DE19909146A1

DE19909146A1 - Process for the targeted biological synthesis of peptides

Info

Publication number: DE19909146A1
Application number: DE19909146A
Authority: DE
Inventors: Mohamed A Marahiel; Torsten Stachelhaus; Henning Mootz; Dirk Konz
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-03-03
Filing date: 1999-03-03
Publication date: 2000-09-28
Also published as: JP2002537806A; CN1342201A; EP1159416A1; AU3425700A; WO2000052152A1; IL145004A0; CA2364569A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten nicht-ribosomalen Synthese von Peptiden einer vorbestimmten Struktur unter Verwendung gentechnisch veränderter nicht-ribosomaler Peptidsynthetasen, die verwendeten gentechnisch veränderten nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen und die damit synthetisierten "Designer"-Peptide.The present invention relates to a method for the targeted non-ribosomal synthesis of peptides of a predetermined structure using genetically modified non-ribosomal peptide synthetases, the genetically modified non-ribosomal peptide synthetases used and the "designer" peptides synthesized therewith.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten nicht-ribosomalen Synthese von Peptiden einer vorherbestimmten Struktur unter Verwendung gentechnisch veränderter nicht- ribosomaler Peptidsynthetasen, die verwendeten gentechnisch veränderten nicht-ribosomalen Peptidsynthetasen und die damit synthetisierten "Designer"-Peptide.The present invention relates to a method for the targeted non-ribosomal synthesis of Peptides of a predetermined structure using genetically modified non- ribosomal peptide synthetases, the genetically modified non-ribosomal used Peptide synthetases and the "designer" peptides synthesized with them.

Nichtribosomale Peptide (NRP) repräsentieren eine große Gruppe von komplexen Metaboliten, die an großen multifunktionellen Enzymen, den sogenannten nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) produziert werden. Diese nichtribosomalen Peptide bestehen in der Regel aus 2 bis 48 Resten und weisen eine enorme strukturelle Vielfalt auf, die sich in erster Linie aus der Fähigkeit ihrer NRPS-Matrize erklärt, neben den 20 proteinogenen Aminosäuren auch eine Vielzahl ungewöhnlicher Reste in die Peptidkette einzubauen [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651- 2673]. Derzeit sind bereits über 300 verschiedene, derartige Substrate identifiziert worden. Hierzu zählen z. B. Pseudo-, N-methylierte und D-konfigurierte Aminosäuren sowie auch Carboxy- oder β-Hydroxysäuren. Untereinander sind die einzelnen Reste über Peptidbindungen oder die Bildung von Estern und Lactonen verknüpft. Darüber hinaus treten in der Substanzklasse der nichtribosomal synthetisierten Peptide aber auch Variationen bezüglich der Peptidhauptkette auf. So findet man neben linearen auch zyklische und verzweigt-zyklische Peptide, die durch Acylierungen, Glykosylierungen und die Ausbildung von heterozyklischen Strukturmerkmalen zusätzlich modifiziert sein können. Viele der nichtribosomal synthetisierten Peptide weisen interessante physikochemische oder pharmakologische Eigenschaften auf, so daß einige dieser Verbindungen z. B. als Biotenside, Siderophore, Antibiotika, Cytostatika, Immunsuppressiva oder Antitumorwirkstoffe Anwendung finden.Non-tribosomal peptides (NRP) represent a large group of complex metabolites, on large multifunctional enzymes, the so-called non-tribosomal peptide synthetases (NRPS) are produced. These non-tribosomal peptides usually consist of 2 to 48 Remnants and have an enormous structural diversity, which is primarily due to the ability their NRPS matrix explains, in addition to the 20 proteinogenic amino acids, a large number to incorporate unusual residues into the peptide chain [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651- 2673]. Over 300 different substrates of this type have already been identified. For this count z. B. pseudo, N-methylated and D-configured amino acids as well as carboxy or β-hydroxy acids. The individual residues are among one another via peptide bonds or Formation of esters and lactones linked. In addition, the substance class of non-tribosomally synthesized peptides but also variations in the main peptide chain. In addition to linear, cyclic and branched-cyclic peptides can also be found through Acylations, glycosylations and the formation of heterocyclic structural features can also be modified. Many of the non-tribosomally synthesized peptides have interesting physicochemical or pharmacological properties, so some of these Connections z. B. as biosurfactants, siderophores, antibiotics, cytostatics, immunosuppressants or Antitumor agents find application.

Es wurden bereits Verfahren zur Synthese von NRPs unter Verwendung von NRPS beschrieben (EP-A 0 789 078). Die beschriebenen Verfahren waren allerdings für eine gezielte gewerbliche Anwendung noch nicht geeignet, vor allem, da die Struktur der synthetisierten Peptide nicht im nötigen Ausmaß zielgerichtet beeinflußt werden konnte.Methods for synthesizing NRPs using NRPS have been described (EP-A 0 789 078). However, the procedures described were for a targeted commercial Not yet suitable for use, especially since the structure of the synthesized peptides is not in the necessary extent could be influenced in a targeted manner.

Die meisten nichtribosomal synthetisierten Peptide besitzen einen einheitlichen Biosynthese- Mechanismus, der durch große multimodulare NRPS vermittelt wird. Jedes Modul repräsentiert hierbei per definitionem eine Einheit, die für die Erkennung, Aktivierung, kovalente Bindung und Inkorporation einer spezifischen Aminosäure in das synthetisierte Peptidprodukt verantwortlich ist. Anhand intensiver molekulargenetischer und biochemischer Analysen konnte gezeigt werden, daß derartige Module ihrerseits aus einzelnen, funktionell aktiven Domänen aufgebaut sind, die spezifische Reaktionen der nichtribosomalen Peptidsynthese katalysieren [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651-2673]. Eine Adenylierungs-(A)-Domäne z. B. erkennt und aktiviert ihre kognate Substrat-Aminosäure als Enzym-assoziiertes Aminoacyladenylat unter gleichzeitiger ATP-Hydrolyse. Diese relativ instabilen Intermediate werden anschließend durch die Übertragung auf die Thiolgruppe eines kovalent mit einer Thiolierungs-(T)-Domäne verknüpften 4'-Phosphopantethein-Kofaktors (4'-PAN) stabilisiert. Unter Beteiligung von Kondensations- (C)-Domänen findet dann, in einer geordneten Folge von Transpeptidierungen der so aktivierten Aminosäuren, ein sukzessives Kettenwachstum bis hin zum fertigen Peptidprodukt statt. Durch eine Modifikation der eingebauten Monomere (z. B. Epimerisierung oder N-Methylierung) bzw. der Peptidhauptkette (z. B. Acylierung oder Glycosylierung) kann die Struktur der gebildeten Produkte zusätzlich verändert werden. Derartige Funktionalisierungen werden durch spezielle Domänen oder Polyketidsynthase-(PKS)-Module innerhalb der NRPS-Matrize katalysiert.Most non-tribosomally synthesized peptides have a uniform biosynthetic Mechanism mediated by large multimodular NRPS. Each module represents here by definition a unit that is responsible for recognition, activation, covalent binding and Incorporation of a specific amino acid into the synthesized peptide product is. On the basis of intensive molecular genetic and biochemical analyzes, it was possible to show that such modules are in turn made up of individual, functionally active domains that catalyze specific reactions of non-tribosomal peptide synthesis [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651-2673]. An adenylation (A) domain e.g. B. recognizes and activates their cognate substrate amino acid as enzyme-associated amino acyl adenylate with simultaneous ATP hydrolysis. These relatively unstable intermediates are then replaced by the Transfer to the thiol group of a covalently linked to a thiolation (T) domain 4'-Phosphopantethein cofactor (4'-PAN) stabilized. With the participation of condensation (C) domains are then found, in an ordered sequence of transpeptidations, of the activated ones Amino acids, a successive chain growth up to the finished peptide product instead. By a modification of the built-in monomers (e.g. epimerization or N-methylation) or of the main peptide chain (e.g. acylation or glycosylation) can be the structure of the formed Products are changed additionally. Such functionalizations are achieved through special Domains or polyketide synthase (PKS) modules catalyzed within the NRPS template.

Es konnte gezeigt werden, daß A-Domänen über ihre Substratspezifität und relative Abfolge innerhalb eines spezifischen NRPS-Systems die Primärstruktur (Sequenz) des gebildeten nichtribosomalen Peptides bestimmen. Durch die Auflösung der Kristallstruktur von zwei Mitgliedern der Superfamilie der Adenylat-bildenden Enzyme, hierbei handelte es sich um die Luciferase aus Photinus pyralis [Conti et al., 1996, Structure 4: 287-298] und die A-Domäne der Gramicidin S-Synthetase 1. (nachfolgend mit PheA bezeichnet) aus Bacillus brevis [Conti et al., 1997, EMBO J. 16: 4174-4183], konnte gezeigt werden, daß, obwohl beide Enzyme nur 16% Identität bezüglich ihrer Primärstruktur besitzen, sie eine ausgesprochen homologe Faltungstopologie aufweisen. Die Struktur von PheA (Abb. 1A), die in Gegenwart ihrer Substrate ATP und Phenylalanin determiniert wurde, gestattete erste Einblicke in die molekularen Mechanismen der Substraterkennung und -aktivierung.It could be shown that A domains determine the primary structure (sequence) of the non-tribosomal peptide formed via their substrate specificity and relative sequence within a specific NRPS system. Due to the resolution of the crystal structure of two members of the superfamily of adenylate-forming enzymes, this was the luciferase from Photinus pyralis [Conti et al., 1996, Structure 4: 287-298] and the A domain of the gramicidin S- Synthetase 1. (hereinafter referred to as PheA) from Bacillus brevis [Conti et al., 1997, EMBO J. 16: 4174-4183], could be shown that, although both enzymes have only 16% identity with regard to their primary structure, they have one have a very homologous folding topology. The structure of PheA ( Fig. 1A), which was determined in the presence of its substrates ATP and phenylalanine, gave first insights into the molecular mechanisms of substrate recognition and activation.

Durch Sequenzvergleiche von NRPS-A-Domänen wurden hochkonservierte Sequenzbereiche, die sogenannten Core-Motive identifiziert, die innerhalb der A-Domänen mit nahezu unveränderter Lokalisation und Aminosäure-Abfolge auftreten. Durch frühere Mutationsanalysen und nun auch durch die Kristallstruktur von PheA konnte gezeigt werden, daß die überwiegende Mehrheit dieser Core-Sequenzen essentiell an der ATP-Bindung und -Hydrolyse beteiligt sind. Darüber hinaus üben einige Core-Motive aber auch Funktionen bei der Bindung der Substrat-Aminosäure aus. So werden z. B. die α-Aminogruppe und α-Carboxygruppe der Substrat-Aminosäure L- Phenylalanin in PheA durch die Reste Asp235 (Core A4) bzw. Lys517 (Core A10) elektrostatisch koordiniert [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651-2673]. Die eigentliche Substratspezifität-vermittelnde Region von PheA befindet sich dagegen in einem ca. 100 Aminosäure-langen Bereich, der innerhalb der Gruppe der A-Domänen eine reduzierte Konservierung aufweist. Diese Region bildet die Bindungstasche für die Seitenkette des Phenylalanin-Substrates aus (Abb. 1B), die auf der einen Seite durch die Reste Ala236, Ile330 und Cys331, sowie auf der anderen Seite durch die Reste Ala322, Ala301, Ile299 und Thr278 aufgebaut wird. Beide Seiten der Tasche sind durch den Indolring des Trp239, der sich am Boden der Tasche befindet, getrennt.Sequence comparisons of NRPS-A domains identified highly conserved sequence areas, the so-called core motifs, which occur within the A domains with almost unchanged localization and amino acid sequence. Previous mutation analyzes and now also the crystal structure of PheA have shown that the vast majority of these core sequences are essentially involved in ATP binding and hydrolysis. In addition, some core motifs also have functions in binding the substrate amino acid. So z. B. the α-amino group and α-carboxy group of the substrate amino acid L-phenylalanine in PheA by the residues Asp235 (Core A4) and Lys517 (Core A10) coordinated electrostatically [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651-2673]. The actual substrate specificity-mediating region of PheA, on the other hand, is located in an approximately 100 amino acid-long region which has a reduced conservation within the group of the A domains. This region forms the binding pocket for the side chain of the phenylalanine substrate ( Fig. 1B), which is built up on one side by the residues Ala236, Ile330 and Cys331, and on the other side by the residues Ala322, Ala301, Ile299 and Thr278 . Both sides of the bag are separated by the indole ring of the Trp239, which is located on the bottom of the bag.

