DE19940270A1

DE19940270A1 - Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigerter Photosyntheserate

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Publication number: DE19940270A1
Application number: DE1999140270
Authority: DE
Inventors: Dario Leister; Claudio Varotto; Francesco Salamini; Koen Dekker
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1999-08-25
Filing date: 1999-08-25
Publication date: 2001-03-01
Anticipated expiration: 2019-08-26
Also published as: DE19940270C2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigerter Photosyntheserate, umfassend das stabile Integrieren eine Nukleinsäuresequenz, codierend für eine PsaE-Untereinheit des Photosystems I, oder deren Fragment oder Derivat in das Genom von Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben, wobei die Nukleinsäuresequenz oder deren Fragment oder Derivat funktional mit einer regulatorischen DNA-Sequenz verbunden ist, die die Expression der integrierten Nukleinsäuresequenz oder deren Fragment oder Derivat steuert, und Regeneration der erhaltenen Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben zu Pflanzen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigerter Photosyntheserate, umfassend das stabile Integrieren einer Nukleinsäuresequenz, codierend für eine PsaE-Untereinheit des Photosystems I, oder deren Fragment oder Derivat in das Genom von Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben, wobei die Nukleinsäuresequenz oder deren Fragment oder Derivat funktional mit einer regulatorischen DNA-Sequenz verbunden ist, die die Expression der integrierten Nukleinsäuresequenz oder deren Fragment oder Derivat steuert, und Regeneration der erhaltenen Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben zu Pflanzen.

Die Energiegewinnung durch Photosynthese beruht auf der Absorption elektromagnetischer Strahlung durch anregbare Pigmente wie z. B. Chlorophyll. Die Strahlungsaufnahme führt zur Anhebung eines Elektrons auf ein energiereicheres Niveau. Ein anschließendes kontrolliertes Absenken des Energieniveaus des angeregten Elektrons über eine definierte Oxidationskette kann vom Organismus zur Energiegewinnung genutzt werden.

An dem photosynthetischen Elektronentransport sind zwei Proteinkomplexe beteiligt, die Photosystem I (PS I) und Photosystem II (PS II) bezeichnet werden. Die durch Anregung von PS II freigesetzten Elektronen werden im Thylakoidlumen durch einen löslichen Elektronencarrier (Plastocyanin oder Cytochrom c₆) zunächst auf das ebenfalls angeregte PS I übertragen, dessen Elektronenlücke dadurch aufgefüllt werden kann. Das oxidierte PS I übernimmt die Elektronen, schleust sie durch die Thylakoidmembran hindurch und überträgt sie auf der Stromaseite an die Elektronencarrier Ferredoxin bzw. Flavodoxin. Flavodoxin ist ein alternativer Elektronenakzeptor bei den meisten. Cyanobakterien und Algen. Eine zusammenfassende Beschreibung dieser photosynthetischen Lichtreaktionen findet sich z. B. in: Photosynthesis: a comprehensive treatise, A.S. Raghavendra, ed. (Cambridge University Press, 1998, Seite 29-43, He, W.Z. und Malkin, R.: Photosystems I and II.

Das Photosystem I besteht in Cyanobakterien aus wenigstens 11 Untereinheiten, die wie folgt bezeichnet werden: PsaA, PsaB, PsaC, PsaD, PsaE, PsaF, Psal, PsaJ, PsaK, PsaL und PsaM. In höheren Pflanzen konnten zusätzlich zu den bereits erwähnten Komponenten drei weitere Untereinheiten nachgewiesen werden, die PsaG, PsaH und PsaN bezeichnet werden; vgl. Knoetzel, J. und Simpson, D.J., (1993), The primary structure of a cDNA for PsaN, encoding an extrinsic lumenal polypeptide of barley photosystem I, Plant Mol Biol 22, 337-345; Okkels, J. et al., (1992), A cDNA clone from barley encoding the precursor from the photosystem I polypeptide PSI-G: sequence similarity to PSI-K, Plant Mol Biol 18, 989-994; Okkels, J. et al., (1989), A cDNA clone encoding the precursor for a 10.2 kDa photosystem I polypeptide of barley, FEBS Letters 250, 575-579.

Die an der Stromaseite der Thylakoidmembran lokalisierte PS-I-Untereinheit PsaE ist am zyklischen Elektronentransport sowie an der Ferredoxin-Bindung beteiligt; vgl. Klukas, O. et al., (1999), Photosystem I, an improved model of the stromal subunits PsaC, PsaD, and PsaE, J Biol Chem 274, 7351-7360; Yu, L. et al., (1993), PsaE is required for in vivo cyclic electron flow around photosystem I in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, Plant Physiology 103, 171-180; Zhao, J. et al., (1993), Cloning and characterization of the psaE gene of the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002: characterization of a psaE mutant and overproduction of the protein in Escherichia coli, Mol Microbiol 9, 183-194; Rousseau, F. et al., (1993), Evidence for the involvement of PSI-E subunit in the reduction of ferredoxin by photosystem I, Embo J 12, 1755-1765; Sonoike, K. et al., (1993), Small subunits of Photosystem I reaction center complexes from Synechococcus elongatus. II. The psaE gene product has a role to promote interaction between the terminal electron acceptor and ferredoxin, Biochim Biophys Acta 1141, 52-57; Weber, N. und Strotmann, H., (1993), On the function of subunit PsaE in chloroplast Photosystem I, Biochim Biophys Acta 1143, 204-210.

Das Wachstum von Cyanobakterien mit fehlendem PsaE entspricht unter photoautotrophen Bedingungen dem des Wildtyps, während PsaE-Mutanten bei wenig Licht bzw. CO₂ im Vergleich zum Wildtyp verlangsamt wachsen und das Wachstum unter photoheterotrophen Bedingungen vollständig einstellen; vgl. Zhao, J et al. (1993), supra.

