DE29724255U1

DE29724255U1 - Microcapsules

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Publication number: DE29724255U1
Application number: DE29724255U
Authority: DE
Original assignee: ALPHA BIOVERFAHRENSTECHNIK GMB
Current assignee: ALPHA BIOVERFAHRENSTECHNIK GMB
Priority date: 1996-12-18
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 2000-10-05
Anticipated expiration: 2007-12-19

Description

MikrokapselnMicrocapsules

Die vorliegende Erfindung betrifft Mikrokapseln mit einer Membranhülle, wie sie z.B. zur Immobilisierung von Biokatalysatoren verwendet werden.
5 The present invention relates to microcapsules with a membrane shell, such as those used for the immobilization of biocatalysts.
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Ein Schwerpunkt biotechnischer Forschung ist die Entwicklung und Applikation von Immobilisierungsmethoden. Unter Immobilisierung versteht man die chemische und/oder physikalische Bindung von wasserlöslichen Biokatalysatoren an einen wasserunlöslichen Träger oder den Einschluß in eine wasserunlösliche Gelmatrix oder Mikrokapsel, unter Erhaltung der enzymatischen Aktivität. Als immobilisierte Biokatalysatoren werden alle Arten von enzymatisch aktivem Material bezeichnet wie Mikroorganismen, isolierte Enzyme, Zellorganellen, pflanzliche und tierische Zellen oder Zellgewebe. Sie werden in analytischen, diagnostischen und industriellen Verfahren eingesetzt.One focus of biotechnological research is the development and application of immobilization methods. Immobilization is the chemical and/or physical binding of water-soluble biocatalysts to a water-insoluble carrier or the inclusion in a water-insoluble gel matrix or microcapsule, while maintaining the enzymatic activity. All types of enzymatically active material are referred to as immobilized biocatalysts, such as microorganisms, isolated enzymes, cell organelles, plant and animal cells or cell tissue. They are used in analytical, diagnostic and industrial processes.

Es gibt keine universellen Träger. Nur wenn die Anwendung eines biologischen Systems definiert ist, können die passenden Träger, die Immobilisierungsmethode und die Reaktorform ausgewählt werden, um eine optimale Einsatzmöglichkeit zu erreichen. Bei der Mikroverkapselung und dem Einschluß in eine Matrix wird der Reaktionsraum durch eine semipermeable Polymermembran begrenzt, die gut substrat- und produktdurchlässig ist, aber völlig undurchlässig für das verkapselte Material. Um dies eindeutig zu gewährleisten, muß die Trenngrenze "cut-off" der Membran bekannt sein. Unter der Trenngrenze versteht man die Ausschlußgrenze für ein Makromolekül bestimmter Größe, bedingt durch den Porendurchmesser der Membran. Die Höhe der Ausschlußgrenze wird ing/mol, der molaren Masse des Moleküls, welches nicht mehr durch die Membran diffundieren kann, angegeben. Die Membran der NaCS/ PDADMAC Mikrokapseln (NaCS = Natriumcellulosesulfat; PDADMAC = Polydialylldimethylammoniumchlorid - s.u.) ist nur für niedermolekulare Stoffe (kleiner als ca. 5.500 g/mol) durchlässig und kann nicht durch die Veränderung der Konzentration eines Reaktionspartners oder der Membranbildungszeit im Reaktionsbad variiert werden, wie es bei den Alginat-Polylysine-Kapseln möglich ist.There are no universal supports. Only when the application of a biological system is defined can the appropriate supports, the immobilization method and the reactor shape be selected to achieve optimal application. In microencapsulation and inclusion in a matrix, the reaction space is limited by a semi-permeable polymer membrane that is easily permeable to substrate and product, but completely impermeable to the encapsulated material. To ensure this, the cut-off limit of the membrane must be known. The cut-off limit is the exclusion limit for a macromolecule of a certain size, determined by the pore diameter of the membrane. The level of the exclusion limit is given in ing/mol, the molar mass of the molecule that can no longer diffuse through the membrane. The membrane of the NaCS/PDADMAC microcapsules (NaCS = sodium cellulose sulfate; PDADMAC = polydialylldimethylammonium chloride - see below) is only permeable to low molecular weight substances (less than approx. 5,500 g/mol) and cannot be varied by changing the concentration of a reaction partner or the membrane formation time in the reaction bath, as is possible with the alginate-polylysine capsules.

Bei der Immobilisierung in Mikrokapseln werden die Biokatalysatoren durch eine Membran eingeschlossen. Besondere Kennzeichen dieser Mikroverkapselung sind eine bestimmte und gleichmäßige Form der Kapsel, höhere mechanische und chemische Beständigkeit als Vollkugeln und ein sehr geringer Verlust an Biokatalysatoren. Die geforderten Eigenschaften der gewählten Ausgangsstoffe sind:
• Bildung einer hydrophilen permeablen Membran,When immobilized in microcapsules, the biocatalysts are enclosed in a membrane. Special features of this microencapsulation are a specific and uniform shape of the capsule, higher mechanical and chemical resistance than solid spheres and a very low loss of biocatalysts. The required properties of the selected starting materials are:
• Formation of a hydrophilic permeable membrane,

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• Biokompatibiltät bezüglich des verwendeten biologischen Materials,• Biocompatibility with regard to the biological material used,

• gute physikalische und chemische Beständigkeit und• good physical and chemical resistance and

• leichte Kapselbildung.• slight capsule formation.

Die Mikrokapseln (oder Mikrohohlkugeln) werden mit einer Vertropfungsapparatur hergestellt, die aus einer koaxialen Doppelkapillardüse besteht. Durch die Mantelkapillare wird der Polyelektrolyt und durch die Kernkapillare ein biologisches Material, z.B. Biokatalysatoren in Suspension, in ein Reaktionsbad mit geeigneten Vernetzerionen vertropft. An der Seite kann Luft oder eine Flüssigkeit eingeblasen werden, wenn eine Änderung der Kapselgröße erwünscht ist. So kann der Durchmesser der Kapseln zwischen 0,5 mm und 8 mm variiert werden. Für das NaCS/PDADAMAC Verkapselungssystem (vgl. DD-219 795A1, DD-274 051) wird eine NaCS-Lösung durch die Mantelkapillare in ein Reaktionsbad mit einer PDADMAC-Lösung vertropft. Die Tropfenbildung erfolgt anhand der schematischen Darstellung in Abbildung 1.The microcapsules (or hollow microspheres) are produced using a dropper device consisting of a coaxial double capillary nozzle. The polyelectrolyte is dropped through the jacket capillary and a biological material, e.g. biocatalysts in suspension, is dropped through the core capillary into a reaction bath with suitable crosslinking ions. Air or a liquid can be blown in from the side if a change in the capsule size is desired. The diameter of the capsules can be varied between 0.5 mm and 8 mm. For the NaCS/PDADAMAC encapsulation system (cf. DD-219 795A1, DD-274 051), a NaCS solution is dropped through the jacket capillary into a reaction bath with a PDADMAC solution. The drop formation takes place according to the schematic representation in Figure 1.

