DE19804800C2 - Vorrichtung zur automatisierten Bergung planar ausgebrachter Objekte vom Objekttisch und zu deren Transfer in nachgeordnete Reaktonsträger - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Mikroskopvorrichtung zur automatisierten Bergung planar ausgebrachter, vorzugsweise membrangestützter Objekte nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Die membrangestützte Mikrodissektion wurde 1992 erstmals vom Anmelder beschrieben und in weiteren Arbeiten präzisiert (1-3). Die Vorteile der Vorrichtung sind in (3) beschrieben. Die Vorrichtung beruht darauf, daß die zu dissezierenden Objekte nicht direkt auf den Objektträger aufgebracht werden, sondern auf eine Trägermembran. Diese Trägermembran erleichtert die Mikrodissektion in mehrfacher Weise: Erstens bleibt die Beschaffenheit und Gestalt (histologische oder zytologische Integrität) des Dissektates erhalten, was die Qualität der Dissektion leicht überprüf- und dokumentierbar macht. Zweitens erleichtert die Trägermembran den Transfer des Dissektates ohne Beschädigung desselben in ein Reaktionsgefäß für die anschließende Analyse. Drittens kann die Trägermembran als Substitut des Deckgläschens dienen und verbessert so die optische Qualität des mikroskopischen Bildes und verhindert die Verunreinigung des zu dissezierenden Objektes von außen. Die Art der Mikrodissektion spielt dabei keine Rolle; sie kann sowohl manuell (1-3) als auch mittels elektromagnetischer Strahlen, zum Beispiel ultravioletten Laserstrahlen (4, 5), geschehen.

Da die weitere Untersuchung meist nicht unter dem Mikroskop selbst stattfindet, müssen die Dissektate in der Regel zunächst in ein Reaktionsgefäß oder eine andere geeignete Vorrichtung verbracht werden. Kleine Dissektate lassen sich mit Hilfe der Laserenergie katapultieren (LPC, Laser Pressure Catapulting, 5). Größere Dissektate, für deren Bewegung die Laserenergie nicht ausreicht, können mechanisch manuell mit Hilfe einer feinen Nadel, Sonde, Kanüle oder Pinzette (2-4) geborgen und transferiert werden. Numerisch gesteuerte Mikromanipulatoren und Roboterarme zur mechanischen Bergung sind kommerziell erhältlich; wegen ihrer langen freien Armlängen und des schrägen Arbeitswinkels von der Seite des Objekttisches sind sie aber langsam und haben große Toleranzen.

Zum Stand der Technik werden folgende Druckschriften gewürdigt: In der Druckschrift DE 42 33 399 A1 (6) ist ein am Mikroskopobjektiv befestigter Lamellenhalter mit Tastspitze beschrieben, wodurch ein Kraftmikroskop geschaffen wird, bei dem die Beschädigung des Lamellenhalters beim Wechsel weitgehend ausgeschlossen ist. Mit der gezielten Kontaktierung, Aufnahme, makroskopischen Transfer und Abgabe eines Objektes an eine Auffangvorrichtung hat der Gegenstand der Druckschrift aber nichts zu tun.

Dies gilt auch für die folgenden drei Druckschriften (7-9). In der Druckschrift DE 36 19 062 C2 (7) wird ein hydraulischer Mikromanipulator beschrieben, mit dem eine Punktionsnadel in der optischen Achse des Mikroskops bewegt werden kann, um Zellen unter mikroskopischer Sicht zu punktieren. In der Druckschrift US 4,907,158 (8) wird ein pneumatischer Mikromanipulator beschrieben, mit dem an Zellkulturzellen gearbeitet werden kann. In der Druckschrift JP 6-202003 (A) (9) wird ein elektrostatischer Mikromanipulator beschrieben, wobei ein spezieller ferroelektrischer Polymerfilm mittels Licht polarisiert wird und die dadurch entstehende elektrostatische Ladung ausgenutzt wird, um geladene Partikel mit der Lichtquelle zu bewegen.