PsaE wird in höheren Pflanzen von nukleären Genen kodiert und liegt in mehreren Kopien im Genom vor; vgl. Obokata, J. et al., (1994), Microheterogeneity of PSI-E subunit of photosystem I in Nicotiana sylvestris. Plant Cell Physiol 35, 203-209). Die Nukleinsäuresequenzen der PsaE- Gene und die entsprechenden Aminosäuresequenzen sind in verschiedenen Pflanzenarten z. B. in Nicotiana sylvestris und Hordeum vulgare bekannt. In Arabidopsis thaliana sind bisher zwei psaE-Gene (psaE1 und psaE2) identifiziert worden. Das Gen psaE1 ist auf Chromosom 4 und psaE2 auf Chromosom 2 lokalisiert. Aufgrund des Arabidopsis Genomprojekts, das die vollständige Sequenzierung des Arabidopsis-Genoms zur Aufgabe hat, konnten über die genomische Sequenz mit Hilfe von Nukleinsäure-Analyseprogrammen die codierenden Sequenzen der beiden psaE-Gene und die daraus abgeleiteten Aminosäuresequenzen ermittelt werden. Die Nukleinsäuresequenz des psaE1-Gens ist unter der GenBank-Accession Nummer AL 035353, Basennummer 52445 bis 53382, zu finden. Die Nukleinsäuresequenz des psaE2- Gens ist unter der GenBank-Accession Nummer AC 006569, Basennummer 74016 bis 75012, auf dem komplementären DNA-Strang zu finden. Funktionsanalysen bezüglich der Aktivität von PsaE in höheren Pflanzen scheiterten bislang daran, daß Mutanten mit defektem psaE-Gen nicht verfügbar waren und ein entsprechender pflanzlicher Phänotyp bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht nachgewiesen werden konnte. Aufgrund der Komplexität der Photosysteme höherer Pflanzen waren die Auswirkungen einer veränderten PsaE-Untereinheit auf die Photosyntheserate bis heute nicht vorhersagbar.

Die Grundversorgung der rasch anwachsenden Weltbevölkerung mit Nahrungsmitteln und pflanzlichen Rohstoffen stellt hohe Anforderungen an die moderne Agrarwirtschaft. Die Verbesserung des pflanzlichen Ertrages durch die traditionelle Züchtung stößt mittlerweile an ihre Grenzen und ist zudem sehr Zeit- und arbeitsintensiv. Einen Ausweg zeigt die moderne Gentechnik auf. Diese erlaubt eine gezielte Modifikation bestimmter Stoffwechselwege durch die Einführung neuer Gensequenzen oder Manipulation von bereits im Organismus vorhandenen Genen. Da bei den gentechnologischen Verfahren die Veränderungen im Erbgut in der Regel genau bekannt sind, lassen sich diese Verfahren zudem meist auf weitere Pflanzenarten übertragen. Dieser Vorteil besteht bei auf klassische Weise gezüchteten Pflanzen nicht. Für entsprechende übertragbare Verfahren besteht demnach ein erhöhter Bedarf. Eine Ertragssteigerung bei Pflanzen kann so z. B. durch die Erhöhung der Photosyntheserate bewirkt werden, ein Ansatz, der beispielsweise bereits in WO 96/21737 - über eine Expression von deregulierter Fructose-1,6-bisphosphatase - verfolgt wurde. Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß eine veränderte Expression eines endogenen PsaE-Genes zu einer starken Veränderung der Photosyntheserate des veränderten Organismus führt. Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Ertragssteigerung bei Pflanzen durch Steigerung der photosynthetischen Leistungsfähigkeit bereitzustellen.

Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden Figuren erläutert.

Fig. 1 zeigt die Nukleinsäuresequenz der psaE1-cDNA aus Arabidopsis thaliana. Start-ATG und Stopp-Codon sind dabei fett hervorgehoben.

Fig. 2 zeigt die aus der psaE1-cDNA von Arabidopsis thaliana abgeleitete Aminosäuresequenz.

Fig. 3 zeigt die Nukleinsäuresequenz des zum psaE1-Gen von Arabidopsis thaliana gehörenden Promotors. Das Start-ATG des zum Promotor gehörenden psaE1-Gens ist fett hervorgehoben. Die Numerierung entspricht der des genomischen BAC-Klons F16A16 (Accession No. AL035353).

Fig. 4A bis D zeigt schematisch das Wuchsverhalten von Arabidopsis thaliana PsaE1- Mutanten im Vergleich zu Wildtyppflanzen. Die PsaE1-Mutanten sind hier abgekürzt als pam4 "photosynthesis affected mutant 4". In A ist das Wachstum von Blattarealen "Plant area" in cm² für den Zeitraum von Tag 12 bis Tag 21 nach Keimung dargestellt. B zeigt die Wachstumsraten "Growth rate", gemessen als prozentuale Zunahme der Blattfläche innerhalb von zwei Tagen. Unter C sieht man eine Häufigkeitsverteilung der Pflanzen in Bezug auf die Blattfläche. Abbildung D zeigt die Häufigkeitsverteilung von Pflanzen in Bezug auf die Wachstumsrate.

Fig. 5A bis C zeigt schematisch die Lichtsättigungskurven von PsaE1-Mutanten und Wildtyppflanzen, gemessen unter verschiedenen Bedingungen anhand der effektiven Quantenausbeute (ΦII = ΔF/F_M' = (F_M'-F_S)/F_M') von Photosystem II. Die PsaE1-Mutanten sind hier abgekürzt als pam4 "photosynthesis affected mutant 4". In A sieht man die Lichtsättigungskurve nach 20 Stunden Dunkelinkubation. In B sieht man die Lichtsättigungskurve nach 20 Stunden Dunkelinkubation plus 4 Stunden Belichtung bei 160 µmol Photonen m^-2 sec^-1, gefolgt von 10 min Dunkelinkubation unmittelbar vor der Messung. In C sieht man die Lichtsättigungskurve nach 20 Stunden Dunkelinkubation plus 4 Stunden Belichtung bei 160 µmol Photonen m^-2 sec^-1, gefolgt von 2 Stunden Dunkelinkubation unmittelbar vor der Messung. Fig. 6 zeigt schematisch den NachWeis der psaE1- und psaE2-Transkripte mittels RT-PCR und darauffolgendem Restriktionsverdau. WT bezeichnet den Wildtyp, pam4 die PsaE1-Mutante.

