DE19919625A1

DE19919625A1 - In-vitro-Verfahren zum Herstellen einer homologen Herzklappe

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Publication number: DE19919625A1
Application number: DE19919625A
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Universitaet Zuerich
Priority date: 1999-04-29
Filing date: 1999-04-29
Publication date: 2000-11-30
Anticipated expiration: 2019-04-30
Also published as: PT1077072E; ES2209715T3; EP1077072A2; DK1077072T3; DE19919625C2; EP1077072B8; ATE253948T1; EP1077072B1; DE50004406D1; EP1077072A3

Abstract

An Herzklappendysfunktion leidenden Patienten wird bisher entweder eine mechanische Herzklappe oder eine biologische Klappe von einem menschlichen oder nicht-menschlichen Spender implantiert. Diese Klappen weisen jedoch erhebliche Nachteile auf, wie z. B. die Notwendigkeit einer lebenslangen Antikoagulation mit der Gefahr hemorrhagischer Komplikationen, eine Degenerationsneigung sowie die Gefahr einer Immunreaktion. Außerdem kann keine der bisher bekannten Klappen sich einem z. B. durch Wachstum verändernden Herzen anpassen. DOLLAR A Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können homologe Herzklappen zur Verfügung gestellt werden, die aus einem im wesentlichen bindegewebigen Kern und einer superfiziellen Endothelzellschicht aufgebaut sind und damit einen der natürlichen Herzklappe analogen Aufbau haben. Die Nachteile der bekannten Herzklappen werden durch die erfindungsgemäßen Herzklappen vermieden.

Description

Jedes Jahr versterben alleine in den USA ca. 20.000 Patienten an den Folgen einer Herzklappendysfunktion, und mehr als 60.000 Patienten sind wegen einer bereits er kannten Dysfunktion gezwungen, ein oder mehrere Herzklappen operativ ersetzen zu lassen. Als Ersatz für die eigene Herzklappe kommen entweder mechanische oder bio logische Klappenprothesen (Xenografts) in Frage, seltener werden kryopreservierte oder glutaraldehydfixierte Homografts verwendet.

Mechanische Klappenprothesen führen jedoch oft zu Fremdkörperreaktionen mit throm boembolischen Komplikationen, die durch die mit der künstlichen Herzklappe verän derten Strömungsverhältnisse im Herzen begünstigt werden. Daher ist eine lebenslange Antikoagulation des betroffenen Patienten erforderlich, die zu einer permanent erhöhten Blutungsgefahr führt. Eine weitere, oft lebensbedrohliche Komplikation bei Patienten mit einer mechanischen Herzklappe sind Infektionen.

Bei den Xenografts handelt es sich meistens um Schweineklappen, die mit Glutaralde hyd behandelt sind. Schweineklappenprothesen können mit guten Ergebnissen bei älte ren Patienten eingesetzt werden, neigen aber zur Degeneration nach nur ca. 12 bis 15 Jahren, so daß sie für junge Leute in der Regel nicht in Frage kommen. Weiterhin be steht bei Schweineklappenprothesen im Vergleich zum gesunden Herzen eine erhöhte Infektionsgefahr. Darüber hinaus neigen Schweineklappen zur Calcifizierung, weshalb sie zum Einsatz bei Kindern und jungen Leuten, die einen erhöhten Calciumstoffwechsel aufweisen, ungeeignet sind. Schließlich stellen sie ebenfalls körperfremdes Gewebe dar, das mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit vom körpereigenen Immunsystem als fremd erkannt wird und damit lebensbedrohliche Immunprozesse auslösen kann.

Als dritte Möglichkeit stehen Homografts, d. h. aus humanen Spendern isolierte, fixierte Herzklappen, zur Verfügung. Homografts sind zwar gegen Infektionen relativ resistent, stellen jedoch ebenfalls körperfremdes Gewebe dar, das mit einer gewissen Wahr scheinlichkeit Immunreaktionen hervorruft. Darüber hinaus neigen Homografts ebenso wie Schweineklappenprothesen zur Calcifizierung und unterliegen daher einer erhebli chen Degeneration, die in der Regel eine Reoperation nach 7 bis 12 Jahren erforderlich macht. Homografts stellen darüber hinaus in nur äußerst begrenztem Umfang zur Ver fügung.

Neben dem bereits beschriebenen Nachteilen der bisher als Klappenersatz verwende ten Klappenprothesen, d. h. der Auslösung von Immunreaktionen, der erhöhten Infekti onsgefahr, der Gefahr thromboembolischer Prozesse und der Degenerationsneigung, ist allen bisher bekannten Klappen gemeinsam, daß sie aus anorganischem Material oder fixiertem organischen Material bestehen und ihnen daher wichtige Eigenschaften lebender Matrix, z. B. die Fähigkeit zu Reparationsprozessen, zur Rekonfiguration oder zum Wachstum fehlen. Daraus folgt u. a., daß bei kindlichen Klappenpatienten bisher regelmäßig Reoperationen in Kauf genommen werden mußten. Zusätzlich zu dem jeder Herzoperation inhärenten Risiko steigt jedoch mit jeder Reoperation das Letalitätsrisiko, da durch die vorangegangenen Operationen erhebliche Verwachsungen im Thorax auf treten.

