode gebracht wird, und ein entgegengesetztes Ende jeder Kapillare in elektrische Verbindung mit einer Anode gebracht wird.
Zw Beginn (Block 11) wird eine Mehrzahl von Mikroplatten bereitgestellt. Die Vertiefungen in jeder Mikroplatte enthalten eine hergestellte Probe. Ein Teil der Proben kann kleine Zielverbindungen enthalten. Diese Zielverbindungen wandern bei einer bekannten Geschwindigkeit oder innerhalb eines bekannten Bereichs von Geschwindigkeiten.
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Nachdem die Mehrzahl von Mikroplatten, enthaltend die Assayproben, vorbereitet worden ist, beginnt die Elektrophorese. Der Anfangsschritt besteht in der Bestätigung der Probeninjektion (Block 13). Wenn die erste Platte geladen ist, wird bestätigt, daß eine anfängliche Probe noch zu injizieren ist. Die Probenplatte wird dann zu der Kathodenbühne bewegt (Block 15).
Sobald die Probenplatte in der Kathodenbühne ist, werden die Kapillaren in der Feldanordnung von Kapillaren jeweils in eine Vertiefung auf der Proben-enthaltenden Mikroplatte eingeführt. Sobald die Kapillaren in Kontakt mit der Probe sind, findet die Probeninjektion statt (Block 17). Die Probeninjektion führt eine diskrete Menge an Probe aus jeder Vertiefung der Proben-enthaltenden Mikroplatte in eine individuelle assoziierte Kapillare ein. Es sind mehrere Probeninjektionen möglich. Diese beinhalten die Anwendung eines elektrischen Strom-Pulses, um zu verursachen, daß eine diskrete Menge an Probe in die Kapillaren wandert. Es ist auch möglich, eine diskrete Menge an Probe unter Druck in jede Kapillare zu injizieren.
Sobald die Proben injiziert sind, wird ein Wassertank auf die Kathodenbühne bewegt (Block 19). Die Kapillarenspitzen der Kapillarenfeldanordnung werden dann in dem Wassertank gespült (Block 21). Alternativ dazu können die Kapillarenspitzen direkt mit Puffer gespült werden. Dies entfernt jedwede überschüssige Probe von dem Äußeren der Kapillarenröhren in der Feldanordnung, was eine Kreuz-Kontamination verhindert. Nachdem die Kapillarenspitzen gespült sind, wird die Medienplatte in die Kathodenbühne bewegt (Block 23). Die Mediumplatte ist mit einer Stromquelle verbunden. Bei dieser Plazierung der Medienplatte kann ein elektrischer Strom durch die Feldanordnung von Kapillaren fließen.
Bei dieser Anordnung der Medienplatte kann elektrischer Strom durch die Kapillaren fließen.
Dies wird die elektrophoretische Separation der Zielverbindungen verursachen, wobei die Verbindungen durch die Kapillare von dem Kathoden- zu einem Anoden-Ende wandern. Wenn die Elektrophorese stattfindet, tastet ein Scan-Mechanismus einen Bereich der Kapillare, distal vom Injektionsende der Kapillare (oder den Enden der Kapillaren in Hüllen-Flußsystemen), ab. Die Abtastung erfolgt kontinuierlich während der elektrophoretischen Trennung.
Die elektrophoretische Trennung von Verbindungen bei gleichzeitigem Abtasten eines Nachweisbereichs findet während eines festgelegten Intervalls statt (Block 25). Die Länge des Intervalls ist ausreichend, damit die Probe vom Injektionsende der Kapillare weg wandert. Sobald dieses Intervall stattgefunden hat, werden die in den Blöcken 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 gezeigten Schritte zehnmal wiederholt (Pfeil 27). Der Abstand der Proben ist so beschaffen, daß die Zielverbindungen innerhalb jeder Probe nicht bei einer solchen Geschwindigkeit wandern, daß die Proben nicht zu unterscheiden wären, wenn die Zielverbindungen den Nachweisbereich erreichen. Die Länge der in der Feldanordnung von Kapillaren verwendeten Kapillaren ist ausreichend groß, um zu gestatten, daß 10 Proben injiziert und während eines festgelegten Intervalls getrennt werden, ohne daß die erste injizierte Probe den Detektor erreicht. Somit werden alle Proben auf die Kapillare geladen, bevor irgendeine Probe nachgewiesen wird.
Nachdem alle Proben auf die Kapillare geladen worden sind, verursacht die kontinuierliche Elektrophorese, daß die Zielverbindungen innerhalb der Proben von einem Kathodenende der Kapillare zu einem Anodenende wandern. Distal vom Injektionsende der Kapillare befindet sich ein Nachweisbereich, der mit der Kapillare assoziiert ist. Wenn Zielverbindungen den Nachweisbereich passieren, werden die Verbindungen nachgewiesen. Somit wird eine kontinuierliche Abtastung und Elektrophorese (Block 29) während einer ausreichenden Zeit bewirkt, um zu erlauben, daß alle Proben innerhalb der Kapillarröhre an dem Nachweisbereich vorbeiwandern und abgetastet werden. Nachdem alle Proben an dem Nachweisbereich vorbeigewandert sind, hält der Betrieb an (Block 31).
Die Fig. 2 präsentiert eine ausführlichere Ansicht des Einsatzes von mehreren, über die Zeit getrennten, Injektionen mit einem Kapillarenfeldanordnungs-Elektrophoresesystern, um Nukleinsäurefragmente von diskreter Größe zu trennen. Die in der Fig. 2 gezeigten getrennten Nukleinsäuresequenzen betreffen den Nachweis eines Einzel-Nukleotid-Polymorphismus an einer spezifischen Stelle. Der Anfangs-Schritt erfordert die Herstellung von Proben (Block 41). Die Probenherstellung beinhaltet den Einzel-Nukleotid-Polymorphismus-Assay. Dieser Assay könnte bestehen in Einzel-Nukleotid-Primerverlängerungsreaktionen, Polymerasekettenreaktion oder anderen Arten der Probenherstellung. Weitere Details über die Probenherstellung werden im Zusammenhang mit der Fig. 3 erörtert. Die Probenherstellung erzeugt eine Anzahl von Proben, wobei ein Prozentsatz der Proben Zielverbindungen enthält. In diesem Beispiel sind die Zielverbindungen Nukleinsäuresequenzen eines diskreten Größenbereichs. Da der Größenbereich der Zielverbindungen bekannt ist, kann die Geschwindigkeit der elektrophoretischen Wanderung der Ziele bestimmt werden. Sobald die Proben-Nukleinsäuresequenzen erzeugt sind, wird die Probe danach gesäubert (Block 43), um
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Salze und andere Kontaminanten zu entfernen. Die Probensäuberung gestattet, daß die Zielverbindungen gereinigt und Matrizen-DNA und überschüssige nachweisbare Markierungen oder überschüssige Nukleotide entfernt werden. Die Probensäuberung kann erfordern, die Zielverbindungen zu entsalzen, was eine effizientere elektrophoretische Trennung gestattet. Die Proben werden jeweils in eine Vertiefung auf einer Mehrfachvertiefungs-Probenplatte plaziert.
Die elektrophoretische Trennung beginnt durch Ersetzen des Mediums innerhalb der Kapillare (Block 45). Das Medium kann das freie Lösungs-Kapillarelektrophorese-Medium sein oder alternativerweise eine Matrix zum Sieben verschieden großer Verbindungen sein. In einem freien Lösungs-Kapillarelektrophorese-Medium, wie 4,5 % oder weniger Hydroxyethylcellulose (HEC), weist das Medium im wesentlichen Matrixeffekte, Polymer-Netzwerk, einen auferlegten pH-Gradienten oder eine sekundäre Phase nicht auf. Dies führt dazu, daß im wesentlichen die gesamte (90 % oder mehr) Wanderung ein Ergebnis der Nettoladung der Verbindung in dem elektrischen Feld ist. Im Gegensatz dazu dient bei Siebmedien, wie linearem oder vernetzten Acrylimid, das Separationsmedium mit einer Siebfunktion, wobei die Verbindungsgröße ein signifikanter Faktor bei der Teilchenwanderungsgeschwindigkeit ist. Wenn ein Medium geringer Viskosität verwendet wird, muß eine Druckbefüllung nicht erforderlich sein. Das Medium kann durch geringeren Druck oder durch Kapillarwirkung eingezogen werden. Das Medium wird mit Druck in die Kapillaren gefüllt. Lineares Polyacrylimid bei einer Konzentration von 4 % oder weniger ist ebenfalls ein effektives Separationsmedium.
