DE19957493C2 - Verfahren zur Identitätsprüfung von 13C-Harnstoff - Google Patents
Verfahren zur Identitätsprüfung von 13C-HarnstoffInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identitäts
prüfung von 13C-Harnstoff mittels IR-Spektroskopie,
wobei die C-N-Valenzschwingung für 13C-markierten und
12C-unmarkierten Harnstoff im Wellenzahlbereich zwischen
1.350 und 1.550 cm-1 ermittelt und ausgewertet wird und
das Peakmaximum für 13C-Harnstoff bei ca. 1430 cm-1
liegt.
Zur Anwendung am Menschen dürfen bestimmte
Laborchemikalien von einer Apotheke nur nach
Identitätsprüfung in dieser Apotheke an andere
abgegeben werden.
Das gilt auch für das stabilisotope Diagnostikum 13C-
Harnstoff, welches für den zuverlässigen in vivo
Nachweis des Bakteriums Helicobacter pylori (H. pylori)
im Magen, dem 1984 wiederentdeckten Auslöser der Typ-B-
Gastritis, des Magen- und Duodenum-Ulcus und des
Magenkrebses bekannt ist. 1987 wurde deshalb ein Test
mit stabilen Isotopen vorgeschlagen, der [13C]Harnstoff-
Atemtest. Er basiert auf der Hydrolyse von appliziertem
13C-markiertem Harnstoff durch Urease, die nur dann im
Magen vorkommt, wenn dort H. pylori-Bakterien anwesend
sind. Man kann dann in der Atemluft 13CO2 nachweisen.
Während für normalen Harnstoff ein einfaches
Identitätsprüfverfahren bekannt ist (Urease-Reaktion),
gelingt der Nachweis eines gegenüber dem natürlichen
12C-Gehalt deutlich erhöhten 13C-Gehalt von Harnstoff
bisher nur nach entsprechender Umarbeitung und Messung
in einem speziellen Meßgerät für stabile Isotope.
Gegenwärtig lassen sich Identitätsprüfungen für 13C-
markiertem Harnstoff nur mit Hilfe folgender isotopen
spektroskopischer Methoden durchführen:
- - Massenspektrometrie aus der Veränderung der Molekülpeakmuster gegenüber dem natürlichen Isotopenverhältnis 12C/13C ("Spektroskopische Methoden in der organischen Chemie" M. Hesse, H. Meier, B. Zeeh (Verfasser), Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1991).
- - Speziell aufgerüstete IR-Spektroskopie aus Veränderung der Lage von Schwingungsbanden von 13C- Kohlendioxid gegenüber 12C-Kohlendioxid (13C- Analysator) (FANci2. Geräteprospekt Isotopenanalysator, Firma Fischer Analysen Instrumente GmbH, Leipzig).
Die bekannten Isotopenanalysatoren sind aufwendig,
teuer und generell in Apotheken nicht vorhanden.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde eine
einfache und preisgünstige Methode zur
Identitätsprüfung von 13C-markiertem Harnstoff zu
finden, die insbesondere in Apotheken mit dort
vorhandenen gerätetechnischen Mitteln durchführbar ist.
Die Aufgabe wurde überraschend einfach gelöst, indem
mittels IR-spektroskopischer Untersuchungen die C-N-
Valenzschwingungen von 13C-Harnstoff und von
unmarkiertem 12C-Harnstoff unter Verwendung eines
herkömmlichen IR-Spektrometers im Wellenzahlbereich
zwischen 1.350 und 1.550 cm-1 ermittelt und ausgewertet
werden. Da das Peakmaximum für 13C-Harnstoff bei ca.
1.430 cm-1 liegt und für unmarkierten Harnstoff 12C bei
ca 1.465 cm-1 ist somit ein sicherer Nachweis für 13C-
Harnstoff möglich.
Insbesondere wird das infrarotspektroskopische
Verfahren zum Nachweis der spektralen Verschiebung der
C-N-Valenzschwingung im Wellenzahlbereich zwischen
1.500 und 1.400 cm-1 genutzt.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung
wird für das Nachweisverfahren im IR-Spektrometer eine
entsprechend präparierte benetzbare Polymerfolie oder
eine Calciumfluorid (CaF2)-Scheibe verwendet, die
zwischen 1.350 und 1.550, insbesondere zwischen 1.400
und 1.500 cm-1 selbst keine Peaks zeigt. Bevorzugt
handelt es sich bei der Folie um thermoelastische
Polymere mit hoher Linearität und ohne Kohlenstoff-
Wasserstoff-Bindungen, wie z. B. Polytetrafluorethylen
(PTFE). Weitere Polymere können andere vollständig
halogenierte Polyalkene sein.
Der zu untersuchende Harnstoff wird in einem
organischen Lösungsmittel gelöst, vorzugsweise in einem
leicht verdampfbaren organischen Lösungsmittelgemisch
mit Methanol- oder Ethanolanteilen. Insbesondere können
Gemische aus Methanol und Aceton im bevorzugten
Verhältnis von 1 : 10 eingesetzt werden.
