DD285372A5 - PROCESS FOR IMMOBILIZING MICROORGANISMS OR COIMMOBILIZATION OF MICROORGANISMS AND ENZYMES - Google Patents

PROCESS FOR IMMOBILIZING MICROORGANISMS OR COIMMOBILIZATION OF MICROORGANISMS AND ENZYMES Download PDF

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DD285372A5
DD285372A5 DD33008789A DD33008789A DD285372A5 DD 285372 A5 DD285372 A5 DD 285372A5 DD 33008789 A DD33008789 A DD 33008789A DD 33008789 A DD33008789 A DD 33008789A DD 285372 A5 DD285372 A5 DD 285372A5
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DD
German Democratic Republic
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microorganisms
enzymes
immobilized
ultramicrocapsules
coimmobilization
Prior art date
Application number
DD33008789A
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German (de)
Inventor
Michael Foerster
Horst Dautzenberg
Torsten Hoffmann
Alfred Schellenberger
Klaus-Peter Doepfer
Johanna Mansfeld
Gabriele Holzapfel
Brigitte Tiersch
Wolfgang Wagenknecht
Brigitte Lukanoff
Helmut Kluge
Joachim Roembach
Original Assignee
Ingenieurtechnik,Dd
Institut Fuer Polymerenchemie "Erich Correns" Der Adw Der Ddr,Dd
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Publication date
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen, das sehr stabile Biokatalysatoren liefert, die auch in Langzeitverfahren und stoffwandelnden Prozessen in der Biotechnologie, chemischen, pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie sowie in der Medizin eingesetzt werden koennen. Die Mikroorganismen werden zunaechst durch Einkapseln in Ultramikrokapseln aus Polyelektrolytkomplexen vorimmobilisiert. Im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen werden die Enzyme an ein Traegermaterial gebunden, die Mikroorganismen zur Vorimmobilisierung in Ultramikrokapseln eingekapselt. Nach Separation und Sedimentation der vorimmobilisierten Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und traegergebundenen Enzyme im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen werden diese in Mikrokapseln eingeschlossen und nach UEberfuehrung in ein fuer die Zuechtung der immobilisierten bzw. coimmobiliserten Biokatalysatoren geeignetes Milieu der gewuenschten Verwendung zugefuehrt.{Immobilisierung von Mikroorganismen; Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen; Vorimmobilisierung; Einkapselung; Polyelektrolytkomplexe; Stoffwandlung}The invention relates to a process for the immobilization of microorganisms or coimmobilization of microorganisms and enzymes, which provides very stable biocatalysts, which can also be used in long-term processes and material-converting processes in biotechnology, chemical, pharmaceutical and food industries and in medicine. The microorganisms are first preimmobilized by encapsulation in ultramicrocapsules of polyelectrolyte complexes. In the case of coimmobilization of microorganisms and enzymes, the enzymes are bound to a carrier material that encapsulates microorganisms for preimmobilization in ultramicrocapsules. After separation and sedimentation of the pre-immobilized microorganisms or microorganisms and carrier-bound enzymes in the case of coimmobilization of microorganisms and enzymes, these are enclosed in microcapsules and, after conversion to a suitable environment for the growth of the immobilized or coimmobilized biocatalysts, the desired use is achieved {immobilization of microorganisms; Coimmobilization of microorganisms and enzymes; Vorimmobilisierung; encapsulation; polyelectrolyte complexes; Material conversion}

Description

Titel der ErfindungTitle of the invention
Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisierung von Mikroorganismen und EnzymenProcess for the immobilization of microorganisms or coimmobilization of microorganisms and enzymes
Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coimmobilisif.rung von Mikroorganismen und Enzymen zur Herstellung von Biokatalysatoren, die zur Durchführung stoffwandelnder Prozesse in der Biotechnologie, in der pharmazeutischen, chemischen und Lebensmittelindustrie sowie für den Einsatz in der Medizin geeignet sind. Sie finden z. B. Verwendung für die Biosynthese von Medikamenten, hochwertigen Chemikalien, Enzymen usw.The invention relates to a process for the immobilization of microorganisms or coimmobilization of microorganisms and enzymes for the production of biocatalysts, which are suitable for carrying out material-converting processes in biotechnology, in the pharmaceutical, chemical and food industries and for use in medicine. You will find z. B. Use for the biosynthesis of drugs, high quality chemicals, enzymes, etc.
Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art
Zur Durchführung biochemischer Reaktionen in der Biotechnologie, pharmazeutischen, chemischen und Lebensmittelindustrie werden verstärkt Mikroorganismen eingesetzt. In zunehmendem Maße werden die Mikroorganismen in immobilisierter Form verwendet, um den Einsatz derselben ökonomisch und effektiv zu gestalten. Mit Hilfe der Immobilisierung wird eine Erhöhung der rnikrobiellen Produktivität im Verhältnis zürn Reaktorvolumen, eine leichtere Abtrennbarkeit des Biokatalysators vom Produkt und damit eine wesentliche Senkung des Aufwands zur Isolierung der gewünschten Produkte ermöglicht.To carry out biochemical reactions in the biotechnology, pharmaceutical, chemical and food industries, microorganisms are increasingly used. Increasingly, the microorganisms are used in immobilized form to make their use economical and effective. Immobilization allows for increased microbial productivity in proportion to reactor volume, easier separability of the biocatalyst from the product, and thus a significant reduction in the cost of isolating the desired products.
Zur Immobilisierung von Mikroorganismen ist eine Reihe von Methoden beschrieben worden, wie z. B. der Einschluß in Netzwerke und in Schaumstoffe, die Fixierung an porösen Trägcrmaterialien und die Verkapselung. Daneben sind einige Methoden und Materialien in Kombination getestet worden.For the immobilization of microorganisms, a number of methods have been described, such as. As the inclusion in networks and in foams, the fixation of porous Trägcrmaterialien and the encapsulation. In addition, some methods and materials have been tested in combination.
