DE19753182A1

DE19753182A1 - Topologisch fixierte matrixgebundene Nukleinsäure

Info

Publication number: DE19753182A1
Application number: DE19753182A
Authority: DE
Inventors: Burghardt Prof Dr Wittig; Claas Junghans
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-11-21
Filing date: 1997-11-21
Publication date: 1999-07-29
Also published as: WO1999027131A2; EP0975808A2; WO1999027131A3

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung, bestehend aus einem oder einer Vielzahl von Nukleinsäuremolekülen, welche mit beiden Enden an einer Matrix, z. B. einer festen Oberfläche, befestigt und topologisch fixiert sind. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren, mit welchem zum einen die Aktivität von Nukleinsäure-Topologie-verändernden Enzymen oder Proteinen bestimmt werden kann, sowie zum anderen die Wirksamkeit von Stoffen ermittelt werden kann, die die genannten Enzymaktivitäten verändern.

Doppelsträngige DNA besteht aus einer rechtsgängigen Helix. In ihrer entspannten, energieärmsten Konformation hat die DNA-Helix eine Ganghöhe von 10,4 Basenpaaren pro Helixdurchgang. Eine Abweichung von dieser Ganghöhe, d. h. eine Über- oder Unterwindung, kommt einer Energieerhöhung der DNA in ihrem Gehalt an Konformationsenergie gleich.

In Zellen liegt DNA in der Regel unterwunden vor. Der Grad dieser Unterwindung wird streng geregelt und dient unter anderem als Energiespeicher für strangtrennende Prozesse. Bei Ablesevorgängen wie Transkription und Replikation wird die Topologie des prozessierten Stranges, d. h. die Windungsdichte der Helix im Raum, stark verändert. Damit diese lebenswichtigen Prozesse ablaufen können, wirken eine Reihe von Enzymen, sog. Topoisomerasen, auf die prozessierte DNA und normalisieren ihre Topologie, um den Ablauf von Replikation und Transkription zu ermöglichen.

Hemmt man diese Enzyme, so kann die Zelle nur eingeschränkt oder gar nicht mehr transkribieren oder replizieren; im letzteren Falle leitet eine Zelle aus einem höheren Tier den programmierten Zelltod ein. Stoffe, welche Enzyme hemmen, die den topologischen Zustand von DNA in bestimmten Zellen oder Organismen regulieren, haben weite Verwendung als Cytostatika und Antibiotika gefunden. Ein einfaches, automatisierbares Verfahren, Hemmer solcher Enzymaktivitäten zu finden, wäre sehr vorteilhaft zum Auffinden neuer Antibiotika oder Cytostatika.

Der topologische Zustand eines DNA-Moleküls ist abhängig von dessen Lage im dreidimensionalen Raum, und wird beschrieben durch die Summe der Zahl der Windungen der DNA-Doppelhelix um sich selbst und der Zahl der Verwindungen der Helixachse im Raum (Crick, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 2639-2640 (1976)). Ein Molekül kann abhängig von seiner Länge eine sehr große Zahl solcher topologischen Zustände einnehmen, die alle eine unterschiedliche Konformationsenergie haben. Fixiert man das Molekül an beiden Enden, so kann es immer noch viele verschiedene Zustände einnehmen, die jedoch dadurch charakterisiert sind, daß bei ihnen die Summe aus Windungen der Helix um sich selbst plus der Windungen der Helixachse im Raum immer gleich ist. Vergleichbar ist dies mit dem Bild eines an beiden Enden festgehaltenen Springseils, in dem Schlaufen zwar innerhalb des Seiles verschoben werden können, nicht aber aus dem Seil hinaus.

Zirkuläre DNA-Moleküle, welche zwei kovalent geschlossene Phosphat-Zucker-Ketten aufweisen, sind topologisch fixiert. An dieser Art von Molekülen kann man die Wirkung von Topologie-verändernden Enzymen und von deren Hemmstoffen studieren. Prinzipiell werden dabei DNA-Ringe unterschiedlicher topologischer Zustände durch Enzymeinwirkung erzeugt, und durch ihr Wanderungsverhalten durch ein Agarose- oder Polyacrylamidgel im elektrischen Feld charakterisiert. Ein Nachteil dabei ist allerdings, daß der Aufbau eines solchen Experiments, obwohl prinzipiell einfach, eine Reihe von Handreichungen umfaßt, welche nicht ohne weiteres automatisierbar sind.