Der Tropfen hängt mit der Kapillarkraft Fk an der Kapillare, bis er unter seiner eigenen Schwere abreißt Die Gewichtskraft Fg ist kurz vor dem Abreißen gleich der Kapillarkraft Fk- Die Kapillarkraft hängt von der Oberflächenspannung der NaCS-Lösung und dem Durchmesser der Mantelkapillare ab. Zur Verringerung der Tropfendurchmesser kann der Kapillardurchmesser verringert werden, eine oberflächenaktive Substanz in die NaCS-Lösung gemischt werden oder dem System ein Luftstrom L in axialer Richtung aufgeprägt werden. Im letzten Fall hegt dann ein Gleichgewicht zwischen Kapillarkraft und der Summe von Windwiderstandskraft und Gewichtskraft vor. Die Tropfengröße hängt außerdem vom Durchsatz der Biokatalysatorlösung, von der Viskosität der tropfenbildenden Lösung sowie von der Viskosität, Dichte und Oberflächenspannung des Reaktionsbades und der Fallstrecke ab. Die kugelförmige Gestalt der Flüssigkeitstropfen wird durch die Tendenz der Flüssigkeit, ihre Oberfläche so klein wie möglich zu halten, bedingt.The drop hangs on the capillary with the capillary force Fk until it breaks off under its own weight. The weight force Fg is equal to the capillary force Fk- shortly before it breaks off. The capillary force depends on the surface tension of the NaCS solution and the diameter of the sheath capillary. To reduce the drop diameter, the capillary diameter can be reduced, a surface-active substance can be mixed into the NaCS solution or an air flow L can be imposed on the system in the axial direction. In the latter case, there is then a balance between capillary force and the sum of wind resistance and weight. The drop size also depends on the throughput of the biocatalyst solution, the viscosity of the drop-forming solution, the viscosity, density and surface tension of the reaction bath and the falling distance. The spherical shape of the liquid drops is determined by the tendency of the liquid to keep its surface as small as possible.

Die Membranaufbaureaktion findet im bewegten Reaktionsbad statt Dies beruht auf der Bildung von Polyelektrolytkomplexen, die durch die Reaktion von entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten entstehen. Das Polyanion ist in diesem System NaCS, ein Derivat der Cellulose, das bei der Umsetzung mit Schwefelsäure entsteht. Die NaCS-Lösung ist die tropfenbildende Lösung. Das Polykation ist PDADMAC. Die PDADMAC-Lösung ist das Reaktionsbad und beinhaltet die Vernetzerionen für die Tropfen.The membrane building reaction takes place in the moving reaction bath. This is based on the formation of polyelectrolyte complexes that are created by the reaction of oppositely charged polyelectrolytes. The polyanion in this system is NaCS, a derivative of cellulose that is created when reacted with sulfuric acid. The NaCS solution is the droplet-forming solution. The polycation is PDADMAC. The PDADMAC solution is the reaction bath and contains the crosslinking ions for the droplets.

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Bei der Polyelektrolytkomplexreaktion bilden sich Hohlkugeln, da die Vernetzung der Polymere von außen nach innen erfolgt. Mit fortschreitender Reaktion verzögert sich das Wachstum der Membranstärke infolge Verarmung des Kapselinneren an reaktiver Komponente und wachsendem Diffusionswiderstand. Es bilden sich asymmetrische Membranen, deren trennaktive Schicht außen liegt Durch Zusatz von geringen Mengen an NaCS in das Reaktionsbad erreicht man infolge der Abschirmung ionischer Gruppen eine lockere Fällungsstruktur, höhere Wandstärken und eine erhöhte Kapselstabilität. Als Maß für die mechanische Stabilität der Kapsem wird die Kraft angegeben, die nötig ist, um die Kapseln zu zerstören. Mit diesem Verfahren können Mikrokapseln mit einer Wandstärke von 20 bis 100 &mgr;&eegr;&igr; und einer maximalen Stabilität von 3 bis 5 N gebildet werden.During the polyelectrolyte complex reaction, hollow spheres are formed because the polymers are cross-linked from the outside to the inside. As the reaction progresses, the growth of the membrane thickness is delayed due to the depletion of the reactive component in the interior of the capsule and the increasing diffusion resistance. Asymmetric membranes are formed with the active separating layer on the outside. By adding small amounts of NaCS to the reaction bath, a loose precipitation structure, greater wall thickness and increased capsule stability can be achieved as a result of the shielding of ionic groups. The force required to destroy the capsules is given as a measure of the mechanical stability of the capsules. Using this process, microcapsules with a wall thickness of 20 to 100 μηγ and a maximum stability of 3 to 5 N can be formed.

In Abbildung 2 sind die Polymerstrukturen des NaCS und des PDADMAC dargestellt Das NaCS besitzt als negativen Elektrolyten eine Sulfat-Seitengruppe, das PDADMAC eine Stickstoff-Seitengruppe als positiven Elektrolyten. Diese reagieren im Reaktionsbad durch Bildung von lonenbrückenbindungen unter Abspaltung von NaCS. Durch die Reaktion der beiden Polymerelektrolyten bildet sich eine stark vernetzte NaCS/PDADMAC-Membran, die nicht wasserlöslich und nicht löslich in organischen Lösungsmitteln ist Der Einfluß des pH-Wertes auf die Membran ist gering. Weiterhin können anorganische Salze die Membran nicht zerstören. Sie ist nicht licht- oder wärmeempfindlich und weist eine hohe mechanische Stabilität auf. Immobilisiert werden können Proteine (Enzyme und Hormone), Zellorganellen (Mikrosomen), Antikörper (anti-TPO), Mikroorganismen (z.B. Pilze und Bakterien), Säugerzellen (Hybridoma) und Zellgewebe (z.B. Langerhanssche Inseln).Figure 2 shows the polymer structures of NaCS and PDADMAC. NaCS has a sulfate side group as a negative electrolyte, while PDADMAC has a nitrogen side group as a positive electrolyte. These react in the reaction bath by forming ionic bonds and releasing NaCS. The reaction of the two polymer electrolytes forms a strongly cross-linked NaCS/PDADMAC membrane that is not soluble in water and not soluble in organic solvents. The influence of the pH value on the membrane is minimal. Furthermore, inorganic salts cannot destroy the membrane. It is not sensitive to light or heat and has a high mechanical stability. Proteins (enzymes and hormones), cell organelles (microsomes), antibodies (anti-TPO), microorganisms (e.g. fungi and bacteria), mammalian cells (hybridoma) and cell tissue (e.g. islets of Langerhans) can be immobilized.