Anschließend wird die Harnstoff-Lösung auf die
Polymerfolie oder die CaF2-Scheibe aufgetragen und das
Lösungsmittel wird verdunstet. Die so präparierte Folie
bzw. Scheibe wird dann IR-spektroskopisch unter
Verwendung eines preiswerten dispersiven Infrarot
spektrometers, über welches auch die meisten Apotheken
verfügen, untersucht und der Harnstoff wird anhand der
C-N-Valenzschwingung identifiziert.
In einer weiteren Ausführungsvariante kann die
Identifizierung des Harnstoffs auch als KBr-Pressling
erfolgen.
Nach herkömmlichen Methoden wird der Harnstoff in
fester Form als KBr-Pressling vermessen. Bei der
Herstellung der Tablette wird wie folgt verfahren:
- 1. Einwaage von ca. 300 mg KBr und ca. 0,5 mg Harnstoff
- 2. Zwei Minuten Mahlen des Gemisches in einer Kugelmühle
- 3. Einbringen in die Presse und zwei Minuten evakuieren
- 4. Zwei Minuten Pressen unter Vakuum und Druck.
Der IR-spektroskopische Identitätsnachweis erfolgt
ebenfalls anhand der Änderung der C-N-Valenzschwingung
von ca. 1.465 auf ca. 1.430 cm-1.
Als Nachteil der Nutzung der Presstechnik erweist sich
der relativ große Arbeitsaufwand, weshalb der
Folienpräparationstechnik der Vorrang zu geben ist.
Da bei dem Nachweis von 13C-Harnstoff nur die Frage nach
An- oder Abwesenheit steht, und keine quantitativen
Untersuchungen notwendig sind, ist das erfindungsgemäße
Verfahren zur Identitätsprüfung von 13C-Harnstoff zum
Einsatz in der Medizin gut anwendbar.
Anstelle teurer und aufwendiger Isotopenanalysatoren
benötigt man nur einfache Wegwerffolien und zur
Detektion ein auch in Apotheken meist vorhandenes
preiswertes dispersives Infrarotspektrometer.
Darüber hinaus ist das Verfahren einfach in seiner
Handhabung und wenig zeitaufwendig.
Anschließend wird das Verfahren anhand von Beispielen
näher erläutert.
Ca. 0,1 g des zu untersuchenden Harnstoffs werden
eingewogen und in einem Gemisch aus ca. 1 ml Methanol
und ca. 10 ml Aceton gelöst. Einige Tropfen der Lösung
werden auf die Teflon-Folie (PTFE) einer 3 M IR-Card
Type 62 aufgetragen. Das Lösungsmittel läßt man an der
Luft bei Zimmertemperatur verdunsten. Die so
präparierte IR-Card wird im Probenraum des IR-Spektro
meters in den Probenhalter eingeschoben und das IR-
Spektrum im Wellenzahlbereich von 1.550 bis 1.350 cm-1
in Transmission oder Extinktion aufgenommen. Die
Identifizierung des 13C-Harnstoffs wird an der
Schwingungsbande im Bereich zwischen 1.400 und
1.500 cm-1 vorgenommen (Abbildung). Liegt das
Peakmaximum bei ca. 1.430 cm-1 und fehlt zugleich ein
Peak mit Maximum bei ca. 1.465 cm-1 (Schwingungsbande
des unmarkierten Harnstoffs), so ist der Harnstoff als
13C-Form identifiziert.
Claims (7)
1. Verfahren zur Identitätsprüfung von 13C-markiertem Harn
stoff,
dadurch gekennzeichnet, dass für 13C-markierten Harnstoff
und 12C-unmarkierten Harnstoff die C-N-Valenzschwingungen
mittels IR-Spektroskopie im Wellenzahlbereich zwischen
1.350 und 1.550 cm-1 ermittelt und ausgewertet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Harnstoffprobe auf eine Polymerfolie oder CaF2-
Scheibe aufgebracht wird, die zwischen 1.350 und
1.550 cm-1 selbst keine Peaks zeigt, indem der
Harnstoff in einem organischen Lösungsmittel gelöst,
aufgetragen und das Lösungsmittel verdunstet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, dass
das organische Lösungsmittel ein organisches
Lösungsmittelgemisch mit Methanol- oder
Ethanolanteilen ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet, dass
Methanol und Aceton im Gemisch vorliegen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Polymerfolie ein thermoelastisches Polymer,
vorzugsweise ein vollständig halogeniertes Polyalken
ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Harnstoffprobe als KBr-Pressling präpariert
wird, wobei KBr und Harnstoff nach an sich bekannten
Methoden vermischt und gepresst werden.
7. Verwendung der IR-Spektroskopie unter Auswertung der
C-N-Valenzschwingungen im Wellenzahlbereich zwischen
1350 und 1550 cm-1 zur Identitätsprüfung von 13C-
Harnstoff.
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1999
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