Es besteht daher ein dringender Bedarf für einen Herzklappenersatz, der die zuvor be schriebenen Nachteile vermeidet. Zu diesem Zweck ist bereits vorgeschlagen worden, künstliche Herzklappen durch "Tissue Engineering" herzustellen. Das "Tissue Engi neering" befaßt sich mit der Entwicklung "biohybrider" Implantate, die im Körper zu Ge weben oder gar zu ganzen Organsystemen heranwachsen. Zuerst fanden die Techni ken des "Tissue Engineering" im Bereich der Hauttransplantation Anwendung. Inzwi schen hat sich ihre Applikation auf andere Gewebe, wie Leber, Knorpel, Knochen und Trachea sowie intestinale und urologische Gewebe und Blutgefäße erweitert. Auch zur Herstellung biohybrider Herzklappen in Form von einzelnen Klappensegeln sind bereits beschrieben worden; die durch "Tissue Engineering" hergestellten Herzklappensegel hatten jedoch bisher den Nachteil, daß sie inadäquate, nicht ausreichende bindegewe bige Strukturen aufwiesen und daher den im Herzen herrschenden Strömungsverhält nissen nach Auflösung der biodegradablen Trägerstruktur nicht hätten standhalten kön nen.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Herstellen einer künstlichen ho mologen Herzklappe zur Verfügung zu stellen, mit dem Herzklappenprothesen erzeugt werden können, die den in vivo herrschenden Strömungsverhältnissen gewachsen sind.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein in vitro-Verfahren zum Herstellen einer homologen Herzklappe gelöst, das die folgenden Schritte umfaßt:

- Bereitstellen eines biologisch abbaubaren Trägers,
- Besiedeln des Trägers mit homologen Fibroblasten und/oder Myofibroblasten zur Ausbildung einer bindegewebigen Matrix,
- Besiedeln des Trägers/der Matrix mit Endothelzellen
- Einbringen des Trägers/der Matrix in eine pulsatile Flußkammer, in der er/sie steigenden Flußraten ausgesetzt werden kann, und
- kontinuierliches oder diskontinuierliches Erhöhen der Flußrate.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können homologe Herzklappen hergestellt wer den, die auf Grund eines ausgeprägten bindegewebigen Kernes mit naturnahem Kolla gen-, Elastin- und Glycosaminanteil zur Implantation beim menschlichen Patienten ge eignet sind. Das Verfahren soll im folgenden näher erläutert werden.

In der folgenden Beschreibung bedeutet der Terminus "Träger" eine azelluläre Struktur, die, wie unten genauer erläutert wird, entweder aus synthetischen Fasern oder einem azellulären Bindegewebsgerüst besteht. Der Begriff "Matrix" bezeichnet eine bindege webige Struktur, die neben Fibroblasten und Myofibroblasten typische Bestandteile einer Extrazellulärmatrix, nämlich Kollagen, Elastin und Glycosaminoglycane enthält. Mit Ma trix bezeichnete Strukturen enthalten typischerweise keine Trägerbestandteile mehr. Die Übergangsstadien zwischen Träger und Matrix werden durch die Doppelbezeichnung "Träger/Matrix" beschrieben.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zunächst ein biologisch ab baubarer Träger bereitgestellt. Das Trägermaterial soll dabei einerseits eine gewisse Zeitlang stabil sein, um eine ausreichende Besiedlung bzw. Durchdringung mit Fibrobla sten und/oder Myofibroblasten zu ermöglichen und die Ausbildung einer bindegewebi gen Matrix erreichen zu können, andererseits innerhalb einer vertretbaren Zeit, die je denfalls kleiner ist, als die Zeit, die die Bildung der homologen Klappenprothese in An spruch nimmt, insgesamt hydrolytisch aufgelöst werden können. Es ist bevorzugt, daß der hydrolytische Abbau nach ca. 8 Tagen beginnt; er sollte in der Regel nach 4 bis 6 Wochen abgeschlossen sein. Bei dem Trägermaterial handelt es sich bevorzugt um eine aus Polymerfasern aufgebaute Struktur, um eine poröse Polymerstruktur oder ein azelluläres biologisches Gewebe. Beispiele für biologisch abbaubare Trägermaterialien sind Polyglycolsäure (PGA), Polymilchsäure (PLA), Polyhydroxyalkanoat (PHA) und Po ly-4-Hydroxybutyrat (P4HB). Diese Polymere können sowohl rein als auch in Mischun gen aus zwei oder mehreren der genannten Substanzen oder Mischungen dieser Sub stanzen mit weiteren biologisch abbaubaren Polymeren verwendet werden. In einer be vorzugten Ausführungsform wird ein Mischpolymer aus 85% PGA und 15% PLA ver wendet. Idealerweise ist der biologisch abbaubare Träger in der Form der gewünschten Herzklappe vorgeformt. Beispiele für mögliche Herzklappenformen sind in Abb. 1 angegeben.

Es hat sich als sinnvoll erwiesen, Träger mit einer Polymerdichte von ca. 40 bis 120 mg/cm³ zu verwenden. Unterhalb von 40 mg/cm³ ist das Polymergewebe zu labil, über halb von 120 mg/cm³ ist das Gewebe zu dicht, um das Eindringen von Fibroblasten in nerhalb eines vertretbaren Zeitraums zuzulassen. In bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Dichte des biologisch abbaubaren Trägers 50 bis 80 mg/cm³, besonders bevorzugt 70 mg/cm³. Von den Erfindern wurde mit guten Ergebnissen ein polymerer Träger der Fa. Albany International Research, Mensville, MA, USA, mit einer Dichte von ca. 70 mg/cm³ verwendet. Die Fasern des Trägers können einen Durchmesser von 6 bis 20 µm haben, bevorzugt 10 bis 18 µm. Es sind jedoch auch Gewebe mit anderen Faserstärken denkbar, die jedoch einerseits dem Träger eine gewisse Stabilität verlei hen müssen, andererseits die Besiedelung und Durchdringung des Trägers mit Fi broblasten oder Myofibroblasten zulassen müssen. Weiterhin können poröse (schwammartige) Polymerformen verwendet werden. Hier haben sich Porengrößen von 80-240 µm als bevorzugt erwiesen. Die Poren können durch die sogenannte "Salt- Leaching" Technik erzielt werden, die dem Fachmann bekannt ist.

Statt eines synthetischen Trägers, wie zuvor beschrieben, ist die Verwendung eines a zellulären Bindegewebsgerüstes denkbar. So könnte beispielsweise eine Schweine klappe in ein immunologisch neutrales Gewebe umgewandelt werden (Bader et al., Eur. J.-Cardiothorac. Surg. 14, 279, 1998), das anschließend mit homologen Zellen besiedelt werden könnte.