Fig. 7 zeigt in einer Übersicht, daß die pam4-Mutation durch die Insertion eines En-Elementes im psaE1-Gen von Arabidopsis thaliana verursacht wurde. Der Insertionsort befindet sich im Intron 1. An der Insertionsstelle findet sich eine typische Duplikation einer 3 Basenpaar langen Zielsequenz (Fett und groß dargestellt). Die Figur zeigt die durch das En-Element hinterlassenen Footprints bei insgesamt 13 germinalen Revertanten (REV #1-13) und einem somatischen Revertantensektor (REV #14). Durch die Insertion hinzugekommene Basen sind fett und klein dargestellt. WT bezeichnet den Wildtyp, pam4 die PsaE1-Mutante.

Fig. 8 zeigt schematisch einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von PsaE-Proteinen aus Pflanzen, Algen und Cyanobakterien. Die Aminosäuresequenzen von A, thaliana PsaE1 und PsaE2 wurden, mit den Aminosäuresequenzen der Psae-Untereinheiten der aufgeführten Organismen verglichen. Der Vergleich ist in drei Teile aufgeteilt, wobei der erste Teil die Domöne der N-terminale Chloroplasten-Importsequenz umfaßt. Der zweite Teil enthält die zweite N-terminale Domäne, der dritte Teil enthält die C-terminale Domäne, die in höheren Pflanzen, Algen und Cyanobakterien eine hohe Ähnlichkeit besitzt. Identische Aminosäuren sind schwarz unterlegt, nah verwandte Aminosäuren sind grau unterlegt.

Der hier verwendete Ausdruck "homologe Sequenz" bezeichnet eine Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz mit signifikanter Ähnlichkeit zur Vergleichssequenz oder Teilen davon. Als homologe Sequenzen gelten somit Nukleinsäuresequenzen, die mit den Vergleichssequenzen oder Teilen dieser Sequenzen unter stringenten oder wenig stringenten Bedingungen hybridisieren (zu stringenten und wenig stringenten Bedingungen siehe Sambrook et all, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory (1989), ISBN 0-87969-309-6). Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist: Hybridisierung in 4 × SSC bei 65°C (alternativ in 50% Formamid und 4 × SSC bei 42°C), gefolgt von mehreren Waschschritten in 0,1 × SSC bei 65°C für insgesamt etwa eine Stunde. Ein Beispiel für wenig stringente Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 4 × SSC bei 37°C, gefolgt von mehreren Waschritten in 1 × SSC bei Raumtemperatur. Als homologe Sequenzen sollen des weiteren Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen oder Teile davon gelten, die unter Zuhilfenahme des Similaritätsalgorithmus BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990) eine signifikante Ähnlichkeit mit Vergleichssequenzen aufweisen. Als signifikant ähnlich werden, wie hier verwendet, Sequenzen bezeichnet, die z. B. unter Verwendung von Standardparametern im Blast-Service des NCBI ein Signifikanzniveau (Probability) von P < 10^-5 aufweisen, wenn Sie mit den Vergleichssequenzen verglichen werden.

Der hier verwendete Ausdruck "Derivate" bezeichnet Nukleinsäuresequenzen, die Modifikationen in Form von einer oder mehreren Deletionen, Substitutionen, Additionen, Insertionen und/oder Inversionen aufweisen. Derivat bedeutet ferner, daß eine Nukleinsäuresequenz zusammengesetzt ist aus einem oder mehreren Nukleinsäurefragmenten eines Gens und einem oder mehreren Nukleinsäurefragmenten eines oder mehrerer anderer Gene. Die einzelnen Domänen können dabei sowohl unmodifiziert als auch modifiziert sein. Der hier verwendete Ausdruck "funktionell verbunden" bedeutet, daß eine regulatorische Sequenz wie ein Promotor die Expression eines Gens steuert oder das eine Nukleinsäuresequenz von dem Promotor ausgehend exprimiert wird.

Der hier verwendete Ausdruck "Vektor" bezeichnet natürlich vorkommende oder künstlich erschaffene Konstrukte zur Aufnahme, Vermehrung, Expression oder Übertragung von Nukleinsäuren, z. B. Plasmide, Phagemide, Cosmide, künstliche Chromosomen, Bakteriophagen, Viren, Retroviren.

Der hier verwendete Ausdruck "Expressionssystem" bezeichnet jedwede Kombination von Vektoren, Restriktionsenzymen, Transformationsmethoden, Zellextrakten, lebenden Zellen z. B. prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder Organismen mit dem Zweck der endogenen oder exogenen Expression von Genen.

Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigerter Photosyntheserate, umfassend das stabile Integrieren einer Nukleinsäuresequenz, codierend für eine PsaE-Untereinheit des PS I, oder deren Fragment oder Derivat in das Genom von Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben, wobei die Nukleinsäuresequenz oder deren Fragment oder Derivat funktional mit einer regulatorischen DNA-Sequenz verbunden ist, die die Expression der integrierten Nukleinsäuresequenz oder deren Fragment oder Derivat steuert, und Regeneration der erhaltenen Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben zu Pflanzen. Aufgrund der gesteigerten Photosyntheserate wird die Biomasseproduktion und somit der Erträg der Pflanzen gesteigert.

