DE19731154A1 - Genetisch veränderte Zellen und deren Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen - Google Patents
Genetisch veränderte Zellen und deren Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie von ErkrankungenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Zellen zur Anwendung in der
Gentherapie erhältlich durch
- a) Isolierung von Zellen aus dem Blut oder zellhaltigen Flüssigkeiten des Körpers;
- b) Kultivierung der in Schritt a) gewonnenen Zellen in einem Zellkulturmedium enthaltend Ganglioside, Phospholipide, Glykolipide und/oder Wachstumsfaktoren;
- c) Immortalisierung der in Schritt a) oder b) gewonnenen Zellen durch Transformation mit einem Onkogen, Aktivierung eines Onkogens oder Inaktivierung eines Suppressorgenes;
- d) Transfektion der in Schritt c) gewonnenen Zellen mit einem Nukleinsäurekonstrukt für Gentherapie, enthaltend ein Effektorgen, welches durch geeignete Promotorsysteme zielzellspezifisch, zellzyklusspezifisch, virusspezifisch und/oder durch Hypoxie aktiviert werden kann.
Die Verabreichung von in vitro transfizierten somatischen Zellen, transduziert zur
Expression eines Wirkstoffes, ist eine derzeit breit präklinisch wie auch klinisch in
Prüfung befindliche Methode der Gentherapie. Unterschiedliche Zellen werden
hierbei verwendet, einschließlich Fibroblasten, Lymphozyten, Keratinozyten und
Tumorzellen.
Endothelzellen kamen erstmals 1989 für diesen Zweck zur Anwendung. Hierzu
wurden die Endothelzellen mit Hilfe eines retroviralen Vektors (Zwiebel et al.
Science 243: 220 (1989)) in vitro transfiziert zur Express Ion eines Wirkstoffes.
Derartig transduzierte Endothelzellen, in vitro angewachsen an Blutgefäßprothesen
aus Kunststoff, waren nach in vivo Transplantation dieser Prothesen in der Lage,
das Transgen zu exprimieren (Zwiebel et al., Science 243: 220 (1989), Wilson et al.
Science 244: 1344 (1989)). In Konsequenz wurde von Zwiebel und Wilson
vorgeschlagen, transduzierte Endothelzellen, adhärierend an einen Kunststoff oder
Kollagenträger, zum Zwecke einer Gentherapie Patienten zu verabreichen.
Experimentell durchgeführt wurde dieser Vorschlag von Nathan et al. (PNAS USA
92: 8130 (1995)).
In Erweiterung dieses Vorschlages wurde von Nabel et al. (Science 244: 1342
(1989)) erstmals die Möglichkeit der Verabreichung einer Zellsuspension von
transduzierten Endothelzellen in den Blutstrom hinein als Weg der Gentherapie
dargestellt. Die Autoren konnten zeigen, daß Endothelzellen, welche aus Gefäßen
eines lebenden Säugers durch Abschaben gewonnen und in vitro zur Expression
eines Reportergenes transduziert worden waren, nach lokaler Verabreichung z. B. in
Blutgefäße mit einem Endothelzellschaden dort anwachsen und das Reportergen
exprimieren. Aufgrund dieser Ergebnisse beschrieben die Autoren die Möglichkeit,
genetisch modifizierte Endothelzellen zum Zwecke der Gentherapie zu
verabreichen, wobei Wirkstoffe von diesen Endothelzellen direkt in die
Blutzirkulation zum Zwecke der Therapie von systemischen oder von Erbleiden
abgegeben werden. Diese Idee wurde von Bernstein et al. (FASEB J. 4: 2665
(1990)) weiterentwickelt. Lungenendothelzellen wurden in vitro zur Expression eines
Wirkstoffes mit Plasmiden transfiziert und Nacktmäusen nachfolgend
intraperitoneal, intravenös, subkutan oder unter die Nierenkapsel injiziert. In den
derartig behandelten Tieren wurde der von den Endothelzelltransplantaten
produzierte Wirkstoff lokal (in Zysten der Niere) oder im Blut (nach i.p., i.v. oder s.c.
Applikation) nachgewiesen, was die Brauchbarkeit der in vivo Verabreichung von in
vitro transduzierten Endothelzellen für die Gentherapie bewies.
Nachfolgend zeigten Zwiebel et al., 1992 (Internationale Patentanmeldung mit der
Veröffentlichungsnummer W093/13807) und Ojeifo et al. (Cancer Res. 55: 2240
(1995)) an mehreren Beispielen die Einsatzmöglichkeit der Methode der
Verabreichung von in vitro transduzierten Endothelzellen in den Blutkreislauf zum
Zwecke der Gentherapie.
Zwiebel et al. (1992) transduzierten in vitro humane Nabelschnurendothelzellen und
Endothelzellen aus dem Fettgewebe von Ratten mit einem retroviralen Vektor zur
Expression von einem Wirkstoff und injizierten diese Endothelzellen intravenös in
Tiere, in denen durch die Injektion von bestrahlten FGF-sekretierenden Zellen vorab
ein lokaler Gefäßschaden und Angiogenese erzeugt worden waren. Sie konnten
zeigen, daß die injizierten Endothelzellen am Ort des Gefäßschadens und der
Angiogenese lokalisieren und dort den Wirkstoff exprimieren. Vor diesem
Hintergrund beanspruchten die Autoren in ihrer Patentanmeldung die Verwendung
von in vitro transduzierten Endothelzellen für die Expression von
Adenosinedeaminase, Blutgerinnungsfaktoren, hematopoietische
Wachstumsfaktoren, Zytokine, Antithrombotika, Enzyminhibitoren und Hormone.
Parallel zu diesen Arbeiten wurde von anderen Autoren sowohl die Technik zur
Isolierung von Endothelzellen verbessert als auch das Wanderungsverhalten von in
vitro transduzieren Endothelzellen näher studiert.
So konnten Messina et al. (PNAS USA 89: 12018 (1992)) zeigen, daß sich in vitro
transfizierte Endothelzellen nach Injektion in den Kreislauf sowohl an die intakte
Endothelzellschicht anheften als auch in diese hinein integrieren können. Eine
ausschließliche Lokalisation von intravaskulär verabreichten Endothelzellen in
Zonen mit Gefäßschaden und Angiogenese konnte mit diesen Ergebnissen also
ausgeschlossen werden. Andererseits konnte gezeigt werden, daß sich im Gemisch
mit Tumorzellen injizierte, in vitro transfizierte Endothelzellen an der Angiogenese
des Tumorgefäßbettes beteiligen (Lal et al., PNAS USA 91: 9695 (1994), Nam et al.
Brain Res. 731: 161 (1996)). Hierdurch bedingt weisen Tumorzellen, transplantiert
im Gemisch mit Endothelzellen, in vivo einen deutlichen Wachstumsvorteil auf
(Stopeck et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 38: 265 (1997)).
Andererseits können transduzierte Endothelzellen lokal z. B. in das Hirn oder in
einen Hirntumor verabreicht, durch Expression des vom Transgen kodierten
Wirkstoffes pharmakologisch aktiv bzw. antitumoral wirksam sein (Nam et al. Brain
Res. 731: 161 (1996), Quinonero et al., Gene Ther. 4: 111 (1997)). Beispielsweise
applizierten Robertson et al. (Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 38: 382 (1997))
humane Endothelzellen (HUVEC), in vitro transduziert mit einem AV-Vektor zur
Expression von HSV-TK, im Gemisch mit humanen Ovarialkarzinomzellen. Nach
Gabe von Ganciclovir, das im Tumor durch die HSV-TK zu einem Zytostatikum
aktiviert wird, konnten sie eine deutliche Tumorregression bei Nacktmäusen
beobachten.
Die Verwendung von Endothelzellen als zellulären Träger von Transgenen in der
Gentherapie ist bislang jedoch durch zwei wesentliche Problembereiche erheblich
eingeschränkt gewesen:
- - Die Gewinnung von geeigneten Endothelzellen in ausreichender Anzahl hat sich
bislang als äußerst schwierig erwiesen.
Allogene Endothelzellen sind zwar relativ einfach aus der Nabelschnur oder aus Zellkulturen zu gewinnen, durch ihre Immunogenität im Empfänger sind sie jedoch nur eingeschränkt verwendbar, zum anderen ist ihre Vermehrung in der Zellkultur nur in beschränktem Maße möglich.
Autologe Endothelzellen können zwar beispielsweise mechanisch durch das "Ausschaben" von Krampfadern oder aus Fettgewebe gewonnen werden. Diese Gewinnungsart ist jedoch nicht bei allen Patienten möglich und bedeutet zudem eine erhebliche Beeinträchtigung des Patienten. Daher wurden alternativ Angioblasten oder Vorläuferzellen von Endothelzellen aus dem peripheren Blut gewonnen (Asahara et al., Science 275: 964 (1997)). Die hierzu notwendige Blutentnahme ist für Patienten zwar wenig belastend, die Isolierung der vermeintlichen Angioblasten aus mononukleären Blutzellen und die Differenzierung dieser Angioblasten zu Endothelzellen ist jedoch sehr aufwendig. So werden aus Blutleukozyten (isoliert mit Hilfe der Dichte- Gradientenzentrifugation) CD34⁺ oder FIk1⁺ mononukleäre Blutzellen durch Immunadsorption an trägergebundene monoklonale Antikörper (spezifisch für CD34 oder FIk-1) angereichert. Nachfolgend werden diese Zellen in Gewebeschalen beschichtet mit Kollagentyp 1 oder Fibronektin für etwa 4 Wochen im Rinderhirn-haltigem Kulturmedium zur Differenzierung in Endothelzellen wie auch zur Vermehrung inkubiert. Die Vermehrung dieser Zellen ist jedoch nur sehr beschränkt möglich. Des weiteren wirft die Inkubation der Endothelzellen mit Hirnsubstanz, z. B. mit Rinderhirn, erhebliche Sicherheitsprobleme auf. - - Die Wanderung der Endothelzellen und die selektive Expression des Transgenes
im gewünschten Zielgebiet ist nicht ausreichend kontrollierbar.