Sobald die Kapillaren mit Medium gefüllt worden sind, wird die erste Probe injiziert (Block 17). Wie in Fig. 1 ersichtlich war, kann die Probe injiziert werden durch Verwendung eines kurzen Strom-Pulses, durch Druck-Injektion oder durch andere bekannte Injektionsarten. Im Anschluß an die Injektion wird Strom während eines zweiminütigen Intervalls durch die Kapillaren angelegt, um die Probe weg von dem Injektionsbereich hin zu einem Nachweis-Ende der Kapillare wandern zu lassen (Block 47). Nach dem zwei Minuten langen Elektrophoreseintervall wird eine nachfolgende Probe injiziert. Diese Art der Probeninjektion, gefolgt von zwei Minuten langer Elektrophorese, wird zehnmal wiederholt, wie angezeigt durch den Pfeil 51. Die Länge der Kapillaren in der Feldanordnung von Kapillaren in dieser Vorrichtung wird so gewählt, daß die 10 Proben in jede Kapillare injiziert werden können, gefolgt von zweiminütiger elektrophoretischer Trennung, ohne daß die anfängliche Probe an dem Nachweisbereich vorbei wandert. Sobald alle 10 Proben in jede Kapillare geladen worden sind, findet eine kontinuierliche Elektrophorese und Abtastanalyse des Nachweisbereichs statt (Block 55). Diese Elektrophorese und Analyse erfordern 20 bis 30 Minuten. In dieser Zeit wandern alle Proben an dem Nachweisbereich vorbei. Wenn die Proben am Nachweisbereich
vorbeiwandern, können nachweisbare Ziele innerhalb der Probe nachgewiesen werden. Durch die Elektrophorese und Analyse werden Nachweissignale erzeugt. Die Nachweissignale werden als Daten erfaßt, welche anschließend verarbeitet werden (Block 57). Bei der Datenverarbeitung wird das Basislinien-Nachweisrauschen von der spektralen Separation subtrahiert, um den Signalhintergrund zu eliminieren. Dies gestattet eine gewisse Normierung der Nachweisdaten und die Eliminierung von falschen Signalen. Die Daten können dann analysiert werden, um das Vorhandensein von Zielverbindungen festzustellen.
Sobald Nachweisdaten erfaßt und verarbeitet werden, werden Allel-Benennungen vorgenommen (Block 61), basierend auf dem Nachweis von Zielverbindungen durch Wellenlängenemission und/oder Ziel-Wanderungsgeschwindigkeit. Die Zielverbindung kann als auf einen Allel-Genotyp hinweisend klassifiziert werden.
Die Analyse von Einzel-Nukleotid-Polymorphismus gestattet eine Genotyp-Charakterisierung, basierend auf Einzelbasen-Unter schieden an bestimmten Stellen (Block 63). Wie bereits bemerkt, stellt Einzel-Nukleotid-Polymorphismus einen hohen Gehalt an Genotypisierungs-Information bereit und kann ein Indikator von phänotypischen Krankheitszuständen sein.
Die in den Fließdiagrammen in den Figs. 1 und 2 gezeigte analytischen Kapillarelektrophorese ist nützlich zur Erhöhung des Durchsatzes der Analyse von irgendeiner der Anzahl an kleinen Verbindungen, solange die Zielverbindungen von einem bekannten diskreten Größenbereich sind, so daß die erwartete Geschwindigkeit der elektrophoretischen Wanderung bestimmt werden kann. Zahlreiche Protein- und Nukleinsäure-Analyseverfahren können auf diese Weise durch die erfindungsgemäße Vorrichtung mit höherem Durchsatz unterstützt werden. Die Erfindung ist besonders nützlich zur Unterstützung bei der Analyse von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen.
Ein "Polymorphismus" ist eine Variante einer DNA-Sequenz, die bei manchen Individuen innerhalb einer Population gefunden wird. Polymorphismen können als "allelisch", d.h. eine von mindestens zwei Genort-Varianten, charakterisiert werden. Einzel-Nukleotid-Polymorphismen deuten darauf hin, daß der Unterschied zwischen den zwei Varianten Allelen eine Veränderung in einer einzelnen Nukleotidbase an einer spezifischen genomischen Stelle ist.
Wenn lediglich zwei Varianten innerhalb der Population vorhanden sind, wird der Einzel-Nukleotid-Polymorphismus als diallelisch charakterisiert.
Für Organismen, welche zwei Kopien der Genom-Chromosomen aufweisen (diploide Organismen), sind drei Genotypen möglich. Ein Individuum kann für ein Allel homozygot sein (beide Chromosomen weisen dieselbe Base an der interessierenden Stelle auf), kann homozygot für die alternative Allelvariante sein (beide Chromosomen besitzen die Base vom Variantentyp an der Stelle von Interesse), oder kann heterozygot sein (ein Chromosom besitzt je einen Alleltyp). Einzel-Nukleotid-Polymorphismen, welche diallelisch sind, sind anpaßbar an eine binäre Typ-Bewertung (+/-), welche die Datenerfassung und -analyse vereinfacht. Wenn eine Einzel-Nukleotid-Primerverlängerungs(SNuPE)-Reaktion verwendet wird, um den Polymorphismus zu analysieren, sind die Reaktionsprodukte in hohem Maße vorhersagbar und gleichförmig, was eine geregeltere Vorhersagbarkeit bei der Bestimmung der elektrophoretischen Beweglichkeit zuläßt.
Die Fig. 3 veranschaulicht die Schritte einer Einzel-Nukleotid-Primerverlängerungs(SNuPE)-Reaktion. Schritt 1 der Reaktion erfordert das Bereitstellen von Matrizen-DNA, zusammengesetzt aus einem ersten DNA-Strang 105 und dem zweiten DNA-Strang 107. In einem zweiten Schritt werden die zwei Stränge der Matrizen-DNA 105 und 107 in Einzelstränge getrennt. Einer der Einzelstränge, Strang 105, enthält die Polymorphismen an einzelnen Nukleotidstellen, welche überprüft werden sollen.
Im Schritt 3 werden drei Primer eingeführt. Die drei Primer 101, 102, 103 sind komplementär zu spezifischen Regionen auf der Matrizen-DNA 105. Die Länge der Primer 101, 102, 103 unterscheidet sich jeweils voneinander um mindestens drei Basen. Wenn zum Beispiel der Primer 101 15 Basen lang ist, würde der Primer 102 18 Basen lang sein, und der Primer 103 wäre 21 Basen lang.
Der Mischung aus Matrizen-DNA mit angelagertem Primer werden in Schritt 4 ein oder mehrere Terminatoren mit nachweisbaren Markierungen zugesetzt. Die markierten Terminatoren lagern sich unmittelbar stromabwärts des 3'-Endes des Primers an eine komplementäre Base auf dem Matrizenstrang an. Wie in der Fig. 3 gezeigt, sind die zwei verwendeten Terminatoren markierte Didesoxynukleotide, nämlich Didesoxyadenosintriphosphat (ddATP) 131 und Didesoxyguanosintriphosphat (ddGTP) 133. ddATP 131 ist mit einem ersten optisch nachweisbaren Farbstoff 111 markiert, und ddGTP ist mit einem zweiten optisch nachweisbaren Farbstoff 113 markiert. Jeder optisch nachweisbare Farbstoff besitzt eine charakteristische Absorptions- und Emissionswellenlänge. Dies ermöglicht, daß der optisch nachweisbare Farbstoff selektiv angeregt und nachgewiesen wird. Die Nukleotide werden an die komplementäre Base auf der Matrizen-DNA binden. Beispielsweise ist die Thyminbase 135 auf der Matrizen-DNA 105 komplementär zu Adenin. In einer ähnlichen Weise ist die
Cytosinbase 137 komplementär zu Guanin. Im Schritt 4 werden die Terminatoren zusammen mit einem Induzierungsmittel, wie einer DNA-Polymerase, zugegeben. Das induzierende Mittel bindet den Terminator an das 3'-Ende des Primers. Wie in Schritt 4 gezeigt, ist der Einzel-Nukleotid-Polymorphismus an der Einzel-Base unmittelbar stromaufwärts vom 3'-Ende jedes Primers eine diallelische Variante. Die polymorphe Stelle weist entweder Thymidin oder Cytosin an der Stelle auf dem Matrizenstrang 105 auf, unmittelbar gegenüber der Stelle, welche eine Base stromaufwärts zu dem 3'-Ende des Primers liegt.