Bei der Nukleinsäuresequenz kann es sich erfindungsgemäß um jedes beliebige psaE-Gen handeln, beispielsweise um solches aus Pflanzen, Algen oder Cyanobakterien. Bevorzugte Nukleinsäuresequenzen, die für eine PsaE-Untereinheit des PS I kodieren, sind z. B. von den folgenden Organismen bekannt: Arabidopsis thaliana, psaE1-Gen (Genbank Accession Nummer: AL 035353, Base 52445 bis 53382), Arabidopsis thaliana, psaE2-Gen (Genbank Accession Nummer: AC 006569, Base komplementär zu 74016 bis 75012), Glycine max, ESTs mit erkannter Homologie zu psaE aus Spinacia oleracea (Genbank Accession Nummern: AI 431141, AI 431199, AI 437768, AI 495553), Mesembryanthemum crystallinum, EST mit erkannter Homologie zu psaE (Genbank Accession Nummer: AA689212), Spinacia o/eracea psaE-mRNA (Genbank Accession Nummer: X14018), Mastigocladus laminosus, psaE-Gen (Genbank Accession Nummer: AF093820, Base 291 bis 506), Yersinia pseudotuberculosis, psaE-Gen (Genbank Accession Nummer: L76301, Base 397 bis 1041), Synechococcus elongatus, psaE-Gen (Genbank Accession Nummer: Y10290, Base 248 bis 478), Hordeum vulgare, psaE-mRNA (Genbank Accession Nummer: Y00966), Porphyra purpurea, psaE-Gen (Genbank Accession Nummer: X60434, Base 274 bis 462), Synechococcus sp. PCC 7002, psaE- Gen (Genbank Accession Nummer: M99379), Nostoc PCC 8009, psaE-Gen (Genbank Accession Nummer: AF148219), Nicotiana sylvestris, psaE A-mRNA (Genbank Accession Nummer: 572356), Nicotiana sylvestris, psaE-B-mRNA (Genbank Accession Nummer: S72358), Chlamydomonas reinhardtii, mRNA für 8,1 kd P30 Protein des Photosystem I, entspricht psaE (Genbank Accession Nummer: X13496), Cyanidium caldarium, psaE-Gen (Genbank Accession Nummer: AF 022186, Base 42464 bis 42673), Guillardia theta, psaE-Gen (Genbank Accession Nummer: AF 041468, Base komplementär zu 116666 bis 116860).

Für das erfindungsgemäße Verfahren können endogene oder exogene Nukleinsäuresequenzen, die eine PsaE-Untereinheit des PS I codieren, verwendet werden. Endogen bedeutet, das die Nukleinsäuresequenz aus dem gleichen Organismus stammt, in den sie mit dem erfindungsgemäßen Verfahren integriert wird, z. B. ein psaE-Gen aus Arabidopsis thaliana wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in Arabidopsis thaliana integriert. Exogen bedeutet, das die Nukleinsäuresequenz aus einem anderen Organismus stammt, z. B. eine Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in z. B. Weizen integriert. Nach der stabilen Integration der transformierten Nukleinsäuresequenz liegen dann zwei oder mehr psaE-Gene im Genom vor. Aufgrund der mit der Nukleinsäuresequenz funktional verbundenen regulatorischen DNA-Sequenz liegt ferner eine gesteigerte Expression der PsaE- Gene vor. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Nukleinsäuresequenzen gegenüber den natürlich vorkommenden Nukleinsäuresequenzen Deletionen, Substitutionen, Additionen, Insertionen und/oder Inversionen auf. Es können somit auch Fragmente oder Derivate der natürlicherweise vorkommenden psaE-Gene für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden.

Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen von PsaE-Untereinheiten des PS I aus höheren Pflanzen, Algen und Cyanobakterien ergab, daß die Proteine aus drei Domänen aufgebaut sind. PsaE aus Algen (ohne Grünalgen) und Cyanobakterien entspricht der Cterminalen Domäne aus höheren Pflanzen und Grünalgen mir etwa 60 Aminosäuren. Zusätzlich besitzen höhere Pflanzen und Grünalgen eine Chloroplasten-Importsequenz und eine zweite N-terminale Domäne mit etwa 40 Aminosäuren. Die C-terminale Domäne ist hoch konserviert zwischen beiden PsaE- Proteinen in Arabidopsis thaliana und darüber hinaus bei allen bekannten Pflanzen- Algen- und Cyanobakterien-PsaE-Proteinen. Die zweite N-terminale Domäne ist dagegen relativ variabel. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Nukleinsäuresequenz verwendet, die aus Nukleinsäurefragmenten verschiedener psaE-Gene zusammengesetzt ist. Die Nukleinsäuresequenz kann z. B. aus der Chloroplasten-Importsequenz- Domäne von Arabidopsis thaliana, der zweiten N-terminalen Domäne von Mais und der C terminalen Domäne von Arabidopsis thaliana zusammengesetzt sein. Die drei Domänen können auch von drei verschiedenen psaE-Genen stammen. Die Nukleinsäuresequenz kann ferner Modifikationen wie Deletionen, Additionen oder Substitutionen enthalten. Die Verfahren zur Herstellung solcher Nukleinsäuresequenzen sind Stand der Technik und vom Fachmann leicht durchzuführen.