Aus früheren in silico (Computersimulationen) Studien an NRPS-A-Domänen konnte geschlossen werden, daß der Substratspezifität-determinierende Bereich von A-Domänen vermutlich zwischen den Core-Motiven A3 und A6 lokalisiert ist. Diese Region weist eine vergleichsweise reduzierte Konservierung auf, wohingegen jedoch für Domänen gleicher Substratspezifität eine erhöhte Homologiebeziehung postuliert wurde. Dementsprechend sollten Domänen die gleiche Substrate aktivieren in phylogenetischen Bäumen gruppiert auftreten. In detaillierten Analysen ließen sich derartige Korrelationen jedoch nicht verifizieren. Vielmehr zeigte sich, daß der evolutionäre Ursprung (Wirtsorganismus) der A-Domänen einen größeren Einfluß auf deren Bündelung ausübte als ihre Substratspezifität.From previous studies in silico (computer simulations) on NRPS-A domains conclude that the substrate specificity-determining range of A domains is probably located between the core motifs A3 and A6. This region has one comparatively reduced conservation, whereas for domains the same An increased homology relationship was postulated for substrate specificity. Accordingly, should Domains that activate the same substrates occur in phylogenetic trees grouped together. In such correlations could not be verified in detailed analyzes. Much more showed that the evolutionary origin (host organism) of the A domains is larger Influence on their pooling exerted as their substrate specificity.

Zur Ableitung der Konsensus-Sequenzen ermittelten wir über Sequenzvergleiche mit PheA und Luciferase die korrespondierenden zehn Reste der putativen Bindungstaschen von 160 in öffentlichen Sequenz-Datenbanken zugänglichen A-Domänen. Nachfolgend wurden für jede A- Domäne nur diese zehn Reste als eigenständige Aminosäure-Sequenz verwendet, um Alignments und phylogenetische Untersuchungen mit dem Programm MegAlign von Lasergene durchzuführen. Mittels dieser Untersuchungen wurde ein phylogenetischer Stammbaum erhalten (Abb. 2), in dem sich eine Gruppierung der 10 Aminosäure-großen Sequenzen, gemäß der Spezifität ihrer Herkunftsdomänen offenbart. Dieses Ergebnis gibt einen eindeutigen Hinweis darauf, daß die ausgewählten Reste tatsächlich in die Substraterkennung involviert sind. Basierend auf diesen Untersuchungen können Diskrepanzen zwischen postulierten und beobachteten Substratspezifitäten von A-Domänen erklärt und die Spezifitäten von NRPS- Systemen vorhergesagt werden.To derive the consensus sequences, we determined the corresponding ten residues of the putative binding pockets of 160 A domains accessible in public sequence databases by means of sequence comparisons with PheA and luciferase. Subsequently, only these ten residues were used as a separate amino acid sequence for each A domain in order to carry out alignments and phylogenetic studies using the MegAlign program from Lasergene. A phylogenetic family tree was obtained from these investigations ( Fig. 2), in which a grouping of the 10 amino acid sequences according to the specificity of their domains of origin is revealed. This result gives a clear indication that the selected residues are actually involved in the substrate recognition. Based on these investigations, discrepancies between postulated and observed substrate specificities of A domains can be explained and the specificities of NRPS systems can be predicted.

Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand daher darin, ein einfaches, auch technisch anwendbares Verfahren zu finden, mit Hilfe dessen definierte Peptide zielgerichtet synthetisiert werden können.The object underlying the present invention was therefore to provide a simple, to find technically applicable processes with the help of which defined peptides are targeted can be synthesized.

Überraschenderweise konnten wir aus den phylogenetischen Studien Konsensus-Sequenzen ableiten, die in gewisser Weise als der nichtribosomale Kode der NRPS zu verstehen sind (Tabelle 1). Ähnlich wie der ribosomale Kode scheint auch dieser Kode degeneriert zu sein, und es konnten bisher z. B. vier verschiedene Kodone für Leu-aktivierende Domänen, drei Kodone für Val- und zwei für Cys-aktivierende Domänen identifiziert werden. Es kann davon ausgegangen werden, daß auch für andere Substrate mehrere Strategien zur Substraterkennung existieren, die mit Hilfe des erfinderischen Verfahrens bestimmt werden können. Surprisingly, we were able to draw consensus sequences from the phylogenetic studies derive, which in a way are to be understood as the non-tribosomal code of the NRPS (Table 1). Similar to the ribosomal code, this code also appears to be degenerate, and so far, z. B. four different codons for Leu-activating domains, three codons for Val and two for Cys-activating domains can be identified. It can be assumed that there are several substrate detection strategies for other substrates, too can be determined using the inventive method.

Anhand der durch Sequenzvergleiche ermittelten Kodone kann das generelle Erscheinungsbild von Substrat-Bindungstaschen vorhergesagt werden. Als Beispiele sind in Abb. 3 die putativen Bindungstaschen für die Substrat-Aminosäuren Asp, Orn und Val dargestellt. Während Asp235 und Lys517 in allen A-Domänen Schlüssel-Wechselwirkungen mit der Amino- und Carboxygruppe des Substrates vermitteln und daher hochkonserviert sind, wird von den übrigen Resten angenommen, daß sie maßgeblich die Spezifität für eine bestimmte Aminosäure- Seitenkette determinieren. Die entsprechenden Reste (Pos. 236 bis 331) in den drei gegebenen Beispielen untermauern diese Theorie und spiegeln perfekt die Bedürfnisse bezüglich der Polarität und Größe der aktivierten Substrate wider.The general appearance of substrate binding pockets can be predicted using the codons determined by sequence comparisons. The putative binding pockets for the substrate amino acids Asp, Orn and Val are shown as examples in Fig. 3. While Asp235 and Lys517 mediate key interactions with the amino and carboxy group of the substrate in all A domains and are therefore highly conserved, the remaining residues are assumed to determine the specificity for a certain amino acid side chain. The corresponding residues (items 236 to 331) in the three examples given support this theory and perfectly reflect the requirements regarding the polarity and size of the activated substrates.

1. Asp activation (codon "Asp"): the basic residue His322 (possibly also Lys278) establishes a polar interaction with the acidic side chain, whereas the rest Leu236 closes the binding pocket for holding longer-chain substrates (e.g. Glu).
2. Orn activation (codon "Orn (2)"): The acidic residues Glu278 and Asp331 appear to play a key role in recognizing the large basic side chain.
3. Val activation (codon "Val (3)"): The entire binding pocket is through built up hydrophobic residues. Relative to that resulting from the branching of the β position large space requirement is (1) through the use of smaller page groups in the upper area, and (2) spatially demanding remnants in the lower area that expand the binding pocket, Taken into account.

Neben der Degenerierung besteht eine weitere Homologie zum ribosomalen Kode im Auftreten von flexiblen (Wobble-ähnlichen) Positionen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, sind die Positionen 278, 299 und 331 solche Wobble-ähnlichen Reste, die innerhalb bestimmter Kodone eine erhöhte Flexibilität aufweisen. Allgemein wird beobachtet, daß Bindungstaschen die kleinere Aminosäuren erkennen eine höhere Flexibilität bei Positionen nahe des Bodens der Tasche aufweisen, wohingegen bei großen Substraten eine größere Variabilität im oberen Bereich beobachtet wird (Tabelle 1).In addition to degeneration, there is another homology to the ribosomal code in the occurrence of flexible (wobble-like) positions. As shown in Table 1, positions 278, 299 and 331 such wobble-like residues that increased within certain codons Have flexibility. It is generally observed that binding pockets are the smaller Amino acids recognize greater flexibility in positions near the bottom of the bag exhibit, whereas with large substrates a greater variability in the upper range is observed (Table 1).

Die Ergebnisse der in silico Studien, die in Abb. 3 und Tabelle 1 zusammengefaßt sind, zeigen, daß die einzelnen Konstituenten einer Bindungstasche unterschiedliche Signifikanz für die Ausbildung einer bestimmten Substratspezifität besitzen. Um diese Beobachtung zu bestätigen wurden die Reste von 160 Bindungstaschen genauer untersucht. Die in Abb. 4 und Tabelle 2 dargestellten Resultate zeigen, daß sich die zehn Konstituenten einer Bindungstasche in drei Gruppen einteilen lassen. Ihre ungleichmässige Variabilität spiegelt wahrscheinlich ihre unterschiedliche Bedeutung bei der Vermittlung der Substratspezifität wider:
The results of the in silico studies, which are summarized in Fig. 3 and Table 1, show that the individual constituents of a binding pocket have different significance for the formation of a specific substrate specificity. To confirm this observation, the remains of 160 binding pockets were examined in more detail. The results shown in Fig. 4 and Table 2 show that the ten constituents of a binding pocket can be divided into three groups. Their uneven variability probably reflects their different meanings in conveying substrate specificity:

1. "Invariant" positions (pos. 235 and 517): Asp235 is only in A domains that Activate substrates without α-amino group, absent. Examples of this are e.g. B. the α- Aminoadipate-activating domains of the AcvA synthetases or the carboxy acid activating domains of Enterobactin (Escherichia coli) and Yersiniabactin systems (Yersinia pestis). Lys517, on the other hand, is absolutely invariant and binds both the α-carboxy group the cognate amino acid, as well as the O4 'and O5' of the ATP / AMP-Ribose unit, thereby presumably both substrates are brought into a position of optimal interaction. Both leftovers mediate important interaction with the (largely) unchangeable α-amino and α-carboxy groups of the substrate, which can explain their own invariance.
2. "Conditional variant" positions (pos. 236, 301 and 330): These residues show inside of all domains examined only a slight variability and in 93% of all cases hydrophobic amino acids realized at these positions. Taking into account the low Flexibility of these positions and the disproportionately low occurrence of loaded or Polar side chains can be essential in conveying substrate specificity be excluded.
3. "Maximum variant" positions (pos. 239, 278, 299, 322 and 331): These positions have the greatest flexibility with regard to the amino acids used. Apart from items 299 and 331, which generally appear to be very adaptive and wobble-like (see Table 1), all positions are predestined for the establishment of substrate specificity. Taking into account their relative location within the binding pocket and the data shown in Table 1 + 2 and Fig. 3, it can be assumed that position 322 has a greater influence on smaller substrate residues, whereas positions 239 and 278 rather affect larger residues . This hypothesis is e.g. B. underpinned by the codons of the Asp (His322), Glu (Lys239) and Orn (Glu278) activating A domains (Table 1 + 2). In all of the examples mentioned, the polarity of the recognized substrate and "highly variant" positions of the binding pocket are perfectly coupled (cf. Table 2; dark gray background).

Die veränderte DNA wird nach dem Fachmann an sich bekannten Verfahren im Wirtsorganismus chromosomal oder extrachromosomal implantiert. The modified DNA is in the host organism according to methods known per se to the person skilled in the art implanted chromosomally or extrachromosomally.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher die in den Patentansprüchen angeführten Ausführungsformen.The present invention therefore relates to those set out in the patent claims Embodiments.