Im Schritt 5 werden die Einzel-Nukleotid-Primerverlängerungsprodukte isoliert. Die isolierten Produkte 141, 142 und 143 sind jeweils um eine Base verlängert worden. Die an das 3'-Ende jedes Primers angefügte eine Base ist eine Base, komplementär zu der Base gegenüber dem 3'-Ende auf dem Matrizen-DNA-Strang 105. Die auf jeden Primer angefügte eine Base ist eine Terminatorbase, welche mit einem optisch nachweisbaren Markierungsmittel markiert ist. Diese Produkt werden dann analysiert, um zu bestimmen, welcher Terminator an jeden Primer hinzugefügt worden ist.
In der in der Fig. 3 gezeigten Vorgehensweise wird ein Assay ermöglicht, in welchem Allel-Benennungen für spezifische Stellen auf einer Matrizen-DNA für eine Mehrzahl von unterschiedlichen Stellen auf diesem Matrizen-DNA-Strang bestimmt werden können. Die Verwendung von unterschiedlichen Primern gestattet die gleichzeitige Analyse von unterschiedlichen Stellen auf dem Matrizenstrang, und die Verwendung von unterschiedlich optisch markierten Terminatoren gestattet, daß die diallelische Variation an jeder Stelle auch gleichzeitig analysiert werden kann. Die Einzel-Nukleotid-Primerverlängerungsprodukte 141, 142 und 143 werden jeweils um eine einzelne Terminatorbase verlängert, komplementär zu dem Einzelnukleotid auf der Matrizen-DNA, welches unmittelbar gegenüber dem 3'-Ende jedes Primers liegt. Der zugegebene Terminator wird mit einer optisch nachweisbaren Markierung markiert, um den spezifischen Nachweis des Produktes zu gestatten. Um eine optische Störung durch überschüssige Didesoxynukleotid-Terminatoren sowie eine optische Störung durch die Matrizen-DNA zu vermeiden, werden sowohl überschüssige markierte Didesoxynukleotide als auch die Matrizen-DNA aus der Probenreaktion entfernt, bevor die Einzel-NuJdeotid-Primerverlängerungs-Reaktionsprodukte analysiert werden.
Die Einzel-Nukleotid-Primerverlängerungsreaktion ist zur Herstellung von Proben geeignet, um kleine Molekül-Proben von bekannter Größe und Wanderungsgeschwindigkeit zu erzeugen. Wie bemerkt, verwendet die PCR zueinander passende Sätze von Primern, um DNA-Sequenzen zu amplifizieren. Das resultierende Reaktionsprodukt kann von einem diskreten Größenbereich sein. Zum Beispiel können Primer entworfen werden, welche sich an
nicht-variable (konservierte) Sequenzen anlagern, die eine variable Region flankieren. Im Falle von kurzen Tandem-Wiederholungen (STR) ist die variable Region eine Nukleotidsequenz von 8 Basen oder weniger, welche sequenziell wiederkehrt. Die Anzahl von Wiederholungen ist variabel. Die Amplifikation von STR-Orten erzeugt Produkte in einem bekannten diskreten Bereich von Größen.
Verbindungen eines diskreten Größenbereichs werden auch durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie(HPLC)-Trennung erzeugt. Eine HPLC-Trennung erfordert eine Separationssäule, in welche die Probe eingeführt wird. Diese Separationssäule enthält ein gepacktes teilchenförmiges Material (stationäre Phase). Durch dieses gepackte Material fließt eine Flüssigkeit (mobile Phase). Die Zielverbindungen bewegen sich als eine Zone in der Säule, wenn die Flüssigkeit fließt. Somit wird die Zielverbindung zu einer spezifischen Zeit aus der Säule eluieren. Wenn eluierte Fraktionen der durch die Säule fließenden Flüssigkeit aufgefangen werden, wird die Probe daher in einer spezifischen Fraktion konzentriert sein. Durch FIPLC isolierte Verbindungen können weiter durch Kapillarelektrophorese analysiert werden. Die Gleichförmigkeit von durch HPLC isolierten Verbindungen erzeugt eine gleichmäßige elektrophoretische Geschwindigkeit.
Die Fig. 4 veranschaulicht die Daten von einem einzelnen Primer, verwendet in einer SNuPE-Reaktion, um eine einzelne Stelle zu untersuchen. Die Daten in der Fig. 4 werden aus der Analyse einer Probe, erzeugt durch Verwendung eines einzelnen Primers, verlängert mit einem von zwei markierten Terminatornukleotiden, gewonnen. Die Peaks 151a, 151b, 151c stammen von der dritten, zweiten bzw. ersten Injektion in eine Kapillarsäule. Wie die Graphik zeigt, sind die Primerverlängerungsprodukte nachweisbar getrennt. Die Lokalisierung des Signals ist abhängig von der charakteristischen Wanderungsgeschwindigkeit des mit einer spezifischen optischen Markierung markierten Oligonukleotides. Die optische Markierung besitzt eine charakteristische Anregungs- und Emissionswellenlänge. Die Gegenwart eines Einzelpeaks in jedem Injektionsintervall zeigt, daß die Matrizenstränge von DNA aus einem diploiden Organismus denselben Alleltyp auf beiden Chromosomen enthalten. Wie früher bemerkt, würde dies als ein homozygoter Fall angesehen. Die Emissionswellenlänge ist abhängig von dem Farbstoff, welcher an den spezifischen Terminator angeheftet ist. Der spezifische Terminator für die gezeigte obere Reihe an Injektionen weist auf das Einzel-Nukleotid-Primerverlängerungsprodukt, das den ddATP-Terminator beinhaltet, hin. Dieses Produkt zeigt das Wildtyp-Allel an.
In der mittleren Daten-Ablesung von Fig. 4 werden die Daten aus einer zweiten Einzel-Nukleotid-Primerverlängerungsreaktion gewonnen. Wie es der Fall bei der oberen Graphik war,
zeigt die mittlere Graphik eine erste, zweite und dritte Injektion mit einem gewählten Intervall zwischen den Injektionen. Die Peaks 153a, 153b und 153c zeigen einen Nachweis bei einer distinkten Wellenlänge. Dies zeigt an, daß ein ddGTP-Terminator in die Einzel-Nukleotid-Primerverlängerungsprodukte eingebaut wurde. Die Injektionen haben einen solchen Abstand, daß die Proben nachweisbar getrennt sind, wenn die Zielverbindungen ein Nachweisfenster erreichen.
Die unterste Graphik repräsentiert die Daten aus einem heterozygoten Individuum. Die Peaks auf der Graphik zeigen, daß von den Einzel-Nukleotid-Primerverlängerungsprodukten einige der Reaktionsprodukte den ddATP-Terminator eingebaut aufweisen und einige der Produkte den ddGTP-Terminator eingebaut aufweisen. Daher besitzt für jede der drei wiederholten Probeninjektionen jede Injektion aus einem heterozygoten Individuum zwei charakteristische Peaks. Jeder Peak repräsentiert eine Ablesung aus einem Analysesystem, welches eine spezifische Emissionswellenlängenintensität nachgewiesen hat, die durch jeden Peak repräsentiert wird. Die Peaks 15Id, 151e, 15If repräsentieren den Einbau des ddATP-Terminators mit assoziierter optischer Markierung. Die Peaks 153d, 153e, 153f repräsentieren Einzel-Nukleotid-Primerverlängerungsprodukte, bei denen der ddGTP-Terminator mit assoziierter optischer Markierung eingebaut ist. Wie es der Fall bei den oberen und mittleren Datenablesungen war, weisen die in der unteren Graphik gezeigten drei Injektionen einen ausreichend weiten Abstand voneinander auf, daß zu dem Zeitpunkt, an dem nachweisbare Ziele den Detektor erreichen, eine ausreichende Trennung sowohl zwischen Proben als auch zwischen Zielverbindungen innerhalb der Proben besteht, um sowohl individuelle Proben als auch Zielverbindungs-Komponenten zu unterscheiden.