Beim Einschluß in Netzwerke aus Gelen ist neben einer relativ geringen mechanischen Festigkeit häufig ein Auswaschen der Zellen aus den Gelen zu beobachten (Stöcklein, Eisgruber, Schmidt, Biotechnol. Lett. 5(10), 703 (1983)).When included in networks of gels, in addition to a relatively low mechanical strength, washing out of the cells from the gels is frequently observed (Stöcklein, Eisgruber, Schmidt, Biotechnol., Lett., 5 (10), 703 (1983)).
Um die Gefahr des Auswachsens von Zellen in das MeJium herabzusetzen und daraus resultierende Störungen des Prozesses zu vermeiden, wird in DE OS 34 32 932 ein Verfahren beschrieben, das c!as Auswachsen von Zellen auch bei Langzeitversuchen sicher verhindern soll. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die Oberfläche des Biokatalysators durch eine zellenfreie Schutzschicht aus einem vernetzten, keine Durchlässigkeit für die Zellen aufweisenden den zallenhaltigen Kern umschließenden Gel gebildet wird. Dieses Verfahren liefert Gelkör_jer, die im allgemeinen eine begrenzte mechanische Haltbarkeit auf v/eisen. Für den beschriebenen Verwendungszweck, die Sektherstellung, ist jedoch die mechanische Festigkeit von untergeordneter Bedeutung, da der Biokatalysator nicht stark beansprucht wird, in anderen stoffwandelnden Prozessen spielt die mechanische Festigkeit eine bedeutende Rolle.In order to reduce the risk of outgrowth of cells in the MeJium and to avoid resulting disturbances of the process, a method is described in DE OS 34 32 932, which should prevent c! As outgrowth of cells, even in long-term experiments. This object is achieved in that the surface of the biocatalyst is formed by a cell-free protective layer of a crosslinked, no permeability to the cells having the zallenhaltigen core enclosing gel. This process provides gel beads which generally have limited mechanical durability. However, for the described purpose, the sparkling, the mechanical strength is of minor importance, since the biocatalyst is not heavily stressed, in other material-converting processes, the mechanical strength plays an important role.
In dieser Patentschrift wird zudem festcnste1It, daß sich das Verfahren der Mikrokapselung für die Immobilisierung von Zellen nicht eignet aufgrund der Toxizität der zu verwendenden Lösungsmittel und der daraus resultierenden geringen Katalysatoraktivität, und daß auch bei dieser Methode das Auswachsen von Zellen nicht sicher verhindert werden kann.In this patent also is festcnste 1 It, that the process of microencapsulation for the immobilization of cells is not suitable due to toxicity of the solvent to be used and the resulting low catalyst activity, and that the outgrowth of cells are not securely prevented even with this method can.
Von Mosbach (Phil. Trans. R. Soc. Lond. B300, 355 (1983)) wird ebenfalls festgestellt, daß bei der Einkapselung von Mikroorganismen irn Vergleich zum Einschluß in Metzwerken die Anzahl Zellen, die ins Medium wachsen können, weiter reduziert ist, daß aber dennoch die in die Membran inkorporierten Zellen Biomasse nach außen abgeben können.Mosbach (Phil. Trans. R. Soc. Lond. B300, 355 (1983)) also notes that in the encapsulation of microorganisms compared to inclusion in networks, the number of cells that can grow into the medium is further reduced, but that nevertheless the cells incorporated in the membrane can deliver biomass to the outside.
In DE-OS 30 12 233 wird ein Verfahren zur Immobilisierung von chemisch oder biologisch aktiven Stoffen, lebendem Gewebe und Einzelzellen beschrieben, bei dem zunächst die Materialien in einem Gel eingeschlossen und anschließend die sauren Gruppen an der Oberfläche der Gelmatrix mit einem aminocjruppenhal tigen Polymer umgesetzt werden, so daß sich eine Membran ausbildet. Als nachteilig sind die geringe Widerstandsfähigkeit der so gebildeten Membran gegenüber proteolytischem Angriff anzusehen, die eine begrenzte Lebensdauer der Kapseln bedingt, und die Anwesenheit einer großen Anzahl freier Aminogruppen an der Oberfläche, die neben der Verklurnpungsgefahr der Kapseln bei Einsatz anionischer Substrate zu einer Akkumulation derselben an derIn DE-OS 30 12 233 a method for the immobilization of chemically or biologically active substances, living tissue and single cells is described, in which first the materials enclosed in a gel and then reacted the acidic groups on the surface of the gel matrix with a aminocjruppenhal term polymer become, so that forms a membrane. A disadvantage is the low resistance of the membrane thus formed against proteolytic attack, which requires a limited life of the capsules, and the presence of a large number of free amino groups on the surface, in addition to the Verklurnpungsgefahr the capsules when using anionic substrates to an accumulation of the same the
Oberfläche führt.Surface leads.
In WO 83/O3C61 wird ein Verfahren zur Doppelkapsalung beschrieben, das jedoch nicht der Immobilisierung von Mikroorganismen dient, sondern auf eine gezielte Freisetzung von Wirkstoffen gerichtet ist. Dabei befindet sich ein Komplex oder ein Reakcionsprodukt eines Wirkstoffes in den Mini-Mikrokapseln. Durch Diffusion gelangt der genannte Stoff aus den Mini-Mikrokapseln in die dieselben umgebende Flüssigkeit innerhalb der Doppelkapsel, reagiert dort mit einem Enzym, und der Wirkstoff v/ird freigesetzt. Der Wirkstoff gelangt durch Diffusion durch die äußere Membran in das Empfängerorqan. Der Vorteil besteht in einer besseren Dosierbarkeit des Wirkstoffs.In WO 83 / O3C61 a process for Doppelkapsalung is described, which does not serve the immobilization of microorganisms, but is directed to a targeted release of drugs. This is a complex or a reaction product of an active ingredient in the mini-microcapsules. By diffusion, said material from the mini-microcapsules enters the same surrounding fluid within the double capsule, reacts there with an enzyme, and the active ingredient is released. The active ingredient passes by diffusion through the outer membrane in the Empfängerorqan. The advantage consists in a better meterability of the active ingredient.