Zur experimentellen Bestätigung mutierten wir mehrere der Spezifität-vermittelnden Aminosäure-Konstituenten der Bindungstasche von PheA und untersuchten die Mutanten auf resultierende Veränderung in (1) der Rate des ATP-Pyrophosphat-Austauschs (Enzymaktivität) und (2) der Aktivierung von mis-kognaten Aminosäuren (Enzymspezifität). Im Hinblick auf den letztgenannten Punkt sollte nicht unerwähnt bleiben, daß das Wildtyp-Protein von vornherein eine signifikante Aktivierung der mis-kognaten Substrate Trp (18%) und Leu (7%) zeigte. Die Ergebnisse unserer PheA-Mutagenese-Experimente sind in Tabelle 3 zusammengefaßt und können wie folgt generalisiert werden:
For experimental confirmation, we mutated several of the specificity-mediating amino acid constituents of the binding pocket of PheA and examined the mutants for resulting changes in (1) the rate of ATP-pyrophosphate exchange (enzyme activity) and (2) the activation of mis-cognate amino acids (Enzyme specificity). With regard to the latter point, it should not be left unmentioned that the wild-type protein showed a significant activation of the mis-cognate substrates Trp (18%) and Leu (7%) from the outset. The results of our PheA mutagenesis experiments are summarized in Table 3 and can be generalized as follows:

1. The substitution for somewhat larger amino acids was inevitably at the expense of Available space in the binding pocket. As a result, the ATP Pyrophosphate exchange rate of these mutants, while their specificity for the cognate substrate Phenylalanine increased (e.g. T278M, T278Q, A301V, A3225 and C331L). In all cases reduced the page specificity for the mis-cognate substrates Trp and Leu by a factor of 20 become.
2. The exact opposite was for exchanges with somewhat smaller groups observed that the binding pocket expanded slightly. In these mutants, the catalytic activity of the wild-type protein can be rescued while the ability to mis Discriminate cognate substrates until decreased by 5 times (e.g. A301G, A322G and I330V).
3. The mutation of the "highly variant" side chains (pos. 239, 278, 322 and 331) caused up to 5-fold loss of enzyme activity (e.g. W239L, T278M and C331L). The introduction of polar or loaded page groups changed the overall polarity of the Binding pocket, whereby the corresponding enzyme was quasi completely inactivated (e.g. A322D, A322K and A322N).
4. The observed increase in activation of a particular mis-cognate substrate was predictable based on the specificity code (Table 1). For example, the activity remained and specificity for Phe in the mutant PheA (I330V) was unaffected, but this revealed Constructs a significant increase in activation of the mis-cognate substrates Trp and Tyr. Interestingly, all Trp and Tyr activating domains have a valine at position 330.

Ein ähnlicher Zusammenhang konnte auch, wie nachfolgend gezeigt, für Mutationen in Richtung des "Leu(4)"-Kodons (Tabelle 1) beobachtet werden.A similar relationship could also, as shown below, for mutations in the direction of the "Leu (4)" codon (Table 1) can be observed.

"Phe"- und "Leu(4)"-Kodon (Tabelle 1) besitzen eine etwa 60%ige Homologie und Hauptunterschiede betreffen die Positionen 278, 301 und 322 (bemerke: zwei-von-drei Positionen sind "höchst variante" Gruppen). Dementsprechend wurde vermutet und anschließend auch experimentell bestätigt, daß Punktmutationen in Richtung des "Leu(4)"-Kodons (→ T278M and A301G) eine erhöhte Aktivierung von Leucin zeigen (Tabelle 3). Interessanterweise, ist für die Mutante PheA(T278M) die katalytische Effizienz für die unspezifische Aktivierung von L-Leu quasi unbeeinflußt (gleiches V_max), während gleichzeitig die Aktivität für die kognaten Substrate (D- und L-Phe) eine etwa 3fache Erniedrigung erfuhr. Das genaue Gegenteil wurde für die Mutante PheA(A301G) beobachtet. Hier blieb das V_max für die Aktivierung von Phenylalanin unbeeinflußt, während gleichzeitig die katalytische Aktivierung von L-Leu quasi um das zweifache anstieg. All diese Änderungen der Substratspezifität und -aktivität waren signifikant, reproduzierbar und deutlich oberhalb der Standardabweichung. Wie nur drei Unterschiede im Kodon eine Unterscheidung zwischen Phenylalanin und Leucin ermöglichen ist derzeit noch unklar, doch zumindest für die Pos. 301 kann vermutet werden, daß hier aufgrund von Unterschieden in der räumlichen Ausdehnung einer CH- (Phe) versus CH₃-Gruppe (Leu) in der δ-Position der entsprechenden Aminosäure diskrimiert wird. Alle Domänen, die Substrate mit sterisch anspruchsvollen γ- or δ-Positionen aktivieren, besitzen die kleinstmögliche Seitengruppe (Gly) in Position 301 (Tabelle 2 und 3)."Phe" and "Leu (4)" codons (Table 1) have approximately 60% homology and the main differences concern positions 278, 301 and 322 (note: two-out-of-three positions are "highly variant" groups) . Accordingly, it was suspected and then also confirmed experimentally that point mutations in the direction of the "Leu (4)" codon (→ T278M and A301G) show an increased activation of leucine (Table 3). Interestingly, for the mutant PheA (T278M) the catalytic efficiency for the unspecific activation of L-Leu is virtually unaffected (same V _max ), while at the same time the activity for the cognate substrates (D- and L-Phe) experienced an approximately 3-fold decrease . The exact opposite was observed for the mutant PheA (A301G). Here the V _max remained unaffected for the activation of phenylalanine, while at the same time the catalytic activation of L-Leu increased almost twice. All of these changes in substrate specificity and activity were significant, reproducible, and well above the standard deviation. How only three differences in the codon enable a distinction between phenylalanine and leucine is currently still unclear, but at least for item 301 it can be assumed that due to differences in the spatial extent of a CH (Phe) versus CH ₃ group ( Leu) is discriminated in the δ position of the corresponding amino acid. All domains that activate substrates with sterically demanding γ or δ positions have the smallest possible side group (Gly) in position 301 (Tables 2 and 3).

Um die Substratspezifität von PheA vollständig zu Leucin zu verändern, konstruierten wir die Doppelmutante PheA(T278M/A301G). Das Kodon dieser Mutante zeigt eine Ähnlichkeit von ca. 80% zum "Leu(4)"-Kodon (vgl. Tabelle 1) und ist im phylogenetische Baum in unmittelbarer Nähe zu Leu-aktivierenden Domänen zu finden (Abb. 2; mittelgraue Unterlegung). Wie in Abb. 5A gezeigt, aktiviert dieses Konstrukt tatsächlich bevorzugt Leu, und zwar mit einer katalytischen Effizienz, die dem Wildtyp-Enzym in nichts nachsteht bzw. dessen Aktivität sogar übertrifft (Aktivität der Mutante für L-Leu: k_cat/K_m = 86 mM^-1 min^-1, Wildtyp-Aktivität für L-Phe: 69 mM^-1 min^-1; Tabelle 4). Es konnte ein mindestens 30facher Zuwachs der L-Leu-spezifischen Aktivierungseffizienz festgestellt werden. Erstaunlicherweise war die Doppelmutante nur geringfügig in der Aktivierung von D-Phe beeinträchtigt, wohingegen die katalytische Effizienz für die Aktivierung des anderen Stereoisomers, L-Phe, eine signifikante, ca. 7fache Verringerung erfuhr (Abb. 5A und Tabelle 4). Für das Wildtyp-Protein PheA konnte im Gegensatz dazu gezeigt werden, daß die Wechselwirkungen des Proteins mit beiden Liganden, L- und D-Phe, fast identisch sind. Wie in Abb. 1B gezeigt, ist der Benzyl-Ring der Seitengruppe von D-Phe um etwa 30° relativ zum L-Phe-Ring gedreht, woraus eine geringfügige Verlagerung der relativen Position des β-C-, aber nicht des α-C-Atoms resultiert.To completely change the substrate specificity of PheA to leucine, we constructed the double mutant PheA (T278M / A301G). The codon of this mutant shows a similarity of approx. 80% to the "Leu (4)" codon (cf. Table 1) and can be found in the phylogenetic tree in the immediate vicinity of Leu-activating domains ( Fig. 2; medium gray background) . As shown in Fig. 5A, this construct actually actually activates Leu preferentially with a catalytic efficiency that is in no way inferior to or even exceeds the wild-type enzyme (activity of the mutant for L-Leu: k _cat / K _m = 86 mM ^-1 min ^-1 , wild-type activity for L-Phe: 69 mM ^-1 min ^-1 ; Table 4). An at least 30-fold increase in the L-Leu-specific activation efficiency was found. Amazingly, the double mutant was only slightly affected in the activation of D-Phe, whereas the catalytic efficiency for the activation of the other stereoisomer, L-Phe, experienced a significant, approximately 7-fold decrease ( Fig. 5A and Table 4). In contrast, for the wild-type protein PheA it could be shown that the interactions of the protein with both ligands, L- and D-Phe, are almost identical. As shown in Fig. 1B, the benzyl ring of the side group of D-Phe is rotated about 30 ° relative to the L-Phe ring, resulting in a slight shift in the relative position of the β-C- but not the α-C -Atoms results.

Wir veränderten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Spezifität einer A-Domäne, deren Kristallstruktur noch nicht aufgeklärt ist. Als Ausgangspunkt dieses Experiments diente die Feststellung, daß die ermittelten Kodons von Asp- und Asn-aktivierenden Domänen sehr ähnlich sind (ca. 80%; vgl. Tabelle 1), und die Hauptunterschiede die Positionen 322 (His vs. Glu; eine "höchst variante" Gruppe) und 330 (Val vs. Ile; eine "bedingt variante" Gruppe) betreffen. Demzufolge wählten wir die Asp-aktivierende A-Domäne des umfassend charakterisierten Surfactin-Biosynthesekomplexes [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831] und unternahmen den Versuch, ihre Spezifität in Richtung Asparagin zu verändern. Für das Wildtyp- Protein AspA konnte eine spezifische Aktivierung von L-Asp, aber nicht L-Asn, mit einer moderaten Aktivität (Wildtyp-Aktivität für L-Asp: k_cat/K_m = 10 mM^-1 min^-1; vgl. Abb. 5B und Tabelle 4) bestätigt werden. Im Gegensatz hierzu offenbarte die Punktmutante AspA(H322E) eine hohe Selektivität für L-Asn (Abb. 5B), wenngleich diese Spezifitätsänderung mit ihrer Abnahme der katalytischen Aktivität (Faktor 10) verbunden war (Aktivität der Mutante für L- Asn: k_cat/K_m = 1 mM^-1 min^-1; Tabelle 4). Somit konnte also mit dem Konstrukt AspA(H322E) gezeigt werden, daß eine vollständige Änderung der Substratspezifität durch die Einführung einer einzigen Punktmutation erzielt werden kann. Die Mutante AspA(H322E) zeigte übrigens darüber hinaus auch eine etwa 5fache Erhöhung der Aktivierungseffizienz für ähnlich-große, aliphatische Asn-Analoga, wie z. B. Ile, Leu und Val.We changed the specificity of an A domain whose crystal structure has not yet been elucidated using the method according to the invention. The starting point of this experiment was the finding that the codons of Asp and Asn activating domains found are very similar (approx. 80%; see Table 1), and the main differences are positions 322 (His vs. Glu; a "highest") variant "group) and 330 (Val vs. Ile; a" conditionally variant "group). Accordingly, we chose the Asp-activating A domain of the extensively characterized surfactin biosynthesis complex [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831] and attempted to change their specificity towards asparagine. For the wild-type protein AspA, a specific activation of L-Asp, but not L-Asn, with moderate activity (wild-type activity for L-Asp: k _cat / K _m = 10 mM ^-1 min ^-1 ; cf. Fig. 5B and Table 4) can be confirmed. In contrast, the point mutant AspA (H322E) revealed a high selectivity for L-Asn ( Fig. 5B), although this change in specificity was associated with its decrease in catalytic activity (factor 10) (activity of the mutant for L-Asn: k _cat / K _m = 1 mM ^-1 min ^-1 ; Table 4). Thus it could be shown with the construct AspA (H322E) that a complete change in the substrate specificity can be achieved by introducing a single point mutation. In addition, the mutant AspA (H322E) also showed an approximately 5-fold increase in the activation efficiency for similarly large, aliphatic Asn analogues, such as, for. B. Ile, Leu and Val.

