Die Erfindung betrifft neuartige pharmazeutische Formulierun
gen, in kolloidaler Form, bestehend aus wenigstens einem
biokompatiblen und bioabbaubaren Polymer in Kombination mit
wenigstens einem Wirkstoff, deren wirkort-, wirkart- und
wirkstoffadaptierter Herstellung, und deren Verwendung,
insbesondere auch für die mucosale Wirkstoffverabreichung.
[Stand der Technik]
In der modernen Pharmakotherapie werden Wirkstofformulierun
gen und Wirkstoffkombinationen immer wichtiger, die den(die)
Wirkstoff(e) in eine applizierbare Form bringen und dabei
besonders die Wirkstoffstabilität, dessen Bioverteilung,
Bioverfügbarkeit und/oder Resorption positiv beeinflussen.
Durch große Fortschritte in der Molekularbiologie, Gen- und
Biotechnologie wird zunehmend eine immer größere Anzahl an
pharmakologisch aktiven Wirkstoffen, wie z. B. Proteinen,
Glycoproteinen, Peptiden, Oligonucleotiden sowie DNA Kon
strukten und Wachstumsfaktoren, zugänglich. Allerdings ist
die human- oder auch veterinärmedizinische Anwendung dieser
Substanzen ohne geeignete Trägersysteme durch zahlreiche
unerwünschte Nebenwirkungen erschwert bzw. sogar zum Teil
nicht möglich.
Insbesondere für Impfstoffe, wie z. B. Tetanus- und Diphterie-
Toxoid, sowie virale Antigene, fehlen derzeit geeignete
Trägersysteme, die eine einfache, billige, für den Patienten
angenehmere und besonders im Hinblick auf die Erreichbarkeit
von Patienten, z. B. in der 3. Welt, zuverlässige Immunisie
rung ermöglichen.
Literaturbeschriebene Versuche zeigen, daß mittels parentera
len biopolymeren Depot- bzw. Retardierungsformulierungen in
Implantat- oder Mikropartikelform zwar eine prinzipielle
Verbesserung erreichbar ist, dennoch bleiben bisher deutliche
Erfolge für diese Systeme aus, was nicht zuletzt auch auf den
Mangel an geeigneten biopolymeren Trägern zurückzuführen ist.
Daher wurde vielerorts auch einen anderer, gezielteren Weg
für die Verabreichung von pharmokologisch relevanten Wirk
stoffen beschritten. Es ist bereits literaturbekannt, daß
partikuläre Systeme bei Applikation auf Schleimhäuten von
spezifischen Strukturen des mukosalen Immunsystems (MALT:
mucosa associated lymphoid tissues) im günstigsten Falle
resorbiert werden können. Hierbei kamen allerdings bisher nur
Systeme zum Einsatz, bei denen die beobachteten Transportphä
nomene auf eine weitestgehend unspezifische Resorption hin
deuten. Dabei deutet sich allerdings an, daß eine Partikel
größenabhängigkeit vorliegen könnte.
Erste literaturbeschriebene Versuche, auf diesem Wege auch
pharmakologisch aktive, niedermolekulare Substanzen, die mit
solchen kolloidalen Systemen assoziiert sind, in den Körper
zu transportieren, zeigten bereits vielversprechende Ergeb
nisse.
Hingegen sind makromolekulare, meist hydrophile Wirkstoffe
bislang diesen Invasionsverfahren nicht zugänglich, was
insbesondere auf den Mangel geeigneter Trägerpolymere sowie
auf die bisher bekannten, zu "aggressiven" Partikelherstel
lungstechnologien zurückzuführen ist.
Probleme bei der Assoziation der meist hydrophilen, makromo
lekularen, pharmakologisch aktiven Wirkstoffe mit polymeren
oder partikulären Systemen liegen also zum einen in ihrer oft
zu geringen Stabilität gegenüber den üblichen Herstellungs
weisen, z. B. zu agressive Polymerisationsverfahren oder
Dispergierverfahren, wie Hochdruckhomogenisation oder Ultra
schalldispergierung, bzw. den bei diesen Verfahren herrschen
den Bedingungen (Temperaturerhöhung, Kontakt mit lipophilen
Lösungsmitteln, etc).
Weitere Probleme liegen aber auch insbesondere bei bisher
nicht ausreichenden Kompatibilität und Interaktion zwischen
Träger(-polymer) und Wirkstoff. Biokompatible Polymere wurden
zwar bereits für die Verwendung in Retardierungsformulierun
gen (Depotsysteme) vorgeschlagen, Ansprüche bzw. Ausführungs
beispiele im Sinne der vorliegenden Erfindung fehlen aber
bisher. Besonders die bewußte Adaption aller Komponenten,
also insbesondere Trägerpolymer(e), Wirkstoff(e), Applikati
onsart(en) und -ort(e), etc., an die besonderen Bedürfnisse
derartiger Anwendungen wurde bisher nicht gezielt angestrebt.
[Aufgabe der Erfindung]
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, pharma
zeutische Formulierungen vorzusehen, die aus wenigstens einem
biokompatiblen und bioabbaubaren Polymer (Komponente 1) und
wenigstens einem Wirkstoff (Komponente 2) bestehen und als
kolloidales Systemen (d. h. also partikulär im Mikron- und
Submikron-Größenbereich) vorliegen, die sich gegenüber be
kannten Trägersystemen auszeichnet durch
- 1. die Fähigkeit, die meist makromolekularen, hydrophilen
Wirkstoffe in biologisch aktiver Form unbeschadet zu as
soziieren.
- 2. die Fähigkeit, die unter 1. genannten Assoziate, wenn
erforderlich, steuerbar zum therapeutisch sinnvollen Ziel
ort zu führen.
- 3. die Fähigkeit gemäß 1. und 2., daß dieser Zielort der
mucosale Zielort ist.
- 4. eine geringere Zahl notwendiger Verfahrensschritte wäh
rend der Herstellung.
- 5. Biokompatibilität und Bioabbaubarkeit des Trägerpolymers.
- 6. eine geringere toxische Wirkung auf das umgebende Gewebe.
- 7. eine ausreichend lange Verweilzeit, gemäß 3. auf mukosa
len Oberflächen.
- 8. eine Wirkstoffanreicherung, gemäß 3. auf mukosalen Ober
flächen.
- 9. eine eventuell erforderliche ausreichende zelluläre
Aufnahme.
- 10. gemäß 3., die Fähigkeit zur Induktion einer Immunantwort,
wenn der relevante Wirkstoff ein Antigen zur Immunisie
rung ist.
- 11. gemäß 10., die Fähigkeit zur Induktion einer Immunant
wort, wenn der relevante Wirkstoff ein DNA Konstrukt ist.
Daher ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung,
schonende Verfahren zur Herstellung derartiger pharmazeuti
scher Zubereitungen vorzusehen, die den Anforderungen von
einem oder mehreren der Teilaspekte 1. bis 11. entsprechen,
und für deren Herstellung wenigstens ein Trägerpolymer (Kom
ponente 1) sowie wenigstens ein relevanter biologisch aktiver
Wirkstoff (Komponente 2), der allein oder in pysikalisch oder
chemischer Form assoziiert vorliegen kann, zum kolloidalen
Trägersystem vereint werden sollen.
Dazu ist es als weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung
nötig, geeignete Trägerpolymere zur Verfügung zu stellen, die
den oben genannten Aufgaben/Aspekten entsprechen.
[Lösung der Erfindung]
Das Auffinden geeigneter Trägerpolymere wird gemäß der vor
liegenden Erfindung durch verzweigte Polyolester gelöst,
welche aus einem Zentralmolekül (ladungsmodifizierte und
ungeladene Polyole), an das kurzkettige, bioabbaubare Hy
droxycarbonsäureestergruppierungen angehängt sind, bestehen.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die Einstellbar
keit des amphiphilen Charakters, also der Balance von hydro
phoben, hydrophilen und gegebenenfalls geladenene Bestand
teilen, der somit ebenfalls erfindungsgemäßen Trägerpolymere
in unerwarteter Weise dazu geeignet ist, diese mit suffizien
ten Mengen an relevanten Wirkstoffen zu assoziieren, sowie
diese Assoziate dann in kolloidaler Form z. B. zu, auf und
durch Zellbarrieren zu tragen.