Die Attraktivität in der Mikroverkapselung von Biokatalysatoren liegt in der einfachen Trennung des verkapselten biologischen Materials vom Produkt bzw. umgebenden Medium und ihrer Wiederverwendbarkeit, was besonders bei teuren Enzymen und aufwendiger oder produktschädigender Aufarbeitung einen großen Vorteil bietet. Die Polyelektrolytkomplexe sind zudem mechanisch stabiler als der Einschluß in eine Gelmatrix und bieten zusätzlich die Sicherheit, daß keine Enzyme oder Zellen in den extrazellulären Raum gelangen können. Sie bilden durch die Membran eine der natürlichen Zelle nachempfundene Umgebung. Dadurch ist ein Schutz vor Temperatur und pH-Wert Änderungen gegeben. Ein weiterer Vorteil ist die Wiederverwendbarkeit der Katalysatoren und die Möglichkeit einer kontinuierlichen Prozeßführung. Die NaCS/PDADMAC Mikrokapseln sind biokompatibel.The attractiveness of microencapsulation of biocatalysts lies in the simple separation of the encapsulated biological material from the product or surrounding medium and their reusability, which is a great advantage, especially in the case of expensive enzymes and complex or product-damaging processing. The polyelectrolyte complexes are also mechanically more stable than inclusion in a gel matrix and also offer the security that no enzymes or cells can enter the extracellular space. They form an environment through the membrane that is modeled on the natural cell. This provides protection against temperature and pH changes. Another advantage is the reusability of the catalysts and the possibility of continuous process control. The NaCS/PDADMAC microcapsules are biocompatible.

Werden Enzyme in Mikrokapseln immobilisiert, wird die Kinetik der enzymatischen Reaktion durch Diffusionsvorgänge überlagert. Limitierend wirken die Diffusion desIf enzymes are immobilized in microcapsules, the kinetics of the enzymatic reaction are overlaid by diffusion processes. The diffusion of the

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Substrats durch die stationäre Grenzschicht zwischen Lösung und Kapsel, die Diffusion von der Oberfläche in die Porenstruktur der Kapsel sowie die Rückdiffusion des Produktes aus der Porenstruktur und die Diffusion durch die Grenzschicht. Die Diffusionslimitierung wird bei Enzym-Membranreaktoren, einer weiteren Möglichkeit der Membrantrennung, weitgehend vermieden. Hier tritt aber eine Desaktivierung der Enzyme durch Scherkräfte auf, die beim Umpumpen der Enzymsuspension bei kontinuierlichen Prozessen hervorgerufen werden. Dieser Reaktor wird erfolgreich in der Technik zur kontinuierlichen L-Aminosäure-Produktion durch katalytische Racemattrennung von N-Acetyl-D,L-methionin eingesetzt Einen Vorteil bietet die Diffusionslimitierung nur für die Verkapselung von Multienzym-Systemen, da dann die Reaktion mit mehreren Enzymen möglich wird. Ein weiterer Nachteil ist die Enzym-Desaktivierung bei der Immobilisierung. Dies kann durch die Immobilisierung von Enzymen in ganzen Zellen eingeschränkt werden, was jedoch den Diffusionswiderstand für Substrat und Produkt durch die zusätzliche ZellwandSubstrate through the stationary boundary layer between solution and capsule, diffusion from the surface into the pore structure of the capsule, as well as back diffusion of the product from the pore structure and diffusion through the boundary layer. Diffusion limitation is largely avoided in enzyme membrane reactors, another possibility for membrane separation. However, deactivation of the enzymes occurs here due to shear forces that are caused when pumping the enzyme suspension in continuous processes. This reactor is successfully used in the technology for continuous L-amino acid production by catalytic racemate separation of N-acetyl-D,L-methionine. Diffusion limitation only offers an advantage for the encapsulation of multi-enzyme systems, as this enables the reaction with several enzymes. Another disadvantage is enzyme deactivation during immobilization. This can be limited by immobilizing enzymes in whole cells, but this increases the diffusion resistance for substrate and product through the additional cell wall.

15 erhöht15 increased

Die Mikrokapseln werden daher eher für Verfahren in der Zellkulturtechnik, der medizinischen Therapie oder der Sicherheitsfermentation angewendet. In der Sicherheitsfermentation ist die Mikroverkapselung ein Verfahren, das die Arbeit mit gentechnisch veränderten Mikroorganismen unter Berücksichtigung des Gentechnik-Gesetzes und der Gentechnik-Sicherheitsverordnung erleichtert. In der Medizin werden Mikrohohlkugeln zur Herstellung künstlicher Organe verwendet, die entweder als Implantat oder extrakorporal eingesetzt werden. Dabei werden sowohl körpereigene als auch fremde Zellen genutzt, um stoffwechselphysiologische oder genetisch bedingte Defekte auszugleichen, da durch die Polymermembran eine Immunbarriere geschaffen wird. In der Zellkulturtechnik wird die Schutzfunktion der Membran vor auftretenden Scherkräften (Rührer, Gasblasen) genutzt, um hohe Zelldichten und damit hohe Produktivität zu erzielen. Zusätzlich wird durch die Membran eine effektive Zellzurückhaltung zur Etablierung kontinuierlicher Prozesse bei gleichbleibend hohen Zelldichten erreicht. Versuche auf diesem Gebiet waren mit verschiedenen Systemen erfolgreich. Für die Produktion stabiler Proteine ist es oft wünschenswert, diese in der Kapsel zurückzuhalten, um ein geringeres Volumen aufarbeiten zu müssen. Für eine Applikation in vivo ist es jedoch erforderlich, daß das Produkt die Kapsel verlassen kann.The microcapsules are therefore more likely to be used for processes in cell culture technology, medical therapy or safety fermentation. In safety fermentation, microencapsulation is a process that makes working with genetically modified microorganisms easier, taking into account the Genetic Engineering Act and the Genetic Engineering Safety Ordinance. In medicine, hollow microspheres are used to produce artificial organs that are used either as implants or extracorporeally. Both the body's own and foreign cells are used to compensate for metabolic or genetic defects, as the polymer membrane creates an immune barrier. In cell culture technology, the protective function of the membrane against shear forces (stirrers, gas bubbles) is used to achieve high cell densities and thus high productivity. In addition, the membrane achieves effective cell retention to establish continuous processes at consistently high cell densities. Experiments in this area have been successful with various systems. For the production of stable proteins, it is often desirable to retain them in the capsule in order to process a smaller volume. For in vivo application, however, it is necessary that the product can leave the capsule.

Es können weitere Laborbeispiele für das NaCS/PDADMAC-Systern gefunden werden wie die Immobilisierung von Yarrowia lipolytica Zellen zur Zitronensäureproduktion, wobei die Zellen über lange Zeit aktiv waren; die Verkapselung von Invertase, die durch den Diffusionsprozeß limitiert war; dieOther laboratory examples of the NaCS/PDADMAC system can be found such as the immobilization of Yarrowia lipolytica cells for citric acid production, where the cells were active for a long time; the encapsulation of invertase, which was limited by the diffusion process; the

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Coinunobilisierting von Yarrowia 1. Zellen und Invertase; die Verkapselung von Urease, die eine höhere Stabilität, aber geringere Aktivität als native Urease durch die Reaktion mit dem restlichen Cellulosesulfat zeigte und die Immobilisierung von Penicillium raistrickii i 477, wobei eine höhere Biotrockenmasse als bei freien Zellen festgestellt werden konnte.Coinunobilization of Yarrowia 1. cells and invertase; the encapsulation of urease, which showed a higher stability but lower activity than native urease by reaction with the residual cellulose sulfate and the immobilization of Penicillium raistrickii i 477, where a higher dry biomass was observed than with free cells.