Die etwa 70fache Zunahme der Effizienz der L-Asn-spezifischen Aktivierung konnte durch die Einführung einer Ile330Val-Punktmutation weiter gesteigert werden. Hierdurch wurde zugleich eine katalytische Aktivität der nunmehr Asn aktivierenden Domäne erreicht, die im selben Größenordnungsbereich der ursprünglichen AspA-Domäne lag.The approximately 70-fold increase in the efficiency of L-Asn-specific activation was due to the Introduction of an Ile330Val point mutation can be further increased. This was at the same time catalytic activity of the now Asn activating domain achieved in the same The order of magnitude of the original AspA domain was.

Bei der Analyse der Kodone von Glu- und Gln-aktivierenden Domänen zeigte sich, daß auch diese Domänen sehr ähnliche Kodone realisieren (Tabelle 1). Der Hauptunterschied betrifft die Position 239 (Lys vs. Gln; eine "höchst variante" Gruppe). Wir wählten daher die Glu-aktivierende Domäne des Surfactin-Biosynthesekomplexes (SrfA-Al) und unternahmen den Versuch die Spezifität in Richtung Glutamin zu verändern. Für das Wildtyp-Protein GluA konnte eine spezifische Aktivierung von L-Glu, aber nicht L-Gln, mit einer moderaten Aktivität (k_cat/K_m = 25 mM^-1 min^-1) bestätigt werden. Im Gegensatz hierzu offenbarte die Punktmutante GluA(K239Q) eine hohe Selektivität für L-Gln, bei einer gleichzeitig nur geringfügig herabgesetzten, katalytischen Aktivität (k_cat/K_m = 20 mM^-1 min^-1). Dieses Ergebnis durfte aufgrund der Kodone der Mutante und Gln-Domänen erwartet werden und zeigt, daß auch mit dem Konstrukt GluA(K239Q) eine vollständige Änderung der Substratspezifität durch die Einführung einer einzigen Punktmutation erzielt werden konnte.Analysis of the codons of Glu and Gln activating domains showed that these domains also implement very similar codons (Table 1). The main difference concerns position 239 (Lys vs. Gln; a "highly variant" group). We therefore selected the glu-activating domain of the surfactin biosynthesis complex (SrfA-Al) and attempted to change the specificity towards glutamine. For the wild-type protein GluA, a specific activation of L-Glu, but not L-Gln, could be confirmed with moderate activity (k _cat / K _m = 25 mM ^-1 min ^-1 ). In contrast, the point mutant GluA (K239Q) revealed a high selectivity for L-Gln, with at the same time only a slightly reduced catalytic activity (k _cat / K _m = 20 mM ^-1 min ^-1 ). This result could be expected due to the codons of the mutant and Gln domains and shows that even with the construct GluA (K239Q) a complete change in substrate specificity could be achieved by introducing a single point mutation.

Nachfolgend wird gezeigt, daß die veränderte Substratspezifität einer A-Domäne auch zur in vivo Synthese eines Peptides mit veränderter Primärstruktur ausgenutzt werden kann. Exemplarisch wurde hierzu das Genfragment der Asn-spezifischen Doppelmutante AspA(I330V/H322E) mittels homologer Rekombination ins Chromosom des Surfactin- Produzenten B. subtilis ATCC 21332 transferiert. Diese Integration erfolgte mit Hilfe einer Zweistufen-Rekombinationsmethode [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318] und führte zur Substitution von aspA' gegen aspA(H322A/I330V)' im srfA-B-Gen des Surfactin- Biosynthese-Operons. Die Identität dieses Klones, B. subtilis Asn-5, wurde durch PCR- Amplifikation des mutierten asp(H322E/I330V)'-Genfragments aus dessen Chromosom und anschließende DNA-Sequenzanalyse des Amplifikates verifiziert.It is shown below that the changed substrate specificity of an A domain also in Vivo synthesis of a peptide with a modified primary structure can be used. The gene fragment of the Asn-specific double mutant was used as an example AspA (I330V / H322E) by means of homologous recombination into the chromosome of the surfactin Producers B. subtilis ATCC 21332 transferred. This integration was carried out with the help of a Two-step recombination method [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318] and led to the substitution of aspA 'against aspA (H322A / I330V)' in the srfA-B gene of the surfactin Biosynthesis operons. The identity of this clone, B. subtilis Asn-5, was confirmed by PCR Amplification of the mutated asp (H322E / I330V) 'gene fragment from its chromosome and subsequent DNA sequence analysis of the amplified product verified.

Das Biosurfactant Surfactin ist ein Lipoheptapeptid mit variablem β-Hydroxyfettsäure-Anteil (6- 9 Methylengruppen), das am Übergang zur stationären Wachstumsphase produziert und ins Kulturmedium sekretiert wird. Entsprechend wurden zum Nachweis des modifizierten Lipoheptapeptide die B. subtilis-Stämme ATCC 21332 und Asn-5 fermentiert, und Wildtyp- und [Asn-5]Surfactin aus ihren Kulturüberständen präpariert. Die nachfolgende HPLC-MS-Analyse zeigte, daß das [Asn-5]Surfactin im Vergleich zum Wildtyp (1) in gleicher Quantität produziert wurde, (2) eine längere Retentionszeit besaß, und (3) in der ESIMS-Analyse einen Massenunterschied von 1 Da aufwies. Diese Massendifferenz war signifikant, und im negativen Ionenmodus konnten Ioneriserien in einer 14er-Abstufung (variabler Fettsäure-Anteil) für den Wildtyp bei m/z 992 bis 1.034, sowie für die Mutante bei m/z 991 bis 1.033 determiniert werden. Dieser Befund ist, gemeinsam mit der reduzierten hämolytischen Aktivität des [Asn-5]Surfactins, als eindeutiger Hinweis auf die Substitution einer Carboxy- (Asp-5; Wildtyp) gegen eine Carbamid-Gruppe (Asn-5; Mutante) im Surfactin anzusehen. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, daß durch die gezielte Veränderung der Substratspezifität einer A-Domäne innerhalb einer katalytischen NRPS-Matrize auch das korrespondierende Peptidprodukt in vivo verändert werden konnte.The biosurfactant surfactin is a lipoheptapeptide with a variable amount of β-hydroxyfatty acid (6- 9 methylene groups), which produces at the transition to the stationary growth phase and ins Culture medium is secreted. Accordingly, the modified Lipoheptapeptides fermented the B. subtilis strains ATCC 21332 and Asn-5, and wild-type and [Asn-5] Surfactin prepared from their culture supernatants. The subsequent HPLC-MS analysis showed that the [Asn-5] surfactin produced in the same quantity compared to the wild type (1) , (2) had a longer retention time, and (3) one in the ESIMS analysis Mass difference of 1 da. This difference in mass was significant and negative Ion series were able to produce ioner series in a 14 step (variable fatty acid content) Wild type at m / z 992 to 1,034, and for the mutant at m / z 991 to 1,033 can be determined. This finding, together with the reduced hemolytic activity of [Asn-5] surfactin, as a clear indication of the substitution of a carboxy (Asp-5; wild type) for one Carbamide group (Asn-5; mutant) to be considered in the surfactin. In summary, these show Results that by deliberately changing the substrate specificity of an A domain within of a catalytic NRPS template also changed the corresponding peptide product in vivo could be.

Grundsätzlich sieht das erfinderische Verfahren zur gezielten Synthese von Peptiden so aus: Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich ausgehend von einem natürlich auftretenden, funktionell aktiven NRPS-System durch gerichtete Punktmutationen innerhalb der A-Domänen jede Aminosäureposition des gebildeten nichtribosomal Produktpeptides gezielt zu verändern. Hierzu wird zunächst die DNA der zu verändernden A-Domäne aus dem Chromosom des Produzentenorganismus amplifiziert und in einen E. coli His-tag-Expressionsvektor kloniert. Basically, the inventive method for the targeted synthesis of peptides looks like this: With the help of the method according to the invention it is possible starting from a natural one occurring, functionally active NRPS system through directed point mutations within the A domains target each amino acid position of the non-tribosomal product peptide formed change. For this, the DNA of the A domain to be modified is first extracted from the chromosome amplified from the producer organism and cloned into an E. coli His-tag expression vector.

Mit Hilfe dieses Konstruktes ist es nun möglich ausreichende Mengen an funktionell aktivem A- Domänenprotein zu produzieren, aufzureinigen sowie in vitro auf seine Substratspezifität zu untersuchen. Im folgenden können nun in die rekombinante A-Domänen-DNA gerichtet Punktmutationen eingeführt werden, die gemäß Tabelle 1) zu einer Veränderung der Substratspezifität führen. Zur Verifizierung dieser Änderung werden die mutierten A-Domänen zunächst in E. coli überexprimiert, aufgereinigt und in Bezug auf ihre Substratspezifität untersucht. Kann hierdurch die zu erwartende Spezifitätsänderung bestätigt werden, wird die mutierte A-Domänen DNA über homologe Rekombination gegen die native A-Domänen-DNA im Chromosom des Produzentenorganismus ausgetauscht. Der so erzeugte Produzentenstamm mit mutierter A-Domäne kann nun zur Produktion des veränderten nichtribosomalen Peptides eingesetzt werden.With the help of this construct, it is now possible to have sufficient amounts of functionally active A- Domain protein to produce, purify and in vitro to its substrate specificity examine. The following can now be directed into the recombinant A-domain DNA Point mutations are introduced which lead to a change in the Lead substrate specificity. The mutated A domains are used to verify this change first overexpressed in E. coli, purified and in relation to their substrate specificity examined. If this can be used to confirm the expected change in specificity, the mutated A-domain DNA via homologous recombination against native A-domain DNA exchanged in the chromosome of the producer organism. The producer base generated in this way with a mutated A domain can now produce the modified non-tribosomal peptide be used.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch eingesetzt werden, um die Spezifität und/oder Aktivität bekannter biologisch aktiver Peptide zu beeinflussen. Hierzu werden aufgrund des aufgefundenen Codes, bestimmte A-Domänen so verändert, daß die mit Hilfe der veränderten NRPS synthetisierten Peptide die gewünschten Eigenschaften besitzen. Beispielhaft sei hier die Verbesserung der Löslichkeit erwähnt, die durch den Austausch von hydrophoben gegen hydrophile Aminosäuren und umgekehrt erfolgen kann.The method according to the invention can also be used to determine the specificity and / or To influence the activity of known biologically active peptides. Due to the found codes, certain A domains changed so that with the help of the changed NRPS synthesized peptides have the desired properties. Here is an example Improvement in solubility mentioned by the exchange of hydrophobic for hydrophilic amino acids and vice versa.

Die erfindungsgemäßen Ergebnisse erlauben auch eine gezielte Vorhersage von Substratspezifitäten bereits sequenzierter NRPS-Gene, deren Funktion aber noch nicht bestimmt wurde. Dies gewinnt im Rahmen der durch diverse Genom-Sequenzierungsprojekte stetig zunehmenden Sequenzmengen immer mehr an Bedeutung. So ist es mit dem hier beschriebenen Verfahren z. B. möglich aus der DNA-Sequenz eines NRPS-Clusters die putative Struktur des gebildeten Produktpeptides vorherzusagen. Somit ist eine anschließende Struktur-Funktions analyse derartiger Gene sehr erleichtert.The results according to the invention also allow a targeted prediction of Substrate specificities of already sequenced NRPS genes, but their function has not yet been determined has been. This is steadily gaining in the context of diverse genome sequencing projects increasing sequence quantities become more and more important. So it is with the one described here Process z. B. possible from the DNA sequence of an NRPS cluster the putative structure of to predict product peptides formed. This is a subsequent structure-function analysis of such genes very much easier.