Die mit der Nukleinsäuresequenz funktional verbundene regulatorische DNA-Sequenz, z. B. ein Promotor, kann sowohl die mit der Nukleinsäuresequenz endogen vorliegende regulatorische DNA-Sequenz als auch jede andere regulatorische DNA-Sequenz sein. Die regulatorische DNA- Sequenz kann sowohl ein endogener Promotor des zu transformierenden Organismus oder ein exogener Promotor sein, der sich z. B. auf dem verwendeten Vektor befindet. Als Promotor ist dabei grundsätzlich jede regulatorische Sequenz geeignet, die die Expression von Fremdgenen in Organsimen, z. B. Pflanzen, steuern kann, z. B. der CaMV 355-Promotor aus dem Blumenkohl- Mosaik-Virus; vgl. Franck et al., Cell 21, 285-294 (1980). Die Expression der Nukleinsäuresequenzen kann auch durch einen chemisch induzierbaren Promotor erreicht werden. Beispiele für chemisch induzierbare Promotoren sind der PRPI-Promotor (Ward et al., Plant Molecular Biology 22, 361-366 (1993)), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid induzierbarer Promotor (EP-A 388186), ein durch Tetrazyklin induzierbarer Promotor (Gatz et al., Plant Journal 2, 397-404 (1992)), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP-A 335528) oder ein durch Ethanol oder Cyclohexanon induzierbarer Promotor (WO 93/21334). Je nach gewünschtem Expressionsort können auch Promotoren verwendet werden, die z. B. in bestimmten Pflanzengeweben oder Pflanzenteilen aktiv sind. Beispiele für entsprechende Promotoren sind der Phaseolin-Promotor (US 5504200), der Isoflavon-Reduktase-Promotor (US 5750399), ein samenspezifischer Promotor, z. B. aus Tabak (US 5824863) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., (1989), EMBO J 8, 2445-2452).

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auf alle beliebigen Organismen anwenden. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Steigerung des Ertrags von mono- und dikotylen Pflanzen sowie Algen und Cyanobakterien einsetzbar. Besonders bevorzugte Pflanzen sind dabei Kulturpflanzen z. B., Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat, Erbse, Bohne, Karotte, Zwiebel, die verschiedenen Baum, Nuß- und Weinspezies, ferner Getreide z. B. Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, ferner Obstsorten z. B. Mango, Apfel, Pfirsich, Stachelbeere, Johannisbeere, Banane, Melone, Kürbis und Zitrusfrüchte z. B. Zitrone, Apfelsine, Pampelmuse oder Mandarine. Die mit der Nukleinsäuresequenz transformierten Pflanzen können unmodifizierte Wildtyppflanzen oder durch Züchtung erhaltene Pflanzen oder modifizierte Pflanzen z. B. transgene Pflanzen sein. Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner nicht nur in Pflanzen oder Pflanzengeweben sondern auch in Pflanzenzellen z. B. in einer Zellkultur oder in Expressionssystemen zur Veränderung der Expressionsmuster von psaE-Genen oder Derivaten oder Homologen dieser Gene, verwendet werden.

Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit besonderen stabilen Eigenschaften genutzt werden. Beispiele hierfür sind Pflanzen mit günstigem Wachstum unter suboptimalen Bedingungen. Entsprechende Pflanzen können beispielsweise bei allgemeinem ablotischen Streß, z. B. besonders viel bzw. wenig Licht, bei extrem hohen oder niedrigen Temperaturen oder bei Kombinationen dieser oder anderer Streßfaktoren eingesetzt werden.

Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren zur temporären Regulation der Photosyntheserate geeignet, indem der psaE-spezifische Promotor gegen einen induzierbaren Promotor ausgetauscht wird. Durch eine entsprechende Induktion der Photosynthese kann z. B. auf Perioden mit besonderen Lichtverhältnissen reagiert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine transformierte Pflanzenzelle oder ein transformiertes Pflanzengewebe, in der die für ein Genprodukt kodierende Nukleinsäuresequenz und die damit funktional verbundene regulatorische DNA-Sequenz stabil integriert sind. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine durch das erfindungsgemäße Verfahren veränderte Pflanzenzelle oder ein verändertes Pflanzengewebe, die oder das zu einer samenproduzierenden Pflanze regenerierbar ist. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Pflanze, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Saatgut, das von Pflanzen erhalten wird, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden. Die Erfindung betrifft ferner die von den Pflanzen produzierten Früchte, z. B. Obst, Beeren, Kartoffeln und Trauben.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Vektoren, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die eine PsaE-Untereinheit des PS I codiert, oder deren Fragment oder Derivat und eine regulatorische DNA-Sequenz.

Geeignete Vektoren zur Aufnahme und Überführung der Nukleinsäuresequenzen können die Vermehrung und/oder die Expression der aufgenommenen Nukleinsäuren in Einzellern wie z. B. Escherichia coli oder Agrobacterium tumefaciens oder in Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen gewährleisten. Entsprechende Vektoren können natürlich vorkommen oder aber künstlich hergestellt sein. Die Vektoren können Selektionsmarker, Terminatorsequenzen, Polylinker, Promotorelemente, Enhancer, Polyadenylierungsstellen und andere genetische Elemente umfassen. Zur Klonierung geeignete Vektoren sind z. B. pBluescript, Plasmide der pUC-Serie, Plasmide der pGEM-Reihe oder auf dem Bakteriophagen λ basierende Vektoren. Ein zur Verwendung in Agrobacterium benutzter Plasmidvektor ist z. B. pBin19; vgl. Bevan et al., (1984), Nucleic Acids Research 12, 8711-8721. Zur Transformation und Expression in Pflanzen stellen auf dem Ti-Plasmid von Agrobacterium-Arten oder auf Pflanzenviren aufbauende Konstrukte verwendungsfähige Vektoren dar und sind dem Fachmann bekannt. Des weiteren werden bei bestimmten Transformationsmethoden wie z. B. Mikroinjektion, Protoplasten- Transformation und Einschießen (microprojectile bombardment) anstelle von Ti-Plasmiden auch obengenannte Klonierungsvektoren oder linearisierte DNA eingesetzt. Eine zusammenfassende Beschreibung bislang benutzter Vektoren findet sich in Guerineau und Mullineaux, Plant Transformation and Expression Vectors, in: Plant Molecular Biology Labfax, herausgegeben von Croy, Oxford, BIOS Scientific Publishers, 121-148 (1993).