Diese Beispiele geben einen kleinen Einblick in die heutige Anwendung mit immobilisierten Biokatalysatoren. Es geht weit über die Anwendung in konventionellen Fermentersystemen wie Bierherstellung, Gewinnung von Essigsäure aus Alkohol und in der Abwasserreinigung hinaus. Je nach Anwendungsfall sind die Anforderungen verschieden. Allgemein sollte die Festigkeit der Kapseln einen Einsatz in konventionellen Fermentersystemen ermöglichen, Materialien und Methoden sind auf ihre schädigende Wirkung auf Organismen zu überprüfen, die Ausschlußgrenze sollte bekannt und wenn möglich einstellbar sein und Nährstoffe und Wachstumsfaktoren müssen die Membran ungehindert passieren könnenThese examples provide a small insight into the current application of immobilized biocatalysts. It goes far beyond the application in conventional fermentation systems such as beer production, extraction of acetic acid from alcohol and in wastewater treatment. The requirements vary depending on the application. In general, the strength of the capsules should enable use in conventional fermentation systems, materials and methods should be checked for their harmful effects on organisms, the exclusion limit should be known and adjustable if possible, and nutrients and growth factors must be able to pass through the membrane unhindered.

Am Beispiel des NaCS/PDAMAC- Systems wird deutlich, daß für die Anwendung der Mikrokapsel die Ausschlußgrenze der Kapselhülle von entscheidender Bedeutung ist. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, die Größe der Ausschlußgrenze in einem bestimmten Bereich variabel und voreinstellbar zu machen. Dadurch sollen Mikrokapseln zu Verfügung gestellt werden, welche den Durchgang von Substraten oder Produkten durch die Hülle bis zum einer vorwählbaren Molekülgröße erlauben. Insbesondere soll die auf ca. 5000g/mol begrenzte Ausschlußgrenze von NaCS/PDAMAC Mikrokapseln erweitert worden.The example of the NaCS/PDAMAC system makes it clear that the exclusion limit of the capsule shell is of crucial importance for the application of the microcapsule. The aim of the present invention was therefore to make the size of the exclusion limit variable and pre-settable within a certain range. This should make microcapsules available which allow the passage of substrates or products through the shell up to a pre-selectable molecular size. In particular, the exclusion limit of NaCS/PDAMAC microcapsules, which is limited to approx. 5000 g/mol, should be extended.

Diese Aufgabe wird durch eine erfindungsgemäße Mikrokapsel mit einer Membranhülle gelöst bei denen die Membran dadurch herstellbar ist, daß inerte Substanzen und/oder Partikel in die sich bildende Membran eingelagert und anschließend aus der gebildeten Membran entfernt werden.This object is achieved by a microcapsule according to the invention with a membrane shell in which the membrane can be produced by incorporating inert substances and/or particles into the forming membrane and subsequently removing them from the formed membrane.

Durch die Einlagerung von inerten Substanzen oder Partikeln, welche an der Membranbildungsreaktion nicht teilnehmen, und welche nach Abschluß der Membranbildung aus dieser entfernbar sind, ist es überraschenderweise gelungen, die wichtige Membraneigenschaft der Ausschlußgrenze beeinflussen zu können. Durch eine entsprechende Wahl der inerten Substanzen/Partikel und ihre Konzentration ist es dabei steuerbar geworden, welche Porengröße in der resultierenden Membran erzielt wird.By incorporating inert substances or particles that do not participate in the membrane formation reaction and that can be removed after the membrane formation has been completed, it has surprisingly been possible to influence the important membrane property of the exclusion limit. By selecting the appropriate inert substances/particles and their concentration, it has become possible to control the pore size achieved in the resulting membrane.

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Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Mikrokapseln mit Membranen aus Polyelktrolytkomplexen gebildet. Bei diesen Komplexen kann es sich z.B. um solche handeln, die aus Natriumcellulosesulfat (NaCS) undPreferably, the microcapsules according to the invention are formed with membranes made of polyelectrolyte complexes. These complexes can be, for example, those made of sodium cellulose sulfate (NaCS) and

Polydialylldimethylammoniumchlorid (PDAMAC) gebildet sind. 5Polydialylldimethylammonium chloride (PDAMAC) is formed. 5

Bei den inerten Substanzen handelt es sich vorzugsweise Polyalkohole, ganz besonders bevorzugt um Polyethylenglykol (PEG). Polyethylenglykole (PEG) sind wasserlösliche Polymere von über Ätherbindungen polymerisiertem Ethylenglykol mit linearer Sekundärstruktur. Die Formel ist: HO(C₂H₄O)_nH.The inert substances are preferably polyalcohols, particularly preferably polyethylene glycol (PEG). Polyethylene glycols (PEG) are water-soluble polymers of ethylene glycol polymerized via ether bonds with a linear secondary structure. The formula is: HO(C ₂ H ₄ O) _n H.

PEG wird in der Technik zur Fällung von Proteinen benutzt Die Gemische können anschließend mit der Ultrafiltration getrennt werden. Ein weiterer Anwendungsbereich ist die Verwendung von PEG mit einer molaren Masse von 10.000 und 20.000 g/mol als Bindungspartner für Coenzyme in Membranreaktoren zur Herstellung von Aminosäuren. Die Beispiele belegen die physiologische Unbedenklichkeit des PEG, da es weder auf Proteine noch auf Coenzyme toxisch wirkt.PEG is used in technology to precipitate proteins. The mixtures can then be separated using ultrafiltration. Another area of application is the use of PEG with a molar mass of 10,000 and 20,000 g/mol as a binding partner for coenzymes in membrane reactors for the production of amino acids. The examples demonstrate the physiological harmlessness of PEG, as it has no toxic effect on proteins or coenzymes.

Bei den inerten Partikeln kann es sich um biologische Zellen, Liposomen oder Ca-Alginat handeln. Diese Aufzählung ist jedoch nicht vollständig. Geeignet sind alle Partikel, die bezüglich der Membranbildungsreaktion inert sind (d.h. hieran nicht teilnehmen), und welche sich anschließend aus der Membran entfernen lassen. Diese Entfernung kann z.B. durch ein Auswaschen der Partikel oder Substanzen stattfinden.The inert particles can be biological cells, liposomes or Ca-alginate. However, this list is not exhaustive. All particles that are inert with regard to the membrane formation reaction (i.e. do not participate in it) and that can subsequently be removed from the membrane are suitable. This removal can take place, for example, by washing out the particles or substances.

Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen Mikrokapseln eine Membran Ausschlußgrenze, welche über 5000 g/mol liegt, ganz besonders bevorzugt über 100.000 g/mol bzw. 300.000 g/mol. Derartig hohe Ausschlußgrenzen waren z. B. bei den bekannten NaCS/PDADMAC-Systemen nicht erreichbar und bekannt.The microcapsules according to the invention preferably have a membrane exclusion limit which is above 5000 g/mol, very particularly preferably above 100,000 g/mol or 300,000 g/mol. Such high exclusion limits were not achievable and known, for example, with the known NaCS/PDADMAC systems.