Zu den Eigenschaften der Polymere, die sich überraschend als
definiert einstellbar herausstellten, zählen neben dem amphi
philen Charakter unter anderem auch deren Löslichkeit. Sie
ließ sich für das breite Spektrum von Wasserlöslichkeit bis
hin zur Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln einstellen,
wobei der erfindungsgemäß bevorzugte Bereich toxikologisch
unbedenkliche Lösungsmitteln beeinhaltet: von Wasser über
Alkohole (wie z. B. Ethanol) und Ester (wie z. B. Ethylacetat)
bis hin zu Ketonen (wie z. B. Aceton), sowie auch deren Kombi
nationen.
Die Löslichkeit in Wasser ließ sich darüberhinaus überra
schenderweise nicht nur im Bereich von gut bis schlecht
löslich einstellen, sondern es wurde eine, in Abhängigkeit
der Polymergesamtzusammensetzung einstellbare Untere Kriti
sche Entmischungstemperatur (LCST) aufgefunden.
Erfindungsgemäße Trägersysteme bestehen aus wenigstens einem
bioabbaubaren und biokompatiblen Polyolester und wenigstens
einem relevanten Wirkstoff (also Komponente 1 und 2). Die
Eigenschaften der Trägerpolymere (Komponente 1) können dabei
sowohl bezüglich ihres Transportsportverhaltens in vivo als
auch bezüglich ihrer Kompatibilität zu bzw. ihrer Interaktion
mit Wirkstoffen synthetisch optimiert werden. Weiterhin
lassen diese Eigenschaften auch die Auswahl der zu verwenden
den schonenden Herstellungstechnologie des erfindungsgemäßen
Trägersystems (gemäß der zweitgenannten Aufgabenstellung) zu.
- A) Im Falle von definiert eingestellter Löslichkeit der
Polymere in Wasser, besteht die Herstellungstechnolo
gie für die pharmazeutischen Formulierungen nach Teil
aufgabe 2 darin, daß die Herstellung des erfindungs
gemäßen Trägersystems durch überraschend gefundene
spontane in-situ Ausbildung von somit ebenfalls er
findungsgemäßen kolloidalen Polymer-Wirkstoff-
Komplexen erfolgt, wenn eine Lösung A mit Komponente
B vereinigt wird. Dabei muß Lösung A ein erfindungs
gemäßes Polymer enthalten und Komponente B ist wenig
stens ein relevanter Wirkstoff oder enthält diese(n)
in chemisch gebundener oder physikalisch assoziierter
Form. Komponente B kann dabei a) selbst Bestandtteil
von Lösung A oder b) eine zweite Lösung sein.
- B) Ist, z. B. aus Kompatibilitätsgründen zum Wirkstoff,
eine höhere Lipophilie der Polymere erwünscht, wird
die Löslichkeit der Polymere definiert auf Löslich
keit in untoxischen organischen Lösungsmitteln bzw.
auch Lösungsmittelgemischen, wie z. B. Estern, Ethern,
Alkoholen, Ketonen eingestellt und dann erfindungsge
mäß als Herstellungstechnologie eine modifizierte
Solvent Deposition Methodik bevorzugt, bei dem erfin
dungsgemäße Trägersysteme zeitgleich (in-situ) oder
in einem nachgeschalteten Schritt adsorptiv oder che
misch mit wenigstens einem relevanten Wirkstoff asso
ziiert werden.
Komponente 1
Polymere und deren Herstellung
Die somit als eine Komponente des erfindungsgemäßen Trägersy
stems dienenden verzweigten Polyolester, bestehend aus einem
Zentralmolekül (modifizierte und unmodifizierte Polyole), das
durch das gezielte synthetische Anhängen kurzkettiger bioab
baubarer Hydroxycarbonsäureestergruppierungen eigenschaftsmo
difiziert und eigenschaftsoptimiert ist, werden bevorzugt
durch sog. Melt Grafting hergestellt.
Erfindungsgemäß bevorzugtes Melt Grafting bezeichnet dabei
die Reaktion von einer oder mehreren Hydroxycarbonsäure/n in
dimerer oder Laktonform (im folgenden auch als Monomere
bezeichnet) oberhalb eines ihrer Schmelzpunkte in Gegenwart
des/der Zentralmoleküle unter Verwendung eines zur ringöff
nenden Polymerisation geeigneten Katalysators.
Katalysatoren können alle zur Ringöffenden Polymerisation
geeigneten Substanzen sein, bevorzugt werden aber untoxische
und durch z. B. die FDA zugelassene Katalysatoren, wie Zinn
und dessen Salze, Zink und dessen Salze sowie Hydride wie
z. B. Calciumhydrid.
Besonderheit dieser Reaktion zur gezielten Einstellung der
Eigenschaften der erfindungsgemäßen Trägerpolymere ist dabei
zum einen, daß sich die Zentralpolyole in definiertem, aus
reichenden Maße bei erfindungsgemäß bevorzugtem Melt Grafting
in der Schmelze der Monomere lösen müssen. Dann können durch
geeignete Auswahl der Synthesebedingungen (Mengenverhältnis
se, Reaktionstemperatur und Reaktionszeit, Wahl des Zentral
polyols, etc.) die erforderlichen Eigenschaften des Zentral
polyols gezielt manipuliert und auf die Anforderungen des
Trägersystems zugeschnitten werden.
Zentralpolyole sind daher bevorzugt:
- a) lineare synthetische Polymere mit <6 bis 500 Hydroxyl
gruppen, insbesondere Polyvinylalkohole (PVA) mit Polyme
risationsgraden von <6 bis 500 (und Verseifungsgraden von
70 bis 98%, sofern durch Hydrolyse von Poly(vinylacetat)
erhalten);
- b) lineare synthetische Vinylcopolymere, insbesondere des
Polyvinylalkohols, mit <6 bis 500 Hydroxylgruppen, insbe
sondere mit Vinylacetat, Vinylpyrrolidonen, Vinylaminen,
Vinylimidazolen, Vinylpyridinen, Vinylsulfonsäuren,
Vinylphosphorsäuren.
- c) lineare, verzweigte oder cyclische, geladene oder ungela
dene Polysaccharide, insbesondere Stärken oder Bestand
teile, Glycogene, Cellulosen oder Bestandteile, Dextrane,
Tunicine, Inuline, Chitine, Alginate, Pektine, Mannane,
Galactane, Xylane und andere Polyosen, Chondroitinsulfa
te, Heparin, Hyaluronsäure und andere Glykosaminoglykane,
Mureine, Dextrine, Cyclodextrine, Chitosane, sowie insbe
sondere deren teilhydrophobisierte Derivate, wobei Hydro
phobisierung durch Methyl- und/oder Ethyl-Ether, -Ester
und/oder -Urethan-Verknüfung erreicht ist.
- d) insbesondere oben aufgeführte Polyole, mit der Besonder
heit, daß sie zusätzlich eine odere mehrere Carboxyl-,
Sulfobutyl- oder Sulfopropyl-Gruppe(n) und/oder Butyla
min-, Propylamin- oder Ethylamin- (primäres, sekundäres,
tertiäres oder quärtäres Amin, wobei entsprechende N-
Substituenten insbesondere -H, -CH3 und/oder -C2H5-
Gruppe(n) darstellen) -Gruppe(n) enthalten, die in Form
von Ether-, -Ester- oder -Urethan-Verknüpfung an das Po
lyol gebunden sind.
Im Falle von Polyolen, die geladene und/oder protonierbare
und/oder deprotonierbare Gruppen tragen, auch deren Alkali
metall- bzw. Halogen-Salze, insbesondere deren Natrium- bzw.
Chloridsalze.
Da zu den erfindungsgemäß bevorzugten Zentralpolyolen eben
falls Polysaccharide gehören, muß bei deren Verwendung eine
ausreichende Löslichkeit und Stabilität in der Schmelze der
Monomere gewährleistet sein. Bei nichtladungsmodifizierten
Polysacchariden wird dies z. B. durch literaturbekannte ge
zielte Teilacylierung erreicht.