Einige der in üblichen Transformations- und Expressionssystemen angewendeten Transformationsmethoden zur Übertragung von Fremdgenen (Transformation) in das Genom von Pflanzen werden im folgenden vorgestellt. Die Wahl der Methode zur Einbringung der Nukleinsäuresequenzen und der mit ihr funktional verbundenen regulatorischen DNA- Sequenzen in pflanzliche Zellen ist jedoch nicht auf diese Liste beschränkt. Bislang eingesetzte Transformationsverfahren bei Pflanzen sind z. B. der Gentransfer mittels Agrobacterium tumefaciens (z. B. durch Baden von Samen oder Blattstückchen in einer Agrobakterienlösung), mittels pflanzlicher Viren, durch Elektroporation, durch Einschießen (microprojectile bombardment) oder Einspritzen (Mikroinjektion) sowie die Inkubation von trockenen Embryonen in DNA-haltigen Flüssigkeiten und die Transformation von Protoplasten unter Zuhilfenahme von Polyethylenglykol. Genauere Beschreibungen der angesprochenen Verfahren finden sich z. B. in Jens et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von Kung und Wu, Academic Press 128-143 (1993).

BEISPIELE

Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:

Beispiel 1 Allgemeine Klonierungsverfahren

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von Nukleinsäurefragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Filtermaterialien, Transformation und Anzucht von Bakterienzellen, Sequenzierungen, PCR etc. wurden wie bei Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory, ISBN 0-87969-309-6, durchgeführt.

Beispiel 2 Herstellung einer Knockout-Population von Arabidopsis thaliana

PsaE1-Mutanten wurden durch das Screening einer mit dem Transposon En-1/Spm (Pereira et al., (1986), EMBO J 5, 835-841) mutagenisierten Knockout-Population von Pflanzen der Spezies Arabidopsis thaliana Ecotyp Columbia erhalten. Die Integration der transposablen Elemente in Gene der Mutterpflanze führt häufig zum Ausfall der entsprechenden Genfunktion und in vielen Fällen zu einem vom Wildtyp unterscheidbaren Erscheinungsbild der betroffenen Pflanze. Zum Aufbau der Knockout-Population wurde das autonome En-1 Element aus Zea mays mittels Agrobacterium tumefaciens in Arabidopsis übertragen. Das entsprechende Transposon tagging System ist in Cardon et al., (1993), Plant Molecular Biology 23, 157-178, beschrieben. Das verwendete Ti-Plasmid, pGV3850HPT::pkEn2, beinhaltete das komplette En-1 Element. Zur Selektion von Hygromycin-resistenten Transformanten trägt dieser Vektor das HPT-Gen unter der Kontrolle des viralen CaMV 35S Promotors. Samen einer Transformante mit einer einzelnen T-DNA-Insertion wurden auf Hygromycin-haltigem Medium ausgesät. Samen der so entstandenen, gegen Hygromycin-resistenten Pflanzen (T₂-Generation) wurden anschließend auf Kanamycin-haltigem Medium ausgesät. Bei den auf diese Weise selektionierten Pflanzen (T₃- Generation) war das Enl-Element aus der T-DNA heraus transponiert. Mittels PCR wurde diejenigen Pflanzen der T₄-Generation identifiziert, die ein oder mehrere transponierte En-1 Elemente, jedoch keine En-1 Elemente mehr in der T-DNA trugen. Diese Pflanzen beinhalteten jedoch noch die T-DNAs ohne integrierte En-1 Elemente. Zur Erzeugung von En-1 positiven, T- DNA negativen Pflanzen wurde die T₄-Generation mit dem Wildtyp Arabidopsis thaliana Ecotyp Columbia gekreuzt und En-1 positive, T-DNA negative Pflanzen (S₀-Generation) durch PCR identifiziert. Samen jeder dieser Pflanzen wurden über 6-12 Generationen (bis zur S₆- bzw. S₁₂-Generation) hinweg vermehrt, bis insgesamt 3.000 Linien mit insgesamt 15.000 unabhängigen En-1 Insertionen zur Verfügung standen; vgl. Wisman et al., (1998), Plant Molecular Biology 37, 989-999; Baumann et al., (1998), Theoretical and Applied Genetics 97, 729-734.

Beispiel 3 Screening nach Mutanten mit veränderter Photosyntheseleistung

Samen der En-Population von Arabidopsis thaliana wurden in Plastikbehältern auf "Minitray"- Erde (Gebr. Patzer GmbH & Co KG, D-36391 Sinntal-Jossa, Deutschland) ausgesät und zur Überwindung der Samenruhe 3 Tage bei 2-5°C im Dunkeln inkubiert. Die Keimlinge wurden im Gewächshaus unter Langtag-Bedingungen (16 Stunden Lichtdauer) angezogen. Zum Screening nach Photosynthesemutanten wurden die Pflanzbehälter 3-4 Wochen nach der Keimung in einen Klimaraum mit Kurztag-Bedingungen (10,5 Stunden Lichtdauer pro Tag bei 20°C und konstanter PAR (photosynthetically active radiation) von 200 µmol sec^-1 m^-2; 13,5 Stunden Nachtperiode bei 15°C) überführt: Nach wenigstens 2 Tagen unter diesen Bedingungen wurde die effektive PS II Quantenausbeute bestimmt. Für diese Messungen wurde ein automatisiertes PAM-Fluorometer (Schreiber, U. et al., (1986), Continuousrecording of photochemical and non photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer, Photosyn. Research 10, 51-62) mit einem modifizierten Sensor eingesetzt, um Bewegung und exakte Positionierung innerhalb der Dimensionen der Pflanzbehälter zu gewährleisten. Die Bestimmung der effektiven Quantenausbeute von PS II (ΦII = ΔF/F_M' = (F_M'-F_S)/F_M'), Parameter nach Genty, B. et al., (1989), The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron-transport and quenching of chlorophyll fluorescence, Biochimica et Biophysica Acta 990, 87-92) erfolgte für jede Pflanze einzeln nach einem vorgegebenen Schema. Für optimale Messungen geeignete Blätter wurden automatisch identifiziert (Autofocus-Modus), indem die maximale Fluoreszenzausbeute (maximaler F₀') von einzelnen Zellen bestimmt wurde. Die Endresultate der F/F_M'-Messungen wurden als Microsoft Excel Tabelle ausgegeben und statistisch ausgewertet.