Der biologisch abbaubare Träger wird zunächst mit einer Fibroblastenpopulation inku biert. Bei Verwendung homologer Fibroblasten und/oder Myofibroblasten, d. h. von Fi broblasten und/oder Myofibroblasten aus einem Menschen, aber nicht unbedingt dem Patienten, sollte auf gleiche HLA-Typisierung geachtet werden. Fibroblastenpopulatio nen können dabei z. B. aus peripheren Blutgefäßen, sowohl Arterien als auch Venen, gewonnen werden. Hierzu bietet sich insbesondere die Arteria radiales des Unterarmes an, die wegen der arteriellen Doppelversorgung des Armes in den meisten Fällen zur schadlosen Explantation zur Verfügung steht. Alternativ können Gefäßzellen aus Blut gefäßen des Beines, z. B. der Vena saphena, gewonnen werden. Denkbar ist weiter die Gewinnung von Fibroblasten oder Myofibroblasten aus pluripotenten Stammzellen oder genetisch manipulierten Zellen.

Die Zellen können beispielsweise aus Gefäßfragmenten gewonnen werden, in dem die Gewebestückchen zunächst, wie in Zünd et al. (Eur. J. Cardiothorac Surg. 13, 160, 1998) beschrieben, in Gewebebruchstücke zerstückelt und ca. 1 bis 2 Wochen unter normalen Zellkulturbedingungen (37°C, 5 CO₂, 95% Luftfeuchtigkeit) inkubiert werden, bis die Zellen auf dem Boden der Kulturschale eine konfluente Zellschicht bilden. An schließend werden sie mehrfachen Passagen unterworfen, um eine von restlichem Ge webematerial freie Zellkultur zu erhalten. Nach zwei bis drei Passagen können die ge mischten Zellpopulationen gereinigt werden, in dem sie mit einem für Endothelzellen spezifischen Fluoreszenzmarker (Dil-Ac-LDL, von Medical Technologies Inc., Stoughton, MA) inkubiert werden und mittels Durchflußzytometrie (FACStar Plus, Becton Dickinson) getrennt werden. Fluoreszenzmarkierte Zellen sind Endothelzellen, nicht markierte Zel len sind Fibroblasten und Myofibroblasten. Diese werden weitere zwei bis drei Wochen kultiviert und während dieser Zeit zwei bis vier Passagen unterworfen, um eine ausrei chende Anzahl an Zellen für die anschließende Besiedelung des Trägers zu erhalten.

In den so erhaltenen Fibroblastenkulturen liegen Fibroblasten und Myofibroblasten ge mischt vor. Das Verhältnis beider Populationen schwankt. Es ist bevorzugt, Kulturen zu verwenden, in denen der Fibroblastenanteil überwiegt; besonders bevorzugt ist ein Fi broblastenanteil von mehr als 75%. Eine wie beschrieben gereinigte oder jede andere reine Fibroblasten/Myofibroblastenkultur kann nunmehr zur Besiedelung des Polymer trägers eingesetzt werden. Dazu werden pro Quadratzentimeter des Trägers ca. 10⁵ bis 5 × 10⁸ Fibroblasten und/oder Myofibroblasten eingesetzt. Unter "Oberfläche" ist in die sem Fall nicht die tatsächliche Oberfläche des Polymers, sondern die bei Betrachtung des Trägers von oben in einer Ebene erkennbare Fläche gemeint. Üblicherweise wer den den Fibroblasten 60 bis 90 min. Zeit gegeben, um sich an den Träger anzuheften. Anschließend kann das überstehende Medium entfernt werden und ein weiteres Mal Fibroblastensuspension zugegeben werden. Idealerweise läßt man jedoch zwischen der ersten und zweiten Zugabe von Fibroblastensuspension 2 bis 36 Stunden, bevorzugt 24 Stunden verstreichen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden dem Träger bzw. sich der nach der erstmaligen Fibroblastenzugabe allmählich ausbildenden Matrix weitere 3- bis 14mal, besonders bevorzugt 5- bis 10mal Fibroblasten und/oder Myofibroblasten zugefügt.

Unter den üblicherweise für das Zellwachstum von Fibroblasten verwendeten Bedin gungen (z. B. 5% CO₂, Inkubation bei 37°C, steriles Medium) entwickelt sich nach ca. ein bis drei Wochen eine solide bindegewebige Struktur. Nunmehr wird diese Struktur mit einer reinen Endothelzell-Suspension inkubiert. Die Endothelzellen können genauso wie die Fibroblasten durch FACS angereichert und anschließend in mehreren Passagen (bevorzugt 3) expandiert werden. Auch für Endothelzellen ist es bevorzugt, die Besie delung mit jeweils ca. 10⁵ bis 5 × 10⁸ Endothelzellen mehrfach zu wiederholen, z. B. 3- bis 14mal. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Besiedelung mit Endothelzellen 5- bis 10mal wiederholt. Zwischen zwei Besiedelungsschritten sollten mindestens 60 min., bevorzugt jedoch 2 bis 24 Stunden liegen.

Bei den zum Besiedeln des Trägers verwendeten Zellen handelt es sich bevorzugt um humane Zellen. Besonders bevorzugt ist es jedoch, autologe Fibroblasten und/oder Myofibroblasten sowie Endothelzellen zu verwenden. Dazu wird dem Patienten, dessen Herzklappe ersetzt werden soll, Gewebe z. B. aus einem seiner Gefäße entnommen. Wie oben bereits erwähnt, bieten sich dazu die Arteria radialis sowie die Vena saphena an. Die Verwendung der autologen Zellen zur Konstruktion der Herzklappe hat den we sentlichen Vorteil, daß die Klappe nach Implantation in den Patienten kein körperfrem des Gewebe darstellt und somit Immunreaktionen gegen die künstliche Herzklappe so gut wie ausgeschlossen erscheinen.