Nach intravaskularer Verabreichung der Endothelzellen lokalisieren diese (wie bereits oben beschrieben) sowohl in Regionen der Angiogenese als auch an und in die ruhende Endothelzellschicht. Des weiteren ist unklar, ob Endothelzellen, die in der Zellkultur aus Vorläuferzellen entstanden sind, sich in vivo nach Injektion wieder in Vorläuferzellen rückdifferenzieren und über den gesamten Organismus verteilen können.
Mit der vorliegenden Erfindung werden nun beide wesentlichen Problembereiche
gelöst.
- A) Die Erfindung besteht in
- 1) einer verbesserten, d. h. einfachen und sicheren Methode zur Isolierung und Kultivierung von Zellen, insbesondere von Endothel- und Vorläuferzellen von Endothelzellen aus dem Blut und anderen zellhaltigen Flüssigkeiten des Körpers.
- 2) in einer zell-, insbesondere endothelzellspezifischen, ggf. pharmakologisch kontrollierbaren Transformation dieser Zellen, so daß mit Hilfe der Zellkultur leicht größere Mengen von solchen Zellen gewonnen werden können.
- 3) der Herstellung von Zellen, insbesondere Endothelzellen, als Vektoren für Effektorgene dergestalt, daß in diese Zellen mindestens ein Effektorgen eingefügt ist, das durch die Wahl geeigneter Promotorsysteme zell-, insbesondere endothelzellspezifisch und ggf. durch Hypoxie, zellzyklusspezifisch und/oder virusspezifisch exprimiert wird.
- 4) der Verabreichung dieser so gewonnenen genetisch veränderten Zellen, insbesondere Endothelzellen zur Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung.
- B) Ein Gegenstand der Erfindung sind daher Zellen zur Anwendung in der Gentheraphie erhältlich durch
- a) Isolierung von Zellen aus dem Blut oder zellhaltigen Flüssigkeiten des Körpers;
- b) Kultivierung der in Schritt a) gewonnenen Zellen in einem Zellkulturmedium enthaltend Ganglioside, Phospholipide, Glykolipide und/oder Wachstumsfaktoren;
- c) Immortalisierung der in Schritt a) oder b) gewonnenen Zellen durch Transformation mit einem Onkogen, Aktivierung eines Onkogens oder Inaktivierung eines Suppressorgenes;
- d) Transfektion der in Schritt c) gewonnenen Zellen mit einem Nukleinsäurekonstrukt für die Gentherapie, enthaltend ein Effektorgen, welches durch geeignete Promotorsysteme zielzellspezifisch, zellzyklusspezifisch, virusspezifisch und/oder durch Hypoxie aktiviert werden kann.
Weitere Gegenstände der Erfindungen, Ausführungsformen der Erfindung sowie
entsprechende Beispiele werden im folgenden beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren der Isolierung von Vorläuferzellen von
Endothelzellen ist in folgende Abschnitte zu zergliedern:
Zellhaltige Körperflüssigkeiten werden mit den dem Fachmann bekannten invasiven Verfahren aus den jeweiligen Organen entnommen. Zu diesen zellhaltigen Körperflüssigkeiten gehören beispielsweise
Zellhaltige Körperflüssigkeiten werden mit den dem Fachmann bekannten invasiven Verfahren aus den jeweiligen Organen entnommen. Zu diesen zellhaltigen Körperflüssigkeiten gehören beispielsweise
- - Blut gewonnen aus Venen, Kapillaren, Arterien oder der Nabelschnur bzw. Plazenta
- - Knochenmarkzellsuspensionen
- - Milzzellsuspensionen
- - Lymphknotenzellsuspensionen
- - Peritonealzellsuspensionen
- - Pleuralzellsuspensionen
- - Lymphe
- - Bindegewebsflüssigkeit (austretend z. B. auf die Oberfläche einer oberflächlich z. B. mechanisch geschädigten Epidermis).
Erythrozyten werden aus diesen Körperflüssigkeiten durch
Dichte-Gradientenzentrifugation entsprechend den dem Fachmann bekannten Methoden
abgetrennt.
Die so isolierten kernhaltigen Zellen werden im Zellkulturmedium suspendiert und
die Suspension wird in Zellkulturschalen eingesät. Nach ≧ 1 Stunde werden die
nichtadhäsierenden Zellen dekantiert und entweder direkt für die Immortalisierung
und/oder Transfektion verwendet oder in ein Zellkulturgefäß gegeben zur weiteren
Vermehrung und Differenzierung. Das Zellkulturgefäß kann beschichtet sein mit
einer Extrazellular-Matrixkomponente (siehe Attachment and Matrix Factors, z. B.
von Fa. Sigma), wie beispielsweise Fibronectin. Dem Zellkulturmedium werden
entweder Ganglioside, Phospholipide und/oder Glykolipide zugegeben oder aber
bevorzugt entsprechend dieser Erfindung
- - β-Endothelial Cell Growth Factor (ECGF, z. B. von Fa. Sigma) und/oder
- - Fibroblast Growth Factor (FGFα, FGFβ, z. B. von Fa. Sigma) und/oder
- - Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF, z. B. von Fa. Sigma) und/oder
- - Endothelial Cell Attachment Factor (ECAF, z. B. von Fa. Sigma)
dem Kulturmedium zugesetzt.
Die nach einer Zeit, ausgewählt zwischen 6 Stunden und 8 Wochen
herangewachsenen Zellen werden erfindungsgemäß weiterbehandelt.
Alternativ zu der erfindungsgemäßen Methode, dargestellt in Abschnitt 3.1.), können
Endothelzellen jedoch auch mit den dem Fachmann bekannten Methoden zum
Beispiel aus Fettgewebe, durch Ausschabung von Venen oder durch Ablösung vom
Nabelschnurendothel gewonnen werden. Ihre Kultivierung erfolgt wie bereits im
Abschnitt 3.1.) beschrieben.
Entsprechend dieser Erfindung wird in eine oder mehrere Endothelzellen eine
Nukleotidsequenz (Komponente a) für ein Protein eingeführt, welches bewirkt daß
diese Endothelzellen fortlaufend den Zellteilungszyklus durchlaufen und damit zu
einer nicht alternden, "permanent" sich teilenden Zellinie werden. Solche
immortalisierenden Nukleotidsequenzen bzw. Gene sind bereits bekannt. Zu diesen
Nukleotidsequenzen gehören beispielsweise Onkogene. Entsprechend dieser
Erfindung können die Onkogene zellulären oder viralen Ursprungs sein. Beispiele
für zelluläre Onkogene wurden bereits von Wynford-Thomas, J. Pathol. 165: 187
(1991); Harrington et al., Curr. Opin. Genet. Developm. 4: 120 (1994); Gonos et al.,
Anticancer Res. 13: 1117 (1993) und Baserga et al., Cancer Surveys 16: 201 (1993)
übersichtlich dargestellt.
Derartige Onkogene können in die Zelle mit dem Fachmann bekannten Methoden
eingeführt werden. Zellen tragen in ihrem Genom jedoch auch Protoonkogene,
welche entsprechend dieser Erfindung in der Zelle mit dem Fachmann bekannten
Methoden aktiviert, d. h. in Onkogene verwandelt werden können.
In einer besonderen Ausführungsform dieser Erfindung stellt die Komponente a)
eine Nukleotidsequenz dar, welche ein Protein kodiert, das das Protein eines
Suppressorgenes inaktiviert.
Beispiele für Suppressorgene sind bereits übersichtlich dargestellt worden von Karp
und Broder, Nature Med. 4: 309 (1995); Skuse und Ludlow, The Lancet 345: 902
(1995); Duan et al., Science 269: 1402 (1995); Hugnh et al., Cancer Res. 55: 2225
(1995); Knudson, PNAS USA 90: 10914 (1993)).
Beispiele für ein Gen (Komponente a), das für ein Protein kodiert, welches das
Expressionsprodukt eines Suppressorgenes inaktiviert:
Protein des Suppressorgenes | |
erfindungsgemäßes Gen (Komponente a) kodierend für: | |
Retinoblastomprotein (Rb-Protein) und verwandte Proteine, wie p107 und p130 | - E1A-Protein des Adenovirus (Whyte et al., Nature 334: 124 (1988)) |
- Large T-Antigen des SV40 Virus (De Caprio et al., Cell 54: 275 (1988)) | |
- E7-Protein des Pappilomavirus (z. B. HPV-16, HPV-18) (Dyson et al., Science 243: 934 (1989)) | |
- ein Protein enthaltend die Aminosäuresequenz LXDXLXXL-II-LXCXEXXXXXSDDE (SEQ ID NO.: 1), bei welcher x eine variable Aminosäure und -II-, eine beliebige Aminosäurekette von 7-80 Aminosäuren darstellen (ausgewählt aus den 20 natürlichen, in Translationsprodukten vorkommenden Aminosäuren; Münger et al., Cancer Surveys 12: 197 (1992)) | |
p53 | - E1B-Protein des Adenovirus (Sarnow et al., Cell 28: 287 (1982)) |
- Large T-Antigen des SV40 Virus (Lane et al., Nature 278: 261 (1979)) | |
- E6-Protein des Papillomavirus (e.g., HPV-16, HPV-18) (Werness et al., Science 248: 76 (1990); Scheffner et al., Cell 63: 1129 (1990)) | |
- MDM-2-Protein (Momand et al., Cell 69: 1237 (1992); Oliner et al., Nature 362: 857 (1993); Kussie et al., Science 274: 948 (1996)) |
In einer weiteren besonderen Ausführungsform dieser Erfindung stellt die
Komponente a) eine mutierte Nukleotidsequenz für ein Protein der
Zellzyklusregulation dar, das durch die Mutation so verändert ist, daß es zwar noch
voll den Zellzyklus aktivieren kann, aber in dieser Funktion nicht mehr durch
zelluläre Inhibitoren inhibierbar ist. Im Sinne dieser Erfindung gehören hierzu
mutierte Nukleotidsequenzen kodierend für Cyclin-abhängige Kinasen, welche trotz
der Mutation ihre Kinaseaktivität beibehalten, aber die Bindefähigkeit an die
zellulären cdk-Inhibitoren verloren haben.