In der Druckschrift DE 29 22 212 C3 (10) wird ein Mikromanipulator beschrieben, der durch die Linsen des Mikroskopobjektivs hindurchgeführt ist. Dadurch wird die Ungenauigkeit der Mikromanipulatoren, die schräg von der Seite herangeführt werden, vermindert.

Die Druckschriften 5 bis 10 stellen sich nicht der Aufgabe der Aufnahme, makroskopischen Transfers und Abgabe eines Objektes an eine Auffangvorrichtung und geben kein Verfahren an, mit dem diese Aufgabe zu lösen wäre, noch ist ein solches aus den Druckschriften naheliegend ableitbar.

Literatur

1. Wieland I, Böhm M, Bogatz S (1992): Isolation of DNA sequences deleted in lung cancer by genomic difference cloning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 89: 9705-9709.
2. Böhm M, Wieland I, Totzeck B (1993): Detection of tumor-specific homozygous deletions in human biopsies by polymerase chain reaction. Cancer Genetics and Cytogenetics 65: 83-87.
3. Böhm M, Wieland I (1997) Analysis of tumour-specific alterations in native specimens by PCR: How to procure the tumour cells!, International Journal of Oncology 10: 131-139.
4. Böhm M, Wieland I, Schütze K, Rübben H (1997) Microbeam-MOMeNT: Non-contact microdissection of membrane-mounted native tissue, Am J Pathol 151: 63-67.
5. Deutsches Patentamt, Offenlegungsschrift DE 196 03 996 A1.
6. Deutsches Patentamt, Patentschrift DE 42 33 399 A1
7. Deutsches Patentamt, Patentschrift DE 36 19 062 C2
8. Patentamt der USA, US 4,907,158
9. Japanisches Patentamt, JP-A2-Veröffentlichung JP 6-202003 (A)
10. Deutsches Patentamt, Patentschrift DE 29 22 212 C3

Die Erfindung löst die Aufgabe, eine kompakte Manipulatorsonde anzugeben, die zugleich einfach justierbar ist und einen einfachen Transfer eines aufgenommenen Objektes in eine Auffangvorrichtung gestattet. Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungen sind in den Unteransprüchen aufgezeigt.

Die Erfindung beschriebt ein schnelles und robustes Verfahren, das zur mechanischen Bergung planar ausgebrachter Objekte, vorzugsweise membrangestützter Mikrodissektate, vom Objekttisch und zu deren Transfer in nachgeordnete Reaktionsträger die optische und mechanische Präzision heutiger Mikroskope nutzt. Darüber hinaus betrifft die Erfindung die optimierte Konstruktion hierzu geeigneter Vorrichtungen, die auf der Übertragung mechanischer, hydraulischer, pneumatischer, elektrostatischer oder elektromagnetischer Kräfte oder auf einer Kombination derselben beruhen (siehe Abbildungen).

Der Vorteil der Erfindung liegt darin, daß handelsübliche Objektivgewinde und Objektivrevolver verwendbar sind, wobei ein geeignetes Auffanggerät so zum Mikroskop positioniert wird, daß das geborgene Objekt nach Weiterdrehen und Einrasten des Objektivrevolvers ohne weitere Justierung in einen Reaktionsträger verbracht werden kann.

Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß der Objektivrevolver motorgetrieben ist.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß das Mikroskop eine Autofokuseinrichtung besitzt.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß die Membran elektrisch geladen (zum Beispiel durch ihre Beschaffenheit oder durch eine Beschichtung) ist, so daß die Bergung und/oder das Abwerfen des geborgenen Objektes durch entsprechende Polung von Bergenadel/-stift und/oder Auffangvorrichtung erleichtert wird.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß die Membran magnetisch (zum Beispiel durch ihre Beschaffenheit oder durch eine Beschichtung) ist, so daß die Bergung und/oder das Abwerfen des geborgenen Objekts durch entsprechende Erzeugung anziehender, bzw. abstoßender elektromagnetischer Felder an Bergenadel/-stift und/oder Auffangvorrichtung erleichtert wird. Im Unterschied zur elektrischen Ladung können hier gekrümmte Feldlinien erzeugt und damit gekrümmte Abwurfbahnen erreicht werden.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß die Bergenadel als stumpfe Kanüle (Bergekanüle) ausgebildet ist (Abb. 3d), deren Öffnung auf die Membran aufgelegt wird, und daß die Bergung und/oder das Abwerfen des geborgenen Objekts durch entsprechende Erzeugung eines Unter- oder Überdruckes in der Bergekanüle erleichtert wird. Dazu könnte die Bergekanüle zum Beispiel aus Metall, Kunststoff, Keramik oder anderen Materialien bestehen. Die Druckänderungen können in die Bergekanüle mit Luft, anderen Gasen oder mit Flüssigkeiten übertragen werden.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß das Bergewerkzeug durch die Objektivoptik geführt wird (Abb. 4), so daß die Bergung des Objekts unter Sicht erfolgt. Das Objektiv kann hierbei als Linsenobjektiv oder als Spiegelobjektiv ausgeführt sein. Gegebenenfalls kann das Bergewerkzeug neben dem Strahlengang angebracht sein, um die Bildqualität weniger zu beeinträchtigen. Dann kann ein gebogenes oder geknicktes Bergewerkzeug verwendet werden, um dessen Ende in den Objektivfokus zu bringen. Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß das Ende des Bergewerkzeugs durchsichtig oder als Ring ausgeführt ist, um die Sicht während der Bergung zu verbessern.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß die einzelnen Schritte der Bergung und des Transfers (Aufsuchen des Objekts, ggf. Einschwenken der Bergevorrichtung, Bergen mit dem Bergewerkzeug, Transfer an die Auffangvorrichtung und Abwerfen des geborgenen Objekts) in einer Kette kombiniert werden, die nach Aktivierung automatisch abläuft. Diese automatische Kette könnte nach Aufforderung an den einzelnen Schritten unterbrochen werden.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß nach dem Transfer des geborgenen Objektes dieses in den nachfolgenden Reaktionsträger verbracht wird, während ein neues Objekt bereits mikrodisseziert oder geborgen wird.

Ausführungsbeispiel

In Abb. 1 wird eine nadelförmige Manipulatorsonde 2 mit weiblichem Luer Ende auf eine Halterung 4 mit männlichem Luer Ende gesteckt. Diese ist in z-Richtung beweglich mit einer Bodenplatte 6 verbunden, die mit einem Gewinde 8 versehen ist und somit in einen Objektivrevolver 10 eingeschraubt werden kann. Die Dimensionen sind so gewählt, daß die Länge L von der Spitze 12 der Manipulatorsonde 2 zum Objektivrevolver 10 gleich der Länge vom Objektivfokus 19 eines handelsüblichen Objektivs bis zum Objektivrevolver 10 ist. Die Halterung 4 ist so justiert, daß sich die Spitze 12 im Fokus 19 eines in dasselbe Gewinde des Objektivrevolvers 10 geschraubten, gedachten Objektivs befindet. Dadurch kann ein Mikrodissektat 14, welches auf einen Objektträger 15 aufgebracht wurde, der auf dem Objekttisch 17 des Mikroskops aufliegt, mit einem Objektiv 18 fokussiert werden. Nach Eindrehen der erfindungsgemäßen Vorrichtung durch Drehen am Objektivrevolver (x-Richtung) befindet sich die Spitze 12 dann exakt über dem vorher fokussierten Mikrodissektat 14. Die Halterung 4 kann mit einem kleinen Motor 16 in z-Richtung auf das Mikrodissektat 14 zu bewegt (↓) und das Mikrodissektat 14 so mit der Spitze 12 der nadelförmigen Manipulatorsonde 2 aufgespießt werden. Durch Zurückziehen (↑) der Halterung 4 und Drehen am Objektivrevolver wird das Mikrodissektat geborgen und zur Seite transportiert. Durch erneute Bewegung der Halterung 4 oder des Auffangröhrchens 11 wird das geborgene Mikrodissektat 14 in das Auffangröhrchen verbracht. Alternativ kann statt der Halterung 4 auch der Objekttisch 17 in z-Richtung verschoben werden, wodurch das Mikrodissektat 14 mit der Spitze der nadelförmigen Manipulatorsonde 2 aufgespießt wird. Die Manipulatorsonde 2 kann mittels einer Abwurfvorrichtung 21 von der Halterung 4 abgeschoben werden. Anstelle der Luer-Steckverbindung von Manipulatorsonde 2 und Halterung 4 können auch anders gestaltete Verbindungen zwischen Manipulatorsonde und Halterung verwendet werden.