Zur Ableitung der Substratspezifität einer NRPS-A-Domäne mit bekannter DNA-Sequenz wird zunächst ein Sequenzvergleich mit der DNA-Sequenz von PheA durchgeführt. Hierdurch können die korrespondierenden zehn Reste der putativen Bindungstasche der zu untersuchenden A- Domäne identifiziert werden. Diese zehn Reste werden nun nachfolgend als eigenständige Aminosäuresequenz in Alignments und phylogenetische Untersuchungen mit den zehn Resten der Bindungstasche sämtlicher anderen, bekannten A-Domänen eingesetzt. Hierbei ergibt sich eine strikte Gliederung der Sequenzen bezüglich der Substratspezifität der zugehörigen A- Domänen. Somit kann über das Gruppierungsverhalten die Substratspezifität der zu untersuchenden A-Domäne bestimmt werden kann. To derive the substrate specificity of an NRPS-A domain with a known DNA sequence first a sequence comparison with the DNA sequence of PheA was carried out. This can the corresponding ten residues of the putative binding pocket of the A- to be examined Domain can be identified. These ten remnants are now considered separate Amino acid sequence in alignments and phylogenetic studies with the ten residues the binding pocket of all other known A domains. This results in a strict organization of the sequences with regard to the substrate specificity of the associated A- Domains. Thus, the substrate specificity of the investigating A domain can be determined.

Unter Anwendung der erfindungsgemäßen Erkenntnisse wird es auch möglich aus den bekannten DNA-Sequenzen für bestimmte A-, C- und T-Domänen, sowie ggf. anderen Domänen - wie in Mahariel et al. (1997) beschrieben - NRPS zu synthetisieren, die nicht von natürlichen Synthetasen abgeleitet sind.Using the knowledge according to the invention it is also possible from the known DNA sequences for certain A, C and T domains, and possibly other domains - as in Mahariel et al. (1997) - synthesize NRPS that are not natural Synthetases are derived.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne sie einzuschränken.The following examples illustrate the invention without restricting it.

EXAMPLES example 1 PCR amplification and cloning of the PheA and AspA mutants

Alle PheA-Mutanten wurden mittels inverser PCR durch gerichtete Mutagenese im Plasmid pPheA erzeugt. Die PCR-Amplifikation des gesamten Plasmides erfolgte mit dem 'Expand Long-Range PCR' System (Boehringer Mannheim; Mannheim, Deutschland, Katalognr.: 1681842) unter Einhaltung des Hersteller-Protokolls. Die folgenden, 5'-phosphorylierten Oligonukleotide (MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) wurden verwendet (die jeweils mutierten Kodone sind unterstrichen): (Seq ID-NO: 1) 3'-A236: 5'-ATC AAA AGA GAT GCT GGC A-3'; (Seq ID-NO: 2) 5'-A236L: 5'-TTA TCT GTA TGG GAG ATG TTT ATG-3'; (Seq ID-NO: 3) 3'-W239: 5'-TAC AGA TGC ATC AAA AGA G-3'; (Seq ID-NO: 4) 5'-W239G: 5'- GGA GAG ATG TTT ATG GCT TTG TTA AC-3'; (Seq ID-NO: 5) 5'-W239L: 5'-TTA GAG ATG TTT ATG GCT TTG TTA-3'; (Seq ID-NO: 6) 3'-T278: 5'-AAT AAC AGT GAT TTC CTT TTG G-3'; (Seq ID-NO: 7) 5'-T278M: 5'-ATG CTG CCA CCT ACC TAT GTA GTT-3'; (Seq ID-NO: 8) 5'-T278Q: 5'-CAG CTG CCA CCT ACC TAT GTA GTT-3'; (Seq ID-NO: 9) 3'-I299: 5'-TAA CGT TTG TAT CGA TAA AAT AC-3'; (Seq ID-NO: 10) 5'-I299T: 5'-ACT ACA GCA GGC TCA GCT AC-3'; (Seq ID-NO: 11) 3'-A301G: 5'-TCC TGT AAT TAA CGT TTG TAT CG-3'; (Seq ID-NO: 12) 3'-A301 V: 5'-AAC TGT AAT TAA CGT TTG TAT CG-3'; (Seq ID- NO: 13) 5'-A301: 5'-GGC TCA GCT ACC TCG CCT-3'; (Seq ID-NO: 14) 3'-A322: 5'-AAT GTA AGT TAC TTT CTC CTT C-3'; (Seq ID-NO: 15) 5'-A322D: 5'-AAT GAT TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 16) 5'-A322E: 5'-AAT GAA TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 17) 5'-A322G: 5'-AAT GGC TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 18) 5'-A322I: 5'-AAT ATT TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 19) 5'- A322K: 5'-AAT AAG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 20) 5'-A322N: 5'-AAT TTG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 21) 5'-A322Q: 5'-AAT CAG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 22) 5'-A322S: 5'-AAT AGC TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3'; (Seq ID-NO: 23) 3'-I330: 5'-AGT TGT TTC CGT AGG GC-3'; und (Seq ID-NO: 24) 5'- I330V: 5'-GTT TGT GCG ACT ACA TGG G-3'. All PheA mutants were generated by inverse PCR by directed mutagenesis in the plasmid pPheA. The PCR amplification of the entire plasmid was carried out using the 'Expand Long-Range PCR' system (Boehringer Mannheim; Mannheim, Germany, catalog no .: 1681842) in compliance with the manufacturer's protocol. The following 5'-phosphorylated oligonucleotides (MWG-Biotech, Ebersberg, Germany) were used (the mutated codons are underlined): (Seq ID-NO: 1) 3'-A236: 5'-ATC AAA AGA GAT GCT GGC A-3 '; (Seq ID-NO: 2) 5'-A236L: 5'- TTA TCT GTA TGG GAG ATG TTT ATG-3 '; (Seq ID-NO: 3) 3'-W239: 5'-TAC AGA TGC ATC AAA AGA G-3 '; (Seq ID-NO: 4) 5'-W239G: 5'- GGA GAG ATG TTT ATG GCT TTG TTA AC-3 '; (Seq ID-NO: 5) 5'-W239L: 5'- TTA GAG ATG TTT ATG GCT TTG TTA-3 '; (Seq ID-NO: 6) 3'-T278: 5'-AAT AAC AGT GAT TTC CTT TTG G-3 '; (Seq ID-NO: 7) 5'-T278M: 5'- ATG CTG CCA CCT ACC TAT GTA GTT-3 '; (Seq ID-NO: 8) 5'-T278Q: 5'- CAG CTG CCA CCT ACC TAT GTA GTT-3 '; (Seq ID-NO: 9) 3'-I299: 5'-TAA CGT TTG TAT CGA TAA AAT AC-3 '; (Seq ID-NO: 10) 5'-I299T: 5'- ACT ACA GCA GGC TCA GCT AC-3 '; (Seq ID-NO: 11) 3'-A301G: 5'- TCC TGT AAT TAA CGT TTG TAT CG-3 '; (Seq ID-NO: 12) 3'-A301 V: 5'- AAC TGT AAT TAA CGT TTG TAT CG-3 '; (Seq ID NO: 13) 5'-A301: 5'-GGC TCA GCT ACC TCG CCT-3 '; (Seq ID-NO: 14) 3'-A322: 5'-AAT GTA AGT TAC TTT CTC CTT C-3 '; (Seq ID-NO: 15) 5'-A322D: 5'-AAT GAT TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3 '; (Seq ID-NO: 16) 5'-A322E: 5'-AAT GAA TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3 '; (Seq ID-NO: 17) 5'-A322G: 5'-AAT GGC TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3 '; (Seq ID-NO: 18) 5'-A322I: 5'-AAT ATT TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3 '; (Seq ID-NO: 19) 5'-A322K: 5'-AAT AAG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3 '; (Seq ID-NO: 20) 5'-A322N: 5'-AAT TTG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3 '; (Seq ID-NO: 21) 5'-A322Q: 5'-AAT CAG TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3 '; (Seq ID-NO: 22) 5'-A322S: 5'-AAT AGC TAT GGC CCT ACG GAA ACA-3 '; (Seq ID-NO: 23) 3'-I330: 5'-AGT TGT TTC CGT AGG GC-3 '; and (Seq ID-NO: 24) 5'- I330V: 5'- GTT TGT GCG ACT ACA TGG G-3 '.

Die PCR-Amplifikate wurden mit dem "QIAquick-spin PCR purification"-System (Qiagen; Hilden, Deutschland, Katalognr.: 28104) aufgereinigt, ihre kohäsiven Enden geglättet und nachfolgend intramolekular ligiert. Die Zugabe der Restriktionsendonuklease DpnI (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E0302Z), die eine methylierte Erkennungssequenz benötigt, gestattete einen gezielten Abbau der PCR-Matrize (pPheA; aufgereinigt aus einem dam⁺-Escherichia coli-Stamm) und damit die Vermeidung von falsch positiven Klonen. Für alle DNA-Manipulationen sowie die Präparation der rekombinaten Plasmide aus E. coli XL-1-blue (Stratagene, Heidelberg, Deutschland, Best.-Nr.: 200268) kamen Standardmethoden zum Einsatz [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]. Durch die Klonierung der PCR-Amplifikate konnten die folgenden Plasmide erhalten werden: pPheA(A236L) (durch Verwendung der Oligonukleotiden Seq ID-NO: 1 und Seq ID-NO: 2), pPheA(W239G) (Seq ID- NO: 3 plus Seq ID-NO: 4), pPheA(W239L) (Seq ID-NO: 3 plus Seq ID-NO: 5), pPheA(T278M) (Seq ID-NO: 6 plus Seq ID-NO: 7), pPheA(T278Q),(Seq ID-NO: 6 plus Seq ID-NO: 8), pPheA(I299T) (Seq ID-NO: 9 plus Seq ID-NO: 10), pPheA(A301G) (Seq ID-NO: 11 plus Seq ID-NO: 13), pPheA(A301V) (Seq ID-NO: 12 plus Seq ID-NO: 13), pPheA(A322D) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 15), pPheA(A322E) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 16), pPheA(A322G) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 17), pPheA(A322I) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 18), pPheA(A322K) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 19), pPheA(A322 N) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 20), pPheA(A322Q) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 21), pPheA(A322S) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 22) und pPheA(I330V) (Seq ID-NO: 23 plus Seq ID-NO: 24). Die Identität aller Konstrukte wurde durch DNA-Sequenzierungen an einem "ABI prism 310 Genetic Analyzer" (ABI; Weiterstadt, Deutschland, Best.-Nr.: 310-A) überprüft und bestätigt.The PCR amplificates were purified using the "QIAquick-spin PCR purification" system (Qiagen; Hilden, Germany, catalog number: 28104), their cohesive ends were smoothed and subsequently intramolecularly ligated. The addition of the restriction endonuclease DpnI (Amersham / Buchler; Braunschweig, Germany; order no .: E0302Z), which requires a methylated recognition sequence, allowed a targeted degradation of the PCR template (pPheA; purified from a dam ⁺ -Escherichia coli strain ) and thus the avoidance of false positive clones. Standard methods were used for all DNA manipulations and the preparation of the recombinant plasmids from E. coli XL-1-blue (Stratagene, Heidelberg, Germany, order no .: 200268) [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]. The following plasmids could be obtained by cloning the PCR amplificates: pPheA (A236L) (by using the oligonucleotides Seq ID-NO: 1 and Seq ID-NO: 2), pPheA (W239G) (Seq ID-NO: 3 plus Seq ID-NO: 4), pPheA (W239L) (Seq ID-NO: 3 plus Seq ID-NO: 5), pPheA (T278M) (Seq ID-NO: 6 plus Seq ID-NO: 7), pPheA ( T278Q), (Seq ID-NO: 6 plus Seq ID-NO: 8), pPheA (I299T) (Seq ID-NO: 9 plus Seq ID-NO: 10), pPheA (A301G) (Seq ID-NO: 11 plus Seq ID-NO: 13), pPheA (A301V) (Seq ID-NO: 12 plus Seq ID-NO: 13), pPheA (A322D) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 15), pPheA (A322E) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 16), pPheA (A322G) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 17), pPheA (A322I) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 18), pPheA (A322K) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 19), pPheA (A322 N) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 20), pPheA (A322Q) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 21), pPheA (A322S) (Seq ID-NO: 14 plus Seq ID-NO: 22) and pPheA (I330V) (Seq ID-NO: 23 plus Seq ID-NO: 24). The identity of all constructs was checked and confirmed by DNA sequencing on an "ABI prism 310 Genetic Analyzer"(ABI; Weiterstadt, Germany, order no .: 310-A).