Bei ladungsmodifizierten Polysacchariden wird die zusätzlich
eingeführte Hydrophille, bedingt durch die ladungstragenden
und/oder (de)protonierbaren Gruppe(n), durch geeignete ali
phatische lipophile Spacerkettenlänge überkompensiert. Dies
wird z. B. wie bereits oben ausgeführt durch Sulfobutyl- oder
Sulfopropyl-Ether-, -Ester- oder -Urethan-Gruppen und/oder
Butylamin- oder Propylamin- (primäres, sekundäres, tertiäres
und/oder quartäres Amin, wobei entsprechende N-Substituenten
bevorzugt -H, -CH3 und/oder -C2H5-Gruppe darstellen) -Ether, -Ester
oder -Urethan-Gruppen erreicht.
Nur wenn diese Löslichkeit der Zentralpolyole gewährleistet
ist, können z. B. über Syntheseeinwaagemengen, Wahl und Menge
des Katalysator(-systems)s, Reaktionstemperatur(en) und -Zeit(en)
die erfindungsgemäß erforderlichen Eigenschaften der
Trägerpolymere (Komponente 1) adäquat eingestellt werden,
z. B. über die Länge der Hydroxycarbonsäuregruppierungen. Ein
Kriterium, daß dann z. B. mit bekannten spektroskopischen
Analysemethoden - wie der NMR Spektroskopie - leicht über
prüft werden kann.
Besonderheit dieser Reaktion zur gezielten Einstellung der
Eigenschaften der erfindungsgemäßen Trägerpolymere ist wei
terhin, daß erst die Kombination aus geeignetem Zentralpolyol
bzw. dessen Eigenschaften und der Wahl des/der Monomer(e),
sowie der Reaktionsbedingungen im Hinblick auf spätere(n)
Wirkstoff(e), dessen/deren Assoziation mit dem polymeren
Träger sowie dessen/deren schoneneden Herstellung und des
sen/deren in-vivo Transportverhalten zu einem erfolgver
sprechenden Trägersystem führt.
Die zur Eigenschaftsadaption der Zentralpolyole bevorzugten
Hydroxycarbonsäureestergruppierungen werden bevorzugt durch
Reaktionsprodukte von Dimeren/Anhydriden/Lactonen von Hy
droxycarbonsäuren (Monomere) hergestellt. Hierbei kommen alle
die in Frage, deren Polymerisationsprodukte als biologisch
unbedenklich gelten. Erfindungsgemäß bevorzugt werden L-
Lactid, D,L-Lactid und Glycolid, da diese in-vivo leicht zu
Milch- und Glycolsäure metabolisiert werden können.
Hierbei hat sich beispielhaft überraschend herausgestellt,
daß insbesondere Verhälnisse Polyol-OH-Gruppe zu Säurebauein
heit im Bereich von 0,6 : 1 bis 6 : 1, insbesondere im Bereich
von 1 : 1 bis 3 : 1 zur Bildung von wasserlöslichen Trägerpo
lymeren führt, die in den Beispielen ausgeführten Fällen
zudem noch eine Untere Kritische Entmischungstemperatur im
Wäßrigen besitzen.
Desweiteren hat sich herausgestellt, daß - wenn die Hydroxy
carbonsäuregruppierungen am Zentralpolyol jeweils aus 1 bis
100, und insbesondere 5 bis 50 Bausteinen zusammengesetzt
sind - eine Löslichkeit in z. B. Aceton resultiert.
In der Literatur werden zwar Polyolester auf der Basis eines
Polyols mit Poly(hydroxycarbonsäuren)seitenketten für bio
medizinische Anwendngen vorgeschlagen. Gezielte Studien zur
synthetischen Einstellung der Polymereigenschaften und im
besonderen der Einstellung der Polymereigenschaften auf die
besonderen Bedürfnisse der erfindungsgemäßen Ansprüche fehlen
aber völlig.
Beispielhaft diesen Literaturbefund erläuternd seien daher an
dieser Stelle genannt: EP 0 407 617 beschreibt zwar Reaktions
produkte aus Poly(hydroxycarbonsäureestern) und Sacchariden,
ebenso beschreiben DE 34 30 852 A1 und DE 40 21 517 A1 Polymere aus
Poly(hydroxycarbonsäureestern) und Polyolen, Ansprüche bzw.
Ausführungsbeispiele im Sinne der erfindungsgemäßen kolloida
len Trägersysteme fehlen aber völlig. WO 95/23175 beschreibt
Poly(hydroxycarbonsäureester)-Polyole und deren Verwendung
als Depotmatrixsystem für die Retardierung von pharmakolo
gisch aktiven Substanzen. Ansprüche bzw. Anwendungsbeispiele
im Sinne des erfindungsgemäßen kolloidalen Trägersystems,
insbesondere zur mucosalen Wirkstoffverabreichung fehlen.
Desweiteren ist die gezielte Steuerung der Polymereigenschaf
ten nicht beschrieben, sowie überhaupt die prinzipielle
Möglichkeit bei dort angeführten Beispielen anzuzweifeln. USP 4745160
beschreibt bioabbaubare amphipathische Copolymere,
USP 5210108 abbaubare Schaummaterialien, erfindungsgemäße
Ausführungsbeispiele bzw. Ansprüche fehlen völlig. USP 5612412
sowie USP 5712334 beschreiben die Synthese von lac
tonmodifizierten Polyvinylalkololen (PVA), der vorliegenden
Erfindung entsprechende Ansprüche bzw. Ausführungsbeispiele
fehlen aber vollständig. USP 5331045 beschreibt die Synthese
von poly(hydroxycarbonsäureester)modifizierten Polyvinylalko
holen (PVA) durch Polykondensation von PVA mit monomeren
Hydroxycarbonsäuren. Ein Verfahren, das nach derzeitigem
Stand der Technik Verunreinigungen in Form von Poly(hydroxy
carbonsäureester)-Homopolymeren nicht ausschließt,
was eine derartige Herstellung für die erfindungsgemäßen
kolloidalen Trägersysteme als nicht wünschenswert erscheinen
läßt.
Komponente 2
Wirkstoffe
Überraschend wurde gefunden, daß alle relevanten und insbe
sondere hydrophile Wirkstoffe erfindungsgemäß herangezogen
werden können. Erfindungsgemäß bevorzugt werden daher alle
Wirkstoffe, die ausgewählt werden aus der Gruppe: aktive
Peptide, Proteine, Enzyme, Enzyminhibitoren, Antigene, Cyto
statika, Antiinflammatorika, Antibiotika, DNA Konstrukte und
Wachstumsfaktoren.
Erfindungsgemäße Trägersysteme dienen aber insbesondere auch
- allerdings ohne darauf eingeschränkt zu sein - gem. Teil
aspekten 3. bzw. 8. bis 11. der ersten Aufgabenstellng als
kolloidale Träger für mukosale bzw. transmukosale Verabrei
chung von relevanten hydrophilen Wirkstoffen, wie z. B. Pro
teinen, Peptiden, Oligonucleotiden und DNA Konstrukten sowie
auch lipophilen Wirkstoffen, wie z. B. Corticosteroiden und
steroiden Sexualhormonen.
Erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierungen zur mukosalen
Applikation können dabei in unterschiedlicher Weise verab
reicht werden, z. B. sublingual, buccal, oral, nasal, pulmo
nal, vaginal, okular oder gastrointestinal.
Derartige Formulierungen sind für alle pharmazeutisch rele
vanten, biologisch aktiven Stoffe von Interesse, wenn ein
Wirkstofftransport an, in oder durch die Mukosa erwünscht
ist. Besonders vorteilhaft sind sie für Wirkstoffe, die ohne
den Einsatz eines erfindungsgemäßen kolloidalen Trägersystems
bei sublingualer, buccaler, oraler, nasaler, pulmonaler,
vaginaler, okularer oder gastrointestinaler Verabreichung
zerstört oder inaktiviert werden, bzw. für die eine hohe
lokale mukosale Konzentration erwünscht ist.