Beispiele für die Komponente a) sind:
- - cdk-4 derartig mutiert, daß p16, p15 und/oder p21 nicht mehr inhibieren können
- - cdk-6 derartig mutiert, daß p15 und/oder p18 nicht mehr inhibieren können
- - cdk-2 derartig mutiert, daß p21 und/oder p27 und/oder WAF-1 nicht mehr inhibieren können.
Beispielsweise kann die Mutation des cdk4 den Austausch eines Arginins durch ein
Cystein in der Position 24 darstellen, so daß dieses mutierte cdk-4 Kinaseaktivität
aufweist, aber durch p15 und p16 nicht mehr inhibierbar ist (Wölfel et al., Science
269: 1281 (1995)).
In einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung stellt die Komponente a) ein
transformierendes Gen dar, dessen Expression von einem selbstverstärkenden
Promotorelement, ggf. in Kombination mit einem pharmakologisch kontrollierbaren
Promotor (siehe hierzu Abschnitt 6.4), reguliert wird.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform dieser Erfindung wird in die
Endothelzellen, besonders aber auch in die Vorläuferzellen von Endothelzellen oder
in Zellen eines Zellgemisches, das einen Anteil an Endothelzellen oder
Vorläuferzellen von Endothelzellen enthält, eine Nukleotidsequenz eingefügt,
welche besteht aus einer endothelzellspezifischen Promotor- oder
Enhancersequenz (Komponente b) und der Komponente a), wobei die Transkription
der Komponente a) durch Bindung von Transkriptionsfaktoren der Endothelzelle an
die Komponente b) aktiviert wird.
Zum besseren Verbleib des Expressionsproduktes der Komponente a) im Zellkern
kann an die Komponente a) ein nukleäres Lokalisations-Signal angefügt werden
(Komponente c). Die hieraus resultierende Anordnung der Komponenten ist
beispielhaft in Fig. 1 dargestellt.
Durch Einführung eines Nukleinsäurekonstruktes, enthaltend die in Fig. 1
dargestellten Komponenten, werden nur Endothelzellen und Vorläufer von
Endothelzellen enthalten in einem heterogenen Zellgemisch in ein immortalisiertes
Stadium, d. h. in sich permanent teilende Zellen, überführt, so daß nach wenigen
Tagen diese Endothelzellen anteilsmäßig in der Zellkultur dominieren und nach
einer von den Kultivierungsbedingungen abhängigen, jedoch überschaubaren Zeit
ausschließlich in der Zellkultur vorhanden sind.
Mit diesen erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten und Verfahren können
somit in einer relativ kurzen Zeit mit geringem Aufwand auch aus wenigen
Endothelzellen oder aus wenigen Vorläuferzellen von Endothelzellen auch dann,
wenn sie in einem heterogenen Zellgemisch vorliegen, große Mengen einheitlicher
Endothelzellen für die Prophylaxe oder Therapie hergestellt werden.
Entsprechend der Erfindung ist in die Endothelzellen ein Nukleinsäurekonstrukt
einzuführen, welches mindestens folgende Komponenten enthält:
- - einen Promotor (Komponente d)
- - ein Strukturgen kodierend für einen Wirkstoff oder ein Enzym (Komponente e)
Im Sinne der Erfindung sind als Promotorsequenzen Nukleotidsequenzen zu
verwenden, welche nach Bindung von Transkriptionsfaktoren die Transkription
eines am 3'-Ende benachbart gelegenen Transgenes, wie beispielsweise eines
Strukturgenes, aktivieren. Im Sinne der Erfindung wird in die Endothelzelle
mindestens eine endothelzellspezifische Promotorsequenz (Komponente b)
und/oder Komponente d) eingefügt. Diese endothelzellspezifische Promotorsequenz
kann mit mindestens einer weiteren Promotorsequenz kombiniert werden. Die Wahl
der mit dem endothelzellspezifischen Promotor zu kombinierenden
Promotorsequenz(en) richtet sich nach der zu behandelnden Erkrankung. So kann
die zusätzliche Promotorsequenz uneingeschränkt, endothelzellspezifisch, unter
bestimmten metabolischen Bedingungen, wie beispielsweise durch Hypoxie
induzierbar oder durch ein Pharmakon induzierbar oder abschaltbar, virusspezifisch
und/oder zellzyklusspezifisch aktivierbar sein. Derartige Promotoren wurden bereits
in den Patentanmeldungen EP 95931204.2; EP 95930524.4; EP 95931205.9;
EP 95931933.6; EP 96110962.2; DE 197 04 301.1 EP 97101507.8; EP 97102547.3;
DE 197 10 643.9 und EP 97110995.8 aufgeführt. Auf diese Patentanmeldungen wird
Bezug genommen. Zu den auszuwählenden Promotorsequenzen gehören
beispielsweise
wie beispielsweise
- - der Promotor der RNA-Polymerase III
- - der Promotor der RNA-Polymerase II
- - der CMV-Promotor und -Enhancer
- - der SV40 Promotor
Wie beispielsweise der durch Hypoxie induzierbare Enhancer (Semenza et al.
PNAS 88: 5680 (1991), McBurneyetal., Nucl. Acids Res. 19: 5755 (1991)).
Solche sind beispielsweise der Promotor des cdc25B Gens, des cdc25C Gens, des
Cyclin A Gens, des cdc2 Gens, des B-myb Gens, des DHFR-Gens, des E2F-1 Gens
oder aber Bindesequenzen für während der Zellproliferation auftretende oder
aktivierte Transkriptionsfaktoren. Zu diesen Bindesequenzen gehören
beispielsweise Bindesequenzen für c-myc-Proteine. Zu diesen Bindesequenzen
sind Monomere oder Multimere der als Myc E-Box bezeichneten Nukleotidsequenz
(5'-GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3' (SEQ ID NO.: 2); Blackwood and
Eisenmann, Science 251: 1211 (1991)) zu zählen.
Im einfachsten Falle kann bei der Kombination von gleichen oder unterschiedlichen
Promotoren ein Promotor induzierbar sein, beispielsweise in Form eines durch
Tetrazyklin aktivierbaren bzw. abschaltbaren Promotors in Form des Tetracyclin-
Operators in Kombination mit einem entsprechenden Repressor.
Entsprechend der Erfindung kann der Promotor jedoch auch selbstverstärkend sein
mit oder auch ohne einer pharmakologisch kontrollierbaren Promotoreinheit.
Derartige selbstverstärkende und/oder pharmakologisch kontrollierbare Promotoren
wurden bereits in der Patentanmeldung DE 196 51 443.6 beschrieben, auf welche
ausdrücklich Bezug genommen wird.
Hierzu zählen Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder
Enhancern von solchen Genen, die für Proteine bevorzugt gebildet in
Endothelzellen kodieren.
Im Sinne der Erfindung sind Promotoren der Gene für folgende Proteine
beispielsweise zu verwenden:
- - Hirnspezifischer, endothelialer Glucose-1-Transporter
- - Endoglin
- - VEGF-Rezeptor-1 (flt-1)
- - VEGF-Rezeptor-2 (flk-1, KDR)
- - til-1 oder til-2
- - B61-Rezeptor (Eck-Rezeptor)
- - B61
- - Endothelin, im speziellen Endothelin B oder Endothelin-1
- - Endothelin-Rezeptoren, insbesondere der Endothel in B-Rezeptor
- - Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren
- - von Willebrand Faktor
- - IL-1α, IL-1β
- - IL-1-Rezeptor
- - Vascular Cell Adhesion Molecule (VCAM-1)
- - Interstitial Cell Adhesion Molecule (LCAM-3)
- - synthetische Aktivatorsequenzen Als Alternative zu natürlichen endothelzellspezifischen Promotoren lassen sich auch synthetische Aktivatorsequenzen verwenden, die aus oligomerisierten Bindestellen für Transkriptionsfaktoren, die preferentiell oder selektiv in Endothelzellen aktiv sind, bestehen. Ein Beispiel hierfür ist der Transkriptionsfaktor GATA-2, dessen Bindestelle im Endothelin-1 Gen 5'- TTATCT-3' ist (Lee et al., Biol. Chem. 16188 (1991), Dormann et al., J. Biol. Chem. 1279 (1992) und Wilson et al., Mol. Cell Biol. 4854 (1990).
Die Kombination von gleichen Promotoren erfolgt beispielsweise durch
hintereinander Verknüpfung von mehreren Promotoren in der Leserichtung von 5'
nach 3' der Nukleotidsequenz.
Zur Kombination von gleichen oder unterschiedlichen Promotoren werden
bevorzugterweise jedoch Technologien eingesetzt, welche bereits in den
Patentanmeldungen GB 9417366.3; EP 97101507.8; EP 97102547.3; DE 197 10 643.9;
DE 196 17 851.7; DE 196 39 103.2 und DE 196 51 443.6 im Detail beschrieben wurden.
Auf diese Patentanmeldungen wird im Rahmen dieser Erfindung ausdrücklich Bezug
genommen. Beispiele für derartige Technologien sind
Ein chimärer Promotor stellt die Kombination einer stromaufwärtsgelegenen
zellspezifisch, metabolisch oder virusspezifisch aktivierbaren Aktivatorsequenz mit
einem stromabwärts gelegenen Promotormodul dar, welches die Nukleotidsequenz
CDE-CHR oder E2FBS-CHR enthält, an welche suppressive Proteine binden, die
hierdurch die Aktivierung der stromaufwärts gelegenen Aktivatorsequenz in G0- und
G1-Phase des Zellzyklus hemmen können (GB 9417366.3; Lucibello et al., EMBO J.,
12 (1994)).
Weiterführende Untersuchungen zur Funktionsweise, insbesondere des
Promotorelementes CDE-CHR, ergaben, daß die durch das CDE-CHR Element
zellzyklusabhängige Regulation einer stromaufwärts gelegenen Aktivatorsequenz
weitgehend davon abhängig ist, daß die Aktivierungssequenz von
Transkriptionsfaktoren mit glutaminreichen Aktivierungsdomänen aktiviert wird
(Zwicker et al., Nucl. Acids Res., 3822 (1995)).
Zu derartigen Transkriptionsfaktoren gehört beispielsweise Sp1 und NF-Y.
