DE19736156A1 - Analytisches Verfahren für Elektrodensensoren unter Verwendung von Enzymen - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf analytische Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probe mit Hilfe von Elektrodensensoren unter Verwendung von Enzymen, die auch als elektrochemische Biosensoren bezeichnet werden.

Mit ihnen werden die Konzentrationen zahlreicher Stoffe wie Glucose, Harnstoff, Alkohol, Lactat usw. in physiologischen bzw. biotechnologischen Flüssigkeiten gemessen. Diese Stoffe sind elek­ trochemisch inaktiv, d. h. sie lassen sich mit Hilfe von Elektrodenreaktionen nicht direkt nachwei­ sen. Ein derartiger Stoff kann aber in Folge einer geeigneten chemischen Reaktion elektroche­ misch aktive Substanzen erzeugen oder verbrauchen. Eine solche chemische Reaktion ist beson­ ders geeignet, wenn für sie ein passendes Enzym zur Verfügung steht. Die Anwesenheit des En­ zyms erniedrigt die Aktivierungsenergie der Reaktion, so daß sie im allgemeinen sehr schnell ab­ läuft. Das Enzym wirkt außerdem zweifach spezifisch: Es selektiert aus einem Gemisch von Substraten nur eines (den Analyten) und katalysiert nur die eine (erwünschte) chemische Reak­ tion, die die an einer Elektrode nachweisbaren Substanzen erzeugt oder verbraucht. Aus diesem Zusammenwirken von Enzym und Elektrode ergibt sich, daß beide eng benachbart sein müssen.

Die elektrochemisch aktiven Substanzen der Enzym-katalysierten Reaktion können Elektronen an die Elektrode abgeben bzw. von der Elektrode aufnehmen. Um sie nachzuweisen, wird z. B. im ersteren Fall von außen ein positives elektrisches Potential an die Elektrode gelegt, so daß die Elektronen kontinuierlich von der Elektrode und damit von der elektrochemisch aktiven Substanz abgezogen werden. Die Stärke des sich einstellenden, äußeren elektrischen Stromes ist dann ein Maß für die Geschwindigkeit der Enzym-katalysierten Reaktion. Unter der Voraussetzung, daß die Konzentration des Analyten diese Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt, ist die Stärke des äußeren Stromes ein Maß für die Konzentration des Analyten. Dieses Meßverfahren heißt am­ perometrisches und entspricht dem Stand der Technik. Es wird durchgeführt mit Hilfe eines po­ tentiostatisch geregelten Dreielektrodensystems, bestehend aus Enzymelektrode, Gegenelektrode und Referenzelektrode, oder eines Zweielektrodensystems, bestehend aus Enzymelektrode und großflächiger Referenzelektrode.

Beim amperometrischen Meßverfahren können Umstände eintreten, die die Meßergebnisse verfäl­ schen:

• 1. Interferenten in der zu untersuchenden Lösung.
  Interferenten sind Substanzen, die elektrochemisch aktiv sind, und zwar im allgemeinen un­ abhängig vom Enzym. Man kann ihren verfalschenden Einfluß auf das Meßergebnis eliminie­ ren bzw. korrigieren, indem man zwei hinreichend gleichartige amperometrische Elektroden­ sensoren gleichzeitig betreibt, den einen mit Enzym und den anderen ohne Enzym, und die Differenz ihrer Meßwerte als Maß der Analytkonzentration heranzieht.
• 2. Ablagerungen von Stoffen auf dem Äußeren des Sensors, insbesondere im Langzeitbetrieb. Diese Stoffe behindern die Diffusion des Analyten zur Enzymelektrode. Als Folge wird der Meßstrom erniedrigt, der die jeweiligen Massentransportbedingungen des Fließgleichgewich­ tes repräsentiert.
• 3. Änderung der Viskosität der zu untersuchenden Lösung, insbesondere im Langzeitbetrieb. Dadurch wird die Diffusion des Analyten verändert, und in Folge ändert sich der Meßstrom, der die jeweiligen Massentransportbedingungen des Fließgleichgewichtes repräsentiert.
• 4. Ablagerung von Stoffen auf der Enzymelektrode, insbesondere im Langzeitbetrieb. Die verfälschende Auswirkung dieser Stoffe auf das Meßergebnis entspricht der des Punktes 2. Diese Stoffe sind oft Produkte elektrochemischer Reaktionen an der Enzymelektrode.