Das Screening nach Pflanzen mit abweichendem (ΦII = ΔF/F_M' = (F_M'-F_S)/F_M')-Quotienten wurde in einer Klimakammer unter Schwachlicht (100 µmol sec^-1 m^-2) 3 bis 7 Stunden nach Beginn einer Tagesperiode durchgeführt. Pro Woche wurden 72 Pflanzenlinien mit jeweils 12 Individuen untersucht, insgesamt etwa 1.000 Pflanzen.

Beispiel 4 Vermehrung der Pflanzen

Die Fertilisation mit "Osmocote Plus" (15% N, 11% P₂O₅, 13% K₂O, 2% MgO; Scotts Deutschland GmbH, D-48527 Nordhorn, Deutschland) erfolgte gemäß den Angäben des Herstellers. Zur Samenproduktion sowie zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen wurde das Aracon-System (Beta Tech, Gent, Belgien) verwendet.

Beispiel 5 Identifizierung von En-flankierenden Sequenzen

Sequenzen, die die 3'-Enden von integrierten En-Transposons flankierten, wurden durch PCR- Amplifikation von geschnittener und mit Adaptern versehener Pflanzen-DNA erhalten. Ein entsprechendes Protokoll für die Isolierung von Mutator-Element flankierenden Sequenzen ist bei Frey, M. et al., (1998), A general method for gene isolation in tagging approaches: Amplification of insertion mutagenised sites (AIMS), Plant Journal 13, 717-721, nachzulesen. Für die Identifizierung der En-flankierenden Sequenzen wurden 100 ng genomische DNA mit Csp6I geschnitten und über Nacht bei 16°C mit 12,5 µmol Adapter APL1632 ligiert. 4 µl des Ligationsansatzes wurden in einer linearen PCR mit dem Primer En-8130s (En-230as) eingesetzt. 1 µl dieses Ansatzes wurden als Template für eine PCR mit den Primern En-8153 s und LR26 verwendet. Die entstandenen PCR-Produkte wurden in einem 4%igem Polyacrylamidgel aufgetrennt, die Banden mit Hilfe von Silberfärbung sichtbar gemacht und ausgeschnitten. Die Banden wurden in 50 ml KCl, 10 mM Tris-Cl (pH 9,0), 0,1% Triton-X 100 eluiert, reamplifiziert und nach Reinigung unter Benutzung eines ABI Prism 377 sequenziert.

Beispiel 6 Spezifische Oligonukleotide und Adaptersequenzen (5'-3' Orientierung)

Zur Isolierung von Transposon-flankierenden Regionen wurden die Adapter APL1632 (LR32 und APL16) und APL1732 (LR32 und APL17) benutzt.
LR32:ACTCGATTCTCAACCCGAAAGTATAGATCCCA
APL 16: P-TATGGGATCACATTAA-NH₂
APL17: P-CGTGGGATCACATTAA-NH₂

PCR-Primer zur Isolierung von Transposon-flankierenden Regionen:
LR26: ACTCGATTCTCAACCCGAAAGTATAG
En-8130s: GAGCGTCGGTCCCCACACTTCTATAC
En-8153s: TACGAATAAGAGCGTCCATTTTAGAGTG
En-230as: AGAAGCACGACGGCTGTAGAATAGGA
En-82as: ACCCACACTTTTACTTCGATTAAGAGTGT.

Für die Analyse der psaE-Gene fanden folgende Primer Verwendung:
PsaE1 footprints:
E1-41s: CCAATGTCACCTCGGTCGCC
E1-806as: AGAAACTAAA CAAAACCGGCAT

Primer zur Amplifikation der psaE1-Region (-206/277), die En-Insertion flankierend:
E1-206s: CCACGTCACCACATTATCCTT
El-277as: CGGTTTAGGTTAGCTGACCT

Primer für RT-PCR:
E(91/85)s: GTGTCTTTCT TGCCGATGAGAA
E(798/868)as: GCGAACCGGACCACAACCGG

Die den Primern zugeordneten Zahlen beschreiben deren Hybridisierungspositionen in den DNA's des En-1-Elementes (Genbank Accession Nummer: M25427) bzw. psaE1/psaE2.

Beispiel 7 Wachstumsmessungen

Für die Wachstumsmessungen wurde das Wachstum der Blätter bestimmt; vgl. Leister, D. et al., (1999), Large-scale evaluation of plant growth in Arabidopsis thaliana by non-invasive image analysis. Plant Physiology and Biochemistry 37, 1-8. Digitalfotografien der Pflanzenbehälter (von oben fotografiert) wurden entsprechend den realen Dimensionen der Behälter vergrößert und mit einem Raster versehen, so daß jede Pflanze in einem separaten Feld lag. Der Parameter "Grünfärbung" erlaubte eine Unterscheidung zwischen Hintergrund und Pflanzenteilen.

Beispiel 8 Messungen des Gasaustausches von Blättern

Die Messung des in vivo Gasaustausches von noch an der Pflanze befindlichen Blättern wurde mit Hilfe eines CO₂/H₂O Porometers (Modell CQP-130, Heinz Walz GmbH, Deutschland) wie in der Gebrauchsanweisung des Herstellers beschrieben vorgenommen. Die erhaltenen Daten wurden unter Benutzung des DIAGAS Analyseprogramms (Heinz Walz GmbH, Deutschland) und der in Von Caemmerer, S. und Farquhar, G.D., (1981), Some relationships between the biochemistry of photosynthesis and gas exchange of leaves, Planta 153, 376-387, angegebenen Berechnungsformel zur Kalkulation der Photosyntheseparameter (CO₂ Assimilationsrate bzw. Transpirationsrate) herangezogen.

