DE19832007A1 - Methode zur fluoreszenzmikroskopischen Unterscheidung lebender und toter Mikroorganismen - Google Patents
Methode zur fluoreszenzmikroskopischen Unterscheidung lebender und toter MikroorganismenInfo
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Abstract
Seit dem Jahre 1977 existiert eine Acridinorange-Differentialfärbung der Bakterien in fixierten klinischen Proben. Aber sie ermöglicht nur die Differenzierung zwischen orange-fluoreszierenden Bakterien und grün-gelblicher Fluoreszierung der menschlichen Zellen und dem Hintergrund. Die neue Methode soll erlauben die Differenzierung zwischen lebenden (grün) und toten (rot) Bakterienzellen. DOLLAR A Das Ziel wird erreicht durch die Fixierung mit Paraformglutaraldehyd, Färbung mit Acridinorange und Bewertung der Ergebnisse mit dem Fluoreszenzmikroskop. DOLLAR A Die Methode eignet sich für: DOLLAR A È eine vorläufige Orientierung über den Erreger: (Mono- oder Mischkultur) DOLLAR A È Unterscheidung lebender oder toter Bakterienzellen DOLLAR A und kann eingesetzt werden in den folgenden Gebieten: Mikrobiologie, Nephrologie, Urologie, Neurologie, Ginekologie usw.
Description
Die Erfindung gehört zur Medizin und zwar zur Mikrobiologie.
Es ist eine Acridinorange-Fluoreszenz-Färbung der fixierten Präparate bekannt (Kronvall, G., Myhre,
E., "Differential staining of bacteria in clinical specimens using acridine orange buffered at a low pH.", Acta
Pathologica et Microbiologica Scandinavica (B) 1977, 85: 249-254.
Mit diesem Fluorochrom können verschiedene Mikroorganismen, z. B. Bakterien oder Pilze gesehen werden. Der
Mangel dieser Methode besteht, unserer Meinung nach, darin, daß bei beliebiger pH Akridinorange-Lösung die
Bakterien und Pilze nur orange-rot fluoreszieren. Gemäß den Untersuchungen von Herrn Strugger, S. & Hilbrich, P.
"Die Fluoreszenzmikroskopische Unterscheidung lebender und toter Bakterienzellen mit Hilfe der
Akridinorangefärbung. Deutsche Tierärzt. Wochenschr. 50: 121-130, 1942, S. 129" kann die vitale
Acridinorange-Fluorochromierung zur exakten fluoroskopischen Unterscheidung lebender und toter Zellen
gesichert bezeichnet werden. "Im pH-Bereich zwischen 5 und pH 8 ist es infolge konzentrationsbedingter
Änderungen des Fluoreszenzspektrums möglich, lebendige und tote Bakterienzellen durch verschiedene
Fluorszenzfarben mikroskopisch auseinanderzuhalten. Das lebende Bakterienplasma fluoresziert grün, während das
tote, kupferrot fluoresziert. Das bisher übliche Ausstrichverfahren läßt sich für diese Fluorochromierung nicht
anwenden."
Der im Patentanspruch angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, die lebende und tote Zellen in
fixierten Präparaten zu unterscheiden.
Dieses Problem wird durch die im Patentanspruch ausgeführten Merkmale gelöst: eine klinische Probe wird
- - vorläufig mit Paraformglutaraldehyd fixiert
- - danach mit Acridinorange gefärbt
- - mit Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.
Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen darin, daß die Fixierung mit Paraformglutaraldehyd vor der
Materialapplikation beugt der Zellveränderung vor und erlaubt einen breiten Farbenspektrum
fluoreszierenden Bakterien bekommen.
Mit anderen Worten gesagt, die Methode vereinigt die beide Methoden von Herrn Kronvall, G., Myhre,E.,
und Strugger, S., Hillbrich, P.,
Hier wird der Ausführungsbeispiel der Erfindung beschrieben:
Fixierung der klinischen Probe : 10 ml frischer Spontan Urin werden bei 2000 Umdrehungen/min. für 5 Minuten zentriefugiert, anschließend der Überstand abgeschüttelt. Das Sediment im Verhältnis 1 : 1 mit Paraformglutaraldehyd mindestens 30 Minuten fixiert. Das fixierte Sediment durch erneutes 5-minutiges Zentriefugieren bei 2000 Umdrehungen/min vom Fixativ getrennt, den Überstand abgegossen und das Sediment im Phosphat Puffer nach Sörensen pH 6,8-7,2 resuspendiert.