Durch diese Umstände ist es unter anderem bisher nicht gelungen, den amperometrischen Enzym­ elektrodensensor zur langfristigen in-vivo-Messung der Blutzuckerkonzentration am Menschen erfolgreich einzusetzen. (Siehe dazu z. B. die Zeitschrift "Biosensors & Bioelectronics", Jahrgang 8 (1993), Seiten 473-482.)

Der im Anspruch 1 angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, ein analytisches Verfah­ ren unter Verwendung von Enzymelektrodensensoren zu finden, bei dem die unter Punkt 1 bis 4 genannten Umstände, insbesondere im Langzeitbetrieb, die Meßergebnisse nicht oder nicht we­ sentlich verfälschen.

Grundlage des erfindungsgemäßen analytischen Verfahrens ist das potentiometrische Relaxati­ onsmeßverfahren für eine Sensorelektrode im potentiostatisch geregelten Dreielektrodensystem (siehe dazu die Patentschrift DE 41 00 727 C2) oder für eine Sensor-Bielektrode, auch Sensor-Zwillingselektrode genannt (siehe dazu die Offenlegungsschrift DE 43 00 499 A1). Bei der Me­ thode wird der Effekt meßtechnisch ausgewertet, daß nach Anlegen einer Rechteckspannung die Spannung der Sensorelektrode im Dreielektrodensystem bzw. der Sensor-Bielektrode umso schneller relaxiert, je höher die Konzentration elektrochemisch aktiver Substanzen in Elektroden­ nähe ist. Die Änderungsgeschwindigkeit, der Momentanwert oder das zeitliche Integral der Span­ nung zu einem bestimmten Zeitpunkt nach dem Anlegen der Rechteckspannung ist ein Maß für die Konzentration des Analyten und ggf. der Interferenten.

Die Sensorelektrode im Dreielektrodensystem bzw. die Sensor-Bielektrode wird in einem sehr flachen Meßraum angeordnet, der über eine semipermeable Membran mit der zu untersuchenden Lösung verbunden ist (siehe dazu die Offenlegungsschrift DE 44 22 018 A1). Der Meßraum ist mit einer geeigneten Lösung gefüllt, die der zu untersuchenden Lösung ähnlich ist und vorzugs­ weise deren Filtrat ist. Der Meßraum, der vorteilhaft aus den Zwischenräumen eines Vliesmateri- als bestehen kann, enthält außerdem ein Enzym. Es ist eine wesentliche Eigenschaft des erfin­ dungsgemaßen Enzymelektrodensensors, daß das Enzym als Biokatalysator im Meßraum perio­ disch abwechselnd wirksam und unwirksam gemacht wird.

In der Wartezeit 1 hat die Lösung im Meßraum hinreichend viel Zeit, sich an die aktuelle Kon­ zentration des Analyten in der zu untersuchenden Lösung anzugleichen, auch wenn abgelagerte Stoffe auf der semipermeablen Membran oder erhöhte Viskosität der zu untersuchenden Lösung die Diffusion des Analyten behindern. In dieser Wartezeit 1 darf das Enzym den Analyten im Meßraum nicht "verbrauchen", weshalb es vorübergehend unwirksam gemacht wird, beispiels­ weise durch Abschirmung, Entfernung, Entzug des Coenzyms oder Inhibitoren. Vor dem Ende der Wartezeit 1 werden eine oder mehrere Relaxationsmessungen durchgeführt, die einen Meß­ wert für die Konzentration der Interferenten allein ergeben. Nach der Wartezeit 1 beginnt die Wartezeit 2, in der das Enzym wirksam ist. Die Wartezeit 2 dauert so lange, bis eine hinreichende Menge der elektrodenaktiven Substanzen aus der Enzym-katalysierten Reaktion die Sensorelek­ trode im Dreielektrodensystem bzw. die Sensor-Bielektrode durch Diffusion erreicht hat. Vor Ende der Wartezeit 2 werden eine oder mehrere Relaxationsmessungen durchgeführt, die einen Meßwert für die Konzentrationen des Analyten und der Interferenten ergeben.