Neben der Wanderung zirkulärer Topoisomere im elektrischen Feld gibt es eine Reihe anderer Ansätze, topologie-abhängige Phänomene sichtbar zu machen. Neben der Interkalation von Farbstoffen wie Ethidiumbromid in die Helix, welche topologieabhängig ist, sowie der unterschiedlichen Empfindlichkeit der DNA für DNA-modifizierende oder -abbauende Enzyme oder Reagenzien, ist hier vor allem die Bindung von Antikörpern an topologieabhängig auftretende DNA-Formen wie Z-DNA zu nennen (Lafer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78, 3546-3550, 1981). Bei einer Reihe von Proteinen wird postuliert, daß sie in Abhängigkeit des topologischen Zustands der DNA unterschiedlich stark an diese binden.

Eine andere Methode, DNA-Moleküle topologisch zu fixieren, wäre, sie mit beiden Enden so an eine Matrix zu binden, daß die Stränge des Phosphatrückgrates an den Enden nicht mehr umeinander frei drehbar sind. Dies würde man dadurch erreichen, daß man jeden Strang des Doppelstranges an beiden Enden fixiert, oder aber den Strang an den Enden über eine kurze Schleife einzelsträngiger Oligonukleotide schließt, und diese Schleife über mindestens zwei Ankerpunkte mit der Matrix verbindet.

Matrix- oder Oberflächen-gebundene DNA ist aus der Literatur bekannt. Es gibt allerdings nur wenig Hinweise darauf, daß DNA zur Untersuchung ihres topologischen Verhaltens fixiert worden wäre. Strick et al. (Science 271, 1835 (1996)) beschreiben, wie sie ein DNA-Molekül an einem Ende auf einem Objektträger festmachen und am anderen Ende ziehen, um die Elastizität des Moleküles zu ermitteln. Die Moleküle sind allerdings linear, nicht kovalent geschlossen und die Art der Befestigung sowie die Anzahl der Ankerpunkte undefiniert. Einen ähnlichen Versuchsaufbau beschreiben Quake et al. (Nature 388, 151 (1997)), aber hier liegt weder kovalent geschlossene DNA vor, noch ist das Molekül topologisch fixiert. Obwohl beide Ansätze in ihrem experimentellen Aufbau brillant sind, ermöglichen sie nicht das schnelle und unkomplizierte Untersuchen topologischer Phänomene.

Ausgehend von diesem Stand der Technik ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein System zu entwickeln, welches die Untersuchung topologischer Phänomene auf experimentell einfache Weise möglich macht, vorzugsweise auf eine Art, welche der Automatisierung zum Zwecke der Wirkstoffsuche zugänglich ist. Insbesondere ist es die Aufgabe der Erfindung, Topoisomeraseaktivitäten, deren Hemmung sowie topologieverändernde andere Enzymaktivitäten und deren Hemmung einem einfachen, automatisierbaren Testsystem zugänglich zu machen.

Erfindungsgemäße technische Lösung

Erfindungsgemäß wird die in der Einführung geschilderte Aufgabe so gelöst, daß DNA-Moleküle mit beiden Enden so an eine Matrix gebunden werden, daß die Stränge des Phosphatrückgrates an den Enden nicht mehr umeinander frei drehbar sind, indem man entweder

a) jeden Strang des Doppelstranges an beiden Enden fixiert, oder aber
b) den Strang an beiden Enden über je eine kurze Schleife einzelsträngiger Oligonukleotide schließt, und diese Schleife über mindestens zwei Ankerpunkte mit der Matrix verbindet.

Erfindungsgemäß wird unterwundene matrixgebundene DNA dadurch hergestellt, daß man die DNA-Moleküle vor der Bindung an die Matrix aufwindet, z. B. durch Interkalation eines geeigneten Liganden wie Ethidiumbromid oder Chioroquin. Nach Bindung und Auswaschen des Liganden liegt die DNA unterwunden vor. Umgekehrt ist es möglich, überwundene DNA durch Bindung anderer Liganden, wie z. B. Netropsin, herzustellen.