In DD 219 795 werden zum Zwecke der Kompartimentierung gleichartige bzw. verschiedenartige biologische Objekte gemeinsam mit bestimmten Substraten in Mehrfachkapseln eingekapselt. In den letzten Jahren wurden in zunehmendem Maße Mikroorganismen verschiedener Species und/oder Enzyme zusammen immobilisiert (Coimmobilisierung), nachdem anfangs jeweils nur ein bestimmter Mikroorganismus bzw. ein bestimmtes Enzym an oder in einer Matrix immobilisiert worden war, von denen einige in einer weiterentwickelten Form zusammen in einem Reaktor eingesetzt wurden. Die Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen ermöglicht es, den Einsatzbereich immobilisierter Mikroorganismen zu verbreitern, indem andere, normalerweise nicht durch den betrachteten Mikroorganismus verwertete Subs'.rate mit Hilfe der coimmobilisiertcn Enzyme in eine Form überführt werden, die vom betreffenden Mikroorganismus umgesetzt werden kann. Bei Auswahl einer geeigneten Sequenz von Enzymen können auf diese Weise mehrstufige Reaktionen katalysiert werden,In DD 219 795 similar or different biological objects are encapsulated together with certain substrates in multiple capsules for the purpose of compartmentalization. In recent years, microorganisms of various species and / or enzymes have been increasingly immobilized together (coimmobilization), after initially immobilizing only one particular microorganism or enzyme at or in a matrix, some of which are combined in a more advanced form were used in a reactor. The coimmobilization of microorganisms and enzymes makes it possible to broaden the scope of use of immobilized microorganisms by converting other subsets normally not exploited by the microorganism under consideration with the aid of the coimmobilized enzymes into a form which can be converted by the microorganism concerned. By choosing an appropriate sequence of enzymes, multi-step reactions can be catalyzed in this way,
Wach einem Verfahren von B. Hägerdal und K. Mosbach (US 4,524,137 zur Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen wird das Enzym kovalent an das Trägermaterial gebunden, das zum Einschluß der Mikroorganismen dient. Als nachteilig sind bei dieser Methode die relativ geringe mechanische Festigkeit der Gelperlen und das Problem des Auswaschens von Zellen aus den Gelen beim Einsatz in Langzeitversuchen anzusehen.According to a method of B. Hägerdal and K. Mosbach (US 4,524,137 for the coimmobilization of microorganisms and enzymes, the enzyme is covalently bound to the support material which serves to enclose the microorganisms.) The disadvantage of this method is the relatively low mechanical strength of the gel beads and to look at the problem of washing out cells from the gels when used in long-term experiments.
In EP 0 041 610 wird von C. H. Doehringer Sohn, Ingelheim die Bindung des Enzyms an Hefezellen vorgeschlagen. Diese Methode ist jedoch nicht bei allen Mikroorganismen-Species anwendbar, da die .neisten Mikroorganismen durch die ImmobilisierungsprozedurEP 0 041 610 proposes binding of the enzyme to yeast cells by C.H. Doehringer Sohn, Ingelheim. However, this method is not applicable to all microorganism species, since the most microorganisms by the Immobilisierungsprozedur
des Enzyms inaktiviert werden. Darüber hinaus wird die Größe der Zellen nicht wesentlich verändert, so daß die Rückhaltung dos Coimmobilisats in kontinuierlichen Fermentationsprozessen sehr schwierig ist.of the enzyme are inactivated. In addition, the size of the cells is not significantly changed, so that the retention dos coimmobilisate in continuous fermentation processes is very difficult.
Von W. Hartmeier und A. Heinrichs wird in DE 35 34 983 ein Verfahren zur Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen beschrieben, bei dem die Mikroorganismen und Enzyme zugleich in einer polymeren Matrix eingeschlossen werden, die in situ mit einer entgegengesetzt geladenen, semipermeablen Membran überzogen wird. Bei diesem Verfahren wird die Anzahl Zellen, die bei Langzeitfermentationen ins Medium auswachsen können, gegenüber dem alleinigen Einschluß in ein Gelnetzwerk reduziert. Es kann aber dennoch nicht verhindert werden, daß beim Eintropfen der Mikroorganismen/Enzym/Alginatlösung in die Calciumchlorid/Methacrylat/Acrylat-Copolymer-Lösung Mikroorganismen in die Membran inkorporiert v/erden, die Ursache für das Auswachsen von Mikroorganismen ins Außenmedium sein können.In DE 35 34 983, W. Hartmeier and A. Heinrichs describe a process for the coimmobilization of microorganisms and enzymes in which the microorganisms and enzymes are simultaneously enclosed in a polymeric matrix which is coated in situ with an oppositely charged, semipermeable membrane , In this method, the number of cells that can grow into the medium during long-term fermentations is reduced compared to the sole inclusion in a gel network. However, it can not be prevented that in the calcium chloride / methacrylate / acrylate copolymer solution microorganisms are incorporated into the membrane during the dripping of microorganisms / enzyme / alginate solution, which may be the cause of the outgrowth of microorganisms in the outer medium.