Die erfindungsgemäßen Mikrokapseln haben einen Durchmesser von 0,1-10 mm, vorzugsweise 0,8-8 mm. Die Dicke ihrer Membranhülle liegt bei 10-200 &mgr;&idiagr;&eegr;, vorzugsweise 20-100 &mgr;&idiagr;&eegr;.The microcapsules according to the invention have a diameter of 0.1-10 mm, preferably 0.8-8 mm. The thickness of their membrane shell is 10-200 μηη, preferably 20-100 μηη.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Mikrokapseln erfolgt in folgenden Schritten: a) aus einer Zentralkapillare tritt das Füllmedium für die Mikrokapseln aus,The microcapsules according to the invention are produced in the following steps: a) the filling medium for the microcapsules emerges from a central capillary,

b) aus einer Mantelkapillare, welche die Zentralkapillare konzentrisch umschließt, tritt eine erste membranbildende Komponente aus und umhüllt den Austrittstropfen des Füllmediums,b) a first membrane-forming component emerges from a sheath capillary which concentrically surrounds the central capillary and envelops the exit drop of the filling medium,

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c) der sich von den Kapillaren ablösende Tropfen aus erster membranbildender Komponente und Füllmedium fällt in eine zweite membranbildende Komponente, in welcher dann die Reaktion zur Bildung der Membranhülle stattfindet,
wobeic) the droplet of the first membrane-forming component and the filling medium detaching from the capillaries falls into a second membrane-forming component, in which the reaction to form the membrane shell then takes place,
where

die erste und/ oder die zweite membranbildende Komponente inerte Substanzen oder Partikel enthält, welche nach Ausbildung der Membran aus dieser entfernt, vorzugsweise ausgewaschen, werden.the first and/or the second membrane-forming component contains inert substances or particles which are removed, preferably washed out, from the membrane after it has been formed.

Durch den Zusatz der inerten Substanzen/Partikel in die membranbildenden Komponenten werden diese bei der Ausformung der Membran dort eingelagert. Durch den anschließenden Schritt der Entfernung (zum Beispiel durch Auswaschen) werden die inerten Substanzen sodann aus der Membran entfernt und hinterlassen dort entsprechende Lücken.By adding inert substances/particles to the membrane-forming components, they are incorporated into the membrane when it is formed. The subsequent removal step (e.g. by washing out) then removes the inert substances from the membrane, leaving gaps there.

Bei dem beschriebenen Verfahren ist die erste membranbildende Komponente vorzugsweise NaCS und die zweite membranbildende Komponente PDADMAC.In the described process, the first membrane-forming component is preferably NaCS and the second membrane-forming component is PDADMAC.

Als inerte Substanz findet bei dem Verfahren vorzugsweise PEG Verwendung. Das PEG hat dabei vorzugsweise ein Molekulargewicht von 400-10.000 g/mol und wird mit einer Konzentration von weniger als 5 Gewichts Prozent, ganz besonders bevorzugt weniger als 2 Gewichts Prozent in der membranbildende Komponente eingesetztPEG is preferably used as the inert substance in the process. The PEG preferably has a molecular weight of 400-10,000 g/mol and is used in the membrane-forming component at a concentration of less than 5 percent by weight, particularly preferably less than 2 percent by weight.

Das Verfahren wird ferner vorzugsweise so durch geführt, daß die Mantelkapillare konzentrisch von einer zweiten Mantelkapillare umgeben ist, aus welcher ein Medium strömt, welches die Tropfenformung unterstützt Dieses Medium ist vorzugsweise Luft oder eine FlüssigkeitThe method is further preferably carried out in such a way that the jacket capillary is concentrically surrounded by a second jacket capillary from which a medium flows which supports the drop formation. This medium is preferably air or a liquid

Die Tropfenbildung in der Kapillare erfolgt vorzugsweise bei erhöhter Temperatur, insbesondere in ein Bereich von 30-40⁰C. Gerade bei NaCS hat sich einer derartige Erhöhung der Temperatur als vorteilhaft erwiesen.Drop formation in the capillary preferably occurs at elevated temperatures, especially in a range of 30-40 ^° C. Such an increase in temperature has proven to be advantageous, especially for NaCS.

Die erfindungsgemäßen Mikrokapsel können verwendet werden, um biologische Zellen einzuschließen. Hierbei kann es sich insbesondere um lebende Insekten- oder Pflanzenzellen handeln. Derartige Zellen können insbesondere für eine Infektion mit rekombinanten, veränderten oder Wildtyp-Viren, Virionen und DNS verwendet werden.The microcapsules according to the invention can be used to enclose biological cells. These can in particular be living insect or plant cells. Such cells can in particular be used for infection with recombinant, modified or wild-type viruses, virions and DNA.

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Im folgenden werden die erfindungsgemäßen Mikrokapseln und ihre Herstellung anhand eines Ausfuhrungsbeispiels näher erläutertIn the following, the microcapsules according to the invention and their production are explained in more detail using an exemplary embodiment

Für die Herstellung der Mikrokapseln werden zu Beginn des jeweiligen Verkapselungsverfahrens die membranbildende Komponente und das Reaktionsbad hergestellt. Dafür werden je Charge die NaCS-Lösung mit 35 g/l NaCS und die PDADMAC-Lösung mit 65 g/l PDADMAC (38,5% ig) + 9 g/l NaCl (0,9%ig) in Phosphatpuffer (pH 6,8) angesetzt. Es werden vier Chargen für folgende Untersuchungen hergestellt:To produce the microcapsules, the membrane-forming component and the reaction bath are prepared at the beginning of the respective encapsulation process. For this purpose, the NaCS solution with 35 g/l NaCS and the PDADMAC solution with 65 g/l PDADMAC (38.5%) + 9 g/l NaCl (0.9%) in phosphate buffer (pH 6.8) are prepared for each batch. Four batches are produced for the following tests:

1. für die TOC-Wert Bestimmung der Kapselaufbewahrungspuffer von den Kapseln mit unterschiedlichen PEG-Konzentrationen in der Membran,1. for the TOC value determination of the capsule storage buffers from the capsules with different PEG concentrations in the membrane,

2. für die Immobilisierung von Cytochrom C und dem E.coli-Zellaufschluß in Kapseln mit unterschiedlichen PEG-Anteilen in der Membran,2. for the immobilization of cytochrome C and E.coli cell disruption in capsules with different PEG contents in the membrane,

3. für die Immobilisierung des Proteingemisches (Combithek, Boehringer, Mannheim) in Kapseln mit unterschiedlichen Konzentrationen und verschiedenen molaren Massen an PEG in der Membran, die TOC-Wert Bestimmung der Kapselaufbewahrungspuffer von Kapseln mit PEG unterschiedlicher molarer Masse in der Membran und deren Stabilitätsmessung, und3. for the immobilization of the protein mixture (Combithek, Boehringer, Mannheim) in capsules with different concentrations and different molar masses of PEG in the membrane, the TOC value determination of the capsule storage buffer of capsules with PEG of different molar mass in the membrane and their stability measurement, and

4. für die Stabilitätsmessung der Kapseln mit unterschiedlichen PEG-Konzentrationen in der Membran.4. for measuring the stability of capsules with different PEG concentrations in the membrane.