Dieses schränkt konsequenterweise die Verwendung des Promotorelementes CDE-
CHR für chimäre Promotoren ein. Gleiches ist für das Promotorelement E2F-BS-
CHB des B-myb Genes anzunehmen (Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 23, 3822
(1995)).
Die hybriden Promotoren sind in der Patentanmeldung DE 196 39 103.2 bereits
beschrieben worden. Für die Kombination des endothelzellspezifischen Promotors
mit mindestens einem weiteren Promotor wird beispielsweise ein Genkonstrukt
gewählt, welches insgesamt die folgenden Komponenten enthält:
Die Nukleotidsequenz des endothelzellspezifischen Promotors in einer Form, bei welcher mindestens eine Bindestelle für einen Transkriptionsfaktor mutiert ist. Durch diese Mutation wird die Initiation der Transkription des Effektorgenes blockiert.
Die Nukleotidsequenz des endothelzellspezifischen Promotors in einer Form, bei welcher mindestens eine Bindestelle für einen Transkriptionsfaktor mutiert ist. Durch diese Mutation wird die Initiation der Transkription des Effektorgenes blockiert.
Ein Transgen, das als Effektorgen für einen Wirkstoff kodiert.
Mindestens eine weitere unspezifisch, zellspezifisch, virusspezifisch, durch
Tetrazykl in und/oder zellzyklusspezifisch aktivierbare Promotor- oder
Enhancersequenz, welche die Transkription mindestens eines Genes für
mindestens einen Transkriptionsfaktor aktiviert, welcher derartig mutiert ist, daß er
an die mutierte(n) Bindestelle(n) in dem endothelzellspezifischen Promotor binden
und diesen aktiveren kann.
In einer beispielhaften Ausführungsform dieser Erfindung kann die Mutation in der
Promotorsequenz z. B. eine Mutation der TATA-Box des cdc25B Promotors
darstellen.
Die Mutation der TATA kann beispielsweise TGTATAA sein. Durch diese Mutation
wird die DNA-Bindungsstelle des normalen TATA-Box bindenden Proteins (TBP)
nicht mehr erkannt und das Effektorgen kann nicht mehr effizient transkribiert
werden. Entsprechend muß die Nukleinsäuresequenz, welche für das TBP kodiert,
eine Kommutation aufweisen. Durch diese Kommutation bindet das TBP an die
mutierte TATA-Box (z. B. an TGTATAA) und führt damit zur effizienten Transkription
des Effektorgenes. Derartige Kommutationen des TBP-Genes sind beispielsweise
von Strubin und Struhl (Cell, 721 (1992)) und von Heard et al. (EMBO J., 3519
(1993)) beschrieben worden.
Diese Technologie ist in der Patentanmeldung DE 196 17 851.7 bereits ausführlich
beschrieben worden. Auf diese Patentanmeldung wird Bezug genommen.
Ein derartiger Promotor enthält erfindungsgemäß folgende Komponenten:
- - eine erste endothelzellspezifische, aktivierbare Promotor- oder Enhancersequenz, die die basale Transkription eines Transgens aktiviert
- - ein Transgen, das als Effektorgen für einen Wirkstoff kodiert
- - ein nukleäres Retentions-Signal (NRS), dessen cDNA am 5'-Ende mit dem 3'- Ende des Strukturgenes (b) mittelbar oder unmittelbar verknüpft ist.
- - Bevorzugterweise hat das Transkriptionsprodukt des nukleären Retentions- Signals eine Bindestruktur für einen nukleären Export-Faktor.
- - Eine weitere unspezifische, zellspezifische, virusspezifische, metabolisch und/oder zellzyklusspezifisch aktivierbare Promotor- oder Enhancersequenz, welche die basale Transkription eines nukleären Export-Faktors aktiviert
- - eine Nukleinsäure kodierend für einen nukleären Export-Faktor (NEF), der an das Transkriptionsprodukt des nukleären Retentions-Signals bindet und hierdurch den Transport des Transkriptionsproduktes des Transgenes aus dem Zellkern vermittelt.
Bevorzugt wird das Gen kodierend für das nukleäre Retentions-Signal ausgewählt
aus der Gruppe umfassend das Rev- responsive Element (RRE) von HIV-1 oder
HIV-2, das RRE-äquivalente Retentions-Signal von Retroviren oder das RRE-
äquivalente Retentions-Signal des HBV.
Der nukleare Export-Faktor ist bevorzugterweise ein Gen ausgewählt aus der
Gruppe umfassend das Rev-Gen der Viren HIV-1, HIV-2, Visna-Maidi Virus, Caprine
arthritis encephalitis Virus, das Virus der infektiösen Anämie des Pferdes, das
Immundefizienzvirus der Katze, von Retroviren, von HTLV oder das Gen des
hnRNP-A1-Proteins oder das Gen des Tanskriptionsfaktors TFIII-A.
Aktivator-responsive Promotoreinheiten sind in der Patentanmeldung
DE 196 17 851.7 bereits im Detail beschrieben worden. Auf diese Patentanmeldung
wird Bezug genommen.
Eine Aktivator-responsive Promotoreinheit besteht aus folgenden Komponenten:
- - eine oder mehrere gleiche oder unterschiedliche Promotor- oder Enhancersequenz(en), die beispielsweise zellzyklusspezifisch, zellproliferationsabhängig, metabolisch, endothelzellspezifisch oder virusspezifisch oder sowohl zellzyklusspezifisch als auch metabolisch, endothelzellspezifisch oder virusspezifisch (sogenannte chimäre Promotoren) aktivierbar ist bzw. sind
- - eine oder mehrere gleiche oder unterschiedliche Aktivatorsubeinheit(en), welche jeweils stromabwärts von den Promotor- oder Enhancersequenzen gelegen und durch diese in ihrer basalen Transkription aktiviert wird bzw. werden
- - einen Aktivator-responsiven Promotor, welcher durch die Expressionsprodukte von einer oder mehreren Aktivatorsubeinheit(en) aktiviert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform können erfindungsgemäße
Aktivatorresponsive Promotoreinheiten Bindesequenzen für chimäre
Transkriptionsfaktoren aus DNA-Bindungsdomänen, Protein-
Proteininteraktionsdomänen und Transaktivierungsdomänen darstellen. Alle in der
Anmeldung genannten Transkriptionsfaktorbindungsstellen können einfach
(Monomere) oder in mehreren Kopien (Multimere beispielsweise bis zu 10 Kopien)
vorliegen.
Ein Beispiel für einen Aktivator-responsiven Promotor aktiviert durch zwei
Aktivatorsubeinheiten stellt der LexA-Operator in Verbindung mit dem SV40-
Promotor dar.
- - Die erste Aktivatorsubeinheit umfaßt die cDNA für das LexA-DNA-Bindeprotein kodierend für die Aminosäuren 1-81 oder 1-202, deren 3'-Ende verknüpft ist mit dem 5'-Ende der cDNA für das Gal80-Protein (Aminosäuren 1-435).
- - Die zweiter Aktivatorsubeinheit umfaßt die cDNA der Gal80-Bindungsdomäne des Gal4-Proteins kodierend für die Aminosäuren 851-881, deren 3'-Ende verknüpft ist mit dem 5'-Ende der cDNA des SV40 large T-Antigens kodierend für die Aminosäuren 126-132, deren 3'-Ende verknüpft ist mit dem 5'-Ende der cDNA für die Transaktivierungsdomäne des VP16 von HSV-1 kodierend für die Aminosäuren 406-488.
Ein weiteres Beispiel für einen Aktivator-responsiven Promotor aktiviert durch zwei
Aktivatorsubeinheiten stellt die Bindesequenz für das Gal4-Protein in Verbindung
mit dem SV40-Promotor dar.
- - Die erste Aktivierungseinheit umfaßt die cDNA für die DNA-Bindedomäne des Gal4-Proteins (Aminosäuren 1-147), deren 3'-Ende verknüpft ist mit dem 5'-Ende der cDNA für das Gal80-Protein (Aminosäuren 1-435).
- - Die zweite Aktivierungssubeinheit umfaßt die cDNA für die Gal80- Bindungsdomäne von Gal4 (Aminosäuren 851-881), deren 3'-Ende verknüpft ist mit dem 5'-Ende der cDNA des nukleären Lokalisationssignals von SV40 (SV40 large T; Aminosäuren 126-132), deren 3'-Ende verknüpft ist mit dem 5'-Ende der cDNA für die Transaktivierungsdomäne des VP16 von HSV-1 kodierend für die Aminosäuren 406-488.
Ein weiteres Beispiel für zwei Aktivatorsubeinheiten, die den Aktivator-responsiven
Promotor, bestehend aus der Bindesequenz für das Gal4-Protein und dem SV40-
Promotor, aktivieren, stellt dar
- - eine erste Aktivierungseinheit, die die cDNA für die zytoplasmische Domäne des CD4-T-Zellantigens (Aminosäuren 397-435) umfaßt deren 5'-Ende verknüpft ist mit dem 3'-Ende der cDNA für die Transaktivierungsdomäne des VP16 von HSV- 1 (Aminosäuren 406-488), deren 5'-Ende wiederum verknüpft ist mit dem 3'-Ende der cDNA des nukleären Lokalisationssignals von SV40 (SV40 large T; Aminosäuren 16-132) und
- - die zweiter Aktivierungseinheit umfassend die cDNA des nukleären Lokalisationssignals von SV40 (SV40 large T; Aminosäuren 126-132), die cDNA für die DNA Bindedomäne des Gal4-Proteins (Aminosäuren 1-147), deren 3'- Ende verknüpft ist mit dem 5'-Ende der cDNA für die CD4 Bindesequenz des p56 Ick Proteins (Aminosäuren 1-71).
Im Sinne der Erfindung enthält die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz mindestens
ein Effektorgen (Komponente e), welches für einen pharmakologisch aktiven
Wirkstoff kodiert zur Prophylaxe und/oder Therapie einer Erkrankung. Dieser
Wirkstoff ist ausgewählt aus einer Gruppe umfassend Cytokine,
Wachstumsfaktoren, Antikörper oder Antikörperfragmente, Rezeptoren für Cytokine
oder Wachstumsfaktoren, antiproliferativ, apoptotisch oder zytostatisch wirkende
Proteine, Angiogeneseinhibitoren, Gerinnungshemmer, fibrinolytisch wirkende
Substanzen, Plasmaproteine, Komplement-aktivierende Proteine, Peptidhormone,
Virushüllproteine, bakterielle Antigene und parasitäre Antigene, auf den
Blutkreislauf wirkende Proteine und Ribozyme.