Die Wartezeiten 1 und 2 wechseln einander periodisch ab. Die Wartezeit 1 ist i.a. länger als die Wartezeit 2. Alle Vorgänge werden automatisch von einem Zeitgeber gesteuert. Die Konzentra­ tion des Analyten wird jeweils aus der Differenz zeitlich benachbarter Meßwertpaare mit bzw. ohne Enzym anhand einer Kalibrierkurve bestimmt. Die absoluten Meßwerte können gewichtet werden.

Mit diesem Verfahren sind Maßnahmen zur Vermeidung der oben unter Punkt 1 bis Punkt 3 ge­ nannten möglichen Meßverfälschungen getroffen. Maßnahmen zur Vermeidung der oben unter Punkt 4 genannten möglichen Meßverfälschung sind folgende:

• - Die an die Sensorelektrode im Dreielektrodensystem bzw. an die Sensor-Bielektrode ange­ legte Rechteckspannung ist klein und kurzzeitig; der elektrochemische Stoffumsatz ist da­ durch gering.
• - Unmittelbar nach jeder Meßwerterfassung wird zur Kompensation der angelegten Rechteck­ spannung eine umgepolte Rechteckspannung an die Sensorelektrode im Dreielektrodensy­ stem bzw. an die Sensor-Bielektrode gelegt, wodurch sie sich schnell entladen kann. Der elektrochemische Stoffumsatz wird dadurch sehr klein gehalten.
• - Der zeitliche Verlauf der Relaxationsspannung ist im wesentlichen unabhängig von der Größe der aktiven Elektrodenoberfläche und damit von deren eventuellen teilweisen Blockierung durch abgelagerte Stoffe.

In dem erfindungsgemäßen analytischen Verfahren wird jeweils vor Anlegen der Rechteckspan­ nung die Ruhespannung der Sensorelektrode im Dreielektrodensystem in Bezug auf die Referenz­ elektrode bzw. die Ruhespannung der Sensor-Bielektrode gemessen, der Meßwert elektronisch gespeichert und dieser als Bezugswert für die angelegte Rechteckspannung und den Relaxations­ meßwert verwendet. Aus dieser Maßnahme ergeben sich vorteilhafte Ausführungsformen des potentiometrischen Relaxationsmeßverfahrens sowohl für das Dreielektrodensystem als auch für das Bielektrodensystem:
Von der Referenzelektrode im potentiostatisch geregelten Dreielektrodensystem wird keine Lang­ zeitstabilität, sondern lediglich eine hinreichende Kurzzeitstabilität des elektrischen Potentials für die Zeit vom Anlegen der Rechteckspannung bis zur Erfassung des Relaxationsmeßwertes ver­ langt, die nur wenige Sekunden dauert. Anstelle z. B. eines Silber/Silberchlorid-Referenzelektro­ densystems ist die Verwendung z. B. eines Stückes Platin oder eines Stückes Graphit als Referenz­ elektrode hinreichend.

Die Sensor-Bielektrode kann anstelle aus zwei gleichartigen Elektroden aus zwei Elektroden mit sehr unterschiedlich großen Flächen ausgeführt werden. Da die Elektrodenimpedanz umgekehrt proportional zur Elektrodenfläche ist und die angelegte Spannung sich proportional zu den Elek­ trodenimpedanzen auf die beiden Elektroden verteilt, liegt diese im wesentlichen an der Elektrode mit der kleineren Fläche. Das Relaxationssignal kommt im wesentlichen von ihr, und nur in ihrer Nähe muß das Enzym periodisch abwechselnd wirksam und unwirksam sein. Die Elektrode mit der größeren Fläche kann außerhalb der Meßzelle angeordnet werden, mit dem Maßeanschluß der Elektronik verbunden werden und auch als elektrische und mechanische Abschirmung der Elektrode mit der kleineren Fläche dienen.