Erfindungsgemäß für mukosale Verabreichung bevorzugte Wirk
stoffe (WS) sind demnach:
- 1. Gruppe der hydrophilen makromolekularen pharmakologisch
relevanten WS:
- 1. 1.1 Impfstoffe, die ausgewählt werden der Gruppe: Lebend-
Impfstoffe, Tot-Impfstoffe, Toxoid-Impfstoffe, DNA Konstrukte
sowie deren adjuvierte Zubereitung und gerichtet sind gegen
pathogene Keime bzw. deren pathogenen Metaboliten, von denen
literaturmäßig der mukosale Penetrationsweg bekannt ist bzw.
die vorwiegend auf mukosalen Oberflächen kolonisieren, wie
z. B. Helicobacter pylori, typhiforme Salmonellen, Vibrio
cholerae, Neisserien (N. gonorrhoee, N. meningitidis), Enta
moeba histolytica, Haemophilus influenzae, Bordetella pertus
sis, Hepatitis A-Viren, colon- bzw. vagina-kolonisierende
Staphylokokken, Streptokokken Typ A & B, Klebstellen (K. pneu
moniae, K. oxytoca, K. rhinoscleromatis), Shigellen,
Yersinien, Vibrionen, Pseudomonas aeroginosa, Legionellen,
Korynebakterium diphtheriae, Bacillus anthracis, Mycobakterien
(M. tuberkulosis, M. leprae), Treponema palli-dum, My
coplasma pneumoniae, Chlamydien (C. trachomatis, C. pneumo
niae), Polio-Viren, Rhino-Viren, Myxoviren (Masern-V., Mumps-
V., Parainfluenza-V.), Röteln-Virus, Rotaviren, Adeno-Viren,
Influenzaviren, Herpes-Viren (Varizellen-Zoster-Virus, Zyto
megalievirus, Herpes Simplex Viris, EBV), HAV, HEV
- 2. 1.2 Impfstoffe, die ausgewählt werden der Gruppe: Lebend-
Impfstoffe, Tot-Impfstoffe, Toxoid-Impfstoffe, DNA Konstrukte
sowie deren adjuvierte Zubereitung und gerichtet sind gegen
pathogene Keime bzw. deren pathogenen Metaboliten, bei denen
bekanntermaßen ein parenteraler Infektionsweg vorliegt, aber
eine mukosale Applikation systemische, spezifische Immunglo
bulintiter hervorruft, wie z. B. Clostridium tetani, Clostri
dium botulinum, Yersinia pestis, Borrelia burgdorferi, Toll
wut-Virus, HIV-1 & HIV-2, HBV, HCV, HDV
- 2. Gruppe der lipophilen pharmakologisch relevanten Wirkstof
fe, wie z. B. Corticosteroide, steroidale Sexualhormone,
Cyclosporin A, Nystatin, Amphotericin B, Clotrimazol, Econa
zol, Miconazol, Fluconazol, Itraconazol, Bifonazol, sowie
Antibiotika
Herstellung der kolloidalen Assoziate
[I] Polymer-Wirkstoff-Komplexe
(Lösung Aufgabe 2 - Methode 1)
Die Erfindung betrifft pharmazeutische Formulierungen, die in
Form von Polymer-Wirkstoff-Komplexen in kolloidaler Form aus
mindestens einem Polymer und mindestens einem Wirkstoff
bestehen. Der Wirkstoff kann dabei selbst ein Partner in dem
Komplex sein oder an einem Partner des Komplexes gebunden
sein. Dabei wurde überraschend gefunden, daß erfindungsgemäße
Polymere mit relevanten Wirkstoffen spontan selbstassemblie
rende Assoziate, hier auch Komplexe genannt, ausbilden und
daß deren Eigenschaften über einfache Parametervariationen
manipuliert und optimiert werden konnten.
Es ist bereits literaturbekannt, daß geladene Makromoleküle
mit Ionen entgegengesetzter Ladung ionische Verbindungen
bilden, die oft, abhängig von der Ladungsverteilung, dem
Molekulargewicht und der Hydrophobizität des Endprodukts, aus
wäßrigen Lösungen ausfallen. Dabei werden niedermolekulare
Ionen gleicher Ladung durch die höhermolekulare Verbindung
verdrängt, Phänomene, die unter dem Oberbegriff "Polyelektro
lyteffekt" zusammengefaßt werden. Stand der Technik sind
unter anderem die Ausbildung von Gelen (Zusammengeben von
Alginatlösungen und Ca2+) oder auch Proteinfällungen. Derar
tige Polyelektrolytkomplexe können prinzipiell entweder aus
einer makromolekularen, mehrfach geladenen Komponente einer
Polarität und vielen niedermolekularen Ionen der anderen
Polarität, oder aber aus zwei makromolekularen, jeweils
mehrfach geladenen Partnern verschiedener Polarität bestehen.
Hohlkapseln, die aus solchen Polyelektrolytkomplexen herge
stellt werden, sind beispielsweise beschrieben in BE-A 9 01 704,
EP-A 01 27 989, EP-A 01 88 309, EP-A 01 27 713, DE-A 32 09 127,
EP-A 01 52 898, US 44 87 758, DE-A 32 09 098, US 44 09 331.
Es ist ebenfalls literaturbekannt, z. B. in
DE 00 040 13 110 A1 beschrieben, daß Polyelektrolytkomplexe in
mikropartikulärer Form hergestellt werden können und dabei
eine Verbesserung der therapeutischen Einsetzbarkeit und
Breite eines Wirkstoffes ermöglichen.
Überraschend wurde nun aber gefunden, daß auch die erfin
dungsgemäßen bioabbaubaren, somit toxikologisch völlig unbe
denklichen Polymere, selbst ohne eindeutige Polyelektrolyteigen
schaften Komplexe mit pharmakologisch relevanten Wirkstof
fen spontan, aufgrund hydrophiler-hydrophober Wechselwirkung,
ausbilden. Desweiteren überraschend ist die einfach Steuer
barkeit dieser Wechselwirkung durch gezielte Trägermpolymer
manipulation von hydrophiler-hydrophober Wechselwirkung bis
hin zu interionischer Wechselwirkung. Somit zeigen diese
Polymere in besonderem Maße ebenfalls als Trägersubstanzen
Eigenschaften, die nicht nur dem Anforderungsprofil biokompa
tibler und bioabbaubarer Polymersysteme entsprechen, sondern
die auch durch geringfügige Variation in der Herstellung den
besonderen Anforderungen eines Therapeutikums, insbesondere
auch zur mucosalen Wirkstoffverabreichung leicht angepaßt
werden können.
Überraschenderweise wurden selbst für die unmodifizierten,
somit keine eindeutigen Polyelektrolyteigenschaften besitzen
den, erfindungsgemäßen Kolloide hohe Wirkstoffassoziation
(Beladungen) gefunden, die eigentlich nicht zu erwarten
gewesen wären, desweiteren ließ sich der Beladungsgrad durch
gezielte Auswahl des Trägerpolymers (Komponente 1) manipulie
ren und optimieren.
Es war ferner überraschend, daß sich bei der Herstellung
solcher Komplexe feine Partikel mit steuerbarer Größe von nm-
bis hin zum µm-Bereich bildeten und nicht - wie eigentlich zu
erwarten war - nur eine verklumpte Masse.
Dabei sind Partikelgrößen, bewußt im Bereich von unter 100 nm
bis zu einigen µm gehalten, und Teilchengrößen/-verteilung
leicht einstellbar, beispielsweise über die Wahl des/der
Trägerpolymere, der eingesetzten Konzentrationen, Salzkonzen
trationen, Ionenstärken, pH-Werte, Temperaturen, etc. Die
erforderlichen Parameter können dabei in entsprechenden
Vorversuchen leicht ermittelt und an die gewünschte Anforder
nisse eines Therapeutikums, insbesondere auch zur mucosalen
Wirkstoffverabreichung angepaßt werden.
Weiterhin war überraschend, daß mit Hilfe derartiker komplex
artiger Assoziate hohe lokale Wirkstoffkonzentrationen auf
relevanten Zellgeweben erzeugt werden können.