Ca. 14 Tage nach Zugabe der Endothelzellen läßt sich histologisch und immunhisto chemisch ein herzklappenanaloges Gewebe mit einem superfiziellen Einzelzellschicht aus Endothelzellen und einer bindegewebigen Grundstruktur nachweisen. Dieses Ge webe ist jedoch zur Implantation in ein menschliches Herz nur bedingt geeignet, da es auf Grund seiner zu schwachen mechanischen Eigenschaften den dort herrschenden Strömungsverhältnissen nicht gewachsen wäre.

Erfindungsgemäß wird nunmehr in einem weiteren Verfahrensschritt die vorgebildete herzklappenanaloge Struktur in eine pulsatile Flußkammer eingebracht, in der sie stei genden Flußraten ausgesetzt werden kann. Es wurde festgestellt, daß durch eine lang same Adaptation der Flußraten die Bildung einer strömungsbeständigen herzklappena nalogen Struktur erreicht werden kann.

Zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens eignet sich ein Bioreaktor. Dieser Bioreaktor sollte möglichst kompakt ausgebildet sein, um in üblichen Zellinkubatoren eingesetzt werden zu können. Der Bioreaktor sollte eine Flußkammer aufweisen, in der das Klappenventil angeordnet ist. Der Antrieb zum Pumpen des Fluids durch die Fluß kammer sollte dabei außerhalb der Flußkammer angeordnet sein. Dies wird bei dem verwendeten Bioreaktor durch eine der Flußkammer benachbarte Luftkammer erzielt, die durch eine hochelastische Membran von der Flußkammer getrennt ist. Durch pulsie rendes Ändern des Luftdrucks in der Luftkammer kann ein Fördern des Fluids durch die Flußkammer erzeugt werden. Anstelle von Luft könnte auch eine Flüssigkeit oder ein anderes Gas in der Luftkammer aufgenommen sein, die dann allgemein auch als An triebsmediumkammer bezeichnet werden kann. Dann müßte dieses Gas oder das darin befindliche Fluid jeweils pulsierenden Druckänderungen unterworfen werden. Luft läßt sich jedoch besonders leicht handhaben und hat sich daher als besonders geeignet für das Betreiben des Bioreaktors erwiesen.

Aufgrund der Luftkammer kann der Antrieb zum Fördern des Fluids in der Flußkammer sehr kompakt gestaltet werden und auch außerhalb des Inkubators angeordnet sein. Es läßt sich dadurch eine Trennung herbeiführen zwischen dem Teil, der unmittelbar auf die Flußkammer wirkt, und dem Teil, der die Druckschwankungen in der Luftkammer, bzw. Antriebsmediumkammer erzeugt. So kann z. B. eine Respiratorpumpe außerhalb des Inkubators angeordnet sein, die über einen dünnen Schlauch mit der Luftkammer, bzw. Antriebsmediumkammer verbunden ist. Dadurch läßt sich die Gestaltung des Bio reaktors und der Antrieb selbst den jeweiligen Einbauerfordernissen anpassen.

Die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete pulsatile Flußkammer ist Be standteil eines Bioreaktors. Eine bevorzugte Ausführungsform des Bioreaktors wird nachfolgend mit Bezug auf die Abb. 2 und 3 detailliert beschrieben. Es versteht sich, daß sowohl der Bioreaktor als auch die ihn umfassende Anordnung nicht nur im erfin dungsgemäßen Verfahren, sondern auch davon unabhängig verwendet werden könn ten.

Es zeigen:

Abb. 2 den Bioreaktor in einer Schnittansicht;

Abb. 3 eine Anordnung zum Betreiben des Bioreaktors aus Abb. 2.

In Abb. 2 ist ein Bioreaktor 1 in einer Schnittansicht dargestellt. Der Bioreaktor ist um die in der Abb. 2 dargestellte vertikale Symmetrieachse im wesentlichen rotationssymme trisch. Es handelt sich bei dem Bioreaktor um einen sogenannten Kompaktbioreaktor, dessen Außendurchmesser in radialer Richtung ca. 15,5 cm und dessen Höhe ca. 16,8 cm beträgt. Der Betrieb kann auch in Standard-Zellinkubatoren erfolgen.

Der Bioreaktor 1 verfügt über ein Gehäuse 2, mit zwei Kammern 3 und 4, die durch ei nen Membran 5 voneinander getrennt sind. Die untere Kammer 3 bildet eine Luftkam mer und die obere Kammer 4 eine Flußkammer, die in zwei Teile unterteilt ist, wobei ein Teil durch einen Fluidkammerabschnitt 6 und der andere Teil durch einen Ventilperfusi onskammerabschnitt 7 gebildet wird. Der Fluidkammerabschnitt 6 und der Ventilperfusi onskammerabschnitt 7 sind über einen Durchgang 8 miteinander verbunden.

Die Kammern kommunizieren mit der Umgebung über Anschlüsse 9, 10 und 11, wobei Anschluß 9 in die Kammer 3, Anschluß 10 in den Fluidkammerabschnitt 6 der Fluß kammer 4 und Anschluß 11 in den Ventilperfusionskammerabschnitt 7 der Flußkammer 4 mündet. Die Anschlüsse 9, 10 und 11 sind jeweils als über das Gehäuse vorstehende Rohrstutzen ausgebildet, auf die Schläuche oder Leitungen in bekannter Weise auf steckbar sind.

Das Gehäuse ist dreiteilig ausgebildet, mit einem unteren Gehäuseteil 12, einem mittle ren Gehäuseteil 13 und einem oberen Gehäuseteil 14. Das untere Gehäuseteil 12 ist im wesentlichen schalenförmig mit einem Boden 15 und einer im wesentlichen ringförmig verlaufenden Wand 16. Die der Wand 16 abgewandte Seite des Bodens bildet gleich zeitig die Auflagefläche für den Bioreaktor, mit der er z. B. auf einem Tisch aufgesetzt werden kann. Der Anschluß 9 erstreckt sich im wesentlichen radial aus der Wand 16 heraus. Die Wand 16 weist eine Flanschfläche 17 auf, in der sich in Axialrichtung er streckende Gewindebohrungen 18 eingelassen sind. Um ein Beobachten der Vorgänge im Innern der Kammer 3 zu erleichtern, ist das untere Gehäuseteil aus durchsichtigem Material, z. B. Plexiglas (Polymethylmetacrylat, PMMA), hergestellt.

