DE19756499A1

DE19756499A1 - Microcapsules with porous membrane wall

Info

Publication number: DE19756499A1
Application number: DE19756499A
Authority: DE
Inventors: Andreas Dr Eberle; Holger Huebner; Rainer Prof Dr Buchholz; Mathias Dr Schroedter
Original assignee: Alpha-Bioverfahrenstechnik 14943 Luckenwalde De GmbH; ALPHA BIOVERFAHRENSTECHNIK GMB
Current assignee: Siegfried Finance Ag Zofingen Ch
Priority date: 1996-12-18
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 1999-06-02
Anticipated expiration: 2017-12-19
Also published as: DE19756499C2

Abstract

Microcapsules having a membrane wall, the membrane produced by incorporating an inert material (substance or particles) into the membrane as it is formed and then removing the inert material from the formed membrane. An Independent claim is also included for a production process of the microcapsules. A first membrane-forming component (I) is introduced from an outer capillary concentrically surrounding a central filling capillary, and the resulting droplet filling surrounded by (I) falls into a second membrane-forming component (II), which reacts with (I) to form the membrane; where (I) and/or (II) contains an inert material, which is removed after the membrane has formed.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikrokapseln mit einer Membranhülle, wie sie z. B. zur Immobilisierung von Biokatalysatoren verwendet werden.The present invention relates to microcapsules with a membrane shell, as z. B. for Immobilization of biocatalysts can be used.

Ein Schwerpunkt biotechnischer Forschung ist die Entwicklung und Applikation von Immobilisierungsmethoden. Unter Immobilisierung versteht man die chemische und/oder physikalische Bindung von wasserlöslichen Biokatalysatoren an einen wasserunlöslichen Träger oder den Einschluß in eine wasserunlösliche Gelmatrix oder Mikrokapsel, unter Erhaltung der enzymatischen Aktivität. Als immobilisierte Biokatalysatoren werden alle Arten von enzymatisch aktivem Material bezeichnet wie Mikroorganismen, isolierte Enzyme, Zellorganellen, pflanzliche und tierische Zellen oder Zellgewebe. Sie werden in analytischen, diagnostischen und industriellen Verfahren eingesetzt.One focus of biotechnological research is the development and application of Immobilization methods. Immobilization means chemical and / or physical binding of water-soluble biocatalysts to a water-insoluble one Carrier or inclusion in a water-insoluble gel matrix or microcapsule, under Maintenance of enzymatic activity. All are considered immobilized biocatalysts Types of enzymatically active material referred to as microorganisms, isolated Enzymes, cell organelles, plant and animal cells or cell tissue. You will be in analytical, diagnostic and industrial processes.

Es gibt keine universellen Träger. Nur wenn die Anwendung eines biologischen Systems definiert ist, können die passenden Träger, die Immobilisierungsmethode und die Reaktorform ausgewählt werden, um eine optimale Einsatzmöglichkeit zu erreichen. Bei der Mikroverkapselung und dem Einschluß in eine Matrix wird der Reaktionsraum durch eine semipermeable Polymermembran begrenzt, die gut substrat- und produktdurchlässig ist; aber völlig undurchlässig für das verkapselte Material. Um dies eindeutig zu gewährleisten, muß die Trenngrenze "cut-off" der Membran bekannt sein. Unter der Trenngrenze versteht man die Ausschlußgrenze für ein Makromolekül bestimmter Größe, bedingt durch den Porendurchmesser der Membran. Die Höhe der Ausschlußgrenze wird in g/mol, der molaren Masse des Moleküls, welches nicht mehr durch die Membran diffundieren kann, angegeben. Die Membran der NaCS/PDADMAC Mikrokapseln (NaCS = Natriumcellulosesulfat; PDADMAC = Polydialylldimethylammoniumchlorid - s. u.) ist nur für niedermolekulare Stoffe (kleiner als ca. 5500 g/mol) durchlässig und kann nicht durch die Veränderung der Konzentration eines Reaktionspartners oder der Membranbildungszeit im Reaktionsbad variiert werden, wie es bei den Alginat-Polylysine- Kapseln möglich ist.There are no universal carriers. Only when using a biological system the appropriate carrier, the immobilization method and the Reactor shape can be selected to achieve an optimal application. At the microencapsulation and the inclusion in a matrix, the reaction space through a semi-permeable polymer membrane delimits good substrate and product permeability is; but completely impermeable to the encapsulated material. To be clear about this ensure the cut-off of the membrane must be known. Under the Separation limit means the exclusion limit for a macromolecule of a certain size, due to the pore diameter of the membrane. The level of the exclusion limit will in g / mol, the molar mass of the molecule that no longer passes through the membrane can diffuse. The membrane of the NaCS / PDADMAC microcapsules (NaCS = sodium cellulose sulfate; PDADMAC = polydialylldimethylammonium chloride - s. u.) is only permeable to low-molecular substances (less than approx. 5500 g / mol) and can not by changing the concentration of a reactant or the Membrane formation time in the reaction bath can be varied, as is the case with the alginate polylysine Capsules is possible.

Bei der Immobilisierung in Mikrokapseln werden die Biokatalysatoren durch eine Membran eingeschlossen. Besondere Kennzeichen dieser Mikroverkapselung sind eine bestimmte und gleichmäßige Form der Kapsel, höhere mechanische und chemische Beständigkeit als Vollkugeln und ein sehr geringer Verlust an Biokatalysatoren. Die geforderten Eigenschaften der gewählten Ausgangsstoffe sind:
When immobilized in microcapsules, the biocatalysts are enclosed by a membrane. Special features of this microencapsulation are a certain and uniform shape of the capsule, higher mechanical and chemical resistance than solid spheres and a very low loss of biocatalysts. The required properties of the selected starting materials are:

Formation of a hydrophilic permeable membrane,
- biocompatibility with regard to the biological material used,
- good physical and chemical resistance and
- slight capsule formation.

Die Mikrokapseln (oder Mikrohohlkugeln) werden mit einer Vertropfungsapparatur hergestellt, die aus einer koaxialen Doppelkapillardüse besteht. Durch die Mantelkapillare wird der Polyelektrolyt und durch die Kernkapillare ein biologisches Material, z. B. Biokatalysatoren in Suspension, in ein Reaktionsbad mit geeigneten Vernetzerionen vertropft. An der Seite kann Luft oder eine Flüssigkeit eingeblasen werden, wenn eine Änderung der Kapselgröße erwünscht ist. So kann der Durchmesser der Kapseln zwischen 0,5 mm und 8 mm variiert werden. Für das NaCS/PDADAMAC Verkapselungssystem (vgl. DD-219 795 A1, DD-274 051) wird eine NaCS-Lösung durch die Mantelkapillare in ein Reaktionsbad mit einer PDADMAC-Lösung vertropft. Die Tropfenbildung erfolgt anhand der schematischen Darstellung in Abb. 1.The microcapsules (or hollow microspheres) are made with a dropletizer, which consists of a coaxial double capillary nozzle. Through the jacket capillary, the polyelectrolyte and through the core capillary a biological material, e.g. B. biocatalysts in suspension, dripped into a reaction bath with suitable crosslinking ions. Air or liquid can be blown into the side if a change in capsule size is desired. The diameter of the capsules can be varied between 0.5 mm and 8 mm. For the NaCS / PDADAMAC encapsulation system (cf. DD-219 795 A1, DD-274 051), a NaCS solution is dripped through the jacket capillary into a reaction bath with a PDADMAC solution. The drop formation is based on the schematic illustration in Fig. 1.

Der Tropfen hängt mit der Kapillarkraft F_K an der Kapillare, bis er unter seiner eigenen Schwere abreißt. Die Gewichtskraft F_G ist kurz vor dem Abreißen gleich der Kapillarkraft F_K. Die Kapillarkraft hängt von der Oberflächenspannung der NaCS-Lösung und dem Durchmesser der Mantelkapillare ab. Zur Verringerung der Tropfendurchmesser kann der Kapillardurchmesser verringert werden, eine oberflächenaktive Substanz in die NaCS-Lösung gemischt werden oder dem System ein Luftstrom L in axialer Richtung aufgeprägt werden. Im letzten Fall liegt dann ein Gleichgewicht zwischen Kapillarkraft und der Summe von Windwiderstandskraft und Gewichtskraft vor. Die Tropfengröße hängt außerdem vom Durchsatz der Biokatalysatorlösung, von der Viskosität der tropfenbildenden Lösung sowie von der Viskosität, Dichte und Oberflächenspannung des Reaktionsbades und der Fallstrecke ab. Die kugelförmige Gestalt der Flüssigkeitstropfen wird durch die Tendenz der Flüssigkeit, ihre Oberfläche so klein wie möglich zu halten, bedingt.The drop hangs on the capillary with the capillary force F _K until it tears off under its own weight. The weight force F _G is equal to the capillary force F _K shortly before tearing off. The capillary force depends on the surface tension of the NaCS solution and the diameter of the jacket capillary. To reduce the drop diameter, the capillary diameter can be reduced, a surface-active substance can be mixed into the NaCS solution or an air flow L can be applied to the system in the axial direction. In the latter case, there is a balance between capillary force and the sum of wind resistance and weight. The drop size also depends on the throughput of the biocatalyst solution, on the viscosity of the drop-forming solution and on the viscosity, density and surface tension of the reaction bath and the drop distance. The spherical shape of the liquid drops is caused by the tendency of the liquid to keep its surface area as small as possible.