Erfindungsgemäß lassen sich derartige selbstassemblierenden
kolloidalen Systeme besonders gut durch erfindungsgemäße
Polymer-Wirkstoff-Komplexe herstellen. Über äußere Einflüsse,
wie Lösungsgleichgewichte, Ladungswechselwirkungen, pH-
Änderungen, etc. kann weiterhin, sofern aus therapeutischer
Sicht erforderlich, in vivo ein langsames Dekomplexieren,
also Wirkstofffreigabe erreicht werden. Diese Freigabebedin
gungen können ebenfalls wie die Konsistenzeigenschaften über
die Komplexzusammensetzung gesteuert werden.
Die Vorteile derartiger sich spontan aus wäßrigen Lösungen
ausbildenen Systemen liegen auf der Hand, u. a. sind keine
besonderen Herstellungstechnologien nötig, es sind nicht
zwingend, die Eigenschaften des Therapeutikums mindernden
Hilfsstoffe, wie z. B. organische Lösungsmittel, Emulgatoren
etc. notwendig, wodurch erfindungsgemäß ein schneller, repro
duzierbarer und kostengünstiger Weg gefunden wurde, effiziente
Therapeutika zu erhalten, insbesondere auch im Hinblick
auf mucosale Wirkstoffverabreichung.
[II] Herstellung und Beladung erfindungsgemäßer kolloidaler
Trägersysteme mittels modifizierter Solvent-Deposition
(Lösung Aufgabe 2 - Methode 2, für lipophilere Polymere)
Da, wie bereits ausgeführt, die meisten Herstellungstechniken
besonders für sensitive Wirkstoffe ungeeignet sind, wird zur
Herstellung des erfindungsgemäßen Trägersystems weiterhin
eine adaptierte und optimierte sogenannte Solvent-Deposition-
Methodik bevorzugt, mit der erfindungsgemäße Kolloide leicht
und reproduzierbar hergestellt werden können, sofern die
Verwendung eines lipophileren, somit nicht mehr wasserlösli
chen Trägerpolymers erwünscht bzw. erforderlich ist.
Diese Herstellungsmethodik, die sich von der 1986 von Fessi
eingeführten Nanopartikel-Herstellungsmethode [USP 5118528,
USP 5049322] ableitet, basiert auf der kontrollierten Fällung
eines gelösten Polymers in einem Nichtlösungsmittel und
erlaubt somit die Herstellung von partikulären Systemen im
Mikron- und Submikrongrößenbereich ohne vorgeschaltete Emul
sifikations- bzw. Dispergierschritte. Sie wurde für erfin
dungsgemäße Trägersysteme, insbesondere auch zur mucosalen
Wirkstoffverabreichung durch Wahl des geeigneten Polymer/Lösungs
mittel/Nichtlösungsmittel/(Emulgator)-Systems
optimiert.
Dabei wurden auch hier Partikelgrößen erfindungsgemäß bewußt
auf einen Bereich von unter 100 nm bis zu einigen µm einge
stellt. Auch die Breite der Teilchengrößenverteilung ist
leicht einstellbar, beispielsweise über die Konzentration der
eingesetzten Polymerlösung, die Zugabegeschwindigkeit, Emul
gatoranteil und durch geeignete Auswahl eines in definierten
Anteilen zugesetzten Kosolvenz. Auch diese Parameter können
in entsprechenden Screenings leicht ermittelt und an die
gewünschte Anfordernisse angepaßt werden, insbesondere konn
ten sie dadurch für die erfindungsgemäße mucosale Wirkstoff
verabreichung optimiert werden.
Dabei wurde gefunden, daß sich der Größenbereich von unter
500 nm Durchmesser erfindungsgemäß besonders gut zur Mukosal
applikation eignet, sich eine erhöhte Wirkstoffkonzentration
auf relevanten Zellen einstellte, sowie in vivo eine entspre
chende Immunantwort erzielen ließ.
Mit erfindungsgemäßen Polyolestern lassen sich derartige
kolloidale Trägersysteme besonders gut herstellen. Aufgrund
der gezielt manipulierten Eigenschaften der Trägerpolymere
wurde weiterhin überraschenderweise gefunden, daß auf den
Einsatz von zusätzlichen Emulgatoren zur Stabilisierung
völlig oder weitestgehend verzichtet werden konnte, was nicht
nur die gleichzeitige Erhaltung der gezielt eingestellen
Oberflächeneigenschaften des erfindungsgemäßen Trägersystems
ermöglichte, sondern auch die Zahl der einzusetzenden Kompo
nenten/Verfahrenschritte reduziert und somit die Herstel
lung vereinfacht und verbilligt.
Die Assoziation dieses Systems mit Wirkstoff(en) kann auf
wenigstens fünf Arten erfolgen:
- 1. durch Adsorption des Wirkstoffs aus einer Lösung, mit der
die bereits hergestellten Polymer-Kolloide nach Lösungs
mittelentzung in Kontakt kommen
- 2. durch in-situ-Adsorption des Wirkstoffs aus einer Lösung,
mit der die gerade hergestellten Polymer-Kolloide vor Lö
sungsmittelentzung in Kontakt kommen
- 3. durch in-situ-Einschluß des Wirkstoffs in die Polymerma
trix während der Partikelbildung und anschließendem Lö
sungsmittelentzung
- 4. durch kovalente Bindung, wobei der Wirkstoff chemisch an
mindestens eine funktionelle Gruppierung des eingesetzten
Polymers gebunden ist.
- 5. durch kovalente Bindung an die Partikeloberfläche, wobei
der Wirkstoff chemisch an mindestens eine funktionelle
Gruppierung der Partikel gebunden ist.
Wegen der einerseits weit variablen, andererseits sehr spezi
fisch einstellbaren Eigenschaften zeigen erfindungsgemäße
Polymerkolloid-Wirkstoff-Formulierungen Eigenschaftsprofile,
die sie insbesondere auch für eine mukosale Applikation
prädestinieren.
Dabei ist zusammengefaßt für beide Kolloidherstellungsweisen
[(I) und (II)] eine Besonderheit der Erfindung, daß das
jeweilige biokompatible und bioabbaubare Trägerpolymer (I)
bewußt aus verstoffwechselbaren und somit untoxischen Bau
steinen hergestellt ist und gezielt (2) an die jeweils beson
deren Erfordernisse des/der Wirkstoffmoleküle, (3) an den
angestrebten Wirk- bzw. Resorptionsort sowie Wirkmechanismus
und (4) an die Einsatzmöglichkeit eines schonenenden Parti
kelherstellungsverfahren angepaßt werden konnte.
ad (1)
Zur Synthese des Trägerpolymers (Komponente 1)
kommen wenigstens eine biokompatible Komponente (Polyo
le) sowie daran geknüpfte Polyesterfragmente, die durch
einfache Hydrolyse im Körper zu im Citratzyklus ver
stoffwechselbaren Bruchstücken zerfallen, zum Einsatz.
ad (2) und (3)
Durch geeignete und gezielte Auswahl bzw.
Modifikation der Polyole (z. B. Typ, Molekulargewicht,
Zahl an veresterbaren Hydroxylgruppen, Zahl und Art der
ladungstragenden Gruppen, Abstand der ladungstragenden
Gruppen vdm Polyolgrundgerüst, etc.) werden die dadurch
vorgegebenen Eigenschaften des Polyols systematisch
durch gezielte Anknüpfung von Polyesterbausteinen an die
Erfordernisse des erfindungsgemäßen kolloidalen Systems
angepaßt. Genannt seien dabei exemplarisch: Löslicheit,
Molekulargewicht, Struktur, Ladungsdichte, Partikel
oberflächenladung etc.