Bei den an dieser Stelle dargestellten Methoden zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und Enzymen ist festzustellen, daß sie im Falle des Geleinschlusses von vornherein eine geringe mechanische Festigkeit besitzen und daß bei den bekannten Verfahren zur Einkapselung von Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und Enzymen dieselben in die Kapselmembran inkorporiert werden und durch Wachstums- und Zellteilungsvorgänge der vitalen Objekte eine beträchtliche Verminderung der Kapselfestigkeit verursacht wird.In the case of the methods described herein for the immobilization of microorganisms or microorganisms and enzymes is to be noted that in the case of Geleinschlusses from the outset have a low mechanical strength and that in the known methods for encapsulating microorganisms or microorganisms and enzymes the same in the Capsule membrane are incorporated and caused by growth and cell division processes of vital objects, a significant reduction in capsule strength.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Ziel der Erfindung sind stabile enkapsulierte Biokatalysatoren, deren Stabilität auch im Falle der Einkapselung proliferierender Systeme nicht durch Wachstums- und Zellteilungsvorgänge derselben herabgesetzt wird und die in biotechnologischen Verfahren eingesetzt werden können.The aim of the invention are stable encapsulated biocatalysts whose stability, even in the case of the encapsulation of proliferating systems, is not reduced by growth and cell division processes of the same and which can be used in biotechnological processes.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung immobilisierter oder coirnmobilisierter Biokatalysatoren mit hoher Operationsstabilität auf dem Wege der Enkapsulierung von Mikroorganismen oder Mikroorganismen und Enzymen zu finden, das den Einbau der zu immobilisierenden Biokatalysatoren in die Kapselwand verhindert und Kapseln mit hoher Membranfestigkeit erzeugt.The invention has for its object to find a method for producing immobilized or coirnmobilisierter biocatalysts with high operational stability by way of encapsulation of microorganisms or microorganisms and enzymes, which prevents the incorporation of the biocatalysts to be immobilized in the capsule wall and produces capsules with high membrane strength.
Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß die zu immobilisierenden Mikroorganismen, beispielsweise Hefen und Bakterien, zur Vorimmobilisierung in Ultramikr'.' apseln eingekapselt werden, daß das Enzym/die Enzyme im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen an ein Trägermaterial gebunden werden, die sedimentierten und separierten Vorimmobilisate bzw. die sedimentierten und separierten Vorimmobilisate und trägergebundenen Enzyme in einer wäßrigen Lösung aus Cellulosesulfat suspendiert werden, die Suspension in eine wäßrige Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung eingetropft wird, und die immobilisierten Biokatalysatoren nach Abschluß des Einkapselungsprozesses in bekannter Weise abgetrennt und in ein für die Züchtung der Mikroorganismen geeignetes Milieu eingebracht '-/erden. Im Falle der Coimmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen erfolgt die Bindung des Enzyms/der Enzyme entweder adsorptiv oder kovalent an einem Trägermaterial, das vorzugsweise ein unlösliches Material darstellt, in einer wäßrigen Lösung bei pH-Werten zwischen 3,5 und 8, bei Temperaturen von 277 K bis zur Stabilitätsgrenze der Enzyme und bei einer Reaktionsdauer von 30According to the invention this is achieved in that the microorganisms to be immobilized, for example yeasts and bacteria, for preimmobilization in Ultramikr '. be encapsulated that the enzyme / enzymes are bound in the case of coimmobilization of microorganisms and enzymes to a support material, the sedimented and separated Vorimmobilisate or the sedimented and separated Vorimmobilisate and carrier-bound enzymes are suspended in an aqueous solution of cellulose sulfate, the suspension is dropped into an aqueous polydimethyldiallylammonium chloride solution, and the immobilized biocatalysts after the completion of the encapsulation process in a known manner and introduced into a suitable for the cultivation of microorganisms environment '- / ground. In the case of coimmobilization of microorganisms and enzymes, the binding of the enzyme (s) is either adsorptive or covalent to a support material, preferably an insoluble material, in an aqueous solution at pHs between 3.5 and 8, at temperatures of 277 K up to the stability limit of the enzymes and with a reaction duration of 30
min bis 24 Stunden. Als Kupplungsreagens wird vorzugsweise GIutardialdehyd mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 10 %, vorzugsweise jedoch 2,5 %. Als unlösliches Trägermaterial wird vorzugsweise Aminomethylpolystyren mit einem Partikcldurchmesser von 5 bis 200 /um verwendet.min to 24 hours. The coupling reagent is preferably glutaric dialdehyde having a concentration between 0.1 to 10%, but preferably 2.5%. As the insoluble support material, aminomethyl polystyrene having a particle diameter of 5 to 200 μm is preferably used.
Die Mikroorganismen werden zur Vorimmobilisierung in Ultramikrokapseln, die vorzugsweise aus Polydimethyldiallylammoniumchlorid und Cellulosesulfat gebildet werden, eingekapselt. Die Konzentration des Cellulosesulfats für die Herstellung der Ultramikrokapseln (Vorinmobilisate) beträgt 5 bis 100 g/l, die der Polyoimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung zwischen 5 und 100 g/l. Die Verweilzeit der in Ultramikrokapseln vorimmobilisierten Mikroorganismen in der Polydimethyldiallylamnioniurnchlorid-Lösuncj wird zwischen 30 Sekunden und 60 Minuten gewählt. Die Temperatur während des Vorimmobilisierungsprozesses reicht von 273 K bis zur Stabilitätsgrenze der zu iirn obilisierenden Mikroorganismen. Für die einkapselung der in Ultramikrokapseln eingeschlossenen Mikroorganismen bzw. der in Ultramikrokapseln eingeschlossenen Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme wird eine Konzentration des Cellulosesulfats von 5 bis 100 g/l eingesetzt. Die Konzentration der Polydimethyl-diaHylammoniumchlorid-Lösung liegt ebenfalls zwischen 5 und 100 g/l.The microorganisms are encapsulated for pre-immobilization in ultramicrocapsules, preferably formed from polydimethyldiallyl ammonium chloride and cellulose sulfate. The concentration of cellulose sulfate for the preparation of the ultramicrocapsules (Vorinmobilisate) is 5 to 100 g / l, that of the polyoimethyldiallyl ammonium chloride solution between 5 and 100 g / l. The residence time of the microorganisms preimmobilized in ultramicrocapsules in the polydimethyldiallylamine chloride solution is chosen to be between 30 seconds and 60 minutes. The temperature during the preimmobilization process ranges from 273 K to the stability limit of the microorganisms that are obilizing. For the encapsulation of the microorganisms enclosed in ultramicrocapsules or of the microorganisms and carrier-bound enzymes enclosed in ultramicrocapsules, a concentration of the cellulose sulfate of 5 to 100 g / l is used. The concentration of polydimethyldiaHylammoniumchlorid solution is also between 5 and 100 g / l.