Die Elektrode mit der größeren Fläche wirkt ähnlich wie die großflächige Referenzelektrode im amperometrischen Zweielektrodensystem. Im Gegensatz dazu wird von ihr jedoch keine Lang­ zeitstabilität, sondern nur eine hinreichende Kurzzeitstabilität des elektrischen Potentials für die Zeit vom Anlegen der Rechteckspannung bis zur Erfassung des Relaxationsmeßwertes verlangt, die nur wenige Sekunden beträgt. Anstelle eines großflächigen Silber/Silberchlorid-Referenz­ elektrodensystems ist die Verwendung von z. B. Graphit oder von Edelstahl als Referenzelektrode hinreichend.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in Fig. 1 schematisch dargestellt. Es handelt sich um einen Bielektrodensensor zur Langzeitmessung der Konzentration eines Analyten mit Hilfe eines Enzyms. Die Bielektrode (Bi) ist in einem Meßraum (MR) angeordnet, dessen Höhe die Größen­ ordnung 0,1 mm hat. Über eine Membran (M), beispielsweise aus regenerierter Cellulose, steht er mit der zu untersuchenden Lösung (L) in Verbindung. Gegenüber befindet sich das Enzym (E) in einer flachen Mulde einer beweglichen Abdeckung (A). Durch Bewegungen der Abdeckung wird das Enzym im Meßraum abwechselnd wirksam (Fig. 1a) und unwirksam (Fig. 1b) gemacht. Eine Rotationsbewegung der Abdeckung wird einer Translationsbewegung vorgezogen, weil bei ihr das Medium der Umgebung nicht umgepumpt wird. Die angelegte Rechteckspannung hat die Größenordnungen 10 mV und 0,1 s. Die Zeit zwischen angelegter Rechteckspannung und Meß­ werterfassung hat die Größenordnung 1 s.

Ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in Fig. 2 prinzipiell dargestellt. Es handelt sich um einen asymmetrischen Bielektrodensensor zur Langzeitmessung der Konzentration eines Analyten mit Hilfe eines Enzyms, wobei beispielsweise der Analyt Glucose und das Enzym Gluco­ seoxidase sein können. Die großflächige Elektrode besteht aus dem Rohr (R) eines elektrisch lei­ tenden Materials, beispielsweise Edelstahl, die kleinflächige Elektrode besteht aus einem Platin­ draht (Pt), der durch den Meßraum (MR) geführt ist. Der Meßraum steht über eine semiperme­ able Membran (M), beispielsweise aus regenerierter Cellulose, und über ein Fenster (F) in dem Rohr (R) mit der zu untersuchenden Lösung (L) in Verbindung. Auf der anderen Seite des Meß­ raumes befindet sich das Enzym (E), das in einer flachen Mulde unterhalb der Mantelfläche eines Drehrohres (D) aus Kunststoff immobilisiert ist. Durch Rotationsbewegungen des Drehrohres wird das Enzym im Meßraum periodisch abwechselnd wirksam und unwirksam gemacht, und zwar in ähnlicher Weise, wie es die Fig. 1 zeigt. Das Drehrohr befindet sich in einem Lager (L) aus Kunststoff. Weil die Aktivität des Enzyms i.a. im Laufe der Zeit abnimmt, kann es zu gegebe­ ner Zeit mit dem Drehrohr ausgetauscht werden. Der verschließbare, innere Kanal (K) des Dreh­ rohres dient dabei der Vermeidung von Luftblasen.