Die Bindung der DNA an die Matrix erfolgt dadurch, daß chemisch modifizierte DNA-Bausteine, welche an den Enden der DNA-Moleküle vorliegen, über kovalente oder quasi kovalente Wechselwirkungen an die Oberfläche der Matrix gebunden werden. Zum Beispiel können die Enden der DNA-Moleküle mit kurzen, durch automatisierte chemische Synthese hergestellten einzelsträngigen Schleifen verknüpft werden, wobei einzelne Basen biotinmodifiziert sind. Diese Moleküle binden an eine Streptavidin-beschichtete Matrix mit einer Stärke, die der von kovalenten Bindungen nahekommt. Alternativ können Aminolinker- modifizierte DNA-Moleküle an eine Matrix gebunden werden, die aktivierte Carbonsäurereste oder epoxid-aktivierte Reste enthält. Die Bindung von thiolmodifizierter DNA an Goldoberflächen ist ebenfalls denkbar.

Die Länge der erfindungsgemäßen matrixgebundenen DNA-Moleküle ist variierbar und kann je nach Aufgabenstellung der zu untersuchenden Enzymaktivität zwischen zwanzig Basenpaaren und vielen Kilobasen liegen. Die topologieabhängige Bindung des Anti-Z-DNA-Antikörpers Z22 (Stollar et al.: J. Biol. Chem. 257, 12 801-12 085 (1982); ibid: 261, 468-476 (1986); ibid.: 265, 18 608-18 614 (1990)) wurde für DNA-Konstrukte bis ≦ 200 bp gezeigt, kleinere Konstrukte wurden nicht untersucht. Es ist allerdings vorstellbar, z. B. zur Untersuchung von topologieabhängigen Sequenzerkennungsphänomenen auch viel kürzere Konstrukte zu binden.

Der Nachweis topologiespezifischer DNA-Strukturen oder des topologischen Zustands kann auf mehrerlei Weise erfolgen. Vor allem bieten sich Methoden an, die leicht in automatisierbaren Systemen nachgewiesen werden können, also vor allem enzymatische Nachweismethoden wie die Bindung von Antikörpern oder Proteinen, welche durch Sekundär-Antikörper-gekoppelte Farbreaktionen sichtbar gemacht werden können, oder die fluorimetrisch nachweisbare Interkalation von Ethidiumbromid, Propidiumiodid oder anderen Farbstoffen. Da die Interkalation dieser Farbstoffe die DNA-Helix aufwindet, erhöht sie in einem topologisch fixierten DNA-Molekül die Konformationsenergie, da die Aufwindung an anderer Stelle im Molekül durch Windungsenergie kompensiert werden muß. Es binden topologisch fixierte Moleküle ab einer bestimmten Konzentration an Interkalator meßbar weniger Farbstoff als relaxierte Moleküle; dieser Unterschied ist direkt meßbar.

Ferner sei der direkte Nachweis von topologieabhängigen Parameterveränderungen bei der Untersuchung mit Oberflächenplasmonresonanz oder der Nachweis von Bindungen oder Enzymaktivitäten durch diese Methode an matrixgebundener topologisch fixierter DNA genannt.

Die Untersuchung von Enzymaktivitäten, welche den topologischen Zustand von DNA verändern können, erfolgt erfindungsgemäß so, daß matrixgebundene topologisch fixierte DNA eines definierten topologischen Zustands mit der betreffenden Enzymaktivität inkubiert wird, und die Veränderung des topologischen Zustands der DNA entweder nach kontrolliertem Abbruch des Experiments oder im Echtzeitverfahren durch eine der genannten Methoden verfolgt wird. Die Wahl der geeigneten Meßmethode und -parameter wird dabei unter anderem stark vom Mechanismus der zu untersuchenden Enzymaktivität abhängen.

Beispiel 1. Herstellung von linearer kovalent geschlossener DNA

Plasmid Blueskript SK (Stratagene) wurde mit EcoRI vollständig geschnitten und anschließend mit einem 200-fachen molaren Überschuß an 5'phosphoryliertem Oligodesoxynukleotid AATTGGCCGGCCGGCXTTXGCCGGCCGGCC (X entspricht Biotin-modifiziertem Uracil) (TIB-MolBiol, Berlin) mit T4-DNA-Ligase (MBI, Heidelberg) ligiert. Nach Abtrennen der überschüssigen Oligodesoxynukleotide erhält man das kovalent geschlossene, ca. 3 kb lange DNA-Molekül mit je zwei Biotinmodifikationen an beiden Enden.