Die Fig. 5 zeigt die Datengraphik aus dem optischen Nachweis von getrennten Verbindungen in einer einzelnen Kapillare. In der Kapillare sind zehn Injektionen bei Intervallen von gleichem zeitlichen Abstand vorgenommen worden. Nach der letzten Injektion verursachte eine kontinuierliche Kapillarelektrophorese die Zielverbindungs-Wanderung, und eine gleichzeitige Abtastung eines Nachweisfensters ermöglichte einen kontinuierlichen Nachweis der Ziele in den wandernden Proben, (wie beschrieben in den Figs. 1 und 2). Die Fig. 5 zeigt ein wiederkehrendes Muster aus drei Peaks. Die Peaks 161a-161j messen die Intensität der Emission von einer Wellenlänge, welche eine erste Zielverbindung anzeigt. Die Peaks 163a-163j und die Peaks 165a-165j messen zwei andere Emissionswellenlängen-Intensitäten, welche den Nachweis von zwei weiteren Zielverbindungen anzeigen. Jeder Satz von Peaks 1 bis 10 zeigt die Daten an, welche von dem System-Detektor aus einer einzelnen Probeninjektion nachgewiesen wurden. Die Peaks 16Ia-16Ij und die Peaks 165a-165j sind Peaks, repräsentativ für zwei optisch nachweisbare Ziele, eingeschlossen innerhalb jeder von zehn Proben. Die Kon-
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sistenz zwischen den Datenpeaks aus getrennten Injektionen ist kennzeichnend für die hohe Reproduzierbarkeit des vorliegenden Multi-Injektions-Analysesystems.
Die Peaks 163a-163j sind kennzeichnend für einen Qualitätsmessungs-Standard, der bei jeder Probe eingeschlossen wird. Ein Qualitätsmessungs-Standard besitzt eine charakteristische Wanderungsgeschwindigkeit, charakteristische Emissionswellenlänge und/oder eine charakteristische Peakgröße. Dies ermöglicht, daß der Qualitätsmessungs-Standard charakteristische bekannte Nachweisdaten erzeugt. Der Qualitätsmessungs-Standard kann dann verwendet werden, um die Nachweisdaten zu normieren oder die Qualität des Durchlaufs, der Reaktion oder des Nachweisereignisses zu überprüfen.
Der Qualitätsmessungs-Standard kann verschiedene Formen einnehmen. Wenn zum Beispiel der Trennungsdurchlauf eine Trennung von Verbindungen basierend auf der Verbindungsgröße ist, kann der Qualitätsmessungs-Standard ein Fragment von spezifischer Größe sein.
Darüber hinaus kann die Menge des in jeder Probe eingeschlossenen Qualitätsmessungs-Standards eng reguliert werden. Die Regulierung der Menge des Standards führt zu hochreproduzierbaren Qualitätsmessungs-Datenpeaks. Die Größe des Datenpeaks von dem Qualitätsmessungs-Standard kann dann mit anderen Peaks in dem Durchlauf verglichen werden, um die Menge der analysierten Probe zu bestimmen. Wenn der Qualitätsmessungs-Standard eine spezifische Fluoreszenzwellenlänge aufweist, kann die spezifische Fluoreszenzwellenlänge verwendet werden, um einen Vergleich mit anderen gemessenen Wellenlängen innerhalb des Proben-Durchlaufs vorzunehmen. Die gemessene Intensität des Qualitätsmessungs-Standard-Signals kann herangezogen werden, um das richtige Funktionieren des Systems zu gewährleisten, indem Fehler in der Laserenergie, Detektorfunktion und andere mögliche Systemprobleme angezeigt werden. Eine Erweiterung des Peak-Profils kann verwendet werden, um die Unversehrtheit der Kapillare und/oder die Qualität des Separationsmediums zu bestimmen. Die Peakerweiterung des Standards kann auch auf Probleme bei der Injektion hinweisen.
Die Verwendung eines Qualitätsmessungs-Referenzstandards als eine optisch nachweisbare, co-migrierende Verbindung mit bekannten physikalischen Eigenschaften ist in der U.S.Patentanmeldung Serien-Nr. 09/036 676 beschrieben worden, welche hiermit ausdrücklich durch den Bezug darauf hierin einbezogen wird. Der Qualitätsmessungs-Standard ermöglicht eine Qualitätsmessung der Auflösung der Probenpeaks, gestattet die Berechnung des Verhältnisses von Signal zum Hintergund, und gestattet die Bestimmung der Linearität der Verbindungs-Trennung. In einem Proben-Durchlauf kann der Qualitätsmessungs-Standard für irgendeine oder alle der obenstehend angegebenen Funktionen verwendet werden.
Es ist auch möglich, den Qualitätsmessungs-Standard auszulegen, um die Qualität der Probenherstellung zu messen. Zum Beispiel kann in einem PCR-basierenden DNA-Amplifikationssystem die Verwendung eines bekannten Satzes von Primern zur Erzeugung eines Standards von bekannter Länge als eine Prüfung der in der PCR-Amplifikation verwendeten Reagenzien eingesetzt werden.
Der in Fig. 6 gezeigte Datensatz zeigt eine andere Graphik von Intensitätspeaks aus optisch nachgewiesenen Zielen. Wie die Graphik von Fig. 5 repräsentieren die Daten von Fig. 6D Nachweis-Ablesungen aus zehn Injektionen, vorgenommen bei zeitlich getrennten Intervallen in eine Kapillare in einem Elektrophoresesystem. Die Figuren von 6A-6C repräsentieren die bei verschiedenen Wellenlängen nachgewiesenen Signale. Die Peaks 175a-175j in der Fig. 6A repräsentieren das Datensignal bei einer charakteristischen Wellenlänge. Die Peaks in den Figs. 6B und 6C repräsentieren die Signale von einer zweiten und dritten distinkten Wellenlänge. Die Figuren 6A bis 6C sind in der Fig. 6D zu einer einzigen Graphik vereinigt. Wie in der Fig. 6D ersichtlich, besetzen die Peaks 171a-171j (in Fig. 6C ersichtliche Peaks) und die Peaks 173a-173j (in Fig. 6B ersichtliche Peaks) die gleiche Stelle zur Zeit des Nachweises. Trotz der Tatsache, daß die zwei Verbindungen, welche durch diese Nachweisereignisse repräsentiert werden, bei gleichen Geschwindigkeiten wandern, sind die Verbindungen aufgrund der unterschiedlichen Ziel-Emissionswellenlängen unterscheidbar. Wenn die durch das Detektionsereignis, gezeigt von Peak 171a-j oder 173a-j, repräsentierte Verbindung ein Qualitätsmessungs-Standard ist, gestattet das Überlagern der zwei Peaks den einfachen Vergleich der von einer Zielverbindung erwarteten Wanderungsgeschwindigkeiten im Vergleich zur Wanderungsgeschwindigkeit des Qualitätsmessungs-Standards.
Es gibt deutliche Vorteile der Erhöhung des Durchsatzes in analytischen Systemen. Durch Anwenden eines einzelnen Kapillarelektrophoresesystems kann eine Einzelprobe in einer gegebenen Auftrennung analysiert werden. Durch Verwendung einer Feldanordnung von Kapillaren wird die Anzahl von analysierten Proben um die Anzahl von Kapillaren in der Feldanordnung von Kapillaren erhöht. Gegenwärtig sind einige Kapillarfeldanordnungs-Systeme zur Verwendung mit Mikroplatten angepaßt. Diese analytischen Systeme weisen 96 Kapillaren in einer Feldanordnung auf, wodurch der Durchsatz 96fach erhöht wird.