Das für die Aspartat-aktivierende A-Domäne aus SrfA-B kodierende DNA-Fragment wurde mittels PCR aus der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis JH642 mit den folgenden Oligonukleotiden amplifiziert: (Seq ID-NO: 25) 5'-AspA: 5'-AAT CCA TGG CGA ACG TTC GGC TGT CTG-3' und (Seq ID-NO: 26) 3'-AspA: 5'-AAT GGA TCC GGC CAA GGC CTT GCC-3'. Das resultierende PCR-Amplifikat wurde gereinigt (s. o.), mit den Restriktionsenzymen NcoI und BamHI (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E1160Z u. E1010Y) verdaut und in den gleichermaßen präparierten "His-tag"-Vektor pQE60 (Qiagen; Hilden, Deutschland, Best.-Nr.: 33603) kloniert. Diese Klonierung lieferte das Plasmid pAspA, daß nachfolgend als Matrize für die Erzeugung von pAspA(H322E) mittels inverser PCR verwendet werden konnte (s. o.): (Seq ID-NO: 27) 5'-AspA(H322E): 5'-TAA TGA GTA CGG CCC GAC AGA AGC-3' (Seq ID-NO: 28) und 3'-AspA(H322E): 5'-ATA AAT TCG GTA TGT CCA TAC-3'. Das resultierende Plasmid pAspA(H322E) diente nachfolgend als Matrize für die Erzeugung von pAspA(H322E/I330V) mittels inverser PCR mit den folgenden Primern (Seq ID- NO: 29) 5'-AspA(I330V): 5'-TAC CGG CCC ACA GAA GCA ACG GTC GGC-3' und (Seq ID-NO: 30) 3'-AspA(I330V): 5'-CTG TGG GCC CGT ACT CAT TAA TAA ATT CGG-3'. Die Identität aller Konstrukte wurde wiederum durch DNA-Sequenzierungen überprüft und bestätigt.The DNA fragment coding for the aspartate-activating A domain from SrfA-B was amplified by means of PCR from the chromosomal DNA from Bacillus subtilis JH642 with the following oligonucleotides: (Seq ID-NO: 25) 5'-AspA: 5'- AAT CCA TGG CGA ACG TTC GGC TGT CTG-3 'and (Seq ID-NO: 26) 3'-AspA: 5'-AAT GGA TCC GGC CAA GGC CTT GCC-3'. The resulting PCR amplificate was purified (see above), digested with the restriction enzymes NcoI and BamHI (Amersham / Buchler; Braunschweig, Germany; order no .: E1160Z and E1010Y) and digested in the "His-tag" vector prepared in the same way pQE60 (Qiagen; Hilden, Germany, order no .: 33603) cloned. This cloning gave the plasmid pAspA, which could subsequently be used as a template for the generation of pAspA (H322E) by means of inverse PCR (see above): (Seq ID-NO: 27) 5'-AspA (H322E): 5'-TAA T GA G TA CGG CCC GAC AGA AGC-3 '(Seq ID-NO: 28) and 3'-AspA (H322E): 5'-ATA AAT TCG GTA TGT CCA TAC-3'. The resulting plasmid pAspA (H322E) subsequently served as a template for the generation of pAspA (H322E / I330V) by means of inverse PCR with the following primers (Seq ID-NO: 29) 5'-AspA (I330V): 5'-TAC CGG CCC ACA GAA GCA ACG GTC GGC-3 'and (Seq ID-NO: 30) 3'-AspA (I330V): 5'-CTG TGG GCC CGT ACT CAT TAA TAA ATT CGG-3'. The identity of all constructs was again checked and confirmed by DNA sequencing.

Das für die Glutamat-aktivierende A-Domäne aus SrfA-A kodierende DNA-Fragment wurde mittels PCR aus der chromosomalen DNA von Bacillus subtilis JH642 mit den folgenden Oligonukleotiden amplifiziert: (Seq ID-NO: 31) 5'-GluA: 5'-TAT GGA TCC ATT GAT GAA TTA ACA CTG-3' und (Seq ID-NO: 32) 3'-GluA: 5'-TAT GGA TCC GAT TGC TTT TTC AGT- 3'. Das resultierende PCR-Amplifikat wurde gereinigt (s. o.), mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E1010Y) verdaut und in den mit Bg/II (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E1021Y) geschnittenen "His tag"-Vektor pQE60 (Qiagen; Hilden, Deutschland, Best.-Nr.: 33603) kloniert. Diese Klonierung lieferte das Plasmid pGluA, daß nachfolgend als Matrize für die Erzeugung von pGluA(K239Q) mittels inverser PCR verwendet werden konnte (s. o.): (Seq ID-NO: 33) 5'-GluA(K239Q): 5'- GTG CAG CAA ATC TTC GCG TCG CTT C-3' und (Seq ID-NO: 34) 3'-GluA(K239Q): 5'-TGA CGC ATC AAA GTG GAA C-3'. Die Identität aller Konstrukte wurde wiederum durch DNA- Sequenzierungen überprüft und bestätigt.The DNA fragment coding for the glutamate-activating A domain from SrfA-A was generated by PCR from the chromosomal DNA of Bacillus subtilis JH642 with the following Oligonucleotides amplified: (Seq ID-NO: 31) 5'-GluA: 5'-TAT GGA TCC ATT GAT GAA TTA ACA CTG-3 'and (Seq ID-NO: 32) 3'-GluA: 5'-TAT GGA TCC GAT TGC TTT TTC AGT- 3 '. The resulting PCR amplificate was purified (see above) with the BamHI restriction enzyme (Amersham / Buchler; Braunschweig, Germany; order no .: E1010Y) digested and in the with Bg / II (Amersham / Buchler; Braunschweig, Germany; order no .: E1021Y) cut "His tag "vector pQE60 (Qiagen; Hilden, Germany, order no .: 33603). This cloning provided the plasmid pGluA that subsequently as a template for the generation of pGluA (K239Q) could be used by inverse PCR (see above): (Seq ID-NO: 33) 5'-GluA (K239Q): 5'-GTG CAG CAA ATC TTC GCG TCG CTT C-3 'and (Seq ID-NO: 34) 3'-GluA (K239Q): 5'-TGA CGC ATC AAA GTG GAA C-3 '. The identity of all constructs was in turn confirmed by DNA Sequencing checked and confirmed.

Example 2 Expression and purification of adenylation domains (wild type and Mutants)

Die Expression der (mutierten) Genfragmente sowie die Aufreinigung der resultierenden His₆- Fusionsproteine wurde, wie an anderer Stelle beschrieben [Mootz et al., 1997, J. Bacteriol. 179: 6843-6850], durchgeführt. Die Ligation in die BamHI-Schnittstelle von pQE60 führte jeweils zur Fusion der Aminosäure-Sequenz "GSRSHHHHHH" an den Carboxy-Terminus des jeweiligen rekombinanten Proteins. Mittels SDS-PAGE konnte gezeigt werden, daß die meisten Proteine annähernd homogen mittels Ni²⁺-Affinitäts-Chromatographie aufgereinigt werden konnten; zwei Konstrukte jedoch waren unlöslich (vgl. Tabelle 3). Fraktionen, die das jeweilige rekombinante Protein enthielten, wurden vereinigt und gegen Assay-Puffer dialysiert (50 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 2 mM Dithioerythritol (DTE) und 1 mM EDTA). Nach Zugabe von 10% Glycerin (v/v) konnten die Proteine, ohne erkennbaren Verlust ihrer katalytischen Aktivität, bei -80°C gelagert werden. Die Protein-Konzentration der verschiedenen Lösungen wurde mit Hilfe der berechneten Extinktionskoeffizienten bei 280 nm (A_280nm) ermittelt: 64060 M^-1 cm^-1 für PheA und alle PheA-Mutanten außer PheA(W239Xaa), 58370 M^-1 cm^-1 für PheA(W239Xaa), sowie 39780 M^-1 cm^-1 für AspA und AspA(H322E) und 35490 M^-1 cm^-1 für GluA und GluA(K239Q).The expression of the (mutated) gene fragments and the purification of the resulting His ₆ fusion proteins were described as described elsewhere [Mootz et al., 1997, J. Bacteriol. 179: 6843-6850]. The ligation into the BamHI site of pQE60 resulted in the fusion of the amino acid sequence "GSRSHHHHHH" to the carboxy terminus of the respective recombinant protein. Using SDS-PAGE it could be shown that most proteins could be purified almost homogeneously using Ni ²⁺ affinity chromatography; however, two constructs were insoluble (see Table 3). Fractions containing the respective recombinant protein were pooled and dialyzed against assay buffer (50 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 2 mM dithioerythritol (DTE) and 1 mM EDTA). After adding 10% glycerol (v / v), the proteins could be stored at -80 ° C without any noticeable loss of their catalytic activity. The protein concentration of the different solutions was determined using the calculated extinction coefficients at 280 nm (A _280nm ): 64060 M ^-1 cm ^-1 for PheA and all PheA mutants except PheA (W239Xaa), 58370 M ^-1 cm ^-1 for PheA (W239Xaa), as well as 39780 M ^-1 cm ^-1 for AspA and AspA (H322E) and 35490 M ^-1 cm ^-1 for GluA and GluA (K239Q).

Example 3 ATP pyrophosphate exchange reaction

Die ATP-Pyrophosphat-Austauschreaktion wurde durchgeführt, um sowohl die katalytische Aktivität als auch die Spezifität der aufgereinigten, rekombinanten A-Domänen zu [Mootz & Marahiel, 1997, J. Bacteriol. 179: 6843-6850]. Hierbei wurde die Spezifität jeweils mit allen 20 proteinogenen Aminosäuren, sowie zusätzlich L-Ornithin und D-Phenylalanin, überprüft. Die Reaktionsmischungen enthielten (Endvolumen: 100 µL): 50 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid, 2 mM DTE, 1 mM EDTA, 0 bis 2 mM Aminosäure, sowie 250 nM Enzym. Die verschiedenen Reaktionen wurden durch Zugabe von 2 mM ATP, 0.2 mM Natriumpyrophosphat und 0.15 µCi (16.06 Ci/mmol) Natrium-[³²P]pyrophosphat (NEN/DuPont; Deutschland; Best.-Nr.: NEX019) initiiert und für 10 min bei 37°C inkubiert. Anschließend konnten die Austauschreaktionen durch Zugabe von 0.5 mL Stopp-Lösung abgestoppt werden: 1.2% (w/v) Aktiv-Kohle, 0.1 M Natriumpyrophosphat und 0.35 M Perchlorsäure. Die Aktiv-Kohle wurde durch Zentrifugation abgetrennt, einmal mit 1 mL bidestilliertem Wasser gewaschen und in 0.5 mL Wasser resuspendiert. Nach Zugabe von 3.5 mL Szintillationsflüssigkeit (Rotiscint Eco Plus; Roth; Art.-Nr.:0016.2) konnte die Kohle-gebundene Radioaktivität an einem Szintallationsmeßgerät (1900CA Tri-Carb "liquid scintillation analyzer"; Packard) bestimmt werden.The ATP pyrophosphate exchange reaction was carried out to determine both the catalytic activity and the specificity of the purified, recombinant A domains [Mootz & Marahiel, 1997, J. Bacteriol. 179: 6843-6850]. The specificity was checked with all 20 proteinogenic amino acids, as well as L-ornithine and D-phenylalanine. The reaction mixtures contained (final volume: 100 μL): 50 mM HEPES, pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 10 mM magnesium chloride, 2 mM DTE, 1 mM EDTA, 0 to 2 mM amino acid, and 250 nM enzyme. The various reactions were initiated by adding 2 mM ATP, 0.2 mM sodium pyrophosphate and 0.15 µCi (16.06 Ci / mmol) sodium [ ³² P] pyrophosphate (NEN / DuPont; Germany; order no .: NEX019) and for 10 min incubated at 37 ° C. The exchange reactions could then be stopped by adding 0.5 mL stop solution: 1.2% (w / v) activated carbon, 0.1 M sodium pyrophosphate and 0.35 M perchloric acid. The activated carbon was separated by centrifugation, washed once with 1 ml of double-distilled water and resuspended in 0.5 ml of water. After adding 3.5 mL scintillation fluid (Rotiscint Eco Plus; Roth; Art.-No. 0016.2), the carbon-bound radioactivity could be determined on a scintillation measuring device (1900CA Tri-Carb "liquid scintillation analyzer"; Packard).