Claims (4)

1. Analytisches Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probe in vitro oder in vivo mit Hilfe des potentiometrischen Relaxationsmeßverfahrens nach der Pa­ tentschrift DE 41 00 727 C2 sowie nach den Offenlegungsschriften DE 43 00 499 A1 und DE 44 22 018 A1 unter Verwendung einer Sensorelektrode im potentiostatisch geregelten Dreielektrodensystem oder einer Sensor-Bielektrode sowie eines Enzyms, das dadurch ge­ kennzeichnet ist, daß

• a) das Enzym im Meßraum periodisch abwechselnd in einer Wartezeit 1 unwirksam und in einer Wartezeit 2 wirksam ist,
• b) jeweils am Ende der Wartezeit 1, in der sich die Konzentration des Analyten im Meßraum seiner Konzentration in der Probe hinreichend annähert, eine oder mehrere Relaxations­ messungen durchgeführt werden, die einen Meßwert für die Konzentration der Interferen­ ten ergeben,
• c) jeweils am Ende der Wartezeit 2, in der die Konzentration der elektrochemisch aktiven Substanz aus der Enzym-katalysierten Reaktion des Analyten an der Sensorelektrode im Dreielektrodensystem bzw. an der Sensor-Bielektrode hinreichend anwächst, eine oder mehrere Relaxationsmessungen durchgeführt werden, die einen Meßwert für die Konzen­ tration des Analyten und der Interferenten ergeben,
• d) jeweils aus zeitlich benachbarten Meßwertpaaren mit bzw. ohne Enzym die Konzentration des Analyten ermittelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

• e) die angelegte Rechteckspannung und der Relaxationsmeßwert auf die jeweilige Ruhespan­ nung der Sensorelektrode im Dreielektrodensystem bzw. der Sensor-Bielektrode vor An­ legen der Rechteckspannung bezogen werden,
• f) im Sensor-Dreielektrodensystem als Referenzelektrode Material eingesetzt werden kann, dessen Referenzspannung nicht langfristig, sondern nur kurzfristig driftarm sein muß,
• g) das Sensor-Bielektrodensystem wie ein amperometrisches Zweielektrodensystem ausge­ führt werden kann, wobei als großflächige Referenzelektrode Material eingesetzt werden kann, dessen Referenzspannung nicht langfristig, sondern nur kurzfristig driftarm sein muß.

3. Verfahren nach Anspruch 2g, dadurch gekennzeichnet, daß in einer vorteilhaften Ausfüh­ rungsart der Erfindung

• h) die kleinflächige Elektrode (Pt) von der großflächigen Elektrode (R) umhüllt und elek­ trisch und mechanisch abgeschirmt wird und über ein Fenster (F) in dieser mit der zu ,in­ tersuchenden Lösung (L) in Verbindung steht,
• i) das Enzym (E) in einer flachen Mulde unterhalb der Mantelfläche eines Drehrohres (D) aus Kunststoff immobilisiert ist,
• j) durch Drehbewegungen des Drehrohres das Enzym im Meßraum (MR) periodisch ab­ wechselnd wirksam und unwirksam gemacht wird,
• k) das Enzym mit dem Drehrohr austauschbar ist,
• l) der verschließbare, innere Längskanal (K) im Drehrohr der Vermeidung von Luftblasen beim Austausch desselben dient,
• m) die großflächige Elektrode mit einem semipermeablen, körperverträglichen Material be­ schichtet werden kann.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

• n) als Relaxationsmeßwert die Änderungsgeschwindigkeit, der Momentanwert, das zeitliche Integral der Elektrodenspannung oder ein anderer davon abgeleiteter Wert zu einem be­ stimmten Zeitpunkt nach Anlegen der Rechteckspannung an die Sensorelektrode im Dreielektrodensystem bzw. an die Sensor-Bielektrode dient,
• o) jeweils nach jeder Relaxationsmeßwerterfassung eine umgepolte Rechteckspannung oder Spannung anderer Form an die Sensorelektrode im Dreielektrodensystem bzw. an die Sen­ sor-Bielektrode angelegt wird zur schnellen Entladung derselben,
• p) die Sensorelektrode im Dreielektrodensystem bzw. die Sensor-Bielektrode zeitweise bei höheren anodischen bzw. kathodischen elektrischen Potentialen konditioniert oder rege­ neriert werden kann,
• q) daß der Meßraum vorteilhaft aus den Zwischenräumen eines Vliesmaterials bestehen kann.