Durch Verwenden verschiedener optisch nachweisbarer Farbstoffe kann der Durchsatz weiter erhöht werden. Optische Detektoren können mehrere unterschiedliche Wellenlängen nachweisen, emittiert von mehreren unterschiedlichen Energietransfer- oder anderen Farbstoffen. Wenn zwei Farbstoffe für die Markierung eines Paares von allelen Varianten an einem Genort
verwendet werden, gestattet die Verwendung von acht Farbstoffen die gleichzeitige Wellenlängen-basierende Unterscheidung von drei Paaren von Genorten in einer einzelnen Probe, wobei zwei Farbstoffe zur Verwendung mit den Qualitätsmessungs-Standards oder Injektionsmarkern übrigbleiben.
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Die Verwendung von mehreren Primern oder Primersätzen in der Probenherstellung vom PCR-Typ gestattet eine weitere Erhöhung des Durchsatzes. Farbstoffe sind durch den Detektor unterscheibar, welcher die Wellenlänge der Emission aus der Kapillare aufzeichnet. Die Größe des nachweisbaren Ziels ist nachweisbar durch Bestimmen der Wanderungsgeschwindigkeit (d.h. der erforderten Zeit, bevor das Ziel einen Detektor erreicht). Der Durchsatz kann mit jedem weiteren verwendeten Primer oder Primersatz erhöht werden, was gestattet, daß ein zusätzlicher Ort in derselben Einzelproben-Präparation geassayt werden kann. Wenn zwei Primer oder Primersätze verwendet werden, verdoppelt sich somit der Durchsatz der Analyse von Genorten.
Die Verwendung von zeitlich getrennten Injektionen schafft eine weitere Möglichkeit zur Erhöhung des Durchsatzes. In den in Fig. 1 und 2 gezeigten Abläufen, welche die in Fig. 5 und 6 gezeigten Daten erzeugen, erlauben zehn zeitlich getrennte Probeninjektionen in eine Kapillare, daß die Kapillarenanalyse den zehnfachen Probendurchsatz aufnimmt. Durch Anwenden von zeitlich getrennten Injektionen in Kapillarenfeldanordnungen zur Analyse von mit mehreren Primersätzen und mehreren optisch nachweisbaren Farbstoffen hergestellten Proben kann der ursprüngliche Durchsatz einer einzigen Probe in einer Dauer von zwei Stunden auf 5760 Proben erhöht werden, welche in einer äquivalenten Zeitdauer verarbeitet werden [96 Kapillaren &khgr; 10 Probeninjektionen pro Kapillare &khgr; 3 Zielgrößen-Varianten &khgr; 2 Farbalternativen-Varianten]. Durch weiteres Erhöhen der bei der Probenherstellung verwendeten Menge an Primern, um zusätzliche Zielgrößen-Variation hinzuzufügen, oder durch Erhöhen der Probenverarbeitung durch Vereinigung von Proben würde eine noch weitere Erhöhung des Durchsatzes zugelassen werden.
Um die beschriebene Arbeitsweise zu ermöglichen, ist also eine Injektionseinrichtung für das Kapillarenfeld-Elektrophoresesystem erforderlich, welche mehrere Injektionen in rascher Folge in dasselbe Separationsmedium vornehmen kann. Die gegenwärtigen Injektionssysteme sind nicht für mehrere Injektionen, gefolgt von einer Analyse der injizierten Verbindungen, entworfen worden.
Einige Injektionssysteme beruhen auf Roboter-Transfer von Proben aus einer Mehrfachvertiefungs-Probenplatte zu Injektionsöffnungen. Die Proben werden durch ein Robotersystem
überfuhrt, bei welchem mehrere Proben durch einen Roboterarm überfuhrt werden. Der Roboterarm muß periodisch den Standort registrieren, um zu gewährleisten, daß die Proben korrekt in die entsprechenden Injektionsöffnungen überfuhrt werden. Nachdem 96 Proben in die Injektionsöffhungen überfuhrt worden sind, können die Proben in die Kapillaren injiziert werden. Derzeitig verfugbare Systeme unter Verwendung von Roboter-Überführung in eine 96-Kapillaren-Feldanordnung erfordern mindestens 8 und bis zu 20 Minuten, um die 96 Proben in die Injektionsöffhungen zu überfuhren. In Anbetracht der verhältnismäßigen langen Zeit für den Transfer der Proben ist die in der vorliegenden Erfindung beschriebene Injektion mit zeitlichem Abstand in derartigen Systemen nicht praktizierbar.
Ein zweiter Typ von Kapillarfeldanordnungs-Analysesystem verwendet ein Acht-Kapillaren-Feld mit den Vertiefungen einer Mikroplatte. Jede Probe wird analysiert, wonach die Kapillarenfeldanordnung von Matrix entleert, gewaschen, getrocknet und erneut mit Matrix gefüllt wird. Eine anschließende Probe wird dann auf die Säule geladen und analysiert. Unter Verwendung dieses Systems können 96 Proben in vierundzwanzig Stunden analysiert werden. Es wird auch angenommen, daß dieses System die mit zeitlichem Abstand erfolgende Injektion von Proben schwieriger machen würde, obschon die Integrität der Analyse beibehalten wird.
Das von Molecular Dynamics of Sunnyvale, California, einer Tochtergesellschaft von Amersham Pharmacia Biotech, hergestellte MegaBACE-96-Kapillaren-Elektrophoresesystem stellt ein System zur Verfügung, welches an zeitlich mit Abstand erfolgende Injektion zur Erhöhung des Durchsatzes angepaßt worden ist. In diesem System ist die 96-Vertiefungs-Probenplatte auf einer Kathodenbühne enthalten. Die Bühne wird in eine solche Position bewegt, daß die Kapillaren in der Feldanordnung in Kontakt mit den Proben, welche in den Probenvertiefungen einer Mikroplatte enthalten sind, stehen. Eine kleine Menge der Probe wird mittels eines elektrischen Pulses in jede Kapillare injiziert. Die Kapillaren werden dann zu einem Reservoir-Tank bewegt und die elektrophoretische Trennung der Proben innerhalb jeder Kapillare wird bewerkstelligt. Derzeitig können bei dem MegaBACE-System Proben alle zwei Minuten injiziert werden. Die Zeitgebung der Injektion ist gegenwärtig durch das System begrenzt, welches die Fähigkeit zum Öffnen der Kathoden-Tür und Entladen einer Probenplatte drosselt. Es ist möglich, dieses System so zu modifizieren, daß raschere Injektionen möglich sind. Gegenwärtig können bis zu zehn Injektionen, in einem Abstand von Zwei-Minuten-Intervallen, vorgenommen werden. Im Anschluß an die zehn Injektionen gestattet eine kontinuierliche Elektrophorese und Abtastung die weitere Trennung und Detektion von Zielverbindungen. Es ist möglich, das MegaBACE-System so zu modifizieren, daß eine kontinuierliche Elektrophorese während Probeninjektion und Nachweis vorgängen
ermöglicht wird. In einem solchen System würden mechanische Mittel eingesetzt werden, um kontinuierlich neue Probenplatten auf die Kathodenbühne zu bringen.
Das Schema für eine Vorrichtung, angepaßt für Injektion bei zeitlichem Abstand, wird in der Fig. 7 gezeigt. In Fig. 7 richtet der blaue Laser 201 blaues Laserlicht 210 durch den Filter 205 und den Verschluß 209, um auf den Ablenkspiegel 211 aufzutreffen. Der Ablenkspiegel 211 lenkt das blaue Laserlicht durch den Strahlenvereinigungsspiegel 213. Gleichzeitig erzeugt ein grüner Laser 203 grünes Laserlicht 212, welches durch den Filter 207 und den Verschluß 209 gelenkt wird, um auf den Strahlenvereinigungsspiegel 213 aufzutreffen. Auf diese Weise werden blaues Laserlicht 210 und grünes Laserlicht 212 zu dem Anregungsstrahl 214 vereinigt. Der Anregungsstrahl 214 wird durch die Ablenkspiegel 215, 240 und 242 gesteuert und läuft durch den Strahlenteiler 217. Der Strahlenteiler 217 ist gewählt, um eine Seite aufzuweisen, welche den Durchtritt eines Strahls der Wellenlänge des Anregungsstrahls 214 gestatten wird. Der Strahl 214 wird dann durch den Ablenkspiegel 219, durch den Strahlenteiler 221 und auf einen Abtastkopf 223 gerichtet. Der Abtastkopf 223 erzeugt eine zweidimensionale Abtastung von Licht über die Nachweisfenster 261 im Nachweisfenster-Block 260.