Beispiel 9 Messungen des Chlorophyll a/b-Verhältnisses

Aus 3 bis 4 Wochen alten Wildtyppflanzen und pam4-Mutanten wurden die Pigmente mit 80%igem Aceton extrahiert. Die Konzentrationen von Chlorophyll a und Chlorophyll b wurden im Anschluß daran spektroskopisch (UVIKON 930, Kontron Instruments) wie bei Porra, J. et al., (1989), Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophyll a and chlorophyll b extracted with 4 different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy, Biochimica et Biophysica Acta 975, 384-394, beschrieben bestimmt. Es wurde festgestellt, daß das Chlorophyll alb-Verhältnis in pam4 gegenüber den Wildtyppflanzen signifikant verringert ist; vgl. Tabelle 1. Der Befund kann aufgrund des nachgewiesenen (siehe Beispiel 11) verringerten Gehalts an PS-I erklärt werden.

Tabelle 1

Beispiel 10 2-D PAGE von Proteinen der Thylakoidmembran

Die Präparation von Thylakoidmembranen aus Chloroplasten des Mesophylls wurde gemäß Bassi, R. et al., (1987), Chlorophyll-proteins of the photosystem II antenna system, JBiol Chem 262, 13333-13334, durchgeführt. Die Membranen wurden in 1% Dodecyl β-D-Maltosid gelöst. Die PAGE-Auftrennung in der ersten Dimension erfolgte bei 4°C in einem 4-12%igem Gradientengel unter Benutzung des bei Peter, G. F. und Thornber, J. P., (1991), Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins, J Biol Chem 266, 16745-16754, beschriebenen Puffersystems. In dem oberen Puffertank der Elektrophoreseapparatur wurde das bei Peter und Thornber, supra, verwendete Deriphat-160 durch Li-Dodecylsulfat ersetzt. Für die Auftrennung in der zweiten Dimension wurde ein 10- 16%iges Gradientengel bei Raumtemperatur eingesetzt. Der verwendete Puffer ist bei Schagger, H und von Jagow, G., (1987), Tricine sodium dodecylsulfate polyacrylamidegel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 kDa to 100 kDa, Analytical Biochemistry 166, 368-379, nachzulesen.

Beispiel 11 Western-Blot

Eine Western-Blot-Analyse wurde mit dem üblichen Verfahren durchgeführt. Es hat sich gezeigt, daß der PsaE-Gehalt in Proteinfraktionen der mutanten Pflanzen gegenüber den Wildtyppflanzen deutlich verringert ist. Wurden gleiche Mengen Protein von mutanten und Wildtyppflanzen pro Spur aufgetragen, wurde zusätzlich zur Verringerung des PsaE-Gehalts eine Reduzierung aller untersuchten PS-I-Polypeptide festgestellt. Daraus ergibt sich, daß die Inaktivierung von psaE1 sowohl die Akkumulation gesamten Photosystems I als auch die Akkumulation von PsaE1 im PS-I-Komplex beeinflußt.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit gesteigerter Photosyntheserate, umfassend das stabile Integrieren einer Nukleinsäuresequenz, codierend für eine PsaE-Untereinheit des Photosystems I, oder deren Fragment oder Derivat in das Genom von Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben, wobei die Nukleinsäuresequenz oder deren Fragment oder Derivat funktional mit einer regulatorischen DNA-Sequenz verbunden ist, die die Expression der integrierten Nukleinsäuresequenz oder deren Fragment oder Derivat steuert, und Regeneration der erhaltenen Pflanzenzellen oder Pflanzengewebe zu Pflanzen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz oder deren Fragment oder Derivat aus Pflanzen, Cyanobakterien oder Algen stammt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Gene umfassend Genbank Accession Nummern AL 035353 (Base 52445 bis 53382), AC 006569 (Base komplementär zu 74016 bis 75012), AI 431141, AI 431199, AI 437768, AI 495553, AA689212, X14018, AF093820 (Base 291 bis 506), L76301 (Base 397 bis 1041), Y10290 (Base 248 bis 478), Y00966, X60434 (Base 274 bis 462), M99379, AF148219, 572356, S72358, X13496, AF 022186 (Base 42464 bis 42673), AF 041468 (Base komplementär zu 116666 bis 116860.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die regulatorische DNA-Sequenz ein PsaE-Promotor, der für die Pflanze endogene PsaE-Promotor oder der zu den Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 2 natürlicherweise gehörende PsaE-Promotor ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die regulatorische DNA-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Promotoren umfassend CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus, PRPI-Promotor, ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor, ein durch Benzolsulfonamid induzierbarer Promotor, ein durch Tetrazyklin induzierbarer Promotor, ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor, ein durch Ethanol oder Cyclohexanon induzierbarer Promotor, Phaseolin-Promotor, Isoflavon-Reduktase-Promotor, ein samenspezifischer Promotor oder der ST-LSI-Promotor.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei in der Nukleinsäuresequenz die zweite N-terminale Domäne aus einem anderen Gen als die Chloroplasten-Importsequenz- Domäne und die C-terminale Domäne stammt.

7. Vektor, umfassend die Nukleinsäuresequenz oder deren Fragment oder Derivat und die regulatorische DNA-Sequenz wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert.

8. Transformierte Pflanzenzelle oder transformiertes Pflanzengewebe, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz oder deren Fragment oder Derivat und die regulatorische DNA-Sequenz wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert oder der Vektor nach Anspruch 7 stabil in das Genom der Pflanzenzelle oder des Pflanzengewebes integriert ist.

9. Pflanzenzelle oder Pflanzengewebe nach Anspruch 8, regenerierbar zu einer samenproduzierenden Pflanze.

10. Pflanze, erhältlich nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 9.

11. Saatgut, erhalten von Pflanzen nach Anspruch 10.