Bevorzugterweise handelt es sich bei dem Transgen um ein Strukturgen, das für ein
Ribozym kodiert, welches die mRNA inaktiviert, welche kodiert für ein Protein
ausgewählt aus der Gruppe umfassend Zellzykluskontrollproteine, insbesondere
Cyclin A, Cyclin B, Cyclin D1, Cyclin E, E2F1-5, cdc2, cdc25C oder DP1 oder
Virusproteine oder Cytokine oder Wachstumsfaktoren oder deren Rezeptoren.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Effektorgen für ein Enzym kodieren,
welches eine Vorstufe eines Pharmakons in ein Pharmakon spaltet.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Effektorgen für ein Ligand-
Effektorfusionsprotein kodieren, wobei der Ligand ein Antikörper, ein
Antikörperfragment, ein Cytokin, ein Wachstumsfaktor, ein Adhäsionsmolekül oder
ein Peptidhormon sein kann und der Effektor ein wie oben beschriebener
pharmakologisch aktiver Wirkstoff oder ein Enzym. Beispielsweise kann das
Strukturgen ein Ligand-Enzymfusionsprotein kodieren, wobei das Enzym eine
Vorstufe eines Pharmakons in ein Pharmakon spaltet und der Ligand an eine
Zelloberfläche bindet, bevorzugt an Endothelzellen oder Tumorzellen.
Im Sinne der Erfindung richtet sich die Auswahl des Effektorgenes und des ggf. mit
dem endothelzellspezifischen Promotor zu kombinierenden weiteren
Promotorelementes nach Art der Prophylaxe und/oder Therapie der jeweiligen
Erkrankung.
Beispielsweise sind bei folgenden Erkrankungen folgende Kombinationen von
Promotorsequenzen und Effektorgenen zu wählen (eine detaillierte Beschreibung
erfolgte bereits in den Patentanmeldungen EP 97101507.8; EP 97102547.3;
DE 197 10 643.9; DE 197704301.1; DE 196 17 851.7; DE 196 39 103.2; DE 196 51 443.6;
EP 95931204.2; EP 95930524.4; EP 95931205.9; EP 95931933.6 und DE 197 01 141.1,
auf die Bezug genommen wird).
8.1.1.) zusätzliche Promotoren:
- - unspezifisch und/oder
- - zellzyklusspezifisch und/oder
- - metabolisch aktivierbar
8.1.2.) Effektorgene für Inhibitoren der Zellproliferation, zum Beispiel für
- - das Retinoblastomprotein (pRb=p110) oder die verwandten p107 und p130 Proteine
- - Das Retinoblastomprotein (pRb/p110) und die verwandten p107 und
p130 Proteine werden durch Phosphorylierung inaktiviert. Bevorzugt sind
solche Gene dieser Zellzyklusinhibitoren zu verwenden, welche
Mutationen für die Inaktivierungsstellen der exprimierten Proteine
aufweisen, ohne daß diese hierdurch in ihrer Funktion beeinträchtigt
werden. Beispiele für diese Mutationen wurden beschrieben für das p110.
In analoger Weise wird die DNA-Sequenz für das p107 Protein oder das p130 Protein mutiert. - - das p53 Protein
- - Das Protein p53 wird in der Zelle inaktiviert entweder durch Bindung an spezielle Proteine, wie beispielsweise MDM2, oder durch Oligomerisierung des p53 über das dephosphorylierte C-terminale Serin. Bevorzugt wird somit eine DNA-Sequenz für ein p53 Protein verwendet, welches C-terminal verkürzt ist um das Serin 392.
- - das p21 (WAF-1)
- - das p16 Protein
- - andere cdk-Inhibitoren
- - das GADD45 Protein
- - das bak Protein
8.1.3.) Effektorgene für Gerinnung induzierende Faktoren und
Angiogeneseinhibitoren, zum Beispiel:
- - Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1)
- - PAI-2
- - PAI-3
- - Angiostatin
- - Interferone (IFNα, IFNβ oder IFNγ)
- - Platelet factor 4
- - TlMP-1
- - TlMP-2
- - TIMP-3
- - Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
- - Tissue Factor (TF) und dessen gerinnungsaktive Fragmente
- - Faktor X oder Mutationen von Faktor X entsprechend der Patentanmeldung D19701141.1, auf welche ausdrücklich Bezug genommen wird.
8.1.4.) Effektorgene für zytostatische und zytotoxische Proteine, zum Beispiel für
- - Perforin
- - Granzym
- - IL-2
- - IL4
- - IL-12
- - Interferone, wie beispielsweise IFNα, IFNβ oder IFNγ
- - TNF, wie TNFα oder TNFβ
- - Oncostatin M
- - Sphingomyelinase
- - Magainin und Magainin-Derivate
8.1.5.) Effektorgene für zytostatische oder zytotoxische Antikörper und für
Fusionsproteine zwischen antigenbindenden Antikörperfragmenten mit
zytostatischen, zytotoxischen oder entzündungserregenden Proteinen oder
Enzymen.
- - Zu den zytostatischen oder zytotoxischen Antikörpern gehören solche gerichtet gegen Membranstrukturen von Endothelzellen wie sie beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac. Ther 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) und Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)) beschrieben wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-Rezeptoren.
- - Des weiteren gehören hierzu zytostatische oder zytotoxische Antikörper gerichtet gegen Membranstrukturen auf Tumorzellen. Derartige Antikörper wurden zum Beispiel von Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und Contrib. to Oncol 43 Karger Verlag, München (1992) übersichtlich dargestellt. Weitere Beispiele stellen dar Antikörper gegen Sialyl Lewis; gegen Peptide auf Tumoren, welche von T-Zellen erkannt werden; gegen von Onkogenen exprimierte Proteine; gegen Ganglioside wie GD3, GD2, GM2, 9-0-acetyl GD3, Fucosyl GM1; gegen Blutgruppenantigene und deren Vorläufer; gegen Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin; gegen Antigene auf Heat Shock Proteinen
- - Des weiteren gehören hierzu gehören Antikörper gerichtet gegen
Membranstrukturen von Leukämiezellen. Eine große Anzahl derartiger
monoklonaler Antikörper sind bereits für diagnostische und
therapeutische Verfahren beschrieben worden (Übersichten bei
Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994); Schranz, Therapia
Hungarica 38, 3 (1990); Drexler et al., Leuk. Res 10, 279 (1986); Naeim,
Dis. Markers 7, 1 (1989); Stickney et al., Curr. Opin. Oncol 4, 847 (1992);
Drexler et al., Blut 57, 327 (1988); Freedman et al., Cancer Invest 9, 69
(1991)). Je nach Typ der Leukämie sind als Liganden beispielsweise
monoklonalen Antikörper oder deren antigenbindende
Antikörperfragmente gerichtet gegen folgende Membranantigene
geeignet:
Tabelle 2 Zellen Membranantigen AML CD13 CD15@ CD33@ CAMAL@ Sialosyl-Le@ B-CLL CD5 CD1c@ CD23@ Idiotypen und Isotypen der Membranimmunglobuline@ I-CLL CD33 M38@ IL-2-Rezeptoren@ T-Zell-Rezeptoren@ ALL CALLA CD19@ Non-Hodgkin Lymphoma - - Die Humanisierung muriner Antikörper, die Herstellung und Optimierung der Gene für Fab und rek. Fv Fragmente erfolgt entsprechend der dem Fachmann bekannten Technik (Winter et al., Nature 349, 293 (1991); Hoogenbooms et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol 36, 19 (1993); Girol. Mol. Immunol 28, 1379 (1991) oder Huston et al., Intern. Rev. Immunol. 10, 195 (1993). Die Fusion der rek. Fv-Fragmente mit Genen für zytostatische, zytotoxische oder entzündungserregende Proteinen oder Enzymen erfolgt gleichermaßen entsprechend dem dem Fachmann bekannten Stand der Technik.
8.1.6.) Effektorgene für Fusionsproteine von weiteren Endothelzell- oder
Tumorzellbindenden Liganden mit zytostatischen und zytotoxischen
Proteinen oder Enzymen. Zu den Liganden gehören zum Beispiel alle
Substanzen, welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf
Endothelzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu
- - Antikörper oder Antikörperfragmente
- - Cytokine wie beispielsweise IL-1 oder Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch Endothelzellen binden, wie beispielsweise PDGF, bFGF, VEGF, TGF.
- - Des weiteren gehören hierzu Adhäsionsmoleküle, welche an aktivierte und/oder proliferierende Endothelzellen binden. Hierzu gehören beispielsweise SLex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1, VLA-4 oder Vitronectin.
- - Hierzu gehören des weiteren Substanzen, welche an Membranstrukturen
oder Membranrezeptoren von Tumor- oder Leukämiezellen binden.
Beispielsweise gehören hierzu Wachstumsfaktoren oder deren
Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert
durch Leukämiezellen oder Tumorzellen binden.
Derartige Wachstumsfaktoren wurden bereits beschrieben (Übersichten bei Gross et al., Gell 64, 271 (1991), Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994), Moore, Glin. Gancer Res. 1, 3 (1995), Van Kooten et al., Leuk. Lymph 12 27 (1993)). - - Die Fusion der Gene dieser an die Zielzelle bindenden Liganden mit zytostatischen, zytotoxischen oder entzündungserregenden Proteinen oder Enzymen erfolgt entsprechend dem Stand der Technik mit den dem Fachmann bekannten Methoden.