2. Kopplung an Streptavidin-beschichtete ELISA-Platten

Kovalent geschlossene DNA aus Schritt 1 wurde in Tris-Puffer (pH 8.0) in einer Konzentration von 2 µg/ml aufgenommen; je 2 ng des Konstruktes wurde in 75 µl Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) in Anwesenheit von 20 µM Ethidiumbromid 45 min auf Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten (Boehringer Mannheim) inkubiert. Anschließend wurde dreimal mit PBS gewaschen.

3. Topoisomerase-Assay

Die mit unterwundener DNA beschichteten Mikrotiterplattennäpfe werden mit je 4 µ Topoisomerase I (Life) zwischen 0 und 30 min inkubiert. Die topologieabhängige Konformationsänderung unter Einwirkung der Topoisomerase wird durch Inkubation mit anti- Z-DNA-Antikörper Z22 und anschließender Inkubation mit sekundärem Peroxidase konjugiertem Anti-Maus-IgG (Boehringer) nach Farbreaktion mit Tetramethylbenzidin nachgewiesen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt schematisch ein kovalent geschlossenes, topologisch fixiertes DNA-Molekül, welches an einer festen Oberfläche gebunden ist.

Fig. 2 zeigt den schematischen Ablauf des Verfahrens: Topologie-induzierte Z-DNA kann durch Antikörperbindung nachgewiesen werden (linke Seite); Topoisomeraseeinwirkung (rechts oben) entspannt die DNA, wodurch die Z-DNA-Struktur verschwindet; das Antikörper-Signal wird dadurch verhindert (rechts unten).

Claims

1. Matrix-gebundenes topologisch fixiertes Desoxyribonukleinsäuremolekül.

2. Matrix-gebundenes topologisch fixiertes Desoxyribonukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Molekül aus einem linearen Doppelstrang komplementärer Basensequenz besteht, dessen beide Enden so an die Matrix gebunden sind, daß die jeweiligen beiden Enden der Doppelstrang-bildenden Einzelstränge nicht umeinander rotieren können.

3. Matrixgebundenes topologisch fixiertes Desoxyribonukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, wobei das Molekül aus einem linearen Doppelstrang komplementärer Basensequenz besteht, dessen Stränge an jedem Ende durch eine kurze Schlaufe einzelsträngiger Nukleotide kovalent verbunden sind.

4. Matrixgebundenes topologisch fixiertes Desoxyribonukleinsäuremolekül nach Anspruch 3, bei welchem die Bindung an eine Streptavidin-beschichtete Matrix durch an die DNA gekoppelte Biotinreste vermittelt wird.

5. Matrixgebundenes topologisch fixiertes Desoxyribonukleinsäuremolekül nach Anspruch 3, bei welchem die Bindung an eine Goldoberfläche über in der kürzen Schlaufe enthaltene thiolmodifizierte Basen vermittelt wird.

6. Verfahren zum Untersuchen von topologieändernden Enzymaktivitäten, dadurch gekennzeichnet daß

a) ein topologisch fixiertes DNA-Molekül mit definierter Topologie auf einer Matrix fixiert wird,
b) die topologisch fixierte DNA in Anwesenheit der zu untersuchende Enzymaktivität inkubiert wird und
c) die Veränderung im topologischen Zustand nachgewiesen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das DNA-Molekül durch an die DNA gekoppelte Biotinreste an eine Streptavidin-beschichtete Matrix gebunden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das DNA-Molekül über in der kurzen Schlaufe enthaltene thiomodifizierte Basen an eine Goldoberfläche gebunden ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Anti-Z-DNA-spezifischer Antikörper zum Nachweis topologischer Veränderungen in der matrixgebundenen DNA benutzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der topologische Zustand der DNA nach Einwirkung der Enzymaktivität durch Fluoreszensintensitätsmessung eines in die DNA interkalierten Fluoreszensfarbstoffes direkt gemessen wird.