Die Membranaufbaureaktion findet im bewegten Reaktionsbad statt. Dies beruht auf der Bildung von Polyelektrolytkomplexen, die durch die Reaktion von entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten entstehen. Das Polyanion ist in diesem System NaCS, ein Derivat der Cellulose, das bei der Umsetzung mit Schwefelsäure entsteht. Die NaCS-Lösung ist die tropfenbildende Lösung. Das Polykation ist PDADMAC. Die PDADMAC-Lösung ist das Reaktionsbad und beinhaltet die Vernetzerionen für die Tropfen.The membrane build-up reaction takes place in the agitated reaction bath. This is due to the Formation of polyelectrolyte complexes caused by the reaction of opposite charged polyelectrolytes are formed. The polyanion is NaCS in this system Derivative of cellulose that is formed when reacting with sulfuric acid. The NaCS solution is the drop-forming solution. The polycation is PDADMAC. The PDADMAC solution is the reaction bath and contains the cross-linking ions for the drops.

Bei der Polyelektrolytkomplexreaktion bilden sich Hohlkugeln, da die Vernetzung der Polymere von außen nach innen erfolgt. Mit fortschreitender Reaktion verzögert sich das Wachstum der Membranstärke infolge Verarmung des Kapselinneren an reaktiver Komponente und wachsendem Diffusionswiderstand. Es bilden sich asymmetrische Membranen, deren trennaktive Schicht außen liegt. Durch Zusatz von geringen Mengen an NaCS in das Reaktionsbad erreicht man infolge der Abschirmung ionischer Gruppen eine lockere Fällungsstruktur, höhere Wandstärken und eine erhöhte Kapselstabilität. Als Maß für die mechanische Stabilität der Kapseln wird die Kraft angegeben, die nötig ist, um die Kapseln zu zerstören. Mit diesem Verfahren können Mikrokapseln mit einer Wandstärke von 20 bis 100 µm und einer maximalen Stabilität von 3 bis 5 N gebildet werden.Hollow spheres are formed in the polyelectrolyte complex reaction because the crosslinking of the Polymers are made from the outside in. This slows down as the reaction progresses Growth of the membrane thickness due to depletion of the interior of the capsule on reactive Component and increasing diffusion resistance. Asymmetric forms Membranes, whose separating layer is on the outside. By adding small amounts of NaCS in the reaction bath is achieved due to the shielding of ionic groups loose precipitation structure, higher wall thicknesses and increased capsule stability. As a measure for the mechanical stability of the capsules, the force is given which is necessary to the Destroy capsules. With this procedure, microcapsules can be made with a wall thickness of 20 to 100 µm and a maximum stability of 3 to 5 N are formed.

In Abb. 2 sind die Polymerstrukturen des NaCS und des PDADMAC dargestellt. Das NaCS besitzt als negativen Elektrolyten eine Sulfat-Seitengruppe, das PDADMAC eine Stickstoff-Seitengruppe als positiven Elektrolyten. Diese reagieren im Reaktionsbad durch Bildung von Ionenbrückenbindungen unter Abspaltung von NaCS. Durch die Reaktion der beiden Polymerelektrolyten bildet sich eine stark vernetzte NaCS/PDADMAC-Membran, die nicht wasserlöslich und nicht löslich in organischen Lösungsmitteln ist. Der Einfluß des pH-Wertes auf die Membran ist gering. Weiterhin können anorganische Salze die Membran nicht zerstören. Sie ist nicht licht- oder wärmeempfindlich und weist eine hohe mechanische Stabilität auf. Immobilisiert werden können Proteine (Enzyme und Hormone), Zellorganellen (Mikrosomen), Antikörper (anti-TPO), Mikroorganismen (z. B. Pilze und Bakterien), Säugerzellen (Hybridoma) und Zellgewebe (z. B. Langerhanssche Inseln). Fig. 2 shows the polymer structures of NaCS and PDADMAC. The NaCS has a sulfate side group as the negative electrolyte, the PDADMAC has a nitrogen side group as the positive electrolyte. These react in the reaction bath by forming ion bridge bonds with the elimination of NaCS. The reaction of the two polymer electrolytes forms a strongly cross-linked NaCS / PDADMAC membrane, which is not water-soluble and not soluble in organic solvents. The influence of the pH on the membrane is slight. Furthermore, inorganic salts cannot destroy the membrane. It is not sensitive to light or heat and has a high mechanical stability. Proteins (enzymes and hormones), cell organelles (microsomes), antibodies (anti-TPO), microorganisms (e.g. fungi and bacteria), mammalian cells (hybridomas) and cell tissue (e.g. Langerhans islands) can be immobilized.

Die Attraktivität in der Mikroverkapselung von Biokatalysatoren liegt in der einfachen Trennung des verkapselten biologischen Materials vom Produkt bzw. umgebenden Medium und ihrer Wiederverwendbarkeit, was besonders bei teuren Enzymen und aufwendiger oder produktschädigender Aufarbeitung einen großen Vorteil bietet. Die Polyelektrolytkomplexe sind zudem mechanisch stabiler als der Einschluß in eine Gelmatrix und bieten zusätzlich die Sicherheit, daß keine Enzyme oder Zellen in den extrazellulären Raum gelangen können. Sie bilden durch die Membran eine der natürlichen Zelle nachempfundene Umgebung. Dadurch ist ein Schutz vor Temperatur und pH-Wert Änderungen gegeben. Ein weiterer Vorteil ist die Wiederverwendbarkeit der Katalysatoren und die Möglichkeit einer kontinuierlichen Prozeßführung. Die NaCS/PDADMAC Mikrokapseln sind biokompatibel.The attraction in the microencapsulation of biocatalysts lies in the simple Separation of the encapsulated biological material from the product or the surrounding one Medium and its reusability, which is particularly the case with expensive enzymes and elaborate or product-damaging reprocessing offers a great advantage. The Polyelectrolyte complexes are also mechanically more stable than the inclusion in a gel matrix and additionally offer the security that there are no enzymes or cells in the extracellular Space. Through the membrane, they form one of the natural cells modeled environment. This protects against temperature and pH Given changes. Another advantage is the reusability of the catalysts and the possibility of continuous process control. The NaCS / PDADMAC Microcapsules are biocompatible.

Werden Enzyme in Mikrokapseln immobilisiert, wird die Kinetik der enzymatischen Reaktion durch Diffusionsvorgänge überlagert. Limitierend wirken die Diffusion des Substrats durch die stationäre Grenzschicht zwischen Lösung und Kapsel, die Diffusion von der Oberfläche in die Porenstruktur der Kapsel sowie die Rückdiffusion des Produktes aus der Porenstruktur und die Diffusion durch die Grenzschicht. Die Diffusionslimitierung wird bei Enzym-Membranreaktoren, einer weiteren Möglichkeit der Membrantrennung, weitgehend vermieden. Hier tritt aber eine Desaktivierung der Enzyme durch Scherkräfte auf, die beim Umpumpen der Enzymsuspension bei kontinuierlichen Prozessen hervorgerufen werden. Dieser Reaktor wird erfolgreich in der Technik zur kontinuierlichen L-Aminosäure-Produktion durch katalytische Racemattrennung von N-Acetyl-D,L- methionin eingesetzt. Einen Vorteil bietet die Diffusionslimitierung nur für die Verkapselung von Multienzym-Systemen, da dann die Reaktion mit mehreren Enzymen möglich wird. Ein weiterer Nachteil ist die Enzym-Desaktivierung bei der Immobilisierung. Dies kann durch die Immobilisierung von Enzymen in ganzen Zellen eingeschränkt werden, was jedoch den Diffusionswiderstand für Substrat und Produkt durch die zusätzliche Zellwand erhöht.If enzymes are immobilized in microcapsules, the kinetics of the enzymatic Reaction overlaid by diffusion processes. The diffusion of the Substrate through the stationary boundary layer between solution and capsule, the diffusion of the surface into the pore structure of the capsule and the back diffusion of the product the pore structure and diffusion through the boundary layer. The diffusion limitation is with enzyme membrane reactors, another possibility of membrane separation, largely avoided. Here, however, the enzymes are deactivated by shear forces on that when pumping around the enzyme suspension in continuous processes are caused. This reactor becomes successful in technology for continuous L-amino acid production by catalytic resolution of N-acetyl-D, L- methionine used. Diffusion limitation only offers an advantage for Encapsulation of multienzyme systems, since then the reaction with several enzymes becomes possible. Another disadvantage is the enzyme deactivation during immobilization. This can be limited by immobilizing enzymes in whole cells, however, what the diffusion resistance for substrate and product by the additional Cell wall increased.