Das mittlere Gehäuseteil 13 ist ebenfalls im wesentlichen rotationssymmetrisch um die Symmetrieachse des Bioreaktors und verfügt über eine im wesentlichen zylindrische Wand 19, an die sich ein Deckelabschnitt 20 anschließt, sowie über einen Flansch 21 auf der dem Deckelabschnitt 20 abgewandten Seite der Wand 19. Der Flansch 21 ist im wesentlichen ringförmig mit einer der Flanschfläche 17 zugewandten Flanschfläche 22, die sich radial erstreckt. Im Flansch 21 sind zudem Durchgangsbohrungen 23 vorgese hen, denen jeweils fluchtend eine der Gewindebohrungen 18 zugeordnet ist. Die Durch gangsbohrungen 23 und Gewindebohrungen 18 sind gleichmäßig am Umfang verteilt, wobei die bevorzugte Ausführungsform über neun Gewindebohrungen 18 mit zugehöri gen Durchgangsbohrungen 23 verfügt.

Zwischen den beiden Flanschflächen 17 und 22 befindet sich die Membran 5. Durch die Membran 5 werden die beiden Kammern 3 und 4 voneinander getrennt. Die Membran besteht aus hochelastischem Silikon, das in der Art eines Trommelfells zwischen die Flanschflächen 17 und 22 gespannt ist. Die Membran weist eine Dicke von ca. 0,5 mm auf, und kann dabei so ausgebildet sein, daß im montierten Zustand ihr Außendurch messer im wesentlichen dem Außendurchmesser des unteren und des mittleren Ge häuseteils entspricht. Dann muß die Membran mit Öffnungen im Bereich der Durch gangsbohrungen 23 versehen sein. Um die Membran 5 fest zwischen den Flanschflä chen 17 und 22 einzuspannen, werden durch die Durchgangsbohrungen 23 Schrauben 24 aus rostfreiem Stahl in die Gewindebohrungen 18 eingeschraubt, die sich auch durch die Öffnungen der Membran hindurch erstrecken. Durch die Schrauben 24 werden die Flanschflächen 22 und 17 gegeneinander gedrückt, um dadurch die Membran fest ein zuspannen und eine optimale Dichtheit zu erzielen.

Während des Betriebs des Bioreaktors schwingt die Membran in Axialrichtung. Um die Belastung der Membran am Übergang von der Flanschfläche 17 und 22 zu den zuge ordneten Wänden 16 und 19 zu verringern, sind dort jeweils umlaufende Phasen 25 und 26 vorgesehen.

Der Fluidkammerabschnitt 6 wird somit nach unten durch die Membran 5 und nach oben durch den Deckelabschnitt 20 begrenzt. Um die Reaktionen in dem Fluidkammerab schnitt 6 visuell überwachen zu können, besteht das mittlere Gehäuseteil, wie auch das untere Gehäuseteil aus durchsichtigem Material z. B. Plexiglas.

An das mittlere Gehäuseteil 13 schließt sich das obere Gehäuseteil 14 an. Dieses ist im wesentlichen glockenförmig und über eine Flanschverbindung mit dem mittleren Gehäu seteil verbunden. Für diese Flanschverbindung verfügt das mittlere Gehäuseteil 13 in seinem Deckelabschnitt über sechs Gewindebohrungen 27, die sich in Axialrichtung erstrecken und gleichmäßig am Umfang verteilt sind. Die Gewindebohrungen 27 sind dabei in einer radial verlaufenden Flanschfläche 28 angeordnet, die eine umlaufende Nut 29 zur Aufnahme eines Dichtelements aufweist. Ein solches Dichtelement kann z. B. ein O-Ring sein. Die Nut 29 ist gegenüber den Gewindebohrungen 27 radial nach innen versetzt.

Das obere Gehäuseteil 14 verfügt über einen Flanschring 30 mit Durchgangsbohrungen 31 und einer der Flanschfläche 28 zugewandten Flanschfläche 32. Das obere Gehäu seteil 14 steht mit seiner Flanschfläche 32 auf der Flanschfläche 28 auf und ist über Schrauben 33 aus rostfreiem Stahl, die durch die Durchgangsbohrungen 31 gesteckt und in die Gewindebohrungen 27 jeweils eingeschraubt werden, mit dem mittleren Ge häuseteil 13 fest verbunden. Das Dichtelement wird dabei von der Flanschfläche 32 in die Nut 29 gedrückt und dichtet den Ventilperfusionskammerabschnitt 7 zur Umgebung hin ab. Der Anschluß 11 ist in der Spitze des oberen Gehäuseteils 14 angeordnet. Ana log der beiden anderen Gehäuseteile 12 und 13 besteht das obere Gehäuseteil 14 aus durchsichtigem Material z. B. Plexiglas.

Wie bereits eingangs erwähnt, sind der Fluidkammerabschnitt 6 und der Ventilperfusi onskammerabschnitt 7 über einen Durchgang 8 miteinander verbunden. Dieser Durch gang 8 wird durch eine Durchgangsbohrung 34 im Deckelabschnitt 20 des mittleren Ge häuseteils 13 gebildet. In diese Durchgangsbohrung 34, die sich axial erstreckt, ist ein Rohr 35 eingeschoben, das sich über den Deckelabschnitt 20 hinaus erstreckt. Auf den Rohrabschnitt des Rohrs 35, der sich über den Deckelabschnitt 20 des mittleren Ge häuseteils 13 hinaus erstreckt, ist ein Silikonrohr 36 aufgesteckt. Dieses Silikonrohr ist abnehmbar. Am Außendurchmesser des Silikonrohrs ist eine ringförmige Stufe 37 vor gesehen. Durch die Gestaltung des Silikonrohrs 36 und der Stufe 37 ist es möglich, Ventile auf das Silikonrohr 36 aufzustecken. Auch ist es möglich, in das Silikonrohr 36 Ventile oder Filter einzustecken, da das Rohr 35 einen kleineren Innendurchmesser als das Silikonrohr 36 aufweist oder dadurch die Stirnseite des Rohrs 35 eine Anlagefläche für einen Filter oder dergleichen bilden kann. Im vorliegenden Fall ist das Ventil ein nicht näher dargestelltes 2-segeliges oder 3-segeliges Klappenventil, das dem oben be schriebenen Träger, bzw. der Matrix entspricht, und als Rückschlagventil arbeitet, um einen Fluidstrom nur von dem Fluidkammerabschnitt zu dem Ventilperfusionskam merabschnitt zu ermöglichen. Das Klappenkonstrukt des Klappenventils ist auf einen Silikonring eingenäht. Zum Befestigen des Klappenventils am Silikonrohr wird der Sili konring auf das Silikonrohr gesteckt und durch Reibschluß gehalten.