8.1.7.) Effektorgene für lnduktoren von Entzündungen, zum Beispiel für
- - IL-1
- - II-2
- - RANTES (MGP-2)
- - monocyte chemotactic and activating factor (MGAF)
- - II-8
- - macrophage inflammatory protein-1 (MlP-1α, -β)
- - neutrophil activating protein-2 (NAP-2)
- - IL-3
- - IL-5
- - human Ieukemia inhibitory factor (LIF)
- - IL-7
- - IL-5
- - Eotaxin
- - IL-13
- - GM-CSF
- - G-CSF
- - M-CSF
- - Cobra venum factor (CVF) oder Teilsequenzen vom CVF, welchem dem menschlichen Komplementfaktor C3b funktionell entsprechen, d. h. welche an den Komplementfaktor B binden können und nach Spaltung durch den Faktor D eine C3 Konvertase darstellen
- - der menschliche Komplementfaktor C3 oder seine Teilsequenz C3b
- - Spaltprodukte des menschlichen Komplementfaktors C3, welche funktionell und strukturell dem CVF ähneln
- - bakterielle Proteine, welche Komplement aktivieren oder Entzündungen auslösen, wie beispielsweise Porine von Salmonella typhi murium "clumping" Faktoren von Staphylococcus aureus, Moduline besonders von gram-negativen Bakterien, "Major outer membrane protein" von Legionellen oder von Haemophilus influenza Typ B oder von Klebsiellen oder M-Moleküle von Streptokokken Gruppe G.
8.1.8.) Effektorgene für Enzyme für die Aktivierung von Vorstufen von Zytostatika,
zum Beispiel für Enzyme, welche inaktive Vorsubstanzen (Prodrugs) in
aktive Zytostatika (Drugs) spalten.
Derartige Substanzen und die jeweils zugehörigen Prodrugs und Drugs sind bereits
von Deonarain et al. (Br. J. Cancer 70, 786 (1994)), Mullen, Pharmac. Ther. 63, 199
(1994)) und Harris et al. (Gene Ther. 1, 170 (1994)) übersichtlich beschrieben
worden. Beispielsweise ist die DNA-Sequenz eines der folgenden Enzyme zu
verwenden:
- - Herpes Simplex Virus thymidinkinase
- - Varizella Zoster Virus Thymidinkinase
- - bakterielle Nitroreduktase
- - bakterielle β-Glucuronidase
- - pflanzliche β-Glucuronidase aus Secale cereale
- - humane β-Glucuronidase
- - humane Carboxy peptidase (CB) zum Beispiel CB-A der Mastzelle, CB-B des Pankreas oder bakterielle Carboxy peptidase
- - bakterielle β-Laktamase
- - bakterielle Cytosine deaminase
- - humane Catalase bzw. Peroxidase
- - Phosphatase, im besonderen humane alkalische Phosphatase, humane saure Prostataphosphatase oder Typ 5 saure Phosphatase
- - Oxidase, im besonderen humane Lysyloxidase oder humane saure D- aminooxidase
- - Peroxidase, im besonderen humane Gluthation Peroxidase, humane Eosinophilen Peroxidase oder humane Schilddrüsen Peroxidase
- - Galaktosidase
8.2.1.) zusätzliche Promotoren:
- - unspezifisch und/oder
- - zellzyklusspezifisch und/oder
- - metabolisch aktivierbar
8.2.2.) Effektorgene für die Therapie von Allergien, zum Beispiel für
- - IFNβ
- - IFNγ
- - IL-10
- - Antikörper bzw. Antikörperfragmente gegen IL-4
- - lösliche IL-4-Rezeptoren
- - IL-12
- - TGFβ
8.2.3.) Effektorgene für die Verhinderung der Abstoßung von transplantierten
Organen, zum Beispiel für
- - IL-10
- - TGFβ
- - lösliche IL-1-Rezeptoren
- - lösliche IL-2-Rezeptoren
- - IL-1 -Rezeptorantagonisten
- - lösliche IL-6-Rezeptoren
- - immunsuppressive Antikörper oder deren VH und VL enthaltende Fragmente oder deren über einen Linker verbundene VH- und VL- Fragmente. Immunsuppressive Antikörper sind beispielsweise Antikörper spezifisch für den T-Zell-Rezeptor oder seinen CD3-Komplex, gegen CD4 oder CD8 des weiteren gegen den IL-2-Rezeptor, IL-1-Rezeptor oder IL- 4-Rezeptor oder gegen die Adhäsionsmoleküle CD2, LFA-1, CD28 oder CD40
8.2.4.) Effektorgene für die Therapie von Antikörper-mediierten
Autoimmunerkrankungen, zum Beispiel für
- - TGFβ
- - IFNα
- - IFNβ
- - IFNγ
- - IL-12
- - lösliche IL-4-Rezeptoren
- - lösliche IL-6-Rezeptoren
- - immunsuppressive Antikörper oder dessen VH und VL-enthaltende Fragmente
8.2.5.) Effektorgene für die Therapie von Zell-mediierten Autoimmunerkrankungen,
zum Beispiel für
- - IL-6
- - IL-9
- - IL-10
- - IL-13
- - TNFα oder TNFβ
- - einen immunsuppressiven Antikörper oder dessen VH- und VL enthaltende Fragmente
Beispiele für Gene kodierend für derartige Proteine sind bereits im Abschnitt
"Strukturgene für die Therapie von Tumoren" aufgeführt.
In gleicher Form wie dort bereits beschrieben, können im Sinne der
Erfindung Strukturgene verwendet werden, welche für Fusionsproteine aus
Antikörpern bzw. Fab oder rek. Fv-Fragmenten dieser Antikörper oder
anderen Liganden spezifisch für die Zielzelle und den o.a. Cytokinen,
Wachstumsfaktoren, Rezeptoren, zytostatischen oder zytotoxischen
Proteinen und Enzymen kodieren.
Im Sinne der Erfindung werden Strukturgene ausgewählt, deren
exprimiertes Protein die Entzündung beispielsweise im Gelenk direkt oder
indirekt hemmt und/oder die Rekonstitution von extrazellulärer Matrix
(Knorpel, Bindegewebe) im Gelenk fördert.
Hierzu gehören zum Beispiel
- - IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1-RA); IL-1-RA inhibiert die Bindung von IL-1α, β
- - löslicher IL-1-Rezeptor; löslicher IL-1-Rezeptor bindet und inaktiviert IL-1
- - IL-6
- - IL-6 erhöht die Sekretion von TIMP und Superoxiden und vermindert die Sekretion von IL-1 und TNFα durch Synovialzellen und Chondrozyten
- - löslicher TNF-Rezeptor löslicher TNF-Rezeptor bindet und inaktiviert TNF.
- - IL-4
- - IL-4 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1, TNFα und MMP
- - IL-10
- - IL-10 inhibiert die Bildung und Sekretion von IL-1, TNFα und MMP und erhöht die Sekretion von TIMP
- - Insulin-like growth factor (IGF-1) IGF-1 stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix.
- - TGFβ, im speziellen TGFβ1 und TGFβ2 TGFβ stimuliert die Synthese von extrazellulärer Matrix.
- - Superoxiddismutase
- - TIMP, im speziellen TlMP-1, TIMP-2 oder TlMP-3
8.3.1.) zusätzliche Promotoren
- - zellunspezifisch und/oder
- - zellzyklusspezifisch und/oder
- - metabolisch aktivierbar
8.3.2.) Effektorgene für die Therapie der Anämie, zum Beispiel für
- - Erythropoietin
8.3.3.) Effektorgene für die Therapie der Leukopenie, zum Beispiel für
- - G-CSF
- - GM-CSF
- - M-CSF
8.3.4.) Effektorgene für die Therapie der Thrombozytopenie, zum Beispiel für
- - IL-3
- - Leukemia Inhibitory Factor (LIF)
- - IL-11
- - Thrombopoietin
8.4.1.) zusätzliche Promotoren
- - unspezifisch und/oder
- - zellzyklusspezifisch und/oder
- - metabolisch aktivierbar
8.4.2.) Effektorgene für neuronale Wachstumsfaktoren, zum Beispiel
- - FGF
- - Nerve growth factor (NGF) Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)
- - Neurotrophin-3 (NT-3)
- - Neurotrophin-4 (NT-4)
- - Ciliary neurotrophic factor (CNTF)
8.4.3.) Effektorgene für Enzyme, zum Beispiel für
- - Tyrosinhydroxylase
- - Dopadecarboxylase
8.4.4.) Effektorgene für Cytokine und deren Inhibitoren, welche die neurotoxische
Wirkung von TNFα inhibieren oder neutralisieren, zum Beispiel für
- - TGFβ
- - lösliche TNF-Rezeptoren
- - TNF-Rezeptoren neutralisieren TNFα
- - IL-10
- - IL-10 inhibiert die Bildung von IFNγ, TNFα, IL-2 und IL-4
- - lösliche IL-1-Rezeptoren
- - IL-1-Rezeptor I
- - IL-1-Rezeptor II
- - lösliche IL-1-Rezeptoren neutralisieren die Aktivität von IL-1
- - IL-1 -Rezeptor-Antagonist
- - lösliche IL-6-Rezeptornn
8.5.1.) zusätzliche Promotoren
- - zellzyklusspezifisch und/oder
- - zellunspezifisch und/oder metabolisch aktivierbar
8.5.2.) Effektorgene für die Inhibition der Gerinnung oder für die Förderung der
Fibrinolyse, zum Beispiel für
- - Tissue Plasminogen Activator (tPA)
- - Urokinase-type Plasminogen Activator (uPA)
- - Hybride von tPA und uPA
- - Protein C
- - Hirudin
- - Serin Proteinase Inhibitoren (Serpine), wie beispielsweise C-1S-Inhibitor, α1-Antitrypsin oder Antithrombin III
- - Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)
8.5.3.) Effektorgene für die Förderung der Gerinnung, zum Beispiel für
- - F VIII
- - F IX
- - von Willebrand factor
- - F XIII
- - PAI-1
- - PAI-2
- - Tissue Factor und Fragmente hiervon
8.5.4.) Effektorgene für Angiogenesefaktoren, zum Beispiel für
- - VEGF
- - FGF
8.5.5.) Effektorgene für die Blutdrucksenkung, zum Beispiel für
- - Kallikrein
- - Endothelzell "nitric oxide synthase"
8.5.6.) Effektorgene für die Inhibition der Proliferation von glatten Muskelzellen
nach Verletzungen der Endothelschicht, zum Beispiel für
- - ein antiproliferatives, zytostatisches oder zytotoxisches Protein oder
- - ein Enzym zur Aufspaltung von Vorstufen von Zytostatika in Zytostatika wie bereits oben (unter Tumor) aufgeführt oder
- - ein Fusionsprotein eines dieser Wirkstoffe mit einem Liganden, beispielsweise einem Antikörper oder Antikörperfragmenten spezifisch für Muskelzellen
8.5.7.) Effektorgene für weitere Blutplasmaproteine, zum Beispiel für
- - Albumin
- - C1-Inaktivator
- - Serum Cholinesterase
- - Transferrin
- - 1-Antritrypsin
8.6.1.) zusätzliche Promotoren
- - unspezifisch und/oder
- - zellzyklusspezifisch
Die Möglichkeiten, auf konventionellem Wege wirkungsvolle Impfstoffe
herzustellen, sind beschränkt.