Einiges Licht aus dem Anregungsstrahl 214 wird aus dem Fensterblock 260 zurück auf den Abtastkopf 223 reflektiert. Der Abtastkopf 223 lenkt das Licht zurück auf die Rückseite des Strahlenteilers 221. Diese Seite des Strahlenteilers 221 ist gewählt, um den Durchtritt von Licht der Wellenlänge des Anregungsstrahls 214 zu gestatten. Der reflektierte Anregungsstrahl 216 trifft dann auf den Ablenkspiegel 219, der den reflektierten Anregungsstrahl 216 auf den Strahlenteiler 217 lenkt. Die Seite des Strahlenteilers 217, auf die der reflektierte Anregungsstrahl 216 gerichtet wird, reflektiert Licht der Wellenlänge des reflektierten Anregungsstrahls 216 durch den Filter 225 und auf die Photodiode 227. Die Photodiode 227 verfolgt kontinuierlich die Strahlenergie des reflektierten Anregungsstrahls 216. Dies liefert eine gewisse Anzeige des richtigen Laserenergieausstoßes, der Systemenergie-Fluktuation und richtigen Ausrichtung von Systemkomponenten.
Licht von der Wellenlänge des Anregungsstrahls 214 wird auch Fluoreszenz aus den Verbindungen anregen, welche durch das Nachweisfenster 261 hindurchlaufen. Das Anregungslicht 218 ist von einer unterschiedlichen Wellenlänge von der Wellenlänge des Anregungsstrahls 214. Das Anregungslicht 218 wird von dem Abtastkopf 223 auf den Strahlenteiler 221 gerichtet. Der Strahlenteiler 221 ist so gewählt, daß die Seite, aufweiche das Emissionslicht 218 auftrifft, selbiges durch den Strahlenteiler 221 durch den Filter 244 und auf die Linse 229 reflektieren wird. Die Linse 229 bündelt das Emissionslicht 218 durch den Stiftlochfilter 231
und auf die Linse 233. Nach Durchtreten durch die Linse 233 trifft das Emissionslicht 218 auf den Strahlenteiler 235. Der Strahlenteiler 235 ist ausgewählt, um Licht mit einer Wellenlänge oberhalb einer gewählten Wellenlänge den Durchtritt zu gestatten, während Licht mit einer Wellenlänge unterhalb der gewählten Wellenlänge reflektiert wird. Auf diese Weise wird der Strahl 218 in einen reflektierten Strahl 232 und einen durchgelassenen Strahl 236 geteilt. Der reflektierte Strahl 232 läuft durch den Filter 237 und auf den ersten Detektor 241. Der transmittierte Strahl 236 läuft durch den Strahlenteiler 235, durch den Filter 243 und auf einen zweiten Photodetektor 245.
Das Signal aus dem Photodetektor 241 wird als ein digitales Signal durch die elektronische Verbindung 247 in einen elektronischen Speicher und Daten-Prozessor 251 übermittelt. Auf eine ähnliche Weise wird das vom zweiten Photodetektor 245 aufgefangene Signal durch die elektronische Verbindung 249 übermittelt und wird ebenfalls vom elektronischen Speicher 251 erfaßt. Diese Daten können in dem elektronischen Speicher gespeichert und gleichzeitig auf einem Sichtmonitor als graphische Daten 250 betrachtet werden.
Dieses System ist ausgelegt, um Fluorophore unter Verwendung definierter Anregungs- und Emissions-Wellenlängen anzuregen. Derartige Fluorophore schließen Energietransferfarbstoffe ein. Solche Fluorophore wandern durch den Nachweisbereich 261, wobei die Wanderung durch ein Kapillarelektrophorese-System bewirkt wird.
Die vorliegenden Beispiele haben Systeme beschrieben, welche optische Detektoren zum Nachweis von Zielverbindungen verwenden, die mit optisch nachweisbaren fluoreszenten Markierungen markiert sind. Es könnten auch alternative Nachweissysteme verwendet werden. Zum Beispiel können Ultraviolett-Detektoren, Infrarot-Massenspektrometrie oder Leitfähigkeit-Detektoren verwendet werden, um Zielverbindungen nachzuweisen. Darüber hinaus können radiometrische, Raman-basierende oder Brechungsindex-Detektoren als Detektoren in Kapillarelektrophoresesystemen verwendet werden. Wenn ein radiometrischer Detektor verwendet wird, ist die Zielverbindung mit einem radioaktiven Marker markiert.
Das Kapillarelektrophoresesystem ist aufgebaut aus einer Kapillare 273, enthalten in einer Feldanordnung von Kapillaren. Ein Satz von 16 solchen Kapillaren wird in einem definierten Verhältnis auf einem Kathoden-Steg 271 gehalten. Die 16 Kapillaren, gehalten vom Kathoden-Steg 271, sind jeweils positioniert, um in eine Einzelvertiefung in einer 96-Vertiefungs-Probenplatte zu passen. Proben können in die Kapillarenfeldanordnung injiziert werden durch Bewegen der Kathodenbühne 280, so daß die Probenplatte 279 in einer solchen Position ist, daß die Kapillaren auf dem Kathodensteg 271 in die Vertiefungen einer
Probenplatte 279 eingeführt werden. Ein.Puls von elektrischem Strom durch die Kapillaren wird dann durch elektrophoretische Probenmigration eine kleine Menge an Probe in jede der Kapillaren in der Feldanordnung von Kapillaren ziehen. Der Kathodensteg 271 wird dann relativ zur Kathoden-Bühne 280 repositioniert, um die Kapillarenfeldanordnung zuerst in die Vertiefungen des 24-Vertiefungs-Kathodenwassertanks 277 und dann in die Vertiefungen der 96-Vertiefungs-Kathodenplatte 275 zu bringen. Die Kathodenplatte steht in elektrischer Verbindung mit der Stromquelle 285 durch eine elektronische Verknüpfung 287. Wenn die Kapillaren in der 96-Vertiefungs-Kathodenplatte 275 sind, wandern die injizierten Proben durch die Kapillare, wenn das distale Ende der Kapillare in elektrischer Verbindung mit einer Anode steht.
Die Kathodenbühne 280 kann bewegt werden, um die Kapillaren in dem Kathodensteg 271 aus der 96-Vertiefungs-Kathodenplatte 275 wieder zu einer Probenplatte 279 zu bringen. Wie in dem Flußdiagramm in der Fig. 1 angezeigt, kann im Anschluß an die Injektion der Proben die Kathodenbühne 280 bewegt werden, um die Kapillaren im Kathodensteg 271 in den 24-Vertiefungs-Kathodenwassertank 277 zurückzubringen. Die Spitzen der Kapillaren können dann im Kathodenwassertank 277 gespült werden, bevor die Bühne 280 die Kapillaren im Kathodensteg 271 in die 96-Vertiefungs-Kathodenplatte 275 repositioniert.
Obwohl nur ein einzelner Kathodensteg gezeigt wird, wird das Elektrophoresesystem sechs solcher Stege beinhalten. Die 6 Stege halten 96 Kapillaren, was ermöglicht, daß alle 96 Vertiefungen in einer Probenplatte gleichzeitig in entsprechende Kapillaren injiziert werden können. Der Nachweisfenster-Block 260 und das Abtastsystem sind ebenfalls angepaßt, um Kapillaren aus sechs Kathodenstegen aufzunehmen, um ein optisches Abtastsystem zu ermöglichen, in welchem 96 Kapillaren gleichzeitig abgetastet werden.
Die Kapillaren erstrecken sich vom Kathodensteg 271 durch den Nachweisfensterblock 260 und enden im Anoden-Stopfen 297. Der Anoden-Stopfen 297 erstreckt sich durch das Anodenabdeckloch 303 auf der Anodenabdeckung 301 in das Anodenreservoir 305 auf dem Anodenreservoirhalter 295. Das Anodenreservoir 295 ist durch die elektronische Leitung 293 mit einer Stromquelle 285 verbunden.