An der Unterseite des Deckelabschnitts ist eine ringförmige Vertiefung 38 vorgesehen, die konzentrisch zum Rohr 35 verläuft und in die das Rohr 35 mündet. Diese Vertiefung 38 kann z. B. als Aufnahme für Filtermaterialien oder dergleichen dienen.

Im weiteren wird eine Bioreaktoranordnung mit dem oben beschriebenen Bioreaktor 1 beschrieben. Zum Betreiben des Bioreaktors ist eine Respiratiorpumpe 39 vorgesehen, die über einen Silikonschlauch 40 und den Anschluß 9 mit der Kammer 3 verbunden ist. Die Respiratorpumpe erzeugt einstellbare Druckimpulse, durch die der Druck der Kam mer periodisch erhöht werden kann. Die Respiratorpumpe ist eine gesteuerte Zweipha sen Respiratorpumpe, die als Luftpumpe funktioniert. Mit der Pumpe kann das Pump volumen und die Pumpfrequenz eingestellt werden, wobei der Fluß in einem Bereich von 50 ml pro Minute bis 5000 ml pro Minute liegt, und der Systemdruck zwischen 20 und 240 mmHg variieren kann.

Ein Reservoir 41 ist über Silikonschläuche 42 und 43 jeweils mit den Anschlüssen 10 und 11 verbunden. Durch die Silikonschläuche 42 und 43 und das Reservoir 41 entsteht ein Kreislauf, wobei Fluid aus den Ventilperfusionskammerabschnitt 7 über den An schluß 10, den Silikonschlauch 42 in das Reservoir 41 und von dort aus über den Sili konschlauch 43 und den Anschluß 10 in den Fluidkammerabschnitt 6 gefördert werden kann.

Der Bioreaktor 1 und das Reservoir 41 mit den Silikonschläuchen 42 und 43 befinden sich in einem standardisierten Inkubator 44 bei 37°C und 5% CO₂.

Nachfolgend wird die Wirkungs- und Funktionsweise des Bioreaktors näher erläutert:
Über die Respiratorpumpe 39 werden Druckimpulse in die Kammer 3 geleitet. Aufgrund dieser Druckimpulse dehnt sich die Membran 5 aus, wobei sie sich in der Darstellung in Abb. 2 mit jedem Druckimpuls nach oben wölbt und dabei auch zu einem Druckanstieg in dem Fluidkammerabschnitt 6 der Flußkammer 4 führt. Dieser Druckanstieg wird in den Durchgang 8 weitergeleitet und öffnet dadurch das nicht näher dargestellte Klap penventil am Silikonrohr 36. Auf diese Weise wird das im Fluidkammerabschnitt 6 vor handene Fluid in den Ventilperfusionskammerabschnitt 7 gefördert. Aus den Ventilper fusionskammerabschnitt 7 wird Fluid dann über den Anschluß 11 und den Silikon schlauch 42 in das Reservoir 11 gefördert. Von dort aus kann es über den Silikon schlauch 43 in den Fluidkammerabschnitt 6 zurückgefördert werden. Bei abfallendem Druck in der Kammer 3 wird die Membran 5 wieder aufgrund ihrer Eigenspannung in ihre Ausgangsstellung rücküberführt, in welcher sie sich im wesentlichen radial erstreckt. Durch den Druckabfall erfolgt auch in dem Fluidkammerabschnitt 6 ein Druckabfall, der wiederum zu einem Schließen des als Klappenventils ausgebildeten Ventils führt.

Durch den pulsierenden Druckanstieg in der Kammer kann somit ein Kreislauf erzeugt werden, der im wesentlichen die physiologischen Flußbedingungen im Herzen simuliert. Aufgrund der Konstruktion des neuartigen Bioreaktors wird eine hohe Dichtigkeit des Fluidkammerabschnitts 6 und des Ventilperfusionskammerabschnitts 7 erreicht. Auf grund des dadurch möglichen Schutzes vor Infektionen können lange Kultivierzeiten ermöglicht werden. Durch den Antrieb mit Luft über die Kammer 3, die durch die Mem bran 5 hermetisch von der Fluidkammer 6 getrennt ist, lassen sich die Probleme von Hitzeentwicklungen innerhalb des Inkubators 44 vermeiden, da der eigentliche Pump motor (Respiratorpumpe) sich außerhalb des Zellinkubators befindet.

Da der gesamte Bioreaktor transparent ist, kann man die Klappenkonstruktion perma nent einsehen und das Öffnen und Schließen der Klappen kontrollieren. Weiterhin kann man an der Färbung der Nährflüssigkeit pH-Veränderungen erkennen. Das Reservoir mit dem Fluid kann durch sterile Konnektoren an die Silikonschläuche angeschlossen werden. Dadurch läßt sich ein sicherer Fluidwechsel ermöglichen.