Die Mikrokapseln werden daher eher für Verfahren in der Zellkulturtechnik, der medizinischen Therapie oder der Sicherheitsfermentation angewendet. In der Sicherheitsfermentation ist die Mikroverkapselung ein Verfahren, das die Arbeit mit gentechnisch veränderten Mikroorganismen unter Berücksichtigung des Gentechnik- Gesetzes und der Gentechnik-Sicherheitsverordnung erleichtert. In der Medizin werden Mikrohohlkugeln zur Herstellung künstlicher Organe verwendet, die entweder als Implantat oder extrakorporal eingesetzt werden. Dabei werden sowohl körpereigene als auch fremde Zellen genutzt, um stoffwechselphysiologische oder genetisch bedingte Defekte auszugleichen, da durch die Polymermembran eine Immunbarriere geschaffen wird. In der Zellkulturtechnik wird die Schutzfunktion der Membran vor auftretenden Scherkräften (Rührer, Gasblasen) genutzt, um hohe Zelldichten und damit hohe Produktivität zu erzielen. Zusätzlich wird durch die Membran eine effektive Zellzurückhaltung zur Etablierung kontinuierlicher Prozesse bei gleichbleibend hohen Zelldichten erreicht. Versuche auf diesem Gebiet waren mit verschiedenen Systemen erfolgreich. Für die Produktion stabiler Proteine ist es oft wünschenswert, diese in der Kapsel zurückzuhalten, um ein geringeres Volumen aufarbeiten zu müssen. Für eine Applikation in vivo ist es jedoch erforderlich, daß das Produkt die Kapsel verlassen kann.The microcapsules are therefore more suitable for processes in cell culture technology medical therapy or safety fermentation applied. In the Safety fermentation, microencapsulation is a process that work with genetically modified microorganisms taking into account genetic engineering Law and the Genetic Engineering Safety Ordinance facilitated. Be in medicine Hollow microspheres used to make artificial organs, either as Implant or extracorporeal. Both the body's own and foreign cells are also used for metabolic or genetic reasons Compensate for defects, as an immune barrier is created by the polymer membrane becomes. In cell culture technology, the protective function of the membrane is prevented from occurring Shear forces (stirrers, gas bubbles) used to high cell densities and thus high To achieve productivity. In addition, the membrane is effective Cell retention to establish continuous processes at consistently high levels Cell densities reached. Trials in this area were with different systems successful. For the production of stable proteins, it is often desirable to have them in the Retain capsule in order to process a smaller volume. For one Application in vivo, however, requires that the product can leave the capsule.

Es können weitere Laborbeispiele für das NaCS/PDADMAC-System gefunden werden wie die Immobilisierung von Yarrowia lipolytica Zellen zur Zitronensäureproduktion, wobei die Zellen über lange Zeit aktiv waren; die Verkapselung von Invertase, die durch den Diffusionsprozeß limitiert war; die Coimmobilisierung von Yarrowia 1. Zellen und Invertase; die Verkapselung von Urease, die eine höhere Stabilität, aber geringere Aktivität als native Urease durch die Reaktion mit dem restlichen Cellulosesulfat zeigte und die Immobilisierung von Penicillium raistrickii i 477, wobei eine höhere Biotrockenmasse als bei freien Zellen festgestellt werden konnte. Further laboratory examples for the NaCS / PDADMAC system can be found such as the immobilization of Yarrowia lipolytica cells for citric acid production, whereby the cells have been active for a long time; the encapsulation of invertase by the Diffusion process was limited; the coimmobilization of Yarrowia 1. cells and Invertase; the encapsulation of urease, which is more stable but less Activity as native urease showed by the reaction with the remaining cellulose sulfate and the immobilization of Penicillium raistrickii i 477, being a higher Dry biomass than could be found in free cells.

Diese Beispiele geben einen kleinen Einblick in die heutige Anwendung mit immobilisierten Biokatalysatoren. Es geht weit über die Anwendung in konventionellen Fermentersystemen wie Bierherstellung, Gewinnung von Essigsäure aus Alkohol und in der Abwasserreinigung hinaus. Je nach Anwendungsfall sind die Anforderungen verschieden. Allgemein sollte die Festigkeit der Kapseln einen Einsatz in konventionellen Fermentersystemen ermöglichen, Materialien und Methoden sind auf ihre schädigende Wirkung auf Organismen zu überprüfen, die Ausschlußgrenze sollte bekannt und wenn möglich einstellbar sein und Nährstoffe und Wachstumsfaktoren müssen die Membran ungehindert passieren können.These examples give a little insight into today's application immobilized biocatalysts. It goes far beyond application in conventional Fermenter systems such as beer production, extraction of acetic acid from alcohol and in the Wastewater treatment. The requirements vary depending on the application. Generally, the strength of the capsules should be used in conventional Enabling fermenter systems, materials and methods are damaging to them To check effect on organisms, the exclusion limit should be known and if be adjustable and nutrients and growth factors must cross the membrane can pass unhindered.

Am Beispiel des NaCS/PDAMAC-Systems wird deutlich, daß für die Anwendung der Mikrokapsel die Ausschlußgrenze der Kapselhölle von entscheidender Bedeutung ist. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, die Größe der Ausschlußgrenze in einem bestimmten Bereich variabel und voreinstellbar zu machen. Dadurch sollen Mikrokapseln zu Verfügung gestellt werden, welche den Durchgang von Substraten oder Produkten durch die Hülle bis zum einer vorwählbaren Molekülgröße erlauben. Insbesondere soll die auf ca. 5000 g/mol begrenzte Ausschlußgrenze von NaCS/PDAMAC Mikrokapseln erweitert worden.The example of the NaCS / PDAMAC system clearly shows that for the application of the Microcapsule the exclusion limit of capsule hell is crucial. The object of the present invention was therefore to determine the size of the exclusion limit to make a certain area variable and presettable. This is supposed to Microcapsules are made available which allow the passage of substrates or Allow products through the shell up to a selectable molecular size. In particular, the NaCS / PDAMAC exclusion limit, which is limited to approx. 5000 g / mol Microcapsules have been expanded.

Diese Aufgabe wird durch eine erfindungsgemäße Mikrokapsel mit einer Membranhülle gelöst bei denen die Membran dadurch herstellbar ist, daß inerte Substanzen und/oder Partikel in die sich bildende Membran eingelagert und anschließend aus der gebildeten Membran entfernt werden.This object is achieved by a microcapsule according to the invention with a membrane shell solved in which the membrane can be produced in that inert substances and / or Particles are embedded in the membrane that forms and then from the formed membrane Membrane are removed.

Durch die Einlagerung von inerten Substanzen oder Partikeln, welche an der Membranbildungsreaktion nicht teilnehmen, und welche nach Abschluß der Membranbildung aus dieser entfernbar sind, ist es überraschenderweise gelungen, die wichtige Membraneigenschaft der Ausschlußgrenze beeinflussen zu können. Durch eine entsprechende Wahl der inerten Substanzen/Partikel und ihre Konzentration ist es dabei steuerbar geworden, welche Porengröße in der resultierenden Membran erzielt wird.Through the storage of inert substances or particles, which on the Do not participate in the membrane formation reaction, and which after completion of the Membrane formation are removable from this, it has surprisingly succeeded in to be able to influence the important membrane property of the exclusion limit. By a it is the appropriate choice of the inert substances / particles and their concentration controllable what pore size is achieved in the resulting membrane.

Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Mikrokapseln mit Membranen aus Polyelektrolytkomplexen gebildet. Bei diesen Komplexen kann es sich z. B. um solche handeln, die aus Natriumcellulosesulfat (NaCS) und Polydialylldimethylammonimchlorid (PDAMAC) gebildet sind. The microcapsules according to the invention are preferably made of membranes Polyelectrolyte complexes formed. These complexes can e.g. B. such act out of sodium cellulose sulfate (NaCS) and polydialylldimethylammonim chloride (PDAMAC) are formed.