Demzufolge wurde die Technologie der DNA-Vakzine entwickelt. Diese
DNA-Vakzinen werfen jedoch Fragen zur Wirksamkeitsstärke auf (Fynan et
al., Int. J. Immunopharm 17, 79 (1995); Donnelly et al., Immunol 2, 20
(1994)).
Gemäß dieser Erfindung ist mit einer größeren Wirksamkeit der DNA-
Vakzine zu rechnen.
Als Wirksubstanz ist die DNA eines vom Infektionserreger gebildeten
Proteins auszuwählen, welches durch Auslösung einer Immunreaktion, d. h.
durch Antikörperbindung und/oder durch zytotoxische T-Lymphozyten zur
Neutralisierung und/oder zur Abtötung des Erregers führt. Derartige
sogenannte Neutralisationsantigene werden als Impfantigene bereits
angewandt (siehe Übersicht bei Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)).
Bevorzugt im Sinne der Erfindung wird die DNA kodierend für
Neutralisationsantigene folgender Erreger:
- - Influenza A-Virus
- - HIV
- - Tollwut-Virus
- - HSV (Herpes Simplex Virus)
- - RSV (Respiratory Syncytial Virus)
- - Parainfluenza-Virus
- - Rotavirus
- - VZV (Varizella Zoster Virus)
- - CMV (Cytomegalo-Virus)
- - Masern-Virus
- - HPV (Humanes Papillomvirus)
- - HBV (Hepatitis B-Virus)
- - HCV (Hepatitis C-Virus)
- - HDV (Hepatitis D-Virus)
- - HEV (Hepatitis E-Virus)
- - HAV (Hepatitis A-Virus)
- - Vibrio Cholera-Antigen
- - Borrelia Burgdorferi
- - Helicobacter pylori
- - Malaria-Antigen
- - Zu derartigen Wirksubstanzen im Sinne der Erfindung gehört jedoch auch die DNA eines Antiidiotyp-Antikörpers oder seiner Antigen-bindenden Fragmente, dessen Antigenbindungsstrukturen (die "complementary determining regions") Kopien der Protein- oder Kohlenhydratstruktur des Neutralisationsantigens des Infektionserregers darstellen.
Derartige Antiidiotyp-Antikörper können besonders Kohlenhydratantigene
bei bakteriellen Infektionserregern ersetzen.
Derartige antiidiotypische Antikörper und ihre Spaltprodukte wurden von
Hawkins et al. (J. Immunother. 14, 273 (1993)) und Westerink und
Apicella (Springer Seminars in Immunopathol. 15, 227 (1993))
übersichtlich beschrieben.
Hierzu gehören Antigene auf Tumorzellen. Derartige Antigene wurden zum Beispiel
von Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32, Karger Verlag, München (1988) und
Contrib. to Oncol 43 Karger Verlag, München (1992) übersichtlich dargestellt.
Weitere Beispiele stellen die Gene für bzw. folgende Antigene bzw. für folgende
Antiidiotypantikörper dar:
- - Sialyl Lewis
- - Peptide auf Tumoren, welche von T-Zellen erkannt werden
- - von Onkogenen exprimierte Proteine
- - Blutgruppenantigene und deren Vorläufer
- - Antigene auf dem polymorphen epithelialen Mucin
- - Antigene auf Heat Shock Proteinen
8.7.1.) zusätzliche Promotoren
- - virusspezifisch und/oder
- - zellzyklusspezifisch und/oder
- - unspezifisch
8.7.2.) Effektorgene, beispielsweise für
- - ein Protein, welches zytostatische, apoptotische oder zytotoxische Wirkungen aufweist,
- - ein Enzym, welches eine Vorstufe einer antiviralen oder zytotoxischen Substanz in die aktive Substanz spaltet.
8.7.3.) Effektorgene für antivirale Proteine
- - antiviral wirksame Cytokine und Wachstumsfaktoren. Hierzu zählen beispielsweise IFNα, IFNβ, IFN-γ, TNFß, TNFα, IL-1 oder TGFβ
- - Antikörper einer Spezifität, die das jeweilige Virus inaktiviert oder dessen
VH und VL enthaltende Fragmente oder dessen über einen Linker
verbundene VH und VL Fragmente herstellt wie bereits beschrieben.
Antikörper gegen Virusantigen sind beispielsweise:
anti HBV
anti HGV
anti HSV
anti HPV
anti HIV
anti EBV
anti HTLV
Anti Goxackie Virus
anti Hantaan Virus
- - ein Rev bindendes Protein. Diese Proteine binden an die Rev-RNA und
inhibieren Rev-abhängige posttranskriptionelle Stufen der Retrovirus-
Genexpression. Beispiele für Rev-bindende Proteine sind:
RBP9-27
RBP1-8U
RBP1-8D
Pseudogene von RBP1-8
- - für Ribozyme, welche die mRNA von Genen für Zellzykluskontrollproteine oder die mRNA von Viren verdauen. Ribozyme katalytisch für HIV wurden beispielsweise von Christoffersen et al., J. Med. Ghem. 38 2033 (1995) übersichtlich beschrieben.
Zu den antibakteriellen Proteinen gehören beispielsweise Antikörper, die bakterielle
Toxine neutralisieren oder Bakterien opsonieren. Beispielsweise gehören hierzu
Antikörper gegen
Meningokokken G oder B
coli
Borrelia
Pseudomonas
Helicobacter pylori
Staphylococcus aureus
Meningokokken G oder B
coli
Borrelia
Pseudomonas
Helicobacter pylori
Staphylococcus aureus
Gegenstand der Erfindung ist des weiteren ein Nukleinsäurekonstrukt, in welchem
eine Kombination der DNA-Sequenzen von zwei gleichen oder zwei
unterschiedlichen Strukturgenen vorliegt. Zur Expression beider DNA-Sequenzen ist
eine weitere Promotorsequenz oder vorzugsweise die cDNA einer "internal
ribosome entry site" (IRES) als regulatorisches Element zwischen beiden
Stukturgenen geschaltet.
Eine IRES ermöglicht die Expression zweier über eine IRES miteinander
verbundener DNA-Sequenzen.
Derartige IRES wurden beispielsweise von Montford und Smith (TIG 11, 179 (1995);
Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19, 4485 (1991); Morgan et al., Nucl. Acids Res.
20, 1293 (1992); Dirks et al., Gene 128, 247 (1993); Pelletier und Sonenberg,
Nature 334, 320 (1988) und Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994))
beschrieben.
So kann beispielsweise die cDNA der IRES-Sequenz des Poliovirus (Position ≦ 140
bis ≧ 630 des 5' UTR verwendet werden.
Bevorzugt im Sinne der Erfindung sind über weitere Promotorsequenzen oder eine
IRES-Sequenz Strukturgene zu verknüpfen, welche eine additive Wirkung
aufweisen.
Im Sinne der Erfindung sind bevorzugte Kombinationen von Strukturgenen
beispielsweise für
9.1.) die Therapie von Tumoren
9.1.) die Therapie von Tumoren
- - gleiche oder unterschiedliche, zytostatische, apoptotische, zytotoxische oder entzündungserregende Proteine oder
- - gleiche oder unterschiedliche Enzyme für die Spaltung der Vorstufe eines Zytostatikums
9.2.) die Therapie von Autoimmunerkrankungen
- - unterschiedliche Cytokine oder Rezeptoren mit synergistischer Wirkung zur Hemmung der zellulären und/oder humoralen Immunreaktion oder
- - unterschiedliche oder gleiche TIMPs
9.3.) die Therapie von mangelhafter Bildung von Zellen des Blutes
- - unterschiedliche, hierarchisch aufeinanderfolgende Cytokine, wie beispielsweise IL-1, IL-3, IL6 oder GM-CSF und Erythropoietin, G-CSF oder Thrombopoietin
9.4.) die Therapie von Nervenzellschäden
- - ein neuronaler Wachstumsfaktor und ein Cytokin oder der Inhibitor eines Cytokines
9.5.) die Therapie von Störungen des Blutgerinnungs- und Blutkreislaufsystems
- - ein Antithrombotikum und ein Fibrinolytikum (z. B. tPA oder uPA) oder
- - ein zytostatisches, apoptotisches oder zytotoxisches Protein und ein Antithrombotikum oder ein Fibrinolytikum
- - mehrere unterschiedliche, synergistisch wirkende Blutgerinnungsfaktoren, beispielsweise F VIII und vWF oder F VIII und F IX
9.6.) Impfungen
- - ein Antigen und ein immunstimulierendes Cytokin, wie beispielsweise IL- 1α, IL-1β, IL-2, GM-CSF, IL-3 oder IL-4 Rezeptor
- - unterschiedliche Antigene eines Infektionserregers oder unterschiedlicher Infektionserreger oder
- - unterschiedliche Antigene eines Tumortyps oder unterschiedlicher Tumortypen
9.7.) Therapie von viralen Infektionserkrankungen
- - ein antivirales Protein und ein zytostatisches, apoptotisches oder zytotoxisches Protein
- - Antikörper gegen unterschiedliche Oberflächenantigene eines Virus oder mehrere Viren
9.8.) Therapie von bakteriellen Infektionserkrankungen
- - Antikörper gegen unterschiedliche Oberflächenantigene und/oder Toxine eines Keimes
Eine detaillierte Beschreibung der Technologie erfolgte bereits in den
Patentanmeldungen DE 196 39 103.2 und DE 196 51 443.6, auf die ausdrücklich Bezug
genommen wird.