Färbung: Lufttrockene Präparate für 10 Minuten in eine mit Puffer Sörensen pH 6,8-7,2 verdünnte Acridinorange-Lösung (1 : 25000) tauchen, danach zweimal nacheinander für jeweils 1 Minute im Puffer spülen. Farbstoffreste auf der Objektträgerunterseite mit einem Tuch entfernen und Präparat schräggestellt bei 37°C Lufttrocknen.
Mikroskopie: Die Auswertung der Präparate wird mit einem Fluoreszenzmikroskop vorgenommen.
Ergebnisse: Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß die Bakterien in einem breiten (grün-orange-rot) Farbenspektrum fluoreszieren.
Fixierung der klinischen Probe : 10 ml frischer Spontan Urin werden bei 2000 Umdrehungen/min. für 5 Minuten zentriefugiert, anschließend der Überstand abgeschüttelt. Das Sediment im Verhältnis 1 : 1 mit Paraformglutaraldehyd mindestens 30 Minuten fixiert. Das fixierte Sediment durch erneutes 5-minutiges Zentriefugieren bei 2000 Umdrehungen/min vom Fixativ getrennt, den Überstand abgegossen und das Sediment im Phosphat Puffer nach Sörensen pH 6,8-7,2 resuspendiert.
Färbung: Lufttrockene Präparate für 10 Minuten in eine mit Puffer Sörensen pH 6,8-7,2 verdünnte Acridinorange-Lösung (1 : 25000) tauchen, danach zweimal nacheinander für jeweils 1 Minute im Puffer spülen. Farbstoffreste auf der Objektträgerunterseite mit einem Tuch entfernen und Präparat schräggestellt bei 37°C Lufttrocknen.
Mikroskopie: Die Auswertung der Präparate wird mit einem Fluoreszenzmikroskop vorgenommen.
Ergebnisse: Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß die Bakterien in einem breiten (grün-orange-rot) Farbenspektrum fluoreszieren.
Claims (1)
- Methode zur fluoreszenzmikroskopischen Unterscheidung lebender und toter Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß eine klinische Probe vorläufig mit Paraformglutaraldehyd fixiert, danach mit Acridinorange gefärbt und mit dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet wird.
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|---|---|---|---|
| DE1998132007 DE19832007C2 (de) | 1998-07-16 | 1998-07-16 | Verfahren zur fluoreszenzmikroskopischen Unterscheidung lebender und toter Mikroorganismen |
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|---|---|
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| DE19832007C2 DE19832007C2 (de) | 2001-02-08 |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE1998132007 Expired - Fee Related DE19832007C2 (de) | 1998-07-16 | 1998-07-16 | Verfahren zur fluoreszenzmikroskopischen Unterscheidung lebender und toter Mikroorganismen |
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|---|---|
| DE (1) | DE19832007C2 (de) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001036661A3 (en) * | 1999-10-25 | 2002-07-11 | Genprime Inc | Method and apparatus for prokaryotic and eukaryotic cell quantitation |
| US6673568B1 (en) | 1999-10-25 | 2004-01-06 | Genprime, Inc. | Method and apparatus for prokaryotic and eukaryotic cell quantitation |
| US6787302B2 (en) | 1999-10-25 | 2004-09-07 | Genprime, Inc. | Method and apparatus for prokaryotic and eukaryotic cell quantitation |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4345027A (en) * | 1980-12-12 | 1982-08-17 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Fluorometric method of quantitative cell mutagenesis |
| EP0801306A1 (de) * | 1996-04-10 | 1997-10-15 | Becton, Dickinson and Company | Methode zur immunohistochemischen Quantifizierung von co-lokalisierten Molekülen |
-
1998
- 1998-07-16 DE DE1998132007 patent/DE19832007C2/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4345027A (en) * | 1980-12-12 | 1982-08-17 | The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy | Fluorometric method of quantitative cell mutagenesis |
| EP0801306A1 (de) * | 1996-04-10 | 1997-10-15 | Becton, Dickinson and Company | Methode zur immunohistochemischen Quantifizierung von co-lokalisierten Molekülen |
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|---|---|---|---|---|
| WO2001036661A3 (en) * | 1999-10-25 | 2002-07-11 | Genprime Inc | Method and apparatus for prokaryotic and eukaryotic cell quantitation |
| US6673568B1 (en) | 1999-10-25 | 2004-01-06 | Genprime, Inc. | Method and apparatus for prokaryotic and eukaryotic cell quantitation |
| US6787302B2 (en) | 1999-10-25 | 2004-09-07 | Genprime, Inc. | Method and apparatus for prokaryotic and eukaryotic cell quantitation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19832007C2 (de) | 2001-02-08 |
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