Bei den inerten Substanzen handelt es sich vorzugsweise Polyalkohole, ganz besonders bevorzugt um Polyethylenglykol (PEG). Polyethylenglykole (PEG) sind wasserlösliche Polymere von über Ätherbindungen polymerisiertem Ethylenglykol mit linearer Sekundärstruktur. Die Formel ist: HO(C₂H₄O)_nH.The inert substances are preferably polyalcohols, very particularly preferably polyethylene glycol (PEG). Polyethylene glycols (PEG) are water-soluble polymers of ethylene glycol polymerized via ether bonds with a linear secondary structure. The formula is: HO (C ₂ H ₄ O) _n H.

PEG wird in der Technik zur Fällung von Proteinen benutzt. Die Gemische können anschließend mit der Ultrafiltration getrennt werden. Ein weiterer Anwendungsbereich ist die Verwendung von PEG mit einer molaren Masse von 10 000 und 20 000 g/mol als Bindungspartner für Coenzyme in Membranreaktoren zur Herstellung von Aminosäuren. Die Beispiele belegen die physiologische Unbedenklichkeit des PEG, da es weder auf Proteine noch auf Coenzyme toxisch wirkt.PEG is used in the technology for protein precipitation. The mixtures can then separated with ultrafiltration. Another area of application is the use of PEG with a molar mass of 10,000 and 20,000 g / mol as Binding partner for coenzymes in membrane reactors for the production of amino acids. The examples demonstrate the physiological harmlessness of PEG since it is neither based on Proteins are still toxic to coenzymes.

Bei den inerten Partikeln kann es sich um biologische Zellen, Liposomen oder Ca-Alginat handeln. Diese Aufzählung ist jedoch nicht vollständig. Geeignet sind alle Partikel, die bezüglich der Membranbildungsreaktion inert sind (d. h. hieran nicht teilnehmen), und welche sich anschließend aus der Membran entfernen lassen. Diese Entfernung kann z. B. durch ein Auswaschen der Partikel oder Substanzen stattfinden.The inert particles can be biological cells, liposomes or Ca alginate act. However, this list is not exhaustive. All particles are suitable are inert to the membrane formation reaction (i.e. do not participate in it), and which can then be removed from the membrane. This distance can e.g. B. by washing out the particles or substances.

Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen Mikrokapseln eine Membran Ausschlußgrenze, welche über 5000 g/mol liegt, ganz besonders bevorzugt über 100 000 g/mol bzw. 300 000 g/mol. Derartig hohe Ausschlußgrenzen waren z. B. bei den bekannten NaCS/PDADMAC-Systemen nicht erreichbar und bekannt.The microcapsules according to the invention preferably have a membrane Exclusion limit, which is above 5000 g / mol, very particularly preferably above 100,000 g / mol or 300,000 g / mol. Such high exclusion limits were e.g. B. at the known NaCS / PDADMAC systems cannot be reached and are known.

Die erfindungsgemäßen Mikrokapseln haben einen Durchmesser von 0,1-10 mm, vorzugsweise 0,8-8 mm. Die Dicke ihrer Membranhülle liegt bei 10-200 µm, vorzugsweise 20-100 µm.The microcapsules according to the invention have a diameter of 0.1-10 mm, preferably 0.8-8 mm. The thickness of their membrane shell is 10-200 microns, preferably 20-100 µm.

Ein fakultativ anaerobes Bakterium wie beispielsweise Escherichia coli zeigt Anzeichen einer Sauerstofflimitierung bei Einsatz von Kapseln mit einem Durchmesser von mehr als 400 µm bei Kultivierung. Bei Applikation in der Zellkulturtechnik (Spodoptera frugiperda, Sf 9) wurden Sauerstofflimitierungen erst ab einem Durchmesser von 800 µm gemessen. Daher sind für den Einsatz aerober Bakterien oder Hefen Kapseln mit Durchmessern um 400 µm und bei Einsatz in der Zellkulturtechnik mit 800 µm erwünscht. Durch eine geringe Modifikation des Verfahrens konnte der Durchmesser der Kapseln wesentlich verkleinert werden. Statt eines gasförmigen Fluides (vorzugsweise sterile Luft) wurde ein flüssiges Trägerfluid eingesetzt. Die Kapseldurchmesser konnten bis auf einen Durchmesser von 0,5 mm reduziert werden. An optional anaerobic bacterium such as Escherichia coli shows signs an oxygen limit when using capsules with a diameter of more than 400 µm when cultivated. When applied in cell culture technology (Spodoptera frugiperda, Sf 9), oxygen limitations were only measured from a diameter of 800 µm. Therefore, capsules with diameters are around for the use of aerobic bacteria or yeast 400 µm and desirable for use in cell culture technology with 800 µm. By a slight Modification of the process could significantly reduce the diameter of the capsules become. Instead of a gaseous fluid (preferably sterile air), a liquid one Carrier fluid used. The capsule diameters could reach a diameter of Can be reduced by 0.5 mm.

Zur Erfindung gehört auch ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mikrokapseln. Dieses Verfahren enthält die folgenden Schritte:
The invention also includes a method for producing the microcapsules according to the invention. This procedure includes the following steps:

a) the filling medium for the microcapsules emerges from a central capillary,
b) emerges from a jacket capillary which concentrically surrounds the central capillary a first membrane-forming component and envelops the outlet drop of the Filling medium,
c) the droplet detaching from the capillaries from the first membrane-forming Component and filling medium fall into a second membrane-forming component, in which then takes place the reaction to form the membrane envelope.

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß
The method is characterized in that

d) the first and / or the second membrane-forming component inert substances or Contains particles which
e) after formation of the membrane removed, preferably washed out.

Durch den Zusatz der inerten Substanzen/Partikel in die membranbildenden Komponenten werden diese bei der Ausformung der Membran dort eingelagert. Durch den anschließenden Schritt der Entfernung (zum Beispiel durch Auswaschen) werden die inerten Substanzen sodann aus der Membran entfernt und hinterlassen dort entsprechende Lücken.By adding the inert substances / particles to the membrane-forming Components are stored there when the membrane is formed. By the subsequent step of removal (for example, by washing out) inert substances are then removed from the membrane and leave corresponding ones there Gaps.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die erste membranbildende Komponente vorzugsweise NaCS und die zweite membranbildende Komponente PDADMAC.In the method according to the invention, the first membrane-forming component is preferably NaCS and the second membrane-forming component PDADMAC.

Als inerte Substanz findet bei dem Verfahren vorzugsweise PEG Verwendung. Das PEG hat dabei vorzugsweise ein Molekulargewicht von 400-10 000 g/mol und wird mit einer Konzentration von weniger als 5 Gewichts Prozent, ganz besonders bevorzugt weniger als 2 Gewichts Prozent in der membranbildende Komponente eingesetzt.PEG is preferably used as the inert substance in the process. The PEG preferably has a molecular weight of 400-10,000 g / mol and is with a Concentration of less than 5 percent by weight, most preferably less than 2 Weight percent used in the membrane-forming component.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird ferner vorzugsweise so durch geführt, das die Mantelkapillare konzentrisch von einer zweiten Mantelkapillare umgeben ist, aus welcher ein Medium strömt, welches die Tropfenformung unterstützt. Dieses Medium ist vorzugsweise Luft oder eine Flüssigkeit.The inventive method is preferably carried out so that the Jacket capillary is concentrically surrounded by a second jacket capillary, from which a medium flows that supports the drop formation. This medium is preferably air or a liquid.

Die Tropfenbildung in der Kapillare erfolgt vorzugsweise bei erhöhter Temperatur, insbesondere in ein Bereich von 30-40°C. Gerade bei NaCS hat sich einer derartige Erhöhung der Temperatur als vorteilhaft erwiesen. The drop formation in the capillary is preferably carried out at elevated temperature, especially in a range of 30-40 ° C. This is particularly the case with NaCS Increasing the temperature has proven to be advantageous.

Bei einer Variante des erfindungsgemäßen Verkapselungs- und Kultivierungskonzeptes mit der Möglichkeit, in demselben Rührreaktor verkapseln und kultivieren zu können, werden Kontaminationsquellen und aufwendige Arbeitsschritte eingespart.In a variant of the encapsulation and cultivation concept according to the invention the possibility of being able to encapsulate and cultivate in the same stirred reactor Sources of contamination and time-consuming work steps saved.