10.1.) Zur Verstärkung der Translation kann am 3' Ende der Promotorsequenz und
unmittelbar am 5, Ende des Startsignals (ATG) der Signal- bzw.
Transmembransequenz die Nukleotidsequenz GCCACC oder GCCGCC
eingefügt (Kozak, J. Gell Biol. 108, 299(1989)) werden.
10.2.) Zur Erleichterung der Sekretion des Expressionsproduktes des
Strukturgenes kann die ggf. in der DNA-Sequenz des Strukturgenes
enthaltende homologe Signalsequenz ersetzt werden durch eine heterologe,
die intrazelluläre Ausschleusung verbessernde Signalsequenz.
So kann beispielsweise die Signalsequenz für das Immunglobulin (DNA
Position ≦ 63 bis ≧ 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)) oder die
Signalsequenz für das CEA (DNA-Position ≦ 33 bis ≦ 134 Schrewe et al.,
Mol. Cell Biol. 10, 2738 (1990); Berling et al., Cancer Res. 50, 6534 (1990))
oder die Signalsequenz des humanen Respiratory Syncytial Virus
Glycoproteins (cDNA der Aminosäuren ≦ 38 bis ≧ 50 oder 48 bis 65;
Lichtenstein et al., J. Gen. Virol. 77, 109 (1996)) eingefügt werden.
10.3.) Zur Verankerung des Wirkstoffes in die Zellmembran der den Wirkstoff
bildenden transduzierten Zelle kann alternativ oder zusätzlich zur
Signalsequenz eine Sequenz für eine Transmembrandomäne eingeführt
werden.
So kann beispielsweise die Transmembransequenz des menschlichen
Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors (DNA-Position ≦ 1485 bis ≧
1554; Cosman et al., Behring lnst. Mitt. 83, 15 (1988)) oder die DNA-
Sequenz für die Signal- und Transmembranregion des menschlichen
Respiratory Syncytial Virus (RSV)-Glykoproteins G (Aminosäuren 1 bis 63
oder deren Teilsequenzen, Aminosäuren 38 bis 63; Vijaya et al., Mol. Cell
Biol. 8, 1709 (1988); Lichtenstein et al., J. Gen. Virol. 77, 109 (1996)) oder
die DNA-Sequenz für die Signal- und Transmembranregion der
Influenzavirus-Neuraminidase (Aminosäuren 7 bis 35 oder die Teilsequenz
Aminosäuren 7 bis 27; Brown et al., J .Virol 62, 3824 (1988)) zwischen der
Promotorsequenz und der Sequenz des Strukturgens eingefügt werden.
10.4.) Zur Verankerung des Wirkstoffes in die Zellmembran der den Wirkstoff
bildenden transduzierten Zellen kann jedoch auch die Nukleotidsequenz für
einen Glykophospholipid-Anker eingefügt werden.
Die Einfügung eines Glykophospholipid-Ankers erfolgt am 3' Ende der
Nukleotidsequenz für das Strukturgen und kann zusätzlich zur Einfügung
einer Signalsequenz erfolgen.
Glykophospholipid-Anker sind beispielsweise für das CEA, für das N-CAM
und für weitere Membranproteine, wie beispielsweise Thy-1, beschrieben
worden (siehe Übersicht Ferguson et al., Ann. Rev. Biochem 57, 285
(1988)).
10.5.) Eine weitere Möglichkeit der Verankerung von Wirkstoffen an die
Zellmembran entsprechend der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung
einer DNA-Sequenz für ein Ligand-Wirkstoff-Fusionsprotein. Die Spezifität
des Liganden dieses Fusionsproteins ist gerichtet gegen eine
Membranstruktur auf der Zellmembran der gewählten Zielzelle.
10.5.1.) Zu den Liganden, welche an die Oberfläche von Zellen binden, gehören
beispielsweise Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet gegen
Strukturen auf der Oberfläche von beispielsweise
- - Endothelzellen. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF- Rezeptoren oder gegen Kinin-Rezeptoren
- - oder von Muskelzellen, wie Antikörper gegen Actin oder Antikörper gegen Angiotensin II-Rezeptoren oder Antikörper gegen Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise gegen EGF-Rezeptoren oder gegen PDGF-Rezeptoren oder gegen FGF-Rezeptoren oder Antikörper gegen Endothelin A-Rezeptoren
- - Zu den Liganden gehören auch Antikörper oder deren Fragmente, welche gerichtet sind gegen tumorspezifische oder tumorassoziierte Antigene auf der Tumorzellmembran. Derartige Antikörper wurden bereits beschrieben.
Die murinen monoklonalen Antikörper sind bevorzugt in humanisierter Form
einzusetzen. Fab und rek. Fv-Fragmente und deren Fusionsprodukte
werden, wie bereits beschrieben, mit der dem Fachmann bekannten
Technologie hergestellt.
10.5.2.) Zu den Liganden gehören des weiteren alle Wirkstoffe, wie beispielsweise
Cytokine oder Adhäsionsmoleküle, Wachstumsfaktoren oder deren
Fragmente bzw. Teilsequenzen von ihnen, Mediatoren oder Peptidhormone,
welche an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf der jeweiligen
ausgewählten Zelle binden. Beispielsweise gehören hierzu
- - Liganden für Endothelzellen, wie IL-1, PDGF, bFGF, VEGF, TGGβ (Pusztain et al., J. Pathol. 169, 191 (1993)) oder Kinin und Derivate oder Analoga von Kinin.
- - Des weiteren gehören hierzu Adhäsionsmoleküle. Derartige Adhäsionsmoleküle, wie beispielsweise SLex, LFA-1, MAC-1, LeCAM-1, VLA-4 oder Vitronectin und Derivate oder Analoga von Vitronectin wurden bereits für Endothelzellen beschrieben (Übersichten bei Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119, 483 (1992); Pauli et al., Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990); Honn et al., Cancer Metast. Rev. 11, 353 (1992); Varner et al., Cell Adh. Commun 3 367 (1995)).
Die Erfindung wird an folgenden Beispielen näher erläutert, ohne sich darauf zu
beschränken.
Die Nukleinsäurekonstrukte bestehen bevorzugterweise aus DNS. Unter dem Begriff
Nukleinsäurekonstrukte werden künstliche Gebilde aus Nukleinsäure verstanden,
die in den Zielzellen transkribiert werden können. Sie sind bevorzugt in einen Vektor
eingefügt, wobei Plasmidvektoren oder mit nichtviralen Trägern komplexierte
Plasmide (Fritz et al., Hum. Gene Ther. 7: 1395 (1996); Solodin et al., Biochem. 34:
13537 (1995); Abdallak et al., Hum Gene Ther. 7: 1947 (1996); Ledley, Hum. Gene
Ther. 6: 1129 (1995); Schofield et al., Br. Med. Bull. 51: 56 (1995); Behr, Bioconj.
Chem. 5: 382 (1994); Gotten et al., Curr. Opin. Biotechnol. 4: 705 (1993); Hodgson
et al., Nature Biotechnol 14: 339 (1996)) besonders bevorzugt sind. Die Vektoren
werden mit den dem Fachmann bekannten Technologien (Cotteb et al., Curr. Opin.
Biotechnol. 4: 705 (1993); Scheffield et al., Br. Med. Bull. 51: 56 (1995), Ledley,
Hum. Gene Ther. 6: 1129 (1995)) in die Vorläuferzelle von Endothelzellen oder in
Endothelzellen eingeführt. In einer weiteren Ausführungsform werden die
erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte in eine viralen Vektor (Weir et al.,
Hum. Gene Ther. 7: 1331 (1996); Flotte et al., Gene Ther. 2: 357 (1995); Efstathion
et al., Br. Med. Bull. 51: 45 (1995); Kremer et al., Br. Med. Bull. 51: 31 (1995); Vile
et al., Br. Med. Bull. 51: 12 (1995); Randrianarison et al., Biologicals 23:145 (1995);
Jolly Gancer Gene Ther. 1: 51 (1994)) eingefügt und mit diesen Endothelzellen
transfiziert. Die hierdurch transduzierten Zellen werden Patienten äußerlich oder
innerlich, lokal, in eine Körperhöhle, in ein Organ, in den Blutkreislauf, in den
Atemweg, in den Magen-Darm-Trakt, in den Urogenitaltrakt, in eine Wundhöhle
oder intramuskulär oder subkutan verabreicht.
Durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte kann ein Strukturgen in den
Endothelzellen oder Vorläuferzellen von Endothelzellen zellspezifisch und ggf. auch
virusspezifisch, unter bestimmten metabolischen Bedingungen und/oder
zellzyklusspezifisch und/oder induziert durch ein Arzneimittel exprimiert werden,
wobei es sich bei dem Strukturgen bevorzugt um ein Gen handelt, das für einen
pharmakologisch aktiven Wirkstoff oder aber für ein Enzym kodiert, welches eine
inaktive Vorstufe eines Pharmakons in ein aktives Pharmakon spaltet. Das
Strukturgen kann so gewählt sein, daß der pharmakologisch aktive Wirkstoff oder
das Enzym als Fusionsprotein mit einem Liganden exprimiert wird und dieser Ligand
an die Oberfläche von Zellen, z. B. proliferierende Endothel- oder Tumorzellen,
bindet.
Figurlegende:
Fig. 1 Nukleinsäurekonstrukt zur Transformation von Zellen
12.1.) Kultivierung von Endothelzellen aus CD34-positiven Blutzellen ohne
Verwendung von Fibronektin und Rinderhirn
CD34-positive Blutzellen, isoliert wie von Asahara et al., Science 275: 964
(1997) beschrieben, wurden entweder
- - Ansatz a), wie von Asahara publiziert, in Plastikflaschen, beschichtet mit Fibronektin und unter Zugabe von Rinderhirnextrakt (100 µg/ml),
- - oder aber (Ansatz b) entsprechend dieser Erfindung in Plastikflaschen
ohne Fibronektinbeschichtung und ohne Zugabe