Ist zur gewünschten Wirkstoff-Trägerpolymer-Interaktion
(wie z. B. Wirkstoffstabilisierung, Beladungsgrad, etc.)
eine hydrophile-hydrophobe Wechselwirkung erwünscht,
wird dies durch die gezielte synthetische Einstellung
der Polymer-Amphiphilie erreicht, ist eine interionische
Wechselwirkung erwünscht, wird dies durch die Auswahl
und/oder Modifizierung eines entsprechenden Elektrolyt-
Polyols erreicht.
ad (4)
[II] Wenn ein stabiler partikulärer Träger bei
lipophileren Wirkstoffen während der Herstellung bzw.
bei hydrophileren Wirkstoffen nach der Herstellung des
erfindungsgemäßen Trägersystems mit Wirkstoffen assozi
iert bzw. verknüpft werden soll, wird die Löslichkeit
des Trägerpolymers bewußt so eingestellt, daß ein modi
fiziertes und optimiertes schonendes sog. Solvent Depo
sition Verfahren zur Partikelerzeugung zum Einsatz kom
men kann.
[I] Wenn auf diesen technologischen Herstellungs
schritt verzichtet werden kann bzw. werden soll, wird
das Trägerpolymer bewußt wasserlöslich hergestellt, so
daß sich bei Vereinigung von Wirkstoff und Trägerpolymer
spontan definierte kolloidale Polymer-Wirkstoff-Komplexe
in wässiger Lösung ausbilden und deren Eigenschaften,
wie z. B. Größe, Beladungsgrad etc. ebenfalls gezielt
eingestellt werden können.
Mit Hilfe dieser erfindungsgemäßen neuen kolloidalen, bioab
baubaren polymeren Trägersysteite, die nur durch Kombination
aller oben genannter Punkte ihre besondere Wirksamkeit er
reichen, sind einerseits völlig neue therapeutische Anwen
dungsgebiete möglich, andererseits können auch herkömmliche
Therapiekonzepte optimiert werden, wie z. B. durch die Erhö
hung der therapeutischen Breite und Effizienz eines Wirkstof
fes.
Weitere Vorteile, die sich durch die Erfindung ergeben, sind
die für den Patienten angenehmere Art der Applikation, da
nicht zwingend parenteral, also über eine Injektion, appli
ziert werden muß, und die damit verbundene erhöhte "Patien
ten"-Compliance. Hierdurch kann, gegenüber bisherigen Impf
verfahren, eine Schutzimpfung z. B. durch Einnahme einer
Tablette oder Lösung, ähnlich der Poliomyelitis-Impfung
(Kinderlähmung), erfolgen. Der hieraus resultierende niedri
gere Durchseuchungsgrad in der Bevölkerung hat einen nicht
unerheblichen volkswirtschaftlichen Nutzen, der sich gleich
falls durch die Anwendung erfindungsgemäßer Systeme in der
Veterinärmedizin ergibt.
Beispiele
Die Erfindung ist im Folgenden, aber ohne darauf beschränkt
zu sein, anhand von einigen ausgewählten Beipielen näher
erläutert.
Polymersynthese
Zentralpolyol-Modifizierung
Die beispielhafte Modifizierung eines ungeladenen Zeritral
polymers, hier Poly(vinylalkohol), erfolgte vergleichbar zu
[F. Dolle, J. Le Moigne and P. Gramain, Eur. Polym. J. 6
(1970) 1227-1232; P. Gramain and J. Le Moigne, Eur. Polym. J. 8
(1972) 703-709] über Veretherung dessen aktivierter
Hydroxylgruppen mit Butansulton bzw. mit Diethyaminoe
thylchlorid.
Abb. 1 zeigt beispielhaft FT-IR-spektroskopisch (Nicolet
510 P FT-IR Spektrometer) die Einführung der Sulfobutylgrup
pen in das urprünglich ungeladene Zentralpolymer und die
Zunahme der Intensitäten der entsprechen SO-zugehörigen
Schwingungen bei 1190, 1040 und 610 cm-1.
Abb. 2 zeigt die entprechenden Modifizierungen NMR-
spektroskopisch (Jeol GX400 Delta N FT-NMR. Spektrometer),
z. B. durch Reduktion der Signalintensität der -CH2-CH-OH (~
1,7 ppm) und -CH2-CH-OH (~ 4,1 ppm), Zunahme der Signalinten
sitäten -CH2-CH-O-C und -CH-O-CH2- (~ 1,9 ppm) und der Sulfo
butylgruppe selbst bei ~ 3,08 und ~ 3,7 ppm.
Melt Grafting zur Herstellung der Trägerpolymere (Komponente
1) durch Anhängen von Hydroxycarbonsäuregruppierungen an die
Zentralpolyole
Beispielhaft für die Lactone der Milch- und Glycolsäure:
D,L-Lactid (dimeres Anhydrid der Milchsäuren) und Glycolid
(dimeres Anhydrid der Glycolsäure) werden in definierten
molaren Mengen, z. B. 1 : 1, in Gegenwart definierter Mengen
des Zentralpolyols, z. B. 1 Gew.-% PVA, bei z. B. 130°C für z. B.
drei Stunden unter inerten, wasserfreien Bedingungungen mit
definierten molaren Mengen Katalysator (z. B. 0.2 mmol Zinnoc
toat) umgesetzt. Anschließend wird das Reaktionsprodukt in
einem geeigneten Lösungsmittel aufgenommen und in einem 10 : 1
Überschuß eines damit mischbaren Polymernichtlösungsmittels
zur Aufreinigng ausgefällt und bis zur Gewichtskonstanz im
Vakkum getrocknet. Für dieses Beispiel erfolgte das Lösen der
Rohproduktes in Dichlormethan (DCM)und die Fällung in Etha
nol. Je nach Löslichkeit ergaben sich aber auch Kombinationen
Aceton in Wasser oder auch invers Wasser in Aceton. Weitere
Einzelheiten s. Tabelle 2.
Struktur und Löslichkeit der Polyolester (Komponente 1)
Abb. 3 zeigt NMR-spektroskopisch die strukturelle Verän
derung der Polymere in Abhängigkeit der Synthesebedingungen.
Hier wurden die Hydroxycarbonsäuregruppierungslängen am
Zentralpolymer systematisch verkürzt, um insbesondere die
Löslichkeitseinstellbarkeit zu demonstrieren. Während bei
PVAPLG10 die Hydroxycarbonsäuregruppierungen, die an die OH-
Gruppen des Zentralpolymers gehängt wurden, noch je aus etwa
10 Säurebaueinheiten besteht, erkennbar z. B. an dem Verhält
nis der Lactid-Signalintensitäten -CH3-Kette : -CH3-
Endgruppe, also bei ~ 1,5 ppm zu ~ 1,3 ppm, sind die Gruppie
rungen bei PVAPLG50 bereits derart verkürzt, daß sich dieses
Trägerpolymer gut in kaltem Wasser löst, allerdings - überra
schend gefunden - durch Temperaturerhöhung wieder ausfällbar
ist und daher eine Untere Kristische Entmischungstemperatur
besitzt.
Abb. 4 zeigt mittels einer Kombination aus Size Exclusion
Chromatographie und Statischer Lichtstreuung (Merck-
Hitachi-System mit RI 71-Detektor in Kombination mit MiniDawn
Light Scattering-Detektor), wie sich diese strukturelle
Veränderung entsprechend auch auf das Molekulargewicht der
Trägerpolymere im Vergleich zu einem unmodifizierten Zentral
polyol auswirkt.
Abb. 5 zeigt mittels photometrischer Trübungsmessung
(Shimadzu UV-VIS Spektrophotometer UV 160) beispielhaft für
ungeladene Trägerpolymere, daß sich die überraschend gefunde
nen Unteren Kristischen Entmischungstemperaturen ebenfalls
als Funktion der (Hydroxycarbonsäuregruppierungs)-Ketten
längen definiert einstellen ließen.
Abb. 6 zeigt mittels photometrischer Trübungsmessung
beispielhaft hier für ein ladungsmodifiziertes Trägerpolymer
eine weitere Manipulationsmöglichkeit der Lage der Unteren
Kristischen Entmischungstemperatur über die Konzentration des
Polymers im Wäßrigen.