Aufgrund der einfachen Konstruktion des Bioreaktors kann ein Austausch der Ventile bzw. der Herzklappen auf einfache Weise durchgeführt werden. Dazu müssen nur die Schrauben 33 gelöst und das obere Gehäuseteil 14 abgenommen werden. Das Ventil bzw. die Herzklappe kann dann ausgetauscht werden und anschließend kann das obe re Gehäuseteil 14 durch die Schrauben 33 wieder am mittleren Gehäuseteil befestigt werden.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden Flußraten zwischen 50 ml/min. und 5000 ml/min., bevorzugt 50 ml/min. bis 2000 ml/min verwendet. Die Angaben beziehen sich auf den Fluß durch die Klappenprothese. Als anfängliche Flußrate haben sich Fluß raten von 50 bis 100 ml/min. als geeignet erwiesen. Diese Flußraten werden z. B. mit einer Pulsfrequenz von 5 bis 10 Pulsen pro Minute durch die Herzklappe geschickt. Die Flußrate wird anschließend kontinuierlich oder diskontinuierlich auf bis zu 5000 ml/min. gesteigert. Gleichzeitig wird die Pulsfrequenz auf bis zu 180 Pulse/min. angehoben. Bei den angegebenen Daten handelt es sich um die Grenzwerte, die normalerweise nicht überschritten werden.

In bevorzugten Ausführungsformen wird die Flußrate bis auf 2000 ml/min. gesteigert, während die Pulsfrequenz auf 70 bis 100, bevorzugt 80 Pulse/min. angehoben wird. Die Belastung der sich stabilisierenden Herzklappe wird damit nahezu physiologischen Ver hältnissen angepaßt. Es hat sich als günstig, aber nicht notwendig erwiesen, die Fluß rate und die Pulsfrequenz jeweils nach ca. 24 bis 48 Stunden zu steigern. So kann bei spielsweise, ausgehend von einer Flußrate von 50 bis 100 ml/min. und einer Pulsrate von 5 bis 10 Pulsen/min. am Tag 1 des Aufenthaltes in der pulsatilen Flußkammer, am Tag 3 eine Erhöhung auf 300 ml/min. bei 20 bis 25 Pulsen/min., am Tag 5 auf 700 ml/min. und 35 bis 45 Pulsen/min., am Tag 7 auf 1000 ml/min und 50 bis 60 Pulsen/min., am Tag 9 auf 1300 ml/min. und 70 bis 80 Pulsen/min., am Tag 11 auf 1500 ml/min. und ca. 100 Pulsen/min., am Tag 13 auf 1750 ml/min. und ca. 120 Pulsen/min. und am Tag 15 auf 2000 ml/min. und 140 Pulsen/min. vorgesehen werden. Je nach zur Verfügung stehender Zeit, Größe der Klappe, Größe und Alter des Patienten etc. kann jedoch eine sehr viel langsamere Steigerung der Flußraten sowie der Pulsfrequenz oder die Steige rung auf höhere Flußraten und Pulsfrequenzen sinnvoll sein.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden die in der pulsatilen Flußkammer herr schenden systemischen Drücke auf 10 bis 240 mmHg eingestellt. Bevorzugt sind sy stemische Drücke von 60 bis 140 besonders bevorzugt sind systemische Drücke von 80 bis 120 mmHg.

Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte homologe bzw. autologe Herzklappe weist gegenüber den herkömmlichen mechanischen und biologischen Herzklappen wesentliche Vorteile auf. So besteht sie in ihrer bevorzugten Ausfüh rungsform aus autologen Gewebe, d. h. aus Gewebe des zur Herzklappenoperation an stehenden Patienten, und vermeidet dadurch jede Fremdkörperreaktion des Klap penempfängers. Die Infektionsgefahr bei Empfängern autologer Herzklappen unter scheidet sich nicht von der eines gesunden Herzens. Eine Antikoagolationstherapie ist nicht erforderlich; damit entfällt die Gefahr hemorrhagischer Komplikationen. Der bei weitem überzeugendste Vorteil der erfindungsgemäßen Herzklappe ist jedoch die Tat sache, daß sie lebendes Gewebe darstellt und daher nach Implantation bei Wachstum des Herzklappenempfängers mitwächst. Das macht die erfindungsgemäße Herzklappe zur Klappe der Wahl vor allem bei Kindern und jugendlichen Patienten, deren Herz sich entwicklungsbedingt noch vergrößert. Die lebende Herzklappe wächst entsprechend mit, so daß auch bei Veränderungen des Herzens keine Dysproportionen (z. B. Veren gungen) zwischen Klappe und Herz auftreten.

Die erfindungsgemäße Herzklappe enthält eine bindegewebige innere Struktur, die ne ben Fibroblasten und Myofibroblasten im wesentlichen Bestandteile einer normalen ex trazellulären Matrix, nämlich Kollagen, Elastin und Glycosaminoglykane enthält. Im Ge gensatz zu früheren Versuchen, durch "Tissue Engineering" Herzklappengewebe her zustellen, weisen die erfindungsgemäßen Klappen einen der nativen Klappe bzw. dem nativen Klappensegel entsprechenden Anteil an Kollagen (43-55%), Elastin (11-13%) und Glycosaminoglycan auf.

Es konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Herzklappen Flußraten von mehr als 2000 ml/min., entsprechend den in einem erwachsenen Humanherzen herr schenden Flußverhältnissen, standhalten. Somit kann erfindungsgemäß erstmals eine autologe Herzklappe zur Verfügung gestellt werden, die bedingungslos zur Implantation in kindliche wie auch erwachsene Patienten geeignet ist.

Die folgenden Abbildungen und Beispiele erläutern die Erfindung.

Abb. 1a zeigt einen aus einem Polymer vorgebildeten Träger, der anschließend einer Besiedlung mit Fibroblasten/Myofibroblasten und Endothelzellen unterworfen wird. Abb. 1b zeigt den Träger/die Matrix nach Besiedelung und einer Woche Inkubati on in der pulsatilen Flußkammer, Abb. 1c zeigt die gleiche Klappenprothese nach 2 Wo chen Inkubation in der Flußkammer.

Abb. 2 zeigt einen Bioreaktor einschließlich einer pulsatilen Flußkammer in Schnittansicht.

Abb. 3 zeigt den Gesamtaufbau, in den der Bioreaktor integriert ist.