Die Temperatur bei der sich anschließenden Einkapselung der sedimentierten und separierten Vorimmobilisate wird ebenfalls zwischen 273 K und der Stabilitätsgrenze der zu immobilisierenden Biokatalysatoren gewählt.The temperature during the subsequent encapsulation of the sedimented and separated preimmobilizates is likewise selected between 273 K and the stability limit of the biocatalysts to be immobilized.
Die Verweilzeit der immobilisierten Mikroorganismen oder Mikroorganismen und Enzyme liegt zwischen 30 Sekunden und 12 Stunden. Nach Abtrennung der erfincungsgomäß hergestellten iminobilisicrtsn Riokatalysatoren von der Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung werden diese in ein für die Züchtung der immobilisierten Hiokatalysatorcn geeignetes ':;iiieu überführt und anschließend der gewünschten Verwendung zugeführt.The residence time of the immobilized microorganisms or microorganisms and enzymes is between 30 seconds and 12 hours. After separating the iminobilisicrtsn Riokatalysatoren of the polydimethyldiallylammonium chloride solution produced according to the invention, these are converted into a mixture suitable for the growth of the immobilized hiocatalysts and then supplied to the desired use.
Somit liefert das erfindungsgsmäße Verfahren immobilisierte Biokatalysatoren, die sich durch eine hohe Vitalität', Aktivität und Operationsstabilität auszeichnen, aic: auch i;n Falle der Einkapselung vitaler, proliferiender Systeme bei Langzeitversuchen nicht durch Wachstums- und ZeiltcilunQsvorgänge derselben oder Auswaschen vermindert wird. Die Cindung des Enzyms/der Enzyme schützt dieses vor Abbauprozossen und Inaktivierung. Die Vorim-Thus, the method of the present invention provides immobilized biocatalysts characterized by high vitality, activity, and surgical stability , even if , in the case of encapsulation of vital, proliferating systems in long-term experiments, it is not diminished by growth and cell culture processes thereof or washing out. The binding of the enzyme (s) protects it from degradation and inactivation. The
mcbilisierung gewährleistet,- daß keine Mikroorganismen oder t'rägergebundenen Enzyme in die Kapselwand inkorporiert werden und die Oberfläche des immobilisierten Biokatalysators frei von Mikroorganismen und trägergebundenen Enzymen ist. Somit ist das Risiko des Auswachsens von !Mikroorganismen in das Kulturmedium, das boim Einschluß von Mikroorganismen in Gelnetzwerkc nicht verhindert worden kann und zu Störungen des Prozesses führt, ausgeschlossen. Von Vorteil ist weiterhin eine öl höhte mechanische Stabilität der Biokatalysatoren gegenüber der von Gelnetzwerken .microfiltration ensures that no microorganisms or carrier-bound enzymes are incorporated into the capsule wall and the surface of the immobilized biocatalyst is free of microorganisms and carrier-bound enzymes. Thus, the risk of outgrowth of microorganisms in the culture medium, which can not prevent boim inclusion of microorganisms in the gel network and leads to process disruption, is excluded. Another advantage is an increased oil mechanical stability of biocatalysts over that of gel networks.
Im Falle der Coimmobilisierung von Invertase und Yarrowia lipolytica-Ze.llen wird es möglich, Saccharose als Substrat einzusetzen, die normalerweise nicht von diesen Zellen verwertet v/erden kann, jedoch ein wesentlich preiswerteres Substrat als das eigentliche Substrat Glucose darstellt.In the case of coimmobilization of invertase and Yarrowia lipolytica cells, it becomes possible to use sucrose as a substrate, which normally can not be utilized by these cells, but is a much cheaper substrate than the actual substrate glucose.
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Das erfindungsgamäße Verfahren soll anhand nachfolgender Beispiele erläutert werden.The process according to the invention will be explained with reference to the following examples.
AusführungsbeispielcAusführungsbeispielc
Beispiel 1example 1
0,8 ml einer Zellsuspension er Hefe Yarrow.ia .lipolytica mit einem Gehalt von 1 mg HTtl/ml werden mit 5 ml einer 2,2-oigcn Cellulosesulfat-Lösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) homogen vermischt. Diese Suspension wird mit Hilfe einer Abblasvorrichtung (nach Dautzenberg) unter Rühren in eine l,5%ige Lösung von Polydimethyldiallylamrnoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 getropft, so daß Ultramikrokapseln mit einem Durchmesser von maximal 200 yum entstehen. Nach maximal 5 min Verweilzeit der Kapseln im Fällbad werden diese sedimentiert und abgetrennt. Anschließend werden die Ultramikrokapseln dreimal mit Wasser gewaschen. Nach Sedimentieren der Ultramikrckapsel η werden diese, v/ie in Beispiel 2 beschrieben, verwendet.0.8 ml of a cell suspension of yeast Yarrow.ia .lipolytica containing 1 mg HTtl / ml are homogeneously mixed with 5 ml of a 2.2% cellulose sulfate solution (cellulose sulfate with a DS of 0.43). This suspension is added dropwise, with the aid of a blow-off device (according to Dautzenberg) with stirring, to a 1.5% solution of polydimethyldiallylamonium chloride having a molecular weight of 40,000, so that ultramicrocapsules with a maximum diameter of 200 μm are formed. After a maximum of 5 min residence time of the capsules in the precipitation bath they are sedimented and separated. Subsequently, the ultramicro capsules are washed three times with water. After sedimentation of the ultramicrocapsule η, they are used, as described in Example 2.