Wenn eine Ende der Kapillare 271 in die 96-Vertiefungs-Kathodenplatte 275 inseriert ist, und das distale Ende der Kapillare 271 in ein Anodenreservoir 295 inseriert ist, bewirkt daher die Leistung aus der Stromquelle 285, welche einen elektrischen Strom durch das Medium in der Kapillare einführt, eine elektrophoretische Separation. Die Stromquelle 285 kann programmiert sein, um einen gewählten Strom durch das System zu liefern.
Der Anoden-Stopfen 297 kann auch in einem Mediumreservoir 307 inseriert sein. Das Mediumreservoir 307 kann durch die Hochdruck-Stickstoffleitung 299 unter Druck gesetzt sein. Das Medium unter Druck kann dann in die Kapillare 273 getrieben werden, was gestattet, daß die Kapillaren in der Kapillarenfeldanordnung mit Medium gefüllt werden. Vorzugsweise werden die Kapillaren vor dem Wechsel des Mediums gewaschen. Beschichtete Kapillaren werden bevorzugt und können für zahlreiche Trennungs-Durchläufe wiederverwendet werden, abhängig von der Stabilität der Kapillarenbeschichtung.
Die Verwendung eines alternativen Mediums von geringer Viskosität (wie einem freien-Lösungs-Medium) würde die Notwendigkeit für Hochdruck-Stickstoff zum Medienwechsel eliminieren. Anstatt dessen könnte Medium einfach in die Kapillare gepumpt werden.
Die Verwendung der Zeitgebereinrichtung 281 gestattet die in zeitlichem Abstand erfolgende Injektion von Proben in die Kapillarenfeldanordnung. Der Zeitgeber 281 ist durch eine elektronische Leitung 289 mit der Kathodenbühne 280 verknüpft. Bei programmierten Intervallen sendet der Zeitgeber 281 ein Signal an die Kathodenbühne 280, um die Bühne so zu bewegen, daß die Kapillaren aus der elektrischen Kommunikation mit der 96-Vertiefungs-Kathodenplatte 275 herausgebracht und in Kommunikation mit einer neuen Probenplatte 279 gebracht werden. Der Kathodensteg 271 ist durch die elektronische Verbindung 289 mit dem Zeitgeber 281 verknüpft. Der Kathodensteg 271 wird dann vom Zeitgeber 281 angewiesen, einen kurzen Puls durch die Kapillaren einzuführen, um eine Probe aus der Probenplatte 279 in jede Kapillare in der Feldanordnung von Kapillaren einzubringen. Der Zeitgeber 281 ist ebenfalls mit der Stromquelle 285 verknüpft. Das Bewegen der Kapillaren von der Kathodenplatte zu einer Probenplatte bewirkt somit den Zyklus der mit zeitlichem Abstand erfolgenden Injektionen. Ein Puls von elektrischem Strom führt eine bestimmte Menge an Probe in die Kapillarenfeldanordnung ein.
Die Kapillarenfeldanordnung bewegt sich dann zurück in die Kathodenplatte, um innerhalb der Platte die eiektrophoretische Separation der Proben während eines gegebenen Intervalls zu ermöglichen. Dies kann kontinuierlich mit einer minimalen Unterbrechung des Stromflusses bewerkstelligt werden. Alternativ dazu kann der Zeitgeber 281 die Stromquelle 285 anweisen, den Energiefluß durch die Kathode und Anode während der Probeninjektion zu pulsen.
Derzeitig besteht die Einschränkung des MegaBACE-Systems darin, daß das Systemdesign erfordert, daß die Türen auf einer Außenhülle nur geöffnet werden sollen, nachdem spezifische Systemkomponenten an Ort und Stelle sind. Dies beschränkt das Injektionsintervall auf
einmal alle 2 Minuten. Es wird jedoch angestrebt, daß das Intervall zwischen Injektionen von einem Zwei-Minuten-Intervall zu einem so kurzen Intervall wie 20 Sekunden verringert werden kann, was eine weitere 12fache Erhöhung des Durchsatzes ermöglicht. Dies wird ermöglicht durch Änderung des Systems zu einfacher zuzuführenden zusätzlichen Probenplatten. Der einzige limitierende Faktor ist die Fähigkeit, injizierte Proben nachweisbar zu unterscheiden. Diese ist eine Funktion des Spielraums der elektrophoretischen Mobilität der analysierten Zielverbindung.
Das System kann ferner modifiziert sein, um einen erhöhten Durchsatz in dem System zu gestatten. Ein System der automatischen Bewegung neuer Platten zu der Probenplatten-Stelle, wie gezeigt in Fig. 8, würde für die rasche Injektion von Proben benötigt werden. Ein solches System würde einen mechanischen Greifer 355, bewegt durch einen Roboterarm 353, verwenden, um Proben auf die Kathodenbühne 280 zu bewegen. Eine solche Fördereinrichtung würde vorbereitete Probenplatten 279 aus einem Magazin 351 auf die Kathodenbühne 280 überführen. Es ist auch möglich, ein Förderband zu verwenden, um die Probenplatten zu dieser Stelle zu bewegen. Durch Aufstellen des Magazins zur internen Zuführung in das Kapillaren-Feldanordnungs-Elektrophoresesystem kann die Geschwindigkeit gesteigert werden.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung repräsentiert einen Weg zur Erhöhung des Durchsatzes der Analyse von kleinen Verbindungen. Die Erhöhung des Durchsatzes sollte sich besonders nützlich für Einzel-Nukleotid-Polymorphismus-Genotypierung unter Verwendung"von Kapillarelektrophorese-Instrurnenten, speziell Instrumenten mit in hohem Maße parallelen Kapillarensystemen, erweisen.
Claims (17)
1. Vorrichtung zur Ultrahochdurchsatz-Analyse von kleinen Verbindungen, wobei die Vorrichtung umfaßt:
Feldanordnung bzw. Array von Kapillaren, bestehend aus Kapillaren in einer parallelen Ausrichtung für wenigstens einen Teil der Länge der Kapillaren;
Separationsmedium, das jede Kapillare in der Kapillaren-Feldanordnung füllt;
Elektroden in elektrischer Verbindung mit einem ersten und einem zweiten entgegengesetzten offenen Ende jeder Kapillare in der Kapillaren-Feldanordnung;
Injektionseinrichtung, wobei die Injektionseinrichtung konfiguriert ist, um Proben aus einer Mehrfachvertiefungs-Probenplatte in das erste Ende einer Mehrzahl der Kapillaren in der Feldanordnung von Kapillaren zu überführen;
Zeitgebereinrichtung in Assoziation mit der Injektionseinrichtung, wobei die Zeitgebereinrichtung die Injektionseinrichtung periodisch anweist, eine Mehrzahl von Proben aus einem Behälter, der mehrere Probe hält, in jeweilig assoziierte Kapillaren der Feldanordnung von Kapillaren zu injizieren, wobei das Intervall der periodischen Injektion angepaßt ist, um zuzulassen, daß kleine Zielmoleküle in jeder Probe eine ausreichende Distanz aus der Injektionseinrichtung wandern, damit die Ziel-Verbindungen von jeder anschließenden Injektion nachweisbar getrennt sind, wenn die Ziel-Verbindungen jeder Probe einen Detektor erreichen;
Nachweisbereich, assoziiert mit jeder Kapillare der Feldanordnung, wobei der Nachweisbereich nahe dem zweiten Ende von jeder Kapillare liegt und räumlich von dem ersten Ende jeder Kapillare getrennt ist;
Laser, positioniert, um kohärentes Licht auf den Nachweisbereich zu richten; und Mehrkanalfluoreszenzdetektor, positioniert im Verhältnis zu dem besagten Fenster, um Fluorsezenzemission aus dem Fenster nachzuweisen.