Example 4 Computer analysis to determine the putative substrate binding pockets

Protein-Sequenzen von 160 A-Domänen wurden von öffentlich-zugänglichen Datenbanken (z. B. http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/nucleotide.html) bezogen und auf den ca. 100 Aminosäuren großen Bereich zwischen den Core-Motiven A4 und A5 reduziert [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651-2673]. Diese Sequenzen wurden nachfolgend, mittels des Unterprogramms MegAlign aus dem DNAStar-Programmpaket, im Bezug auf Sequenzhomologien ausgerichtet, wobei die Methode "clustal" in ihrer Grundeinstellung zum Einsatz kam. Der einzige Zweck dieser ersten Ausrichtung war es, die anschließende Zuordnung der Konstituenten der putativen Substrat-Bindungstaschen zu erleichtern. Diese Zuordnung konnte letztendlich durch die Berücksichtigung ihrer Lage, relativ zu hoch-konservierten Sequenzmotiven (Core-Motive A4 und A5, sowie die Motive "TPS" und "GE"; strukturelle "Anker") getroffen werden. Alle Sequenzen wurden nachfolgend auf die ermittelten Konstituenten der Bindungstaschen zurecht gestutzt, und neue Ausrichtungen und phylogenetische Untersuchungen wurden mit diesen lediglich zehn Aminosäure-großen Bereichen durchgeführt. Eine Gruppierung der kodierenden Sequenzen gemäß der Substratspezifität ihrer Herkunftsdomänen konnte mit jeder Methode und jedem Parameter-Satz erzielt werden. Der in Abb. 2 gezeigte phylogenetische Baum wurde mit der Methode von Jotun Hein, unter Anwendung der folgenden Parameter, ermittelt: gap penalty 12, gap length penalty 6, und Ktuple 2.Protein sequences from 160 A domains were obtained from publicly accessible databases (e.g. http // www.ncbi.nlm.nih.gov / Entrez / nucleotide.html) and on the approximately 100 amino acid region between the Core motifs A4 and A5 reduced [Marahiel et al., 1997, Chem. Rev. 97: 2651-2673]. These sequences were subsequently aligned with the homolog using the MegAlign subroutine from the DNAStar program package, the "clustal" method being used in its basic setting. The sole purpose of this first alignment was to facilitate the subsequent assignment of the putative substrate binding pocket constituents. This assignment could ultimately be made by taking into account their location, relative to highly conserved sequence motifs (core motifs A4 and A5, as well as the motifs "TPS" and "GE"; structural "anchors"). All sequences were subsequently trimmed to the determined constituents of the binding pockets, and new alignments and phylogenetic studies were carried out with these regions, which were only ten amino acids in size. A grouping of the coding sequences according to the substrate specificity of their origin domains could be achieved with every method and every parameter set. The phylogenetic tree shown in Fig. 2 was determined using Jotun Hein's method, using the following parameters: gap penalty 12, gap length penalty 6, and Ktuple 2.

Example 5 Integration of the AspA (H322E / I330V) -coding gene fragment into the B. subtilis AS20 chromosome

Um das Potential unserer Methode zur in vivo Synthese von gerichtet-modifizierten Peptidantibiotika unter Beweis zu stellen, wurde das kodierende Genfragment der AspA- Doppelmutante (Asp(H322E/I331V) in das srfA-Biosynthese-Operon von B. subtilis [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831] eingebracht. Für die Konstruktion des hierzu benötigten Integrationsplasmids mußte zunächst das entsprechende srfA-B-Genfragment, das für das Asp-aktivierende Modul kodiert (Basenpaar 14195-18200; [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831]), mittels PCR aus dem Chromosom von B. subtilis ATCC 21332 amplifiziert werden (unterstrichen: Restriktionsendonuklease-Schnittstellen): (Seq ID-NO: 35) 5'- homo Asp(ClaI): 5'-TAA ATC GAT GGA GGC TGC CAA GG-3'; und (Seq ID-NO: 36) 3'- homo Asp(SpeI): 5'-TAA ACT AGT CAG TAA ATC CGC CCA GT-3'. Das resultierende Amplifikat wurde gereinigt, mit den Restriktionsenzymen ClaI und SpeI (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E11034Y u. E1086Z) verdaut und in den gleichermaßen präparierten Vektor pBluescript SK(-) kloniert (Stratagene, Heidelberg, Deutschland, Best.-Nr.: 212206) kloniert. Diese Klonierung lieferte das Plasmid pSK-homoAsp, aus dem nachfolgend mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und PstI (Amersham/Buchler; Braunschweig, Deutschland; Best.-Nr.: E1040Y u. E1073Y) ein ca. 1.3 kb-großes aspA'-Fragment (Basenpaar 15212-16559; [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831]) herausgeschnitten und gegen das komplementäre, zweifach mutierte Fragment aus pAspA(H322E/I33V) ersetzt wurde. Die Identität des resultierenden Integrationsplasmids pSK-homoAsp(H322E/I330V) konnte durch DNA-Sequenzierung bestätigt werden.In order to demonstrate the potential of our method for the in vivo synthesis of directed-modified peptide antibiotics, the coding gene fragment of the AspA double mutant (Asp (H322E / I331V) was inserted into the srfA biosynthesis operon from B. subtilis [Cosmina, P. et al., 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831]. In order to construct the integration plasmid required for this purpose, the corresponding srfA-B gene fragment coding for the Asp-activating module (base pair 14195-18200; [Cosmina , P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831]), by means of PCR from the chromosome of B. subtilis ATCC 21332 (underlined: restriction endonuclease cleavage sites): (Seq ID-NO: 35) 5 '- homo Asp (ClaI): 5'-TAA ATC GAT GGA GGC TGC CAA GG-3'; and (Seq ID-NO: 36) 3'-homo Asp (SpeI): 5'-TAA ACT AGT CAG TAA ATC CGC CCA GT-3 '. The resulting amplificate was purified with the restriction enzymes ClaI and SpeI (Amersham / Buchler; Braunschweig, Germany; order no .: E1103 4Y u. E1086Z) and cloned into the similarly prepared vector pBluescript SK (-) (Stratagene, Heidelberg, Germany, order no .: 212206). This cloning yielded the plasmid pSK-homoAsp, from which an approximately 1.3 kb aspA 'fragment (with the restriction endonucleases EcoRI and PstI (Amersham / Buchler; Braunschweig, Germany; order no .: E1040Y and E1073Y) ( Base pair 15212-16559; [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831]) was cut out and replaced with the complementary, double mutant fragment from pAspA (H322E / I33V). The identity of the resulting integration plasmid pSK-homoAsp (H322E / I330V) could be confirmed by DNA sequencing.

Zur Integration des mutierten aspA'-Fragmentes in das Surfactin-Biosynthese-Operon wurde auf eine bewährte Ko-Transformationstechnik ("congression") zurückgegriffen [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318]. Als Wirt diente der B. subtilis Stamm AS20 [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318], in dem das aspA'-Fragment (Basenpaar: 15245- 17177; [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831]) deletiert und gegen das Chloramphenicoltransferase-Gen substituiert wurde. B. subtilis AS20 wurde für eine DNA- Aufnahme kompetent gemacht und mit dem Intergrationsvektor pSK-homoAsp(H322E/I330V) sowie dem Helferplasmid pNEXT33A ko-transformiert [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318]. Das letztgenannte Helferplasmid vermittelte hierbei über sein Neomycin- Resistenzgen zunächst eine positive Selektion, und die erhaltenen Klone konnten anschliessend auf den Verlust ihrer Chloramphenicol-Kassette und damit die Integration des aspA(H322E/I330V)'-Genfragments untersucht werden. Über eine PCR-Amplifikation dieses Bereiches aus dem Chromosom der selektionierten Klone, sowie eine anschließende DNA- Sequenzierung, konnte die Identität des konstruierten Klons B. subtilis Asn-5 verifiziert werden.The integration of the mutated aspA 'fragment into the surfactin biosynthesis operon was carried out on a tried and tested co-transformation technique ("congression") was used [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318]. The B. subtilis strain AS20 [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318] in which the aspA 'fragment (base pair: 15245- 17177; [Cosmina, P. et al. 1993, Mol. Microbiol. 8: 821-831]) and against that Chloramphenicol transferase gene was substituted. B. subtilis AS20 was designed for a DNA Recording made competent and with the integration vector pSK-homoAsp (H322E / I330V) as well as the helper plasmid pNEXT33A [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318]. The latter helper plasmid mediated via its neomycin Resistance gene first made a positive selection, and the clones obtained were then able to on the loss of their chloramphenicol cassette and thus the integration of the aspA (H322E / I330V) 'gene fragments. Via PCR amplification of this Area from the chromosome of the selected clones, as well as a subsequent DNA Sequencing, the identity of the constructed clone B. subtilis Asn-5 could be verified.

Example 6 Surfactin preparation and analysis.

Die Präparation des Surfactin-Derivats aus B. subtilis Asn-5 erfolgte nach einem Standardverfahren [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318]. Zur Analyse wurde die erhaltene methanolische Lösung mittels eines 'HP1100 Series LC/MSD' HPLC-System unter Verwendung einer PepRPC HR 5/5-Säule Säule (Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Best.-Nr.: 18-0383-01) aufgetrennt. Die Separation der einzelnen Komponenten wurde bei einer Flußrate von 0.7 mL min^-1 durch Anlegen eines linearen Gradienten von 35% bis 70% Acetonitril (v/v) in 0.1% Trifluoressigsäure (v/v) erzielt. Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von 214 nm und durch eine massenspektrometrische Online-Analyse der eluierten Substanzen. Als Kontrolle wurde eine Präparation aus dem Wildtyp-Surfactin-Produzenten B. subtilis ATCC 21332 analog aufgearbeitet und analysiert. The preparation of the surfactin derivative from B. subtilis Asn-5 was carried out according to a standard method [Schneider, A. et al. 1998, Mol. Gen. Genet. 257: 308-318]. For analysis, the methanolic solution obtained was separated by means of an 'HP1100 Series LC / MSD' HPLC system using a PepRPC HR 5/5 column (Pharmacia, Freiburg, Germany, order no .: 18-0383-01) . The separation of the individual components was achieved at a flow rate of 0.7 mL min ^-1 by applying a linear gradient from 35% to 70% acetonitrile (v / v) in 0.1% trifluoroacetic acid (v / v). The detection was carried out at a wavelength of 214 nm and by means of an online mass spectrometric analysis of the eluted substances. As a control, a preparation from the wild-type surfactin producer B. subtilis ATCC 21332 was processed and analyzed analogously.