Um die Verkapselung steril durchzuführen, werden die Lösungen, die Vorlagegefäße, die Verkapselungsapparatur mit Schläuchen, die Behälter für das Reaktionsbad mit Rührer und die Probenbehälter zum Aufbewahren ohne Vergleichsgefäß autoklaviert (120⁰C, 30 min).To perform the encapsulation under sterile conditions, the solutions, the storage vessels, the encapsulation apparatus with tubes, the containers for the reaction bath with stirrer and the sample containers for storage without a reference vessel are autoclaved (120 ⁰ C, 30 min).

Das Verkapselungsverfahren und die gesamte Apparatur wird im folgenden am Beispiel der Kapselsynthese von Kapseln ohne PEG in der Membran und einer Proteinlösung in der Kapsel erläutert Die Proteinlösung und die NaCS-Lösung werden in SCHOTT-Gläsern vorgelegt und mit der Schlauchpumpe (Schlauchdurchmesser. NaCS-Lösung: 3 mm, Proteinlösung: 0,5 mm) in die Vertropfungsapparatur gepumpt. Die Massenströme der NaCS-Lösung und der Proteinlösung werden durch Auswiegen einer Menge an NaCS-Lösung oder Proteinlösung in einer bestimmten Zeit wie folgt bestimmtThe encapsulation process and the entire apparatus are explained below using the example of capsule synthesis of capsules without PEG in the membrane and a protein solution in the capsule. The protein solution and the NaCS solution are placed in SCHOTT glasses and pumped into the dropletization apparatus using the peristaltic pump (tube diameter. NaCS solution: 3 mm, protein solution: 0.5 mm). The mass flows of the NaCS solution and the protein solution are determined by weighing out an amount of NaCS solution or protein solution in a certain time as follows:

1. Einstellung: 29,74 mg NaCS/s; 1,46 mg Proteinlösung/s
2. Einstellung: 35,68 mg NaCS/ s; 1,75 mg Proteinlösung/s1st setting: 29.74 mg NaCS/s; 1.46 mg protein solution/s
2nd setting: 35.68 mg NaCS/s; 1.75 mg protein solution/s

Die Lösungen werden mit der 1. Pumpeneinstellung zur Vertropfungsapparatur gepumpt &Ggr;&eegr; Abbildung 3 ist der Verkapselungsprozeß schematisch dargestellt.The solutions are pumped to the dropletizing apparatus using the first pump setting. Figure 3 shows the encapsulation process schematically.

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Aus der Vertropfungsapparatur tropfen die Lösungen in das bewegte Reaktionsbad. Das Reaktionsbad mit der PDADMAC-Lösung hat immer das 3fache Volumen der vertropften kapselbildenden NaCS-Lösung. Die Fallstrecke (ca. 0,5 m) und die Rührergeschwindigkeit (laminare Strömung) werden so eingestellt, daß sich die Kapseln gut ausbilden können ohne deformiert zu werden.The solutions drip from the dropletizing apparatus into the agitated reaction bath. The reaction bath with the PDADMAC solution always has three times the volume of the dropletized capsule-forming NaCS solution. The drop distance (approx. 0.5 m) and the stirrer speed (laminar flow) are set so that the capsules can form well without being deformed.

Die Kernkapillare der Vertropfungsapparatur hat einen Innendurchmesser di =0,5 mm, die Mantelkapillare einen Innendurchmesser di = 1,0 nun und der Luftkanal einen Durchmesser Dl = 5 mm. Die Rührzeit im Reaktionsbad beträgt 45 min. Nachdem die Membran ausgebildet ist, werden die Kapsem gründlich und schnell mit Puffer (4fache Menge des Reaktionsbades) und VE-Wasser (2-fache Menge des Reaktionsbades; VE = vollentsalzt) gewaschen und in den Aufbewahrungspuffer gegeben.The core capillary of the dropletization apparatus has an inner diameter di = 0.5 mm, the jacket capillary an inner diameter di = 1.0 mm and the air channel a diameter Dl = 5 mm. The stirring time in the reaction bath is 45 minutes. After the membrane has formed, the capsules are washed thoroughly and quickly with buffer (4 times the amount of the reaction bath) and deionized water (2 times the amount of the reaction bath; deionized water = fully demineralized) and placed in the storage buffer.

Als Polymer kommt Polyethylenglykol PEG (Merck-Schuchardt, Hohenbrunn) in Frage. Dabei ist zu klären,Polyethylene glycol PEG (Merck-Schuchardt, Hohenbrunn) is a possible polymer. It is important to clarify

1. ob PEG aus der Kapselmembran ausgewaschen wird,1. whether PEG is washed out of the capsule membrane,

2. ob die Änderung der PEG-Konzentration bei konstantem Molekulargewicht die Ausschlußgrenze ändert und, wenn dies nicht zutrifft,2. whether changing the PEG concentration at constant molecular weight changes the exclusion limit and, if not,

3. ob die Ausschlußgrenze im direkten Zusammenhang mit der Variation des PEG-Molekulargewichtes steht.3. whether the exclusion limit is directly related to the variation of the PEG molecular weight.

Zu 1: Um das Auswaschen des Polyethylenglykols zu überprüfen, wurde PEG 10.000 dem NaCS und dem PDADMAC jeweils zu 2, 3, 4 und 5 % zugesetzt , mit dem Gemisch Kapseln hergestellt und anschließend in 0,9 %iger NaCl-Lösung aufbewahrt Weiterhin erfolgte die Zumischung nur in je einem der Kapselkomponenten. Ein weiterer Schritt war das Untersuchen des Auswaschvorganges mit PEG unterschiedlichen Molekulargewichtes, aber gleicher Konzentration im NaCS und PDADMAC. Dazu wurde PEG der Größe 400, 1000, 3000, 6000, 10.000 und 20.000 g/mol den Kapselkomponenten zu 2 % zugemischt, Kapsem hergestellt und in physiologischer Kochsalzlösung aufbewahrt.1: To check the leaching of the polyethylene glycol, PEG 10,000 was added to the NaCS and the PDADMAC at 2, 3, 4 and 5%, capsules were made with the mixture and then stored in 0.9% NaCl solution. Furthermore, the addition was only carried out in one of the capsule components. A further step was to examine the leaching process with PEG of different molecular weights but the same concentration in the NaCS and PDADMAC. For this purpose, PEG of sizes 400, 1000, 3000, 6000, 10,000 and 20,000 g/mol was added to the capsule components at 2%, capsules were made and stored in physiological saline solution.

Anhand der Analyse der Aufbewahrungslösung auf ihren Gehalt an organischem Kohlenstoff sollte überprüft werden, ob PEG aus der Membran ausgewaschen wird. In regelmäßigen Abständen wurden deshalb von der Aufbewahrungslösung je 5 ml Probe entnommen und mittels TOC-Messung auf ihren organischen Kohlenstoffgehalt untersucht.By analyzing the storage solution for its organic carbon content, it was possible to check whether PEG was being washed out of the membrane. For this reason, 5 ml samples of the storage solution were taken at regular intervals and analyzed for their organic carbon content using TOC measurement.