Beispiel 2Example 2
0,5 ml des Sediments der Ultramikrokapseln, die Hefezellen der Species Yarrowia lipolytica enthalten, werden in 5 ml einer 2,2%igen Lösung von Cellulosesulfat (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) suspendiert und möglichst homogen verteilt. Danach v/i cd diese Suspension der Ultramikrokapseln in eine Lösung von l,2%igern Polydimethyldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 getropft und mindestens 5 min langsam gerührt. '0.5 ml of the sediment of the ultramicrocapsules containing yeast cells of the species Yarrowia lipolytica are suspended in 5 ml of a 2.2% solution of cellulose sulfate (cellulose sulfate with a DS of 0.43) and distributed as homogeneously as possible. Thereafter, this suspension of the ultramicrocapsules is added dropwise to a solution of 1.2% polydimethyldiallylammonium chloride having a molecular weight of 40,000 and slowly stirred for at least 5 minutes. '
Mach Abtrennung des Fällbads von den gebildeten Mikrokapseln wcruen diese zweimal mit !30 ml sterilem destillierten Hasser gov/aschen .Separate the precipitation bath from the microcapsules formed by washing twice with 30 ml sterile distilled haters.
Zur Kultivierung werden 20 g der so erhaltenen Kapseln in einem 500-rnl-Fermenter eingesetzt. Mach einer Kultivierungscauer von 24 h ist das Kulturmedium aufgezehrt und das Zellwachstum abgeschlossen. Die Zellmasse im Kapselinneren istFor cultivation, 20 g of the capsules thus obtained are used in a 500 ml fermenter. Make a cultivation cure of 24 h, the culture medium is eaten and cell growth completed. The cell mass in the capsule interior is
auf eine Konzentration von 15 mg HTM/rnl Immobilisat angewachsen. Das Außenmedium ist nicht getrübt, d. h. frei von Hefezellen. Diese Kapseln werden in einem kontinuierlichen Fermentationsprozeß zur Produktion von Citronensäure eingesetzt .to a concentration of 15 mg HTM / rnl immobilizate. The external medium is not clouded, d. H. free of yeast cells. These capsules are used in a continuous fermentation process for the production of citric acid.
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde analog mit bakterien der Species Pseudomonas aeruginosa ausgeführt.The inventive method was carried out analogously with bacteria of the species Pseudomonas aeruginosa.
Beispiel 3Example 3
0,2 g Polystyren Wofatit UF 93 (Partikeldurchmesser 5 bis 100 |uin) werden mit 3 ml 2,5%iger Glutardialdehyd-Lösung in SÖRENSEN-Phosphatpuffer pH 7,0 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Das aktivierte Trägermaterial wird anschließend mit Wasser bis zur völligen Entfernuncj des überschüssigen .GIutardialdehyds gewaschen. Anschließend v/ird das aktivierte Polystyren mit 300 U Invertase in 3 ml SÖREHSEK-Pnosphatpuffer pH 7,0 4 h bei Raumtemperatur gerühr': und danach mit 25 rnM Natriumacetatpuffer pH 5,0/1 M NaCl und 25 mi-1 Udtriumacetatpuffer pH 5,0 gewaschen, bis kein Protein mehr im Waschwasser nachweisbar ist.0.2 g of polystyrene Wofatit UF 93 (particle diameter 5 to 100 μl) are stirred with 3 ml of 2.5% glutaraldehyde solution in SÖRENSEN phosphate buffer pH 7.0 for 2 hours at room temperature. The activated carrier material is then washed with water until complete removal of the excess .Giutardialdehyds. Subsequently, the activated polystyrene is stirred with 300 U invertase in 3 ml of SÖREHSEK phosphate buffer pH 7.0 for 4 h at room temperature and then with 25 mM sodium acetate buffer pH 5.0 / 1 M NaCl and 25 ml -1 Ud trium acetate buffer pH 5.0 washed until no protein is detectable in the wash water.
Der Invertase-Polystyren-Komplex wird, wie in Beispiel 5 beschrieben, verwendet.The invertase polystyrene complex is used as described in Example 5.
Beispiel 4Example 4
0,2 g Folystyren Wofatit UF 93 (Partikeldurchmesser 5 bis 100 /am) werden mit 800 U Invertase in 3 ml SÖRENSEM-Phosphatouffer pH 7,0 4 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit 25 rnM Natriumacctatpuffer pH 5,0/1 M NaCl und 2 5 mfi Natriumacetatpuffer pH 5,0 gewaschen, bis kein Protein mehr im Waschwasser nachweisbar ist. Der Invertase-Polystyren-Komplex v/ird, wie in Beispiel 5 beschrieben, verwendet.0.2 g Folystyrene Wofatit UF 93 (particle diameter 5 to 100 / am) are stirred with 800 U invertase in 3 ml SÖRENSEM Phosphatouffer pH 7.0 for 4 h at room temperature and then with 25 mM sodium acetate buffer pH 5.0 / 1 M NaCl and 2 5 mfi sodium acetate buffer pH 5.0 washed until no protein is detectable in the wash water. The invertase polystyrene complex was used as described in Example 5.
- 10 -- 10 -
Beispiel 5Example 5
0,5 ml des Sediments der Ultramikrokapseln, die Hefezellen der Species Yarrowia lipolyticc? enthalten, gemäß Beispiel 1 und 0,2g des Invertase-Polystyren-Kopplcxes gemäß Beispiel 3 oder 4 v/erden in 5 ml 2,29öiger Cellulosesulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) suspendiert und möglichst homogen verteilt.0,5 ml of sediment of ultramicrocapsules, yeast cells of a variety Yarrowia lipolyticc? contained, according to Example 1 and 0.2 g of the invertase Polystyren Kopplcxes according to Example 3 or 4 v / erden in 5 ml of 2.2 9 öiger cellulose sulfate solution (cellulose sulfate with a DS of 0.43) suspended and distributed as homogeneously as possible.