Abb. 7 zeigt mittels Photonen-Korrelations-Spektroskopie
[PCS, Malvern Zetasizer 4], beispielhaft hier für ein la
dungsmodifiziertes Trägerpolymer, die Größe der reinen Trä
gerpolymerassoziate in Abhängigkeit der Temperatur, was eine
Möglichkeit demonstriert, die Eigenschaften der Polymer-
Wirkstoff-Komplexe zu steuern. Besonders für sehr empfindli
che Wirkstoffe (genannt seien exemplarisch Wachstumsfaktoren)
kann dem Wirkstoff bereits bei niederen Temperaturen ein
partikuläres Trägerpolymerassoziat im Wäßrigen (vergleichbar
einem micellarem System) angeboten werden, an dessen Oberflä
che dann der Wirkstoff selbst assoziiert wird.
Spontan ausgebildete Polymer-Wirkstoff-Komplexe im Wäßrigen
Generelles Vorgehen für die nachfolgende Beispiele: Eine
definierte Menge einer Wirkstoffstammlösung wird vorgelegt,
mit definierter Menge Puffer verdünnt, anschließend mit einer
definierten Menge Polymerstammlösung versetzt, so daß sich
wenn nicht explizit anders angegeben ein Gesamtvolumen von 1 ml
ergibt.
Abb. 8 zeigt die Möglichkeit, die Größe derartiger
Polymer-Wirkstoff-Komplexe über die eingesetzte Polymerkon
zentration zu steuern (Wirkstoff: Fluoreszenzmarkiertes
Modellprotein FITC-BSA (Bovines Serumalbumin) 640 µg; Polymer
PVAPLG50; isotonischer Phosphatpuffer pH 6.0 (PBS 6.0),
Größenmessung per PCS).
Abb. 9 zeigt beispielhaft die leichte Einstellbarkeit
der Polymer-Wirkstoff-Komplex-Eigenschaften über "Verfah
rens"-parameter wie pH-Wert und/oder Ionenstärke der wäßrigen
Lösungen (Wirkstoff: Tetanus Toxoid, Menge für dieses facto
rial Design variiert in den Grenzen 332 µg . . . 949 µg/200 ml,
Polymer: PVAPLG57.1 1670 µg/200 ml, Größenmessung per PCS,
Zetapotentialmessung mit Malvern Zetasizer 4).
Abb. 10 zeigt beispielhaft, daß - wenn erwünscht - auch
die Zugabe eines Emulgators eine Möglichkeit darstellt, die
Polymer-Wirkstoff-Komplex-Eigenschaften zu beeinflussen
(Wirkstoff: Tetanus Toxoid 3.367 mg; Polymer: PVAPLG57.1
3.32 mg; in zusammen 1,220 ml PBS 6.0, Emulgator Pluronik F68
BASF).
Abb. 11 zeigt beispielhaft, wie durch die Auswahl des
Trägerpolymers und dessen eingesetzter Menge das Gesamtsy
stem, also Polymer-Wirkstoff-Komplex, für einen Wirkstoff
optimierbar ist. Wird ein ungeladenens Zentralpolyol mit
Hydroxycarbonsäuregruppierungen synthetisch versehen, werden
bei ausreichend hoher Konzentration dieses Trägerpolymers im
Wäßrigen zwar bereits 90% des eingesetzten Modellwirkstoffes
(FITC-BSA, 450 µg, Gesamtflüssigkeitsvolumen: 1 ml PBS 6.0)
in Form der erfindungsgemäßen Polymer-Wirkstoff-Komplexe
gebunden, wird aber ein Zentralpolyol mit nur 10% ladungstra
genden Gruppen zur Synthese der Komponente 1 eingesetzt, wird
die gesamte Menge des eingesetzten Proteins assoziiert. Ist
derartig das erwünschte Polymer einmal gewählt, kann darüber
hinaus über dessen eingesetzte Menge jede beliebige Menge des
eingesetzten Proteins in Form der Polymer-Wirkstoff-Komplexe
assoziiert werden.
Abb. 12 zeigt, daß - wenn therapeutisch sinnvoll - auch
ein Dekomplexieren/Freisetzen von Wirkstoffen, hier beispiel
haft Tetanus Toxoid, aus den Polymer-Wirkstoff-Komplexen
erreicht werden kann. Freisetzungen, die hier beispielhaft
durch die Auswahl des Trägerpolymers gesteuert wurden. Des
weiteren zeigt dieses Beispiel, daß insbesondere bei erfin
dungsgemäßer mucosaler Anwendung dieser Systeme, innerhalb
der ersten Stunden noch keine signifikanten Mengen Protein
abgegeben werden, so daß der mucosale Zielort erreicht werden
kann, und erst dort eine Abgabe des Wirkstoffes stattfindet
(Photometrische Gehaltsbestimmung bei 280 nm, Menge Komponen
te 1 (Trägerpolymere) jew. 10 mg, Menge Komponente 2 (Tetanus
Toxoid) jew. 1992 µg, jew. in insgesamt 1000 µl PBS 6.0, nach
spontaner Bildung der Polymer-Wirkstoff-Komplexe wurden diese
zu angegebenen Zeiten bei 44°C abzentrifugiert, der Über
stand photometrisch untersucht, anschließend wurden die
Komplexe in frischem PBS 6.0 bei 37°C weiterinkubiert).
Abb. 13 zeigt, hier am Beispiel eines Komplexes zwischen
einem ladungstragenden Trägerpolymer und dem Modellprotein
FITC-BSA, die massive Anreicherung der Komplexe auf mucosal
ähnlichem Zellgewebe (Caco 2-Zellkultur), ein Phänomen, das
sich bei Verwendung von freien Wirkstoffen allein nicht
erzeugen läßt und somit eindeutig die überraschend gefundene
Effektivität des erfindungsgemäßen neuen Trägersystem demon
striert (640 µg Protein, 10 mg Polymer, in zusammen 1000 µl
PBS 6.0)
Kolloide
Wenn die Verwendung eines Trägerpolymers erwünscht ist,
dessen hydrophile-hydrophobe Balance mehr auf die Seite der
Lipophilie verschoben ist, z. B. aus Kompatibilitätsgründen
zum Wirkstoff oder wenn sich der relevante Wirkstoff aus
schließlich definiert auf der Oberfläche des kolloidalen
Trägers befinden soll, kann bei entsprecheder Polymergesamt
zusammensetzung dann ein acetonlösliches Trägerpolymer herge
stellt und gemäß modifizierter Solvent Deposition Methodik in
den erfindungsgemäßen kolloidalen Träger überführt werden.
Beispielhafte Herstellungsbeschreibung (Herstellungsparameter
können zur Eigenschaftsoptimierung davon abweichen): 50 mg
Polymer werden in 5 ml Aceton (kann Kosolvenz enthalten)
gelöst. Die Lösung wird mit konstanter Zugaberate in 50 ml
PBS gegeben (kann anteilig Emulgator enthalten). Die entste
hende Suspension wird kontinuierlich dispergiert. Nach der
Zugabe wird das organische Lösungsmittel 8 h unter Rühren
evaporisiert.
Abb. 14 demonstriert am Beispiel eines ungeladenen
bioabbaubaren Polymers eine Möglichkeit die Größe derartiger
über kontrollierte Fällung hergestellter Partikel zu variie
ren, hier über den anteiligen Zusatz eines toxikologisch
unbedenklichen Kosolvenz (Ehylacetat) in der Trägerpolymera
cetonlösung.
Abb. 15 verdeutlicht, hier am Beispiel eines geladenen
Trägerpolymers SB50PVAPLG10, die Morphologie und Größe derar
tiger Kolloide (transmissionselektronenmikroskopische (TEM)
Photograpie).
Abb. 16 demonstriert beispielhaft die Möglichkeit,
aufgrund des amphiphilen Charakters der Trägerpolymere auch
bei der Solvent Deposition Methodik nicht nur ohne Emulgator
zusatz (Emulgator hier PVA(18.88), Hoechst) arbeiten zu
können, sondern auch den dadurch möglichen Erhalt der Ober
flächeneigenschaften der Kolloide.