Beispiel 1 Herstellung von Trägern

Zum Herstellen des herzklappenförmigen Trägers wird ein nicht-gewebtes Polyglycol säurepolymer (Fiberdurchmesser 12-15 µm, Polymerdichte: 70 mg/ml, Albany Interna tional Research, Mansfield MA, USA) verwendet. Das Polymer wird in der Art zuge schnitten, daß es eine Röhre mit 19 mm Durchmesser bildet. In diesen Conduit werden 3 dreieckige Segel eingenäht. Dieser Träger kann zum Herstellen von 3-segeligen Klappen, d. h. Pulmonal- Aorten- und Tricuspidalklappen verwendet werden. Für Mitralklappen werden 2 Segel eingenäht.

Beispiel 2 Herstellung einer dreisegeligen Herzklappenprothese

Ein dreisegeliger Träger wird sterilisiert und in Medium (DMEM, GIBCO BRL-Life Tech nologies) für 24 Stunden eingelegt, um die Polymeroberfläche einzuweichen. Daraufhin wird der klappenförmige Träger pro Quadratzentimeter Oberfläche mit 4 Mio. Fibrobla sten alle 90 Minuten insgesamt 6mal besiedelt. Weiterhin wird der besiedelte Träger für 2 Wochen inkubiert (5% CO₂, 37°C, 95% Luftfeuchtigkeit). Das Medium wird alle 4 Tage unter sterilen Bedingungen gewechselt. Anschließend werden Endothelzellen auf den besiedelten klappenförmigen Träger aufgebracht (3-4 Mio. Endothelzellen pro Quadratzentimeter Oberfläche, 6 Besiedlungen alle 90 Minuten). Nach weiteren 2 Wo chen wird das entstandene Gewebe in die Flußkammer der Bioreaktors unter sterilen Kautelen eingebracht und hier mittels des Silikonringes in Durchflußposition installiert. Anschließend wird der Bioreaktor mit Medium gefüllt und in den Zellinkubator gestellt. Nachdem über den Druckluftschlauch die Konnektion zur außerhalb des Inkubators ste henden Pumpe hergestellt wurde, wird mit minimalen pulsatilen Flüssen begonnen (50 ml/min). In 2 Tages-Schritten wird die Flußrate und Pulsrate gesteigert auf 100 ml/min (Puls 10), 300 ml (Puls 25), 700 ml (Puls 35), 1000 ml (Puls 60) für insgesamt weitere 4 Tage. Anschließend (nach 14 Tagen) wird das nun gebildete Gewebe unter sterilen Be dingungen entnommen und zur biochemischen, histologischen und mechanischen Analyse asserviert.

Claims

1. In vitro-Verfahren zum Herstellen einer homologen Herzklappe, umfassend die fol genden Schritte:

- Bereitstellen eines biologisch abbaubaren Trägers,
- Besiedeln des Trägers mit homologen Fibroblasten und/oder Myofibroblasten zur Ausbildung einer bindegewebigen Matrix,
- Besiedeln des Trägers/der Matrix mit Endothelzellen,
- Einbringen des Trägers/der Matrix in eine pulsatile Flußkammer, in der er/sie steigenden Flußraten ausgesetzt werden kann, und
- kontinuierliches oder diskontinuierliches Erhöhen der Flußrate.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der biologisch abbauba re Träger eine biologisch abbaubare Polymermatix oder eine azelluläre biologische Matrix ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger eine Polyglycolsäure (PGA), Polymilchsäure (PLA), Polyhydroxyalkanoad (PHA), Poly-4-Hydroxybutyrat (P4HB) oder eine Mischung aus zwei oder mehreren dieser Polymere umfaßt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der biologisch abbaubare Träger in Form einer Herzklappe vorgebildet ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger eine Polymerdichte von 40 bis 120 mg/cm³, bevorzugt 50 bis 80 mg/cm³ aufweist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein poröses Polymer mit einer Porengröße von 80 bis 240 µm ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Fasern des Trägers einen Durchmesser von 6 bis 20 µm, bevorzugt 10 bis 18 µm aufweisen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein Bindegewebsgerüst einer Tier-Herzklappe ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Besiedelns mit Fibroblasten und/oder Myofibroblasten 3- bis 14mal, be vorzugt 5- bis 10mal wiederholt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß pro Quadratzentimeter Träger/Matrix und Besiedelungsschritt ca. 10⁵ bis 5 × 10⁶ Fi broblasten und/oder Myofibroblasten eingesetzt werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt des Besiedelns mit Endothelzellen 3- bis 14mal, bevorzugt 5- bis 10mal wie derholt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß pro Quadratzentimeter Träger/Matrix und Besiedelungsschritt ca. 10⁵ bis 5 × 10⁶ En dothelzellen eingesetzt werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten und/oder Myofibroblasten und/oder Endothelzellen humane Zellen sind.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten und/oder Myofibroblasten und/oder Endothelzellen autologe Zellen sind.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß in der pulsatilen Flußkammer Flußraten von 50 ml/min bis 5000 ml/min, bevorzugt 50 bis 2000 ml/min eingestellt werden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Flußrate über einen Zeitraum von 1 Woche bis 12 Wochen gesteigert wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die anfängliche Flußrate 50 bis 100 ml/min beträgt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die anfängliche Pulsfrequenz 5 bis 10 Pulse/min beträgt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Flußrate bis auf 5000 ml/min gesteigert wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Pulsfrequenz bis auf 180 Pulse/min gesteigert wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß in der pulsatilen Flußkammer systemische Drücke von 10 bis 240 mmHg eingestellt wer den.

22. Homologe Herzklappe, herstellbar durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21.

23. Homologe Herzklappe mit einem bindegewebigen inneren Kern, der von einer En dothelzellschicht umgeben ist, dadurch gekennzeichnet, daß in dem bindegewebi gen Kern eine Kollagendichte von 43 bis 55%, bezogen auf die Matrix, gegeben ist.

24. Homologe Herzklappe nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie den Strömungsbedingungen im menschlichen Herzen standhält.