Ausgehend vom Reaktor, der das Abtrennen von flüssigem Trägerfluid und PDADMAC einerseits und der vollständigen Rückhaltung der Kapseln im Kessel garantiert erfolgen die drei Arbeitsschritte Verkapselung, Spülvorgang und Medienzufuhr sowie Kultivierung im selben Gefäß. Im Gegensatz zum bisherigen Verfahren kann im PDADMAC beim Kapselherstellungsprozeß der Sauerstoffpartialdruck pO₂ gemessen, mitverfolgt und ggf. geregelt werden.Starting from the reactor, which guarantees the separation of liquid carrier fluid and PDADMAC on the one hand and the complete retention of the capsules in the boiler, the three steps of encapsulation, rinsing and media supply as well as cultivation take place in the same vessel. In contrast to the previous method, the oxygen partial pressure pO ₂ can be measured, tracked and, if necessary, regulated in the capsule manufacturing process in the PDADMAC.

Als flüssiges Trägerfluid kann perfluorierte Inertflüssigkeit verwendet werden. In der Inertflüssigkeit löst sich Sauerstoff um ein Vielfaches mehr als in wäßrigen Lösungen. Wird die Flüssigkeit vor dem Verkapselungsprozeß mit Sauerstoff gesättigt, so gibt sie diesen bei der Kapselherstellung langsam an das PDADMAC ab und dient somit zusätzlich als Sauerstoffspeicher.Perfluorinated inert liquid can be used as the liquid carrier fluid. In the Inert liquid dissolves oxygen many times more than in aqueous solutions. Becomes the liquid is saturated with oxygen before the encapsulation process, so it adds this the capsule production slowly from the PDADMAC and thus also serves as Oxygen storage.

Die Immobilisierung in NaGS/PDADMAC Kapseln vereint einige wichtige Vorteile: Sie haben eine hohe mechanische Stabilität und können als Minimembranreaktoren bezeichnet werden, die unter sterilen Bedingungen arbeiten. Sie grenzen das immobilisierte biologische Material von dem Umgebungsvolumen ah und erleichtern dadurch die Produkttrennung sowie die Arbeit mit gentechnisch veränderten Mikroorganismen.Immobilization in NaGS / PDADMAC capsules combines several important advantages: You have high mechanical stability and can be used as mini membrane reactors that work under sterile conditions. You limit the immobilized biological material from the surrounding volume ah and thereby facilitate the Product separation and working with genetically modified microorganisms.

Die Erhöhung der Ausschlußgrenze dieser Membran erweitert ihren Anwendungsbereich deutlich. Zum einen können niedermolekulare Stoffe, wie Glucose und Sauerstoff, durch größere Poren besser diffundieren, zum anderen ist es möglich, daß höhermolekulare Stoffe, wie Proteine, Polysaccharide und Viren, durch die Membran diffundieren können.The increase in the exclusion limit of this membrane extends its field of application clear. On the one hand, low-molecular substances, such as glucose and oxygen, can Diffuse larger pores better, on the other hand it is possible that higher molecular weight Substances such as proteins, polysaccharides and viruses can diffuse through the membrane.

Im folgenden werden die erfindungsgemäßen Mikrokapseln und ihre Herstellung anhand der folgenden eines Ausführungsbeispiele näher erläutert.The microcapsules according to the invention and their production are described below the following one of the exemplary embodiments explained in more detail.

Die erfindungsgemäßen Mikrokapsel können verwendet werden, um biologische Zellen einzuschließen. Hierbei kann es sich insbesondere um lebende Insekten- oder Pflanzenzellen handeln. Derartige Zellen können insbesondere für eine Infektion mit rekombinanten, veränderten oder Wildtyp-Viren, Virionen und DNS verwendet werden.The microcapsule according to the invention can be used to generate biological cells to include. This can be, in particular, live insect or Act plant cells. Such cells can be used for infection in particular recombinant, altered or wild-type viruses, virions and DNA can be used.

Erfindungsgemäß ist es überraschend gelungen, eine stabile Hülle zu erzeugen, die durchlässig für Viren sowie rekombinante DNA ist. Versuche haben gezeigt, daß die Zelle extrem lange lebensfähig bleibt und sich in dieser die Viren stark vermehren. Mit dieser Methode ist es nunmehr möglich, Viren in Zellen, vorzugsweise in tierischen Zellen zu züchten. Bisher mußte dies konventionell in mehrzelligen Lebewesen höherer Tiere oder Pflanzen durchgeführt werden. Insbesondere gentechnisch veränderte, neue Viren konnten jedoch in solchen Tieren oder Pflanzen bisher nicht gezüchtet werden, da diese augenblicklich abgetötet oder gelähmt werden. Auch die isolierte Züchtung in Zellen ist nicht möglich, da die Zellwände sehr schnell lysieren und eine Vermehrung der Viren nicht mehr durchgeführt werden kann. Hier führt die erfindungsgemäße Kapselhülle zu überraschenden neuen Erkenntnissen.According to the invention, it has surprisingly been possible to produce a stable shell that is permeable to viruses and recombinant DNA. Experiments have shown that the cell remains viable for an extremely long time and the viruses multiply rapidly in it. With this Method, it is now possible to virus viruses in cells, preferably in animal cells breed. So far, this had to be conventional in multicellular organisms of higher animals or Plants are carried out. In particular, genetically modified, new viruses could however, have not yet been bred in such animals or plants as these instantly killed or paralyzed. The isolated cultivation in cells is also not possible because the cell walls lyse very quickly and the virus does not multiply more can be done. The capsule shell according to the invention leads here surprising new knowledge.

example 1 Encapsulation process

Für die Herstellung der Mikrokapseln werden zu Beginn des jeweiligen Verkapselungsverfahrens die membranbildende Komponente und das Reaktionsbad hergestellt. Dafür werden je Charge die NaCS-Lösung mit 35 g/l NaCS und die PDADMAC-Lösung mit 65 g/l PDADMAC (38,5%ig) + 9 g/l NaCl (0,9%ig) in Phosphatpuffer (pH 6,8) angesetzt. Es werden vier Chargen für folgende Untersuchungen hergestellt:
For the production of the microcapsules, the membrane-forming component and the reaction bath are produced at the beginning of the respective encapsulation process. For each batch, the NaCS solution with 35 g / l NaCS and the PDADMAC solution with 65 g / l PDADMAC (38.5%) + 9 g / l NaCl (0.9%) in phosphate buffer (pH 6 , 8). Four batches are made for the following tests:

1. for the TOC value determination of the capsule storage buffer from the capsules with different PEG concentrations in the membrane,
2. for the immobilization of cytochrome C and the E.coli cell disruption in capsules different PEG contents in the membrane,
3. for the immobilization of the protein mixture (Combithek, Boehringer, Mannheim) in Capsules with different concentrations and different molar masses PEG in the membrane, the TOC value determination of the capsule storage buffer Capsules with PEG of different molar mass in the membrane and their Stability measurement, and
4. for the stability measurement of the capsules with different PEG concentrations in the membrane.

Um die Verkapselung steril durchzuführen, werden die Lösungen, die Vorlagegefäße, die Verkapselungsapparatur mit Schläuchen, die Behälter für das Reaktionsbad mit Rührer und die Probenbehälter zum Aufbewahren ohne Vergleichsgefäß autoklaviert (120°C, 30 min).In order to carry out the encapsulation in a sterile manner, the solutions, the storage containers, are used Encapsulation apparatus with hoses, the container for the reaction bath with a stirrer and autoclaved the sample container for storage without a reference vessel (120 ° C, 30 min).

Das Verkapselungsverfahren und die gesamte Apparatur wird im folgenden am Beispiel der Kapselsynthese von Kapseln ohne PEG in der Membran und einer Proteinlösung in der Kapsel erläutert. Die Proteinlösung und die NaCS-Lösung werden in SCHOTT-Gläsern vorgelegt und mit der Schlauchpumpe (Schlauchdurchmesser: NaCS-Lösung: 3 mm, Proteinlösung: 0,5 mm) in die Vertropfungsapparatur gepumpt. Die Massenströme der NaCS-Lösung und der Proteinlösung werden durch Auswiegen einer Menge an NaCS-Lösung oder Proteinlösung in einer bestimmten Zeit wie folgt bestimmt:
The encapsulation process and the entire apparatus are explained below using the example of the capsule synthesis of capsules without PEG in the membrane and a protein solution in the capsule. The protein solution and the NaCS solution are placed in SCHOTT glasses and pumped into the dropping apparatus using the peristaltic pump (hose diameter: NaCS solution: 3 mm, protein solution: 0.5 mm). The mass flows of the NaCS solution and the protein solution are determined by weighing out an amount of NaCS solution or protein solution in a certain time as follows:

1st setting: 29.74 mg NaCS / s; 1.46 mg protein solution / s
2nd setting: 35.68 mg NaCS / s; 1.75 mg protein solution / s.

Die Lösungen werden mit der 1. Pumpeneinstellung zur Vertropfungsapparatur gepumpt. In Abb. 3 ist der Verkapselungsprozeß schematisch dargestellt.The solutions are pumped to the dripping apparatus with the 1st pump setting. The encapsulation process is shown schematically in Fig. 3.

Aus der Vertropfungsapparatur tropfen die Lösungen in das bewegte Reaktionsbad. Das Reaktionsbad mit der PDADMAC-Lösung hat immer das 3-fache Volumen der vertropften kapselbildenden NaCS-Lösung. Die Fallstrecke (ca. 0,5 m) und die Rührergeschwindigkeit (laminare Strömung) werden so eingestellt, daß sich die Kapseln gut ausbilden können ohne deformiert zu werden.The solutions drip from the dropletizer into the agitated reaction bath. The Reaction bath with the PDADMAC solution always has 3 times the volume of the droplets capsule-forming NaCS solution. The fall distance (approx. 0.5 m) and the stirrer speed (laminar flow) are set so that the capsules can form well without being deformed.

Die Kernkapillare der Vertropfungsapparatur hat einen Innendurchmesser d_i = 0,5 mm, die Mantelkapillare einen Innendurchmesser d_i = 1,0 mm und der Luftkanal einen Durchmesser D_L = 5 mm. Die Rührzeit im Reaktionsbad beträgt 45 min. Nachdem die Membran ausgebildet ist, werden die Kapseln gründlich und schnell mit Puffer (4-fache Menge des Reaktionsbades) und VE-Wasser (2-fache Menge des Reaktionsbades; VE = vollentsalzt) gewaschen und in den Aufbewahrungspuffer gegeben.The core capillary of the dropletization apparatus has an inside diameter d _i = 0.5 mm, the jacket capillary has an inside diameter d _i = 1.0 mm and the air duct has a diameter D _L = 5 mm. The stirring time in the reaction bath is 45 min. After the membrane has been formed, the capsules are washed thoroughly and quickly with buffer (4 times the amount of the reaction bath) and demineralized water (2 times the amount of the reaction bath; VE = fully desalinated) and added to the storage buffer.

Als Polymer kommt Polyethylenglykol PEG (Merck-Schuchardt, Hohenbrunn) in Frage. Dabei ist zu klären,
Polyethylene glycol PEG (Merck-Schuchardt, Hohenbrunn) is a suitable polymer. It should be clarified

1. whether PEG is washed out of the capsule membrane,
2. whether the change in PEG concentration at constant molecular weight Exclusion limit changes and, if this is not the case,
3. whether the exclusion limit is directly related to the variation of the PEG molecular weight stands.

Zu 1: Um das Auswaschen des Polyethylenglykols zu überprüfen, wurde PEG 10 000 dem NaCS und dem PDADMAC jeweils zu 2, 3, 4 und 5% zugesetzt, mit dem Gemisch Kapseln hergestellt und anschließend in 0,9%iger NaCl-Lösung aufbewahrt. Weiterhin erfolgte die Zumischung nur in je einem der Kapselkomponenten. Ein weiterer Schritt war das Untersuchen des Auswaschvorganges mit PEG unterschiedlichen Molekulargewichtes, aber gleicher Konzentration im NaCS und PDADMAC. Dazu wurde PEG der Größe 400, 1000, 3000, 6000, 10 000 und 20 000 g/mol den Kapselkomponenten zu 2% zugemischt, Kapseln hergestellt und in physiologischer Kochsalzlösung aufbewahrt. 1 : To check the washing out of the polyethylene glycol, PEG 10,000 was added to the NaCS and the PDADMAC at 2, 3, 4 and 5%, capsules were made with the mixture and then stored in 0.9% NaCl solution. Furthermore, the admixture was only carried out in one of the capsule components. Another step was to examine the washout process with PEG of different molecular weights but the same concentration in NaCS and PDADMAC. For this purpose, PEG sizes 400, 1000, 3000, 6000, 10,000 and 20,000 g / mol were mixed with the capsule components at 2%, capsules were prepared and stored in physiological saline.

Anhand der Analyse der Aufbewahrungslösung auf ihren Gehalt an organischem Kohlenstoff sollte überprüft werden, ob PEG aus der Membran ausgewaschen wird. In regelmäßigen Abständen wurden deshalb von der Aufbewalirungslösung je 5 ml Probe entnommen und mittels TOC-Messung auf ihren organischen Kohlenstoffgehalt untersucht.Based on the analysis of the storage solution for its organic content Carbon should be checked to see if PEG is washed out of the membrane. In 5 ml of sample were therefore taken from the storage solution at regular intervals taken and by means of TOC measurement for their organic carbon content examined.

Zu 2: PEG 10 000 wurde 2 und 3%ig den Kapselkomponenten zugemischt und mit den Mischungen zum einen Cytochrom C (Merck, Darmstadt) verkapselt. Zum zweiten wurde PEG 10 000 zu 0.5, 1, 2 und 3% zugemischt und damit ein Proteingemisch (Combithek, Boehringer Mannheim) verkapselt. Die Kapseln lagerten im Kühlschrank bei 4°C in Phosphatpuffer und nach drei Tagen wurde der Puffer durch Gelelektrophorese auf Proteine überprüft.2: PEG 10,000 was mixed with 2 and 3% of the capsule components and with the Mixtures encapsulated on the one hand cytochrome C (Merck, Darmstadt). The second was PEG 10,000 mixed at 0.5, 1, 2 and 3% and thus a protein mixture (Combithek, Boehringer Mannheim) encapsulated. The capsules were stored in the refrigerator at 4 ° C Phosphate buffer and after three days the buffer was opened by gel electrophoresis Proteins checked.

Zu 3: NaCS und PDADMAC wurde jeweils 2% PEG mit dem Molekulargewicht 400, 1000, 3000, 6000, 10 000 und 20 000 zugemischt und damit ein Proteingemisch verkapselt. Lagerung und Probenahme und -analyse entspricht Punkt 2.3: NaCS and PDADMAC were each 2% PEG with the molecular weight 400, 1000, 3000, 6000, 10,000 and 20,000 mixed in and encapsulated with a protein mixture. Storage and sampling and analysis correspond to point 2.

Die entsprechenden Mengen an PEG werden in die membranbildenden Komponenten (entweder in beide oder in eine) gemischt, ohne innere Lösung vertropft, gewaschen und in den Aufbewahrungspuffer gegeben.The appropriate amounts of PEG are in the membrane-forming components (either in both or in one) mixed, dripped without internal solution, washed and in given the storage buffer.

Es wird mit einer Zumischung von 5% PEG mit einer molaren Masse von 10 000 g/mol (PEG 10 000) in die beiden Kapselpolymere begonnen. Dafür werden 50 ml NaCS-Lösung und 150 ml PDADMAC-Lösung mit 5% PEG 10 000 gemischt. Die NaCS/PEG-Lösung wird mit einem Massenstrom von 29,74 mg/s vollständig in das PDADMAC/PEG- Reaktionsbad vertropft. Die Tropfen werden 45 min gerührt, mit 900 ml Phosphatpuffer und 450 ml dest. H₂O gewaschen.An admixture of 5% PEG with a molar mass of 10,000 g / mol (PEG 10,000) is started in the two capsule polymers. For this, 50 ml NaCS solution and 150 ml PDADMAC solution are mixed with 5% PEG 10,000. The NaCS / PEG solution is completely dripped into the PDADMAC / PEG reaction bath at a mass flow of 29.74 mg / s. The drops are stirred for 45 min, with 900 ml of phosphate buffer and 450 ml of dist. H ₂ O washed.

Im nächsten Versuch wird PEG 10 000 mit Konzentrationen von 2%, 3% und 4% in beide Kapselpolymere gemischt. Aus diesen Lösungen werden Kapseln hergestellt, denen PEG entweder in beide oder in eine der beiden Lösungen gemischt wird. Gleichzeitig werden aus diesen Lösungen Kapseln ohne PEG in der Membran hergestellt. Für jede Kapselherstellung werden 50 ml der kapselbildenden Lösung in 150 ml des Reaktionsbades vertropft. Die Tropfen werden wie bereits beschrieben gerührt, gewaschen und in den Aufbewahrungspuffer gegeben.In the next experiment, PEG will be 10,000 with concentrations of 2%, 3% and 4% in both Capsule polymers mixed. Capsules are made from these solutions, which PEG is mixed in either or in one of the two solutions. At the same time, are out these solutions capsules made without PEG in the membrane. For every Capsule preparation are 50 ml of the capsule-forming solution in 150 ml of the reaction bath drained. The drops are stirred, washed and washed as described above Storage buffer given.

Weiterhin werden die Zugabe verschiedener molarer Massen des PEG auf ihre Wirkung auf die Kapseln untersucht. Der Auswaschprozeß wird für die Zumischung von 2% PEG mit einer molaren Masse von 400, 1000, 3000, 6000, 10 000 und 20 000 g/mol und ohne PEG in beide Kapselpolymere bestimmt. Der Vorgang wird für die Zumischung einer molaren Masse kurz erläutert:
Die NaCS/PEG-Lösung wird 5 min in das PDADMAC/PEG-Reaktionsbad (100 ml) vertropft. Bei dem eingestellten Massenstrom des NaCS mit 29,74 mg/s werden ca. 700 Kapseln hergestellt. Nach 45 min Rühren im Reaktionsbad werden die Kapseln mit 200 ml H₂O und 400 ml Phosphatpuffer gewaschen und in 100 ml Aufbewahrungspuffer gegeben.Furthermore, the addition of different molar masses of the PEG are examined for their effect on the capsules. The washout process is determined for the admixture of 2% PEG with a molar mass of 400, 1000, 3000, 6000, 10,000 and 20,000 g / mol and without PEG in both capsule polymers. The procedure for adding a molar mass is briefly explained:
The NaCS / PEG solution is dripped into the PDADMAC / PEG reaction bath (100 ml) for 5 min. Approx. 700 capsules are produced with the set mass flow of the NaCS at 29.74 mg / s. After stirring in the reaction bath for 45 min, the capsules are washed with 200 ml of H ₂ O and 400 ml of phosphate buffer and placed in 100 ml of storage buffer.

Die Untersuchungen haben gezeigt, daß die Kapselstruktur durch die Zugabe kleiner Mengen an PEG in die Kapselpolymere in ihrer Struktur verändert werden können, ohne an Stabilität zu verlieren.The studies have shown that the capsule structure is smaller by the addition Amounts of PEG in the capsule polymers can be changed in their structure without losing stability.

Auch die Größe der PEG-Moleküle hat einen Einfluß auf die Kapselstruktur. PEG mit sehr kleiner molarer Masse (400 g/mol) diffundiert aus der Membran heraus. Seine Größe reicht nicht aus, um die Membranstruktur so aufzulockern, daß eine höhere Ausschlußgrenze erreicht werden kann. Sehr große PEG-Moleküle (20 000 g/mol) sind dagegen schwerer aus der Membran zu lösen.The size of the PEG molecules also has an influence on the capsule structure. PEG with a lot small molar mass (400 g / mol) diffuses out of the membrane. His size is not sufficient to loosen the membrane structure so that a higher one Exclusion limit can be reached. Very large PEG molecules (20,000 g / mol) are on the other hand, more difficult to separate from the membrane.

Aufgrund der durchgeführten Untersuchungen wird die PEG-Zugabe vorzugsweise auf 1% bis 3% PEG 10 000 und 2% PEG 6000 in beide Kapselpolymere eingegrenzt. Diese Kapseln sind für Moleküle mit einer relativen Molekülmasse von mindestens 240 000 durchlässig. Die Ausschlußgrenze läßt sich durch die Zugabe von den verwendeten PEG-Konzentrationen oder molaren Massen des PEG in die Kapselpolymere variieren. Based on the tests carried out, the PEG addition is preferably reduced to 1% limited to 3% PEG 10,000 and 2% PEG 6000 in both capsule polymers. This Capsules are for molecules with a molecular weight of at least 240,000 permeable. The exclusion limit can be determined by adding the ones used PEG concentrations or molar masses of the PEG in the capsule polymers vary.

Example 2 Expression of recombinant proteins with the baculovirus expression system

3,5 g Cellulosesulfat wird über Nacht in 100 ml PBS gelöst. 300 ml einer 2,2% polyDADMAG Lösung in PBS angesetzt. Diese Lösungen, ca. 2 L PBS, sowie die Verkapselungsapparatur mit ihrer Peripherie werden bei 121°C für 15 min autoklaviert.3.5 g of cellulose sulfate is dissolved in 100 ml of PBS overnight. 300 ml of a 2.2% polyDADMAG solution prepared in PBS. These solutions, about 2 L PBS, as well as the Encapsulation apparatus with its periphery are autoclaved at 121 ° C for 15 min.

Insektenzellen, die sich in der logarithmischen Wachstumsphase befinden, werden zentrifugiert. Zur Infektion wird der rekombinierte Baculovirus zu dem Zellpellet gegeben, so daß 1-100% der Zellen sofort infiziert werden, und gut vermischt. Dann werden die Zellen in frischem Medium aufgenommen und in den Vorlagenbehälter der Verkapselungsapparatur verbracht.Insect cells that are in the logarithmic growth phase will centrifuged. For infection, the recombined baculovirus becomes the cell pellet given so that 1-100% of the cells are immediately infected and mixed well. Then the cells are taken up in fresh medium and placed in the original container Encapsulation equipment spent.

Die Suspension aus Baculoviren und Insektenzellen wird immobilisiert, die Kapseln für 15 min im Fällbad ausgehärtet und anschließend intensiv mit PBS gespült, um polyDADMAC-Rest zu entfernen. Die Kapseln werden auf dem Schüttler in Kolben mit Schikanen und in frischem Medium bei 27°C kultiviert. Nach 4-6 Tagen werden die Kapseln vom Medium getrennt, mechanisch zerstört und die enthaltenen Zellen und Proteinlösung durch Zentrifugation von Membranfragmenten getrennt. Standardreinigungschritte für die Aufreinigung des produzierten rekombinanten Proteins schließen sich an.The suspension of baculoviruses and insect cells is immobilized, the capsules for Cured for 15 min in the precipitation bath and then rinsed intensively with PBS to remove polyDADMAC rest. The capsules are placed in flasks on the shaker Baffled and cultivated in fresh medium at 27 ° C. After 4-6 days, the Capsules separated from the medium, mechanically destroyed and the cells and Protein solution separated from membrane fragments by centrifugation. Standard purification steps for the purification of the recombinant produced Proteins join.

Verglichen mit der Produktion in Suspension wird eine um 50% höhere Ausbeute an rekombinantem Protein erreicht.Compared to the production in suspension, the yield is 50% higher recombinant protein reached.

Example 3 Batch production of monoclonal antibodies

Wie Beispiel 2, nur daß Hybridome als Zellkultur verwendet werden, die nicht infiziert werden müssen. Die Kultivierungstemperatur beträgt 37°C, der Aufschluß erfolgt nach 5-10 Tagen (spätestens, wenn die Nährstoffe im Medium verbraucht sind).As example 2, except that hybridomas are used as cell culture that are not infected Need to become. The cultivation temperature is 37 ° C, the digestion takes place after 5-10 days (at the latest when the nutrients in the medium have been used up).

Example 4 Continuous production of monoclonal antibodies

3,5 g Cellulosesulfat wird über Nacht in 100 ml PBS mit 2% PEG (MW 10 000) gelöst. 300 ml einer 2,2% polyDADMAC Lösung in PBS mit 2% FEG (MW 10 000) angesetzt. Diese Lösungen, ca. 2 L PBS, sowie die Verkapselungsapparatur mit ihrer Peripherie werden bei 121°C für 15 min autoklaviert.3.5 g of cellulose sulfate is dissolved in 100 ml of PBS with 2% PEG (MW 10,000) overnight. Prepare 300 ml of a 2.2% polyDADMAC solution in PBS with 2% FEG (MW 10,000). These solutions, approx. 2 L PBS, as well as the encapsulation apparatus with its periphery are autoclaved at 121 ° C for 15 min.

Hybridome, die sich in der logarithmischen Wachstumsphase befinden, werden zentrifugiert und zur Immobilisierung in frischem Medium aufgenommen und in den Vorlagenbehälter der Verkapselungsapparatur verbracht.Hybridomas that are in the logarithmic growth phase will centrifuged and taken up for immobilization in fresh medium and in the Master container of the encapsulation apparatus spent.

Die Zellsuspension wird immobilisiert, die Kapseln für 15 min im Fällbad ausgehärtet und anschließend intensiv mit PBS gespült, um polyDADMAC-Rest zu entfernen. Die Kapseln werden in einem Zellkulturreaktor oder Standardrührreaktor und in frischem Medium bei 37°C kultiviert. Dem Reaktor wird ständig frisches Medium zugegeben und gleichzeitig dasselbe Volumen an "altem" Medium entnommen (Ablauf).The cell suspension is immobilized, the capsules cured for 15 minutes in the precipitation bath and then rinsed intensively with PBS to remove polyDADMAC residue. The Capsules are in a cell culture reactor or standard stirred reactor and in fresh Medium cultivated at 37 ° C. Fresh medium is continuously added to the reactor and at the same time the same volume of "old" medium is removed (drain).

Die monoklonalen Antikörper können aus dem Ablauf durch Standardverfahren gewonnen werden.The monoclonal antibodies can be drained by standard procedures be won.

Example 5 Production of wild-type baculoviruses

3,5 g Cellulosesulfat wird über Nacht in 100 ml PBS gelöst. 300 in einer 2,2% polyDADMAC Lösung in PBS angesetzt. Diese Lösungen, ca. 2 L PBS, sowie die Verkapselungsapparatur mit ihrer Peripherie werden bei 121°C für 15 min autoklaviert.3.5 g of cellulose sulfate is dissolved in 100 ml of PBS overnight. 300 in a 2.2% polyDADMAC solution prepared in PBS. These solutions, about 2 L PBS, as well as the Encapsulation apparatus with its periphery are autoclaved at 121 ° C for 15 min.

Insektenzellen, die sich in der logarithmischen Wachstumsphase befinden, werden zentrifugiert und in frischem Medium aufgenommen. Diese Zellsuspension wird geteilt und die Hälfte mit der Cellulosesulfatlösung gemischt, die andere Hälfte wie bisher an die innere Kapillare der Vertropfungsapparatur angeschlossen.Insect cells that are in the logarithmic growth phase will centrifuged and taken up in fresh medium. This cell suspension is divided and half mixed with the cellulose sulfate solution, the other half as before the inner capillary of the dropletizer is connected.

Die Insektenzellsuspensionen werden immobilisiert, die Kapseln für 15 min im Fällbad ausgehärtet und anschließend intensiv mit PBS gespült, um polyDADMAC-Rest zu entfernen. Die Kapseln werden auf dem Schottler in Kolben mit Schikanen und in frischem Medium bei 27°C kultiviert, wobei das Medium regelmäßig durch frisches Medium ersetzt werden muß. Nach 7-21 Tagen wird dem frischen Medium eine Virussuspension zugegeben. Die Viren dringen über die Membranporen in die Kapseln ein und infizieren die Insektenzellen, wodurch es zur Virusvermehrung kommt. Nach weiteren 7-14 Tagen werden die Kapseln aus dem Medium genommen, mechanisch aufgeschlossen und die Dauerform der Baculoviren, die Polyhedra, durch Filtration oder Zentrifugation konzentriert gewonnen werden.The insect cell suspensions are immobilized, the capsules for 15 min in the precipitation bath cured and then rinsed intensively with PBS to remove polyDADMAC residue remove. The capsules are on the Schottler in flasks with baffles and in fresh medium cultivated at 27 ° C, the medium regularly by fresh Medium needs to be replaced. After 7-21 days the fresh medium becomes one Virus suspension added. The viruses penetrate the capsules through the membrane pores and infect the insect cells, causing virus multiplication. After The capsules are removed from the medium for a further 7-14 days, mechanically open-minded and the permanent form of the baculovirus, the polyhedra, by filtration or centrifugation can be obtained in a concentrated manner.

Verglichen mit der Produktion in Suspension werden 4-6 mal mehr Polyhedra pro Insektenzelle erreicht, bezogen auf eine Zelldichte bei der Infektion von 1E6 Zellen/ml; bei höheren Zelldichten sogar noch mehr, da hier in Suspension für eine optimale intrazelluläre Virusvermehrung entweder nicht mehr genug Sauerstoff und Nährstoffe zu den Insektenzellen transportiert werden kann, oder diese durch Misch- und Gasdispergiereinrichtungen irreversibel geschädigt werden.Compared to the production in suspension, 4-6 times more polyhedra per Insect cell reached, based on a cell density in the infection of 1E6 cells / ml; at higher cell densities even more, since here in suspension for an optimal intracellular virus replication either lacks oxygen and nutrients can be transported to the insect cells, or these by mixing and Gas dispersing devices are irreversibly damaged.

Example 6 Continuous production of natural substances from plant cells

3,5 g Cellulosesulfat wird über Nacht in 100 ml PBS gelöst. 300 ml einer 2,2% polyDADMAC Lösung in PBS angesetzt. Diese Lösungen, ca. 2 L PBS, sowie die Verkapselungsapparatur mit ihrer Peripherie werden bei 121°C für 15 min autoklaviert.3.5 g of cellulose sulfate is dissolved in 100 ml of PBS overnight. 300 ml of a 2.2% polyDADMAC solution prepared in PBS. These solutions, about 2 L PBS, as well as the Encapsulation apparatus with its periphery are autoclaved at 121 ° C for 15 min.

Pflanzenzellen, die sich in der logarithmischen Wachstumsphase befinden, werden zentrifugiert und das Pellet in frischem Medium resuspendiert. Diese Suspension wird mit der Cellulosesulfatlösung vermischt und in den Vorlagenbehälter der Verkapselungsapparatur verbracht.Plant cells that are in the logarithmic growth phase will centrifuged and the pellet resuspended in fresh medium. This suspension will mixed with the cellulose sulfate solution and in the original container Encapsulation equipment spent.

Die Suspension aus Pflanzenzellen wird ohne Verwendung der inneren Kapillare immobilisiert, die Kapseln für 15 min-30 min im Fällbad ausgehärtet und anschließend intensiv mit PBS gespült, um polyDADMAC-Rest zu entfernen.The suspension of plant cells is made without using the inner capillary immobilized, the capsules cured for 15 min-30 min in the precipitation bath and then rinsed intensively with PBS to remove polyDADMAC residue.

Die Kapseln werden in einem Standardrührkessel bei 26°C kultiviert. Das Medium wird durch Zulauf ständig erneuert. Im Medienablauf befinden sich die von den Pflanzenzellen produzierten Naturstoffe, die durch Standardverfahren aufkonzentriert und gewonnen werden können.The capsules are cultivated in a standard stirred kettle at 26 ° C. The medium will constantly renewed by inflow. Those of the are in the media flow Plant cells produced natural substances that were concentrated by standard procedures and can be won.

In Immobilisaten steigt die spezifische Produktion von Naturstoffen in Pflanzenzellen um den Faktor 6-10 an.In Immobilisaten, the specific production of natural products in plant cells increases by a factor of 6-10.

Fig. 1-5. Fig. 1-5.

Claims

1. Microcapsules with a membrane shell, characterized in that the membrane can be produced by incorporating inert substances and / or particles in the membrane which is formed and then removed from the membrane formed.

2. microcapsules according to claim 1, characterized in that the membrane consists of polyelectrolytes.

3. microcapsules according to one of claims 1 or 2, characterized in that the membrane of sodium cellulose sulfate (NaCS) and Polydialylldimethylammoniumchlorid (PDADMAC) is formed.

4. Microcapsules according to one of claims 1 to 3, characterized in that the inert substances are preferably polyalcohols Are polyethylene glycol (PEG).

5. Microcapsules according to one of claims 1 to 4, characterized in that the inert particles are biological cells, lysosomes or Ca alginate.

6. microcapsules according to one of claims 1 to 5, characterized in that the membrane exclusion limit is above 5000 g / mol, preferably over 100,000 g / mol, very particularly preferably over 200,000 g / mol.

7. microcapsules according to one of claims 1 to 6, characterized in that they have a diameter of 0.1 to 10 mm, preferably have 0.8 to 8 mm.

8. microcapsules according to one of claims 1 to 7, characterized in that the membrane shell has a thickness of 10 to 200 µm, preferably 20 to 100 microns.

9. A method for producing microcapsules according to any one of claims 1 to 8, in which

a) the filling medium for the microcapsules emerges from a central capillary,
b) from a jacket capillary, which concentrically surrounds the central capillary, exits a first membrane-forming component and encloses the outlet drop of the filling medium,
c) the drop detaching from the capillaries falls into a second membrane-forming component, whereupon the reaction to form the membrane envelope takes place,
characterized in that
d) the first and / or the second membrane-forming component contains inert substances and / or inert particles which
e) after formation of the membrane removed, preferably washed out.

10. The method according to claim 9, characterized in that the first membrane-forming component NaCS and / or the second membrane-forming component is PDADMAC.

11. The method according to any one of claims 9 to 10, characterized in that the inert substance is PEG, preferably with a Molecular weight of 400 to 10,000 g / mol and in a concentration of less than 5 percent by weight, very particularly preferably less than 2 percent by weight, be used.

12. The method according to any one of claims 9 to 11, characterized in that the jacket capillary concentrically from a second Sheathed capillary from which a drop formation is supported Medium, preferably air or a liquid, emerges.

13. The method according to any one of claims 9 to 12, characterized in that the drop formation at elevated temperature, preferably at 30 to 40 ° C, takes place.

14. Use of the microcapsules in one of claims 1 to 8 for inclusion biological cells, especially living hybridomas, animal or vegetable Cells, preferably around them with recombinant, modified or wild-type viruses Virions, and infect DNA.