Zu 2: PEG 10.000 wurde 2 und 3 %ig den Kapselkomponenten zugemischt und mit den Mischungen zum einen Cytochrom C (Merck, Darmstadt) verkapselt. Zum zweitenFor 2: PEG 10,000 was mixed with 2 and 3 % of the capsule components and encapsulated with the mixtures of cytochrome C (Merck, Darmstadt). For the second

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wurde PEG 10.000 zu 0.5, 1, 2 und 3% zugemischt und damit ein Proteingemisch (Combithek, Boehringer Mannheim) verkapselt. Die Kapseln lagerten im Kühlschrank bei 4°C in Phosphatpuffer und nach drei Tagen wurde der Puffer durch Gelelektrophorese auf Proteine überprüft.
5 PEG 10,000 was added at 0.5, 1, 2 and 3% and a protein mixture (Combithek, Boehringer Mannheim) was encapsulated with it. The capsules were stored in a refrigerator at 4°C in phosphate buffer and after three days the buffer was checked for proteins by gel electrophoresis.
5

Zu 3: NaCS und PDADMAC wurde jeweils 2 % PEG mit dem Molekulargewicht 400, 1000, 3000, 6000, 10.000 und 20.000 zugemischt und damit ein Proteingemisch verkapselt. Lagerung und Probenahme und -analyse entspricht Punkt 2.3: NaCS and PDADMAC were each mixed with 2% PEG with molecular weights of 400, 1000, 3000, 6000, 10,000 and 20,000 to encapsulate a protein mixture. Storage, sampling and analysis correspond to point 2.

Die entsprechenden Mengen an PEG werden in die membranbildenden Komponenten (entweder in beide oder in eine) gemischt, ohne innere Lösung vertropft, gewaschen und in den Aufbewahrungspuffer gegeben.The appropriate amounts of PEG are mixed into the membrane-forming components (either both or one), dripped without internal solution, washed and added to the storage buffer.

Es wird mit einer Zumischung von 5% PEG mit einer molaren Masse von 10.000 g/mol (PEG 10.000) in die beiden Kapselpolymere begonnen. Dafür werden 50 ml NaCS-Lösung und 150 ml PDADMAC-Lösung mit 5% PEG 10.000 gemischt. Die NaCS/PEG-Lösung wird mit einem Massenstrom von 29,74 mg/s vollständig in das PDADMAC/PEG-Reaktionsbad vertropft. Die Tropfen werden 45 min gerührt, mit 900 ml Phosphatpuffer und 450 ml dest. H2O gewaschen.
20 The process begins with the addition of 5% PEG with a molar mass of 10,000 g/mol (PEG 10,000) to the two capsule polymers. To do this, 50 ml of NaCS solution and 150 ml of PDADMAC solution with 5% PEG 10,000 are mixed. The NaCS/PEG solution is completely added dropwise to the PDADMAC/PEG reaction bath at a mass flow rate of 29.74 mg/s. The drops are stirred for 45 minutes and washed with 900 ml of phosphate buffer and 450 ml of distilled H2O.
20

Im nächsten Versuch wird PEG 10.000 mit Konzentrationen von 2%, 3% und 4% in beide Kapselpolymere gemischt. Aus diesen Lösungen werden Kapseln hergestellt, denen PEG entweder in beide oder in eine der beiden Lösungen gemischt wird. Gleichzeitig werden aus diesen Lösungen Kapseln ohne PEG in der Membran hergestellt. Für jede Kapselherstellung werden 50 ml der kapselbildenden Lösung in 150 ml des Reaktionsbades vertropft Die Tropfen werden wie bereits beschrieben gerührt, gewaschen und in den Aufbewahrungspuffer gegeben.In the next experiment, PEG 10,000 is mixed into both capsule polymers at concentrations of 2%, 3% and 4%. Capsules are prepared from these solutions in which PEG is mixed into either or both of the two solutions. At the same time, capsules without PEG in the membrane are prepared from these solutions. For each capsule preparation, 50 ml of the capsule-forming solution is dropped into 150 ml of the reaction bath. The drops are stirred, washed and placed in the storage buffer as described above.

Weiterhin werden die Zugabe verschiedener molarer Massen des PEG auf ihre Wirkung auf die Kapseln untersucht. Der Auswaschprozeß wird für die Zumischung von 2% PEG mit einer molaren Masse von 400, 1.000, 3.000, 6.000, 10.000 und 20.000 g/mol und ohne PEG in beide Kapselpolymere bestimmt. Der Vorgang wird für die Zumischung einer molaren Masse kurz erläutert:Furthermore, the addition of different molar masses of PEG is investigated for its effect on the capsules. The leaching process is determined for the addition of 2% PEG with a molar mass of 400, 1,000, 3,000, 6,000, 10,000 and 20,000 g/mol and without PEG into both capsule polymers. The process is briefly explained for the addition of a molar mass:

Die NaCS/PEG-Lösung wird 5 min in das PDADMAC/PEG-Reaktionsbad (100 ml) vertropft. Bei dem eingestellten Massenstrom des NaCS mit 29,74 mg/s werden ca. 700 Kapseln hergestellt. Nach 45 min Rühren im Reaktionsbad werden die Kapseln mit 200 ml H2O und 400 ml Phosphatpuffer gewaschen und in 100 ml Aufbewahrungspuffer gegeben.The NaCS/PEG solution is added dropwise to the PDADMAC/PEG reaction bath (100 ml) for 5 minutes. With the NaCS mass flow set at 29.74 mg/s, approximately 700 capsules are produced. After stirring in the reaction bath for 45 minutes, the capsules are washed with 200 ml H2O and 400 ml phosphate buffer and placed in 100 ml storage buffer.

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Die Untersuchungen haben gezeigt, daß die Kapselstruktur durch die Zugabe kleiner Mengen an PEG in die Kapselpolymere in ihrer Struktur verändert werden können, ohne an Stabilität zu verlieren.
5The studies have shown that the capsule structure can be changed by adding small amounts of PEG to the capsule polymers without losing stability.
5

Auch die Größe der PEG-Moleküle hat einen Einfluß auf die Kapselstruktur. PEG mit sehr kleiner molarer Masse (400 g/mol) diffundiert aus der Membran heraus. Seine Größe reicht nicht aus, um die Membranstruktur so aufzulockern, daß eine höhere Ausschlußgrenze erreicht werden kann. Sehr große PEG-Moleküle (20.000 g/mol) sind dagegen schwerer aus der Membran zu lösen.The size of the PEG molecules also has an influence on the capsule structure. PEG with a very small molar mass (400 g/mol) diffuses out of the membrane. Its size is not sufficient to loosen the membrane structure enough to achieve a higher exclusion limit. Very large PEG molecules (20,000 g/mol), on the other hand, are more difficult to release from the membrane.