Abb. 17 zeigt beispielhaft, daß die Kolloidoberflä
cheneigenschaften als Funktion der Trägerpolymere, genauer
der Wahl des zum Melt Grafting verwendeten Zentralpolyols und
dessen Eigenschaften in Kombination mit geeigneter Hydroxy
carbonsäuregruppierungsmodifikation, einstellbar sind - hier
beispielhaft aufgeführt: Oberflächenladung der Kolloide
(Zeta-Potentialmessung sowie Particle Charge Detection (PCD)
-Titration) sowie deren Hydrophobizität (Bengal-Adsorptions-
Methode).
Abb. 18 demonstriert, daß auch der Beladungsgrad derar
tiger Kolloide mit relevantem Wirkstoff eine direkte Funktion
der Trägerpolymere, genauer der Wahl des zum Melt Grafting
verwendeten Zentralpolyols und dessen Eigenschaften in Kombi
nation mit geeigneter Hydroxycarbonsäuregruppierungsmodifika
tion, ist.
Abb. 19 zeigt die hohe Effektivität der erfindungsgemä
ßen Kolloide, hier beispielhaft für nilrotmarkierte
SB30PVAPLG10-Kolloide im Zellkulturmodell (Konfokale Lasermi
kroskopie), nicht nur auf (apikal), sondern auch in und sogar
basal findet man eine hohe fluoreszierende Assoziation (opti
sche Zellschnittebenen in Abb. 19 von links nach rechts
etwa 0 µm, 10 µm, 20 µm).
Abb. 20 untermauert diesen Befund, da die zelladsorbierte
und zellabsorbierte Kolloid-Menge wieder eine Funktion der
Trägerpolymere darstellt, genauer der Wahl des zum Melt
Grafting verwendeten Zentralpolyols und dessen Eigenschaften
in Kombination mit geeigneter Hydroxycarbonsäuregruppierungs
modifikation.
Toxizität und Wirkstoffstabilität
Abb. 21 demonstriert die toxikologische Unbedenklichkeit
erfindungsgemäßer Kolloide, gemäß MTT-Assay bleibt eine
Zellviabilität von 100% erhalten, d. h. kein Zellabsterben
durch die Kolloide ist erkennbar, auch bezüglich der LDH-
Freisetzung verhalten sich die Kolloide neutral. Bei dem
Propidiumiodid-Versuch wird dieser Befund ebenfalls untermau
ert, weniger als 0,2% der Zellen starben bei Inkubation mit
den Kolloiden, ein Wert, der dem von reinem wäßrigen Puffer
medium entspricht.
Abb. 22 zeigt das Ergebnis von Gel Elektrophorese (GE)
Versuchen (Native PAGE und SDS PAGE), die die Unverändertheit
des Wirkstoffes demonstrieren, sowohl im Polymer-Wirkstoff-
Komplex, als auch davon desorbierter Wirkstoff nach 24 Stun
den zeigen keine Veränderungen im Vergleich zu freiem unbe
handelten Wirkstoff (1 = freies unbehandeltes Modellprotein
FITC-BSA; 2 = Polymer-Wirkstoff-Komplex: SB10PVAPLG50-FITC-
BSA-Komplex; 3 = von 2 nach 24 h desorbiertes FITC-BSA).
Generelle Methodenbeschreibung Zellversuche
Bestimmung der Zytoadhäsion und Zytotoxizität
Voraussetzung für eine Applikation von kolloidalen Arznei
stoffträgern, insbesondere auch mucosale Applikation, ist
neben einer nur geringen toxischen Wirkung auf das umgebende
Gewebe (Epithelzellen), auch eine ausreichend lange Verweil
zeit auf mukosalen Oberflächen (Zytoadhäsion) sowie eine
eventuell erforderliche ausreichende zelluläre Aufnahme. Zur
Untersuchung der Wechselwirkung mit mucosalen Zellen wurde
das Caco 2 Zellkulturmodell herangezogen. Dieses in vitro-
Modell der intestinalen Mucosa hat bereits in vielen Untersu
chungen seine Eignung zum Studium von intestinaler Resorption,
Cytoadhäsion und Toxizität von Arzneistoffen und Arznei
stoffträgersystemen zeigen können.
Zellkultur
Caco 2 Zellen der Passagen 42 bis 45 wurden kultiviert in
Dulbecco Modified Eagles-Medium mit einem Glucosegehalt von
4.5 g/l unter Zusatz von 10% Fötalem Kälberserum, 2 mM L-
Glutamin und 1% Nichtessentieller Aminosäuren in 10%iger CO2-Atmo
sphäre bei 95% RF und 37°C.
Toxizitätsuntersuchungen
Caco 2 Zellen wurden in einer Zelldichte von 6.5 × 104 Zellen/cm2
auf Polystyrol-Multiwell-Platten ausgesät. Mediumwech
sel erfolgte alle 2 Tage. Am Tag 21 nach Aussaat haben die
Zellen eine differenzierte Monozellschicht ausgebildet und
sind für in vitro Untersuchungen nutzbar.
Hierzu wurden Zellen 2× gewaschen mit isotonischer phosphat
gepepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7.2) und entsprechende
erfindungsgemäßen Kolloid-Suspensionen (0.25, 2.5 mg/ml) auf
die Zelloberfläche aufgebracht. Nach mehrstündiger Inkubation
(Zeitintervalle gemäß Abbildungen) wurden die nachfolgend
genannten Toxizitätsprüfungen durchgeführt.
1. Freisetzung von Lactatdehydrogenase (LDH)
Prinzip: Als cytoplasmatisches Enzym tritt LDH bei einer
Schädigung der Plasmamembran aus dem Zellinnern in das Außen
medium (Puffer) über und kann mittels kinetischer Bestim
mungsmethoden gegen einen Standard UV-photometrisch quantifi
ziert werden. Als toxischer Referenz-Standard dient Triton X
100 (0.1%ig in PBS), dessen LDH-Freisetzung 70% entspricht.
2. Transformation von MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyl tetrazolium bromide)
Prinzip: Die Tetrazolverbindung MTT wird in Mitochondrien
noch lebensfähiger Zellen zu einem blaugefärbten Formazan
farbstoff enzymatisch reduziert. Die Blaufärbung ist dabei
proportional zur Viabilität der Zellen und wird photometrisch
erfaßt, als untoxische Referenz dient PBS.
3. Propidium-Iodid-Färbung
Prinzip: Propidiumiodid durchdringt als hydrophile Substanz
nur geschädigte Zellmembranen und bindet an Nukleinsäuren des
Kerns, wodurch es bei UV-Anregung zu einer roten Kernfluo
reszenz kommt, die mikroskopisch erfaßbar ist. Die Auswertung
erfolgt fluoreszenzmikroskopisch mit Wellenlängerfilter
(380/550) gegen einen untoxischen PBS-Standard.
Zytoadhäsion und zelluläre Aufnahme
Caco 2 Zellen wurden in einer Zelldichte von 6.5 × 104 Zel
len/cm2 auf Polycarbonatmembranen (Costar-Transwell) ausge
sät. Mediumwechsel erfolgte alle 2 Tage. Am Tag 21 nach
Aussaat haben die Zellen einen differenzierten Monolayer
ausgebildet und können für Adhäsions- und Aufnahme-
Untersuchungen verwendet werden.
Mit Nilrot (1%, w/w) fluoreszenzmarkierte Kolloide sowie
Polymer-Wirkstoff-Komplexe (Wirkstoff: mit Fluorescein-
Isothiocyanat markiertem Rinderserumalbumin (FITC-BSA))
wurden auf die apikale Oberfläche der Zellen appliziert und
für 120 min bei 37°C, 95% RF, 10% CO2 inkubiert. Die Kol
loidkonzentration betrug in beiden Fällen 250 µg/ml.
Nach Inkubation wurden die Zellmonoschichten 3 mal mit PBS
gewaschen und anschließend mit Formalinlösung (4%ig in PBS)
60 min lang fixiert. Die Filtermembranen wurden mittels
Skalpell herausgeschnitten und in Glycerol-Gelatine eingebet
tet. Die so hergestellten Präparate wurden mittels Konfokaler
Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) auf adhäsive und in
tracytoplasmatische Fluoreszenz untersucht.
Bei Kontrollen nur mit Wirkstoff ohne Kolloide bzw. Komplexe
war keine Fluoreszenz auf bzw. in den Zellen nachweisbar.