Dann wird diese Suspension in 50 ml einer Fjösung von l,2?üigem Polydimethyldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 5 min langsam gerührt.Then this suspension is dissolved in 50 ml of a solution of 1, 2 ? drip polydimethyldiallylammonium chloride with a molecular weight of 40,000 with gentle stirring and stirred slowly for at least 5 min.
Nach Abtrennung des Fällbads von den gebildeten Mikrokapseln werden diese zweimal mit 50 ml sterilem destillierten Wasser gewaschen.After separation of the precipitation bath from the microcapsules formed, they are washed twice with 50 ml of sterile distilled water.
Zur Kultivierung v/erden 20 g der so erhaltenen Kapseln in einem 500-ml-Fermenter eingesetzt. Nach einer Kultivierungsdauer von 24 h ist das Kulturmedium aufgezehrt und das,Zellwachstum abgeschlossen. Die Zellmasse im Kapselinneren ist auf eine Konzentration von 15 mg HTM/ml Immobilisat angewachsen. Das Außenmedium ist nicht getrübt, d. h. frei von Hefezellen. Diese Kapseln v/erden in einem kontinuierlichen Fermentationsprozeß zur Produktion von Citronensäure mit Saccharose als Substrat eingesetzt.For cultivation, 20 g of the capsules thus obtained are used in a 500 ml fermenter. After a culture period of 24 h, the culture medium is consumed and the cell growth is complete. The cell mass in the capsule interior has grown to a concentration of 15 mg HTM / ml immobilizate. The external medium is not clouded, d. H. free of yeast cells. These capsules are used in a continuous fermentation process for the production of citric acid with sucrose as substrate.
Beispiel 6Example 6
50 ml einer 2,2%igen Cellulosesulfatlösung (Cellulosesulfat mit einem DS von 0,43) werden 10 min bei 121 C autoklaviert. Dann Dann werden 0,5 ml des Sediments gemäß Beispiel 2 bzw. 5 in 5 ml des autoklavierten Cellulosesulfats suspendiert und homogen verteilt. Diese Suspension v/ird in 50 ml einer Lösung von 0,25 % Polydimethy.ldiallylammoniumchlorid mit einer Molmasse von 40000 unter leichtem Rühren getropft und mindestens 40 min gerührt. Danach wird das Fällbad 1 : 1 mit Wasser verdünnt. Die Kapseln werden weitere 80 min unter leichtem Rühren im Fällbad bewegt. Nach Abtrennung des Fällbades werden die Kapseln ohne v/eitere Behandlung sofort dem Kultivierungsprozeß zugeführt, wie es in Beispiel 2 und 5 beschrieben wurde.50 ml of a 2.2% strength cellulose sulfate solution (cellulose sulfate with a DS of 0.43) are autoclaved at 121 ° C. for 10 minutes. Then 0.5 ml of the sediment according to Example 2 or 5 is suspended in 5 ml of the autoclaved cellulose sulfate and distributed homogeneously. This suspension is added dropwise in 50 ml of a solution of 0.25% Polydimethyl.ldiallylammonium chloride with a molecular weight of 40,000 with gentle stirring and stirred for at least 40 minutes. Thereafter, the precipitating bath is diluted 1: 1 with water. The capsules are stirred for a further 80 minutes with gentle stirring in the precipitation bath. After separation of the precipitation bath, the capsules are immediately added to the cultivation process without further treatment, as described in Examples 2 and 5.

Claims (12)

  1. - A1- - A1-
    Patentansprücheclaims
    Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen bzw. Coirnmobilisierung von Mikroorganismen und Enzymen durch Vorimmobilisierung und Einkapselung gekennzeichnet dadurch, daß dio Mikroorganismen zur Vorimmobilisierung in Ultramikrokapseln eingekapselt v/erden, im Falle der Coimmobilisierung das Enzym/ die Enzyme an ein Trägermaterial gebunden v/erden, die sedimentierten und separierten Ultramikrokapseln (Vorirnmobilisate) bzw. die sedimentierten und separierten Ultramikrokapseln (Vorimmobilisate) und die trägergebundonen Enzyme in einer wäßrigen Lösung aus Cellulosesulfat suspendiert werden, die Suspension in eine wäßrige Polydimethyldiallylammoniurnchiorid-Lösung eingecropft wird, und die immobilisierten Mikroorganismen bzw. die erhaltenen komplexen (coimmcbilisierten) Biokatalysatoren in bekannter Weise abcjetrennt werden und in ein für die Züchtung der immobilisierten bzw. coimmobilisierten Biokatalysatoren geeignetes Milieu eingebracht werden.Method for the immobilization of microorganisms or coimmobilization of microorganisms and enzymes by preimmobilization and encapsulation characterized in that the microorganisms encapsulated for preimmobilization in ultramicrocapsules, in the case of coimmobilization the enzyme (s) bound to a support material which sedimented and the separated Ultramikrokapseln (Vorimmobilisate) and the carrier-bound enzymes are suspended in an aqueous solution of cellulose sulfate, the suspension is grafted into an aqueous polydimethyldiallylammonium chloride solution, and the immobilized microorganisms or the obtained complex ( co-immobilized) biocatalysts are separated in a known manner and introduced into a suitable for the cultivation of immobilized or coimmobilized biocatalysts environment.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß das Enzym/die Enzyme adsorptiv oder !-covalent an einem Trägermaterial in einer wäßrigen Lösung bei pH-V.'erten zwischen 3,5 und 8, bei Temperaturen von 277 K bis zur Stabilitätsgrenze der Enzyme und bei einer Reaktionsdauer von 30 nin bis 24 Stunden gebunden werden.2. The method according to claim 1, characterized in that the enzyme / enzymes adsorptively or! -Covalent on a support material in an aqueous solution at pH-V.'erten between 3.5 and 8, at temperatures of 277 K to the stability limit of Enzymes and bound at a reaction time of 30 nin to 24 hours.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 gekennzeichnet dadurch, daß zur kovalcnten Bindung der Enzyme an das Trägermaterial vorzugsweise Glutardialdehyd als Kupplungsreagens verwendet wird.3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that for covalent bonding of the enzymes to the support material preferably glutaric dialdehyde is used as a coupling reagent.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3 gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des Glutardialdehyds 0,1 bis 10 %, vorzugsweise 2,5 % beträgt.4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that the concentration of glutaric dialdehyde is 0.1 to 10%, preferably 2.5%.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4 gekennzeichnet dadurch, daß vorzugsweise ein unlösliches Trägermaterial zur iiindung der Enzyme verwendet wird.5. The method according to claim 1 to 4, characterized in that preferably an insoluble carrier material is used to connect the enzymes.