Aufgrund der durchgeführten Untersuchungen wird die PEG-Zugabe vorzugsweise auf 1% bis 3% PEG 10.000 und 2% PEG 6.000 in beide Kapselpolymere eingegrenzt Diese Kapseln sind für Moleküle mit einer relativen Molekülmasse von mindestens 240.000 durchlässig. Die Ausschlußgrenze läßt sich durch die Zugabe von den verwendeten PEG-Konzentrationen oder molaren Massen des PEG in die Kapselpolymere variieren.Based on the studies carried out, the PEG addition is preferably limited to 1% to 3% PEG 10,000 and 2% PEG 6,000 in both capsule polymers. These capsules are permeable to molecules with a relative molecular mass of at least 240,000. The exclusion limit can be varied by adding the PEG concentrations used or the molar masses of the PEG in the capsule polymers.

Ein fakultativ anaerobes Bakterium wie beispielsweise Escherichia coli zeigt Anzeichen einer Sauerstofflimitierung bei Einsatz von Kapseln mit einem Durchmesser von mehr als 400 &mgr;&idiagr;&eegr; bei Kultivierung. Bei Applikation in der Zellkulturtechnik (Spodoptera frugiperda, Sf 9) wurden Sauerstofflimitierungen erst ab einem Durchmesser von 800 &mgr;&pgr;\ gemessen. Daher sind für den Einsatz aerober Bakterien oder Hefen Kapsem mit Durchmessern um 400 &mgr;&pgr;&igr; und bei Einsatz in der Zellkulturtechnik mit 800 &mgr;&pgr;\ erwünscht. Durch eine geringe Modifikation des Verfahrens konnte der Durchmesser der Kapseln wesentlich verkleinert werden. Statt eines gasförmigen Fluides (vorzugsweise sterile Luft) wurde ein flüssiges Trägerfluid eingesetzt Die Kapseldurchmesser konnten bis auf einen Durchmesser von 0,5 mm reduziert werden.A facultative anaerobic bacterium such as Escherichia coli shows signs of oxygen limitation when using capsules with a diameter of more than 400 μηι during cultivation. When used in cell culture technology (Spodoptera frugiperda, Sf 9), oxygen limitations were only measured from a diameter of 800 μια. Therefore, capsules with diameters of around 400 μια are desired for the use of aerobic bacteria or yeasts and 800 μια for use in cell culture technology. By slightly modifying the process, the diameter of the capsules could be reduced considerably. Instead of a gaseous fluid (preferably sterile air), a liquid carrier fluid was used. The capsule diameters could be reduced to a diameter of 0.5 mm.

Bei einer Variante des erfindungsgemäßen Verkapselungs- und Kultivierungskonzeptes mit der Möglichkeit, in demselben Rührreaktor verkapseln und kultivieren zu können, werden Kontaminationsquellen und aufwendige Arbeitsschritte eingespart.In a variant of the encapsulation and cultivation concept according to the invention with the possibility of encapsulating and culturing in the same stirred reactor, sources of contamination and complex work steps are eliminated.

Ausgehend vom Reaktor, der das Abtrennen von flüssigem Trägerfluid und PDADMAC einerseits und der vollständigen Rückhaltung der Kapseln im Kessel garantiert, erfolgen die drei Arbeitsschritte Verkapselung, Spülvorgang und Medienzufuhr sowie Kultivierung im selben Gefäß. Im Gegensatz zum bisherigenStarting from the reactor, which guarantees the separation of liquid carrier fluid and PDADMAC on the one hand and the complete retention of the capsules in the vessel, the three work steps of encapsulation, rinsing and media supply as well as cultivation take place in the same vessel. In contrast to the previous

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Verfahren kann im PDADMAC beim Kapselherstellungsprozeß der Sauerstoffpartialdruck pO2 gemessen, mitverfolgt und ggf. geregelt werden.In the PDADMAC, the oxygen partial pressure pO2 can be measured, monitored and, if necessary, regulated during the capsule production process.

Als flüssiges Trägerfluid kann perfluorierte Inertflüssigkeit verwendet werden. In der Inertflüssigkeit löst sich Sauerstoff um ein Vielfaches mehr als in wäßrigen Lösungen. Wird die Flüssigkeit vor dem Verkapselungsprozeß mit Sauerstoff gesättigt, so gibt sie diesen bei der Kapselherstellung langsam an das PDADMAC ab und dient somit zusätzlich als Sauerstoffspeicher.Perfluorinated inert liquid can be used as a liquid carrier fluid. Oxygen dissolves many times more in the inert liquid than in aqueous solutions. If the liquid is saturated with oxygen before the encapsulation process, it slowly releases this oxygen to the PDADMAC during capsule production and thus also serves as an oxygen reservoir.

Die Immobilisierung in NaCS/PDADMAC Kapseln vereint einige wichtige Vorteile: Sie haben eine hohe mechanische Stabilität und können als Minimembranreaktoren bezeichnet werden, die unter sterilen Bedingungen arbeiten. Sie grenzen das immobilisierte biologische Material von dem Umgebungsvolumen ab und erleichtern dadurch die Produkttrennung sowie die Arbeit mit gentechnisch verändertenImmobilization in NaCS/PDADMAC capsules combines several important advantages: They have a high mechanical stability and can be described as mini membrane reactors that work under sterile conditions. They separate the immobilized biological material from the surrounding volume and thus facilitate product separation and work with genetically modified

15 Mikroorganismen.15 microorganisms.

Die Erhöhung der Ausschlußgrenze dieser Membran erweitert ihren Anwendungsbereich deutlich. Zum einen können niedermolekulare Stoffe, wie Glucose und Sauerstoff, durch größere Poren besser diffundieren, zum anderen ist es möglich, daß höhermolekulare Stoffe, wie Proteine, Polysaccharide und Viren, durch die Membran diffundieren können.Increasing the exclusion limit of this membrane significantly expands its application area. On the one hand, low-molecular substances such as glucose and oxygen can diffuse better through larger pores, and on the other hand, it is possible for higher-molecular substances such as proteins, polysaccharides and viruses to diffuse through the membrane.

Claims

1. Microcapsules with a membrane shell, characterized in that the membrane can be produced by incorporating inert substances and/or particles into the membrane being formed and then removing them from the formed membrane.

2. Microcapsules according to claim 1, characterized in that the membrane consists of polyelectrolytes.

3. Microcapsules according to one of claims 1 or 2, characterized in that the membrane is formed from sodium cellulose sulfate (NaCS) and polydialylldimethylammonium chloride (PDADMAC).

4. Microcapsules according to one of claims 1 to 3, characterized in that the inert substances are polyalcohols, preferably polyethylene glycol (PEG).

5. Microcapsules according to one of claims 1 to 4, characterized in that the inert particles are biological cells, lysosomes or Ca-alginate.

6. Microcapsules according to one of claims 1 to 5, characterized in that the membrane exclusion limit is above 5000 g/mol, preferably above 100,000 g/mol, very particularly preferably above 200,000 g/mol.

7. Microcapsules according to one of claims 1 to 6, characterized in that they have a diameter of 0.1 to 10 mm, preferably 0.8 to 8 mm.

8. Microcapsules according to one of claims 1 to 7, characterized in that the membrane shell has a thickness of 10 to 200 µm, preferably 20 to 100 µm.