In Abb. 2a wird die Halterung 4 gegenüber der Bodenplatte 6 elektrostatisch mittels einer polbaren Spannung zwischen Bodenplatte und Rücken 23 der Halterung bewegt, die von einer Spannungsquelle V erzeugt wird. Die Federn 20 dienen der Speicherung der notwendigen Gegenkräfte.

In Abb. 2b wird die Halterung 4 gegenüber der Bodenplatte 6 mittels eines Elektromagneten 24 bewegt, der von einer steuerbaren Stromquelle I über die Leitungen 26 versorgt wird.

In Abb. 2c wird die Halterung 4 gegenüber der Bodenplatte 6 mittels eines druckleitenden Mediums 28 bewegt, das von einer Pumpe P in einer Druckleitung 30 bewegt wird, die durch die durchbohrte Bodenplatte führt.

In Abb. 3a wird an die Spitze 12 der nadelförmigen Manipulatorsonde 2 eine polbare Spannung mittels einer steuerbaren Spannungsquelle V angelegt.

In Abb. 3b ist die oben erwähnte, nadelförmige Manipulatorsonde als Stift 42 oder Sonde 44 oder als Kombination von Nadel und Stift 46 oder Nadel und Sonde 48 ausgebildet, an die zusätzlich eine polbare Spannung mittels einer steuerbaren Spannungsquelle V angelegt werden kann.

In Abb. 3c ist die oben erwähnte Manipulatorsonde, -stift, -sonde oder Kombination von Nadel und Stift oder Nadel und Sonde als Elektromagnet 24 ausgebildet, womit mittels einer steuerbaren Stromquelle I ein magnetisches Feld erzeugt wird.

In Abb. 3d ist die oben erwähnte Manipulatorsonde als stumpfe Kanüle 60 oder als Kombination 62 von Kanüle und Sonde augebildet, wobei mit einer steuerbaren Pumpe P über Druckleitungen 63 ein Druck oder Unterdruck in der Kanüle erzeugt werden kann, und an die Kanüle 60 oder an die Kombination 62 zusätzlich eine polbare Spannung mittels einer steuerbaren Spannungsquelle V angelegt werden kann.

In Abb. 4a liegt die Manipulatorsonde 2 in der optischen Achse 70 des Objektivs, so daß die Nadelspitze 12 in den Fokus 19 des Objektivs geführt werden kann und die Bergung des Mikrodissektates 14 (oder 115 oder 120) unter Sicht geschieht. In Abb. 4a.a wird das Bild über einen Spiegel 72 (ähnlich einem Spiegelteleskop, schematischer Strahlengang 33) erzeugt und über ein Prisma oder eine Linse 77 in den Strahlengang des Mikroskops eingekoppelt. Mit dieser Lösung erreicht man relativ viel Platz, um die Bergeeinrichtung bei guter Bildqualität konstruktiv unterzubringen. In Abb. 4a.b wird die Manipulatorsonde 2 durch die Objektivlinse 4 geführt. Falls konstruktiv erforderlich, dienen die Prismen 75 und Linse 76 der Strahlumlenkung um die Bergeeinrichtung herum, damit ein Bild entsteht. In Abb. 4b ist die Bergeeinrichtung neben dem Strahlengang eines Linsenobjektivs mit Linsen 80 plaziert, um die Bildqualität nicht zu stören. Das Bergewerkzeug ist dazu gebogen oder geknickt ausgeführt, damit sich sein Ende im Objektivfokus befindet. Das Ende des Bergewerkzeugs kann zusätzlich zentral durchsichtig ausgeführt sein, um die Betrachtung des zu bergenden Objekts während der Bergung zu verbessern.