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Abb. 1 Strukturelle Basis für die Erkennung und Aktivierung von Phenylalanin (aus Conti et al. [Conti et al., 1997, EMBO J. 16: 4174-4183]). (A) Das Bänder-Diagramm zeigt, daß PheA aus zwei Faltungsdomänen, einer großen N-terminalen (unten) und einer kleineren C- terminalen (oben), besteht. AMP und die Substrat-Aminosäure Phenylalanin sind schwarz gezeigt. (B) Die Bindungstasche für Phenylalanin wird von zehn Aminosäuren gebildet. Asp235 und Lys517 vermitteln elektrostatische Wechselwirkungen (gestrichelte Linien) mit der α- Amino- und α-Carboxylgruppe des Substrates. Die eigentliche Bindungstasche, die die spezifische Erkennung der Phenylalanin-Seitengruppe ermöglicht, wird durch Ala236, Ile330 und Cys331 auf der einen, sowie Ala322, Ala301, I299 und Thr278 auf der anderen Seite gebildet. Beide Seiten werden am unteren Ende durch den Indol-Ring des Trp239 voneinander getrennt gehalten. Diese Architektur gestattet es der Bindungstasche von PheA beide Stereoisomere, L- Phe (hellgrau) und D-Phe (dunkelgrau) ohne erkennbare Änderung der Konformation aufzunehmen. Fig. 1 Structural basis for the detection and activation of phenylalanine (from Conti et al. [Conti et al., 1997, EMBO J. 16: 4174-4183]). (A) The band diagram shows that PheA consists of two folding domains, a large N-terminal (bottom) and a smaller C-terminal (top). AMP and the substrate amino acid phenylalanine are shown in black. (B) The binding pocket for phenylalanine is formed from ten amino acids. Asp235 and Lys517 mediate electrostatic interactions (dashed lines) with the α-amino and α-carboxyl group of the substrate. The actual binding pocket, which enables the specific recognition of the phenylalanine side group, is formed by Ala236, Ile330 and Cys331 on the one hand, and Ala322, Ala301, I299 and Thr278 on the other. Both sides are kept separate at the lower end by the indole ring of the Trp239. This architecture allows the PheA binding pocket to accept both stereoisomers, L-Phe (light gray) and D-Phe (dark gray) without noticeable change in conformation.

Abb. 2 Phylogenetischer Baum, konstruiert mit den zehn Spezifität-vermittelnden Aminosäuren der A-Domänen. Die phylogenetische Untersuchung offenbart eine Gruppierung der ermittelten Kodone, gemäß der Spezifität ihrer Herkunftsdomänen (hellgraue Kästen). Dies bestätigt die Richtigkeit des Konzepts der strukturelle Homologie zwischen A-Domänen und zeigt, daß die jeweils ermittelten zehn Aminosäuren wirklich das Kodon für die Erkennung der kognaten Substrat-Aminosäure bilden. Es werden Beispiele gebracht die zeigen, daß die Spezifität von neu-entdeckten Domänen mittels dieser Technik vorhersagbar ist und das die Gruppierung von der experimentell beobachteten Spezifität geleitet wird (dunkelgraue Unterlegung). Dies gilt auch für die konstruierten Mutanten PheA(T278M/A301G) und AspA(H322E), die in der ATP-Pyrophosphat-Austauschreaktion eine Leu bzw. Asn-Spezifität (mittelgraue Unterlegung) zeigen. Fig. 2 Phylogenetic tree, constructed with the ten specificity-mediating amino acids of the A domains. The phylogenetic examination reveals a grouping of the codons determined, according to the specificity of their domains of origin (light gray boxes). This confirms the correctness of the concept of structural homology between A domains and shows that the ten amino acids determined in each case really form the codon for the recognition of the cognate substrate amino acid. Examples are given which show that the specificity of newly discovered domains can be predicted using this technique and that the grouping is guided by the experimentally observed specificity (dark gray background). This also applies to the constructed mutants PheA (T278M / A301G) and AspA (H322E), which show a Leu or Asn specificity (medium gray background) in the ATP-pyrophosphate exchange reaction.

Abb. 3 Schematische Darstellung der postulierten Bindungstaschen von drei Adenylierungsdomänen. Die ermittelten Kodone von drei verschiedenen Substraten ("Asp", "Orn(2)" und "Val(3)"; vgl. Tabelle 1) wurden in die in Abb. 1B gezeigte Darstellung der Bindungstasche von PheA projeziert. Aliphatische (hellgrau), polare (gestreift), acide (weiß) und basische (dunkelgrau) Seitengruppen sind schematisch gezeigt. In allen drei Fällen vermitteln Asp235 und Lys517 Wechselwirkungen mit der α-Amino und α-Carboxylgruppe des jeweiligen Substrats, während alle anderen Reste (Xaa236 bis Xaa331) die eigentliche Erkennung der Seitenkette des Substrates vermitteln. Es kann eine perfekte Korrelation zwischen der Polarität der Bindungstasche und des Substrates für alle gezeigten Beispiele beobachtet werden. Fig. 3 Schematic representation of the postulated binding pockets of three adenylation domains. The codons determined from three different substrates ("Asp", "Orn (2)" and "Val (3)"; see Table 1) were projected into the representation of the binding pocket of PheA shown in FIG. 1B. Aliphatic (light gray), polar (striped), acidic (white) and basic (dark gray) side groups are shown schematically. In all three cases, Asp235 and Lys517 mediate interactions with the α-amino and α-carboxyl group of the respective substrate, while all other residues (Xaa236 to Xaa331) mediate the actual recognition of the side chain of the substrate. A perfect correlation between the polarity of the binding pocket and the substrate can be observed for all the examples shown.

Abb. 4 Beobachtete Variabilität der Konstituenten von verschiedenen Substrat- Bindungstaschen. Die konstituierenden Aminosäuren der verschiedenen Positionen in 160 postulierten Substrat-Bindungstaschen wurden auf ihre Variabilität hin untersucht. Die proportionale Verteilung der Natur der. Substrate in den untersuchten A-Domäne ist im mittelgrauen Kasten dargestellt. Die hellgrauen Kästen, die mit jeder Position der Bindungstasche verbunden sind, geben die Anzahl der beobachteten, verschiedenen Reste (Häufigkeit: = 1%), sowie das proportionale Auftreten von hydrophoben, polaren, aciden und basischen Seitengruppen an diesen Stellen wieder. Aufgrund der gezeigten Ergebnisse können die zehn konstituierenden Aminosäuren in drei Untergruppen klassifiziert werden: (1) Die Positionen 235 (Asp: acid, weiß) und 517 (Lys: basisch, dunkelgrau) sind "invariant". (2) Die Positionen 236, 301 und 330 sind lediglich "bedingt variant". Sie offenbaren ein unterdurchschnittliches Auftreten von geladen und polaren Seitengruppen und die überwiegende Mehrzahl (93%) der untersuchten A-Domänen verwendet aliphatische Reste (grau) an diesen Positionen. Als "höchst variant" können die Positionen 239, 278, 299, 322 und 331 angesehen werden, die eine hochgradige Variabilität im Bezug auf die Verwendung unterschiedlicher Aminosäuren zeigen. Fig. 4 Observed variability of the constituents of different substrate binding pockets. The constituent amino acids of the various positions in 160 postulated substrate binding pockets were examined for their variability. The proportional distribution of the nature of the. Substrates in the examined A domain are shown in the medium gray box. The light gray boxes, which are connected to each position of the binding pocket, indicate the number of different residues observed (frequency: = 1%) and the proportional occurrence of hydrophobic, polar, acidic and basic side groups at these points. Based on the results shown, the ten constituent amino acids can be classified into three subgroups: (1) Positions 235 (Asp: acid, white) and 517 (Lys: basic, dark gray) are "invariant". (2) Items 236, 301 and 330 are only "conditionally variant". They reveal a below average occurrence of charged and polar side groups and the vast majority (93%) of the A domains examined use aliphatic residues (gray) at these positions. Positions "239, 278, 299, 322 and 331 can be regarded as the" highest variant ", which show a high degree of variability with regard to the use of different amino acids.

Abb. 5 Gezielte Veränderung der Substratspezifität von PheA und AspA. Die Substratspezifität von Wildtyp (weiß) und Mutanten (verschiedene Grau-Töne) wurden mit Hilfe von ATP-Pyrophophat-Austauschreaktionen untersucht. Die verwendeten Substrate sind auf der Abszisse dargestellt, und der beobachtete Maximalwert für die Aktivität eines jedes Protein wurde als 100% festgesetzt. (A) Punktmutationen in PheA in Richtung des "Leu(4)"-Kodons (T278M and A301G) erhöhen geringfügig die Seitenspezifität für Leu, während das bevorzugte Substrat immer noch Phe ist. Die entsprechende Doppelmutante (PheA(T278M/A301G); dunkelgrau) aktiviert dagegen bevorzugt Leu mit einer katalytischen Aktivität, die der Effizienz des Wildtyp- Enzyms PheA für Phe in nichts nachsteht. (B) Eine H322E-Punktmutation in AspA reichte aus, um die Substratspezifität der Mutante vollständig von Asp nach Asn zu verschieben. Die beobachteten Aktivierungsmuster der Mutanten stimmen mit der Lage ihrer Kodons im in Abb. 2 gezeigten phylogenetische Baum überein (mittelgraue Unterlegung). Fig. 5 Targeted change in the substrate specificity of PheA and AspA. The substrate specificity of wild type (white) and mutants (different shades of gray) were examined with the help of ATP-pyrophophate exchange reactions. The substrates used are shown on the abscissa and the maximum observed activity for each protein was set at 100%. (A) Point mutations in PheA towards the "Leu (4)" codon (T278M and A301G) slightly increase the site specificity for Leu, while the preferred substrate is still Phe. The corresponding double mutant (PheA (T278M / A301G); dark gray), however, preferentially activates Leu with a catalytic activity that is in no way inferior to the efficiency of the wild-type enzyme PheA for Phe. (B) A H322E point mutation in AspA was sufficient to completely shift the substrate specificity of the mutant from Asp to Asn. The observed activation patterns of the mutants correspond to the position of their codons in the phylogenetic tree shown in Fig. 2 (medium gray background).

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LOG

Claims

1. Method for the targeted non-ribosomal synthesis of peptides predetermined structure, being in a given DNA sequence coding for a non-ribosomal peptide synthetase encoding one or more A domains Sections changed according to the non-ribosomal code presented in Table 1) be that the expression product of the altered DNA sequence the peptide of predetermined structure expressed.

2. The method according to claim 1, wherein in at least one A domain to be changed at most 10, preferably at most 6, particularly preferably at most 3, an amino acid is very particularly preferably exchanged.

3. The method according to claim 1, wherein targeted at the given DNA sequence A- Sections encoding domains can be added or removed to lengthen or longer to synthesize shorter peptides.

4. The method according to at least one of claims 1 to 3, wherein the synthesized Peptides antibiotic, immunosuppressive, cytostatic, antiviral, antihelmitic, have a fungicidal or surface-active effect.

5. The method according to at least one of claims 1 to 4, wherein the modified non- ribosomal peptide synthetase is built into a host organism.

6. The method according to claim 5, wherein the host organism is selected from the Group: bacteria, fungi, yeasts, particularly preferred are Bacilli, Actinomycetes, Myxobacteria, Pseudomonads and Escherichia Coli, is particularly preferred Bacillus subtilis.

7. The method according to claim 5, wherein the host organism is a plant.

8. The method of claim 5, wherein the host organism is a mammal.

9. The method according to claim 8, wherein the host organism is a human.

10. The method according to at least one of claims 1 to 4, wherein the modified one non-ribosomal peptide synthetase is used in isolated form.

11. The method of claim 10, wherein the altered non-ribosomal peptide synthetase is immobilized.

12. The method of claim 11, wherein the altered non-ribosomal peptide synthetase is bound to a carrier.

13. DNA sequence coding for a non-ribosomal peptide synthetase in which one or more A-domains coding sections according to the non-presented in Table 1) ribosomal codes were changed so that the expression product of the changed DNA sequence the peptide of a predetermined structure, which is preferably not corresponds to a natural peptide.

14. DNA sequence according to claim 13, wherein in at least one A- to be changed Domain at most 10, preferably at most 6, particularly preferably at most 3, most preferably an amino acid is exchanged.

15. Use of the DNA sequence according to claim 13 or 14, for the synthesis of Peptides in one of the methods according to claims 1 to 11.

16. Peptides synthesized using one of the methods according to claims 1 to 12 have been.

17. Peptides according to claim 16, which are chemically or biochemically modified.