Feldanordnung bzw. Array von Kapillaren, bestehend aus Kapillaren in einer parallelen Ausrichtung für wenigstens einen Teil der Länge der Kapillaren;
Separationsmedium, das jede Kapillare in der Kapillaren-Feldanordnung füllt;
Elektroden in elektrischer Verbindung mit einem ersten und einem zweiten entgegengesetzten offenen Ende jeder Kapillare in der Kapillaren-Feldanordnung;
Injektionseinrichtung, wobei die Injektionseinrichtung konfiguriert ist, um Proben aus einer Mehrfachvertiefungs-Probenplatte in das erste Ende einer Mehrzahl der Kapillaren in der Feldanordnung von Kapillaren zu überführen;
Zeitgebereinrichtung in Assoziation mit der Injektionseinrichtung, wobei die Zeitgebereinrichtung die Injektionseinrichtung periodisch anweist, eine Mehrzahl von Proben aus einem Behälter, der mehrere Probe hält, in jeweilig assoziierte Kapillaren der Feldanordnung von Kapillaren zu injizieren, wobei das Intervall der periodischen Injektion angepaßt ist, um zuzulassen, daß kleine Zielmoleküle in jeder Probe eine ausreichende Distanz aus der Injektionseinrichtung wandern, damit die Ziel-Verbindungen von jeder anschließenden Injektion nachweisbar getrennt sind, wenn die Ziel-Verbindungen jeder Probe einen Detektor erreichen;
Nachweisbereich, assoziiert mit jeder Kapillare der Feldanordnung, wobei der Nachweisbereich nahe dem zweiten Ende von jeder Kapillare liegt und räumlich von dem ersten Ende jeder Kapillare getrennt ist;
Laser, positioniert, um kohärentes Licht auf den Nachweisbereich zu richten; und Mehrkanalfluoreszenzdetektor, positioniert im Verhältnis zu dem besagten Fenster, um Fluorsezenzemission aus dem Fenster nachzuweisen.
2. Vorrichtung zur Ultrahochdurchsatz-Analyse von kleinen Verbindungen, wobei die Vorrichtung umfaßt:
eine Mehrzahl von Probenaufnahmegefäß-Behältern, wobei jeder Probenaufnahmegefäß- Behälter eine Mehrzahl von Probenhalte-Aufnahmegefäßen zum Halten einer Probe aufweist, wobei ein erstes Ende einer Kapillare aus der Feldanordnung von Kapillaren mit der Probe in dem Aufnahmegefäß in Kontakt gebracht und eine diskrete Menge der Probe auf die Kapillare injiziert werden kann;
Mittel zum Auslegen eines elektrischen Feldes elektrisches Feld über die Feldanordnung von Kapillaren, so daß bei angelgtem elektrischen Feld jegliche kleinen Zielmoleküle in jeder Probe in jeder Kapillare durch das Separationsmedium zum zweiten Ende der Kapillare hin wandern;
eine Mehrzahl von Probenaufnahmegefäß-Behältern, wobei jeder Probenaufnahmegefäß- Behälter eine Mehrzahl von Probenhalte-Aufnahmegefäßen zum Halten einer Probe aufweist, wobei ein erstes Ende einer Kapillare aus der Feldanordnung von Kapillaren mit der Probe in dem Aufnahmegefäß in Kontakt gebracht und eine diskrete Menge der Probe auf die Kapillare injiziert werden kann;
Mittel zum Auslegen eines elektrischen Feldes elektrisches Feld über die Feldanordnung von Kapillaren, so daß bei angelgtem elektrischen Feld jegliche kleinen Zielmoleküle in jeder Probe in jeder Kapillare durch das Separationsmedium zum zweiten Ende der Kapillare hin wandern;
3. Vorrichtung von Anspruch 1, bei der die Zeitgebereinrichtung so in Assoziation mit den Elektroden steht, daß bevor die Zeitgebereinrichtung die Injektionseinrichtung anweist, eine Mehrzahl von Proben aus dem Behälter zu injizieren, die Zeitgebereinrichtung zuerst die Elektroden anweist, den Stromfluß aus den Elektroden durch die Kapillaren- Anordnung zu pausieren.
4. Vorrichtung von Anspruch 1, bei der eine Kapillarenlänge jeder Kapillare in der Kapillaren-Anordnung an die Anzahl aufzutrennder Proben angepaßt ist.
5. Vorrichtung von Anspruch 1, bei der die Zeitgebereinrichtung ein Zeitgebungs-Schaltkreis ist.
6. Vorrichtung von Anspruch 1, bei der die Zeitgebereinrichtung ein Zeitgebungs- Algorithmus ist.
7. Vorrichtung von Anspruch 1, wobei die Kapillaren-Feldanordnung 96 Kapillaren enthält.
8. Vorrichtung von Anspruch 1, wobei der mehrere Proben haltende Behälter eine Mehrfachvertiefungs-Probenplatte ist, wobei die Vorrichtung ferner umfaßt:
Mehrfachvertiefungs-Probenplatten-Transporter, wobei der Transporter positioniert ist, um weitere Mehrfachvertiefungs-Probenplatten zu der Injektionseinrichtung zu bringen; und
Magazin zum Halten einer Mehrzahl von Mehrfachvertiefungs-Probenplatten, wobei das Magazin positioniert ist, um weitere Probenplatten auf den Transporter zuzuführen.
Mehrfachvertiefungs-Probenplatten-Transporter, wobei der Transporter positioniert ist, um weitere Mehrfachvertiefungs-Probenplatten zu der Injektionseinrichtung zu bringen; und
Magazin zum Halten einer Mehrzahl von Mehrfachvertiefungs-Probenplatten, wobei das Magazin positioniert ist, um weitere Probenplatten auf den Transporter zuzuführen.
9. Vorrichtung von Anspruch 8, wobei es sich bei dem Transporter um ein Förderband handelt.
10. Vorrichtung von Anspruch 8, wobei es sich bei dem Transporter um einen Roboterarm handelt.
11. Vorrichtung von Anspruch 1, bei der eine Feldanordnung von Kapillaren in ausreichender Länge vorgesehen ist, so daß während wiederholter Zyklen des Injizierens von Proben und des elektrophoretischen Trennens der Proben während eines gewählten Zeitintervalls, keine Probe die Nachweis-Stelle erreicht, bis ein letzter Satz von Proben in jede Kapillare in der Feldanordnung von Kapillaren injiziert wird.
12. Vorrichtung von Anspruch 11, bei der die Kapillaren eine ausreichende Länge aufweisen, um die Auftrennung von 10 oder mehr getrennten injizierten Proben aufzunehmen.
13. Vorrichtung von Anspruch 1, bei der jede Kapillare in der Feldanordnung von Kapillaren mit einer Separationsmatrix mit Hydroxyethylcellulose-Lösung bei einer Konzentration von nicht mehr als 4, 5 Prozent (w/v) befüllbar ist.
14. Vorrichtung von Anspruch 1, bei der jede Kapillare in der Feldanordnung von Kapillaren mit einer Separationsmatrix mit einer Lösung von linearem Polyacrylamid bei einer Konzentration von nicht mehr als 4 Prozent befüllbar ist.
15. Vorrichtung von Anspruch 1, bei der Mittel zum Beleuchten der aufgetrennten Proben mit Laserlicht, um laserinduzierte Fluoreszenz zu erzeugen, und ein optischer Detektor zum Nachweisen der emittierten Fluoreszenz vorgesehen ist.
16. Vorrichtung von Anspruch 1, bei der zum Nachweisen emittierter Fluoreszenz ein optischer Detektor vorgesehen ist, der getrennte optische Nachweiselemente für unterschiedliche Wellenlängenbereiche umfaßt.
17. Vorrichtung von Anspruch 1, bei der ein elektronischer Speicher zum Speichern von Daten vorgesehen ist.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/352,281 US6156178A (en) | 1999-07-13 | 1999-07-13 | Increased throughput analysis of small compounds using multiple temporally spaced injections |
| EP00945324A EP1194770A1 (de) | 1999-07-13 | 2000-07-11 | Analyse von kleinen bestandteilen mit erhöhtem durchsatz durch verwendung von mehreren zeitlich getrennten einspritzungen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE20022785U1 true DE20022785U1 (de) | 2002-10-17 |
Family
ID=26075317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE20022785U Expired - Lifetime DE20022785U1 (de) | 1999-07-13 | 2000-07-11 | Analyse kleiner Verbindungen bei erhöhtem Durchsatz unter Verwendung mehrerer zeitlich getrennter Injektionen |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE20022785U1 (de) |
-
2000
- 2000-07-11 DE DE20022785U patent/DE20022785U1/de not_active Expired - Lifetime
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