In Abb. 5a ist der Auffangträger (Auffangröhrchen 100 oder Auffangmembran 110) elektrisch leitend, wobei mittels einer steuerbaren Spannungsquelle V eine polbare Spannung angelegt werden kann, die das elektrisch geladene Mikrodissektat 115 anzieht.

In Abb. 5b wird mittels einer steuerbaren Stromquelle I ein Magnetfeld erzeugt, welches das magnetisierte Mikrodissektat 120 anzieht. Dazu ist hinter Auffangröhrchen 100 oder Auffangmembran 110 ein Elektromagnet 130 angebracht, der das Magnetfeld erzeugt.

Claims (10)

1. Mikroskopvorrichtung zur automatisierten Bergung planar ausgebrachter, vorzugsweise membrangestützter Objekte,
mit einem drehbaren, wenigstens eine Objektiveinheit aufnehmenden Objektivrevolver
und mit einer nadelförmigen Manipulatorsonde zur Kontaktierung, Aufnahme und Abgabe eines Objektes vorzugsweise eines Mikrodissektates an eine Auffangvorrichtung,
wobei die Manipulatorsonde in ihrem Relativabstand zum Objekt längs der optischen Achse der Mikroskopeinrichtung verschiebbar ist,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Manipulatorsonde in einer vorgegebenen, bereits justierten Objektivöffnung des Objektivrevolvers vermittels einer Klemm-, Bajonett- oder Schraubverbindung befestigbar ist und dabei eine definierte Endlage einnimmt,
und dass die Manipulatorsonde zusammen mit dem aufgenommenen Objekt durch Drehen des Objektivrevolvers zu der Auffangvorrichtung transferierbar ist, in die hinein das aufgenommene Objekt abgebbar ist.

2. Mikroskopvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass entweder die Manipulatorsonde oder der Objekttisch längs der optischen Achse anhebbar oder absenkbar ist.

3. Mikroskopvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Relativbewegung zwischen Manipulatorsonde und Objekt auf elektromechanische, elektrostatische, elektromagnetische, hydraulische oder pneumatische Weise oder durch eine Kombination dieser Weisen durchführbar ist.

4. Mikroskopvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Ende der Manipulatorsonde verbreitert, vorzugsweise durchsichtig ausgebildet ist.

5. Mikroskopvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Manipulatorsonde gegenüber dem Objekt elektrisch geladen oder magnetisch gepolt ist.

6. Mikroskopvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Manipulatorsonde hohl ausgebildet und zur Übertragung druckbeaufschlagter, gasförmiger oder flüssiger Medien vorgesehen ist.

7. Mikroskopvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Manipulatorsonde in ein Objektiv integriert ist, wobei der Objektivstrahlengang vermittels Prismen, wahlweise zusammen mit Linsen, um die Manipulatorsonde und deren Halterung herumgeführt ist.

8. Mikroskopvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die nadelförmige Manipulatorsonde gebogen oder geknickt ausgebildet ist.

9. Mikroskopvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Auffangvorrichtung ein Reaktionsröhrchen oder eine Aufnahmemembran ist.

10. Mikroskopvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das von der Manipulatorsonde aufgenommene Objekt vermittels einer elektrostatischen, elektromagnetischen oder mechanischen Kraft in die Auffangvorrichtung abgebbar ist.