    G. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5 gekennzeichnet dadurch, daß als unlösliches Trägermateria] vorzugsweise Aminornethylpolystyren vorv/endet wird.G. The method of claim 1 to 5, characterized in that as insoluble Trägermateria] preferably Aminornethylpolystyren vorv / ends.
  6. 7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6 gekennzeichnet dadurch, daß der Partikeldurchmesser der Polystyrenkugeln von 5 bis 200 Ajm gewählt wird.7. The method according to claim 1 to 6, characterized in that the particle diameter of the polystyrene beads of 5 to 200 Ajm is selected.
    S. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß zur Herstellung der Ultrarnikrokapseln vorzugsweise Polyeloktrolytkomplexe, bestehend aus ^olydirne thyldiallylammoniumchlorid und Cellulosesulfat Verwendung finden.S. The method of claim 1, characterized in that for the production of the ultraricrocapsules preferably Polyeloktrolytkomplexe consisting of ^ olydirne thyldiallylammoniumchlorid and cellulose sulfate use.
  7. 9. Verfahren nach Anspruch 1 und 8 gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration des Cellulosesulfats zur Herstellung der Ultramikrokapseln 5 bis 100 g/l beträgt.9. The method according to claim 1 and 8, characterized in that the concentration of the cellulose sulfate for the preparation of the ultramicrocapsules is 5 to 100 g / l.
  8. 10. Verfahren nach Anspruch 1, 0 und 9 gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration der Polydimethyldiallylammoniumchlorid-Lösung zur Herstellung der Ultramikrokapseln 5 bis 100 g/l beträgt.10. The method of claim 1, 0 and 9 characterized in that the concentration of the polydimethyldiallyl ammonium chloride solution for the preparation of the ultramicrocapsules is 5 to 100 g / l.
  9. 11. Verfahren nach Anspruch 1 und S bis 10 gekennzeichnet dadurch, daß die Verweilzeit der in Ultramikrokapseln vorimmobilisierten Mikroorganismen in der Polydimethyldiallylarnmoniumchlorid-Lösung von 30 Sekunden bis GO Minuten gewählt wird.11. The method of claim 1 and S to 10, characterized in that the residence time of pre-immobilized in ultramicrocapsules microorganisms in the polydimethyldiallyl ammonium chloride solution is selected from 30 seconds to GO minutes.
    12: Vorfahren nach Anspruch 1 und 8 bis 11 gekennzeichnet dadurch, daß die Temperatur während des Vorimmobilisierungsprozesses der Mikroorganismen von 273 K bis zur Stabilitätsgrenze der zu immobilisierenden Mikroorganismen reicht.12: ancestors according to claim 1 and 8 to 11, characterized in that the temperature during the Vorimmobilisierungsprozesses the microorganisms of 273 K to the stability limit of the microorganisms to be immobilized ranges.
  10. 13. Verfahren nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, daß eine Konzentration des Cellulosesulfats bei der Einkapselung der Ultramikrokapseln bzw. Ultramikrokapseln und trägergebundenen Enzyme (Vorirninobilisate) von 5 bis 100 g/l eingesetzt wird .13. The method according to claim 1, characterized in that a concentration of the cellulose sulfate in the encapsulation of the ultramicrocapsules or ultramicrocapsules and carrier-bound enzymes (Vorirninobilisate) of 5 to 100 g / l is used.
  11. 14. Verfahren nach Anspruch 1 und 13 gekennzeichnet dadurch, daß zur Einkapselung der Vorimnobilisate eine Konzentration des Polydimethylallylaminoniumchlorids zwischen 5 und 100 g/l verwendet wird.14. The method according to claim 1 and 13, characterized in that for the encapsulation of Vorimnobilisate a concentration of Polydimethylallylaminoniumchlorids between 5 and 100 g / l is used.
  12. 15. Verfahren nach Anspruch 1, 13 und 14 gekennzeichnet dadurch, daß die Temperatur bei der Einkapselung der Vorimmobilisate von 273 K bis zur Stabilitätsgrenze der einzukapselnden Mikroorganismen bzw. Mikroorganismen und trägergebundenen Enzyme reicht.15. The method of claim 1, 13 and 14, characterized in that the temperature in the encapsulation of Vorimmobilisate of 273 K to the stability limit of the encapsulated microorganisms or microorganisms and carrier-bound enzymes ranges.
    IG. Verfahren nach ,Anspruch 1 und 13 bis 15 gekennzeichnet dadurc daß die Verweilzeit der immobilisierten bzv/. coimmobilisierten Eiokatalysatoren in der Polydimetbyldial.lylammoniumchlorid-Iiösung von 30 Sekunden bis 12 Stunden gewählt wird.IG. Process according to claim 1 and 13 to 15, characterized in that the residence time of the immobilized bzv /. co-immobilized eggcatalysts in the polydimetyldial.lylammonium chloride solution are chosen from 30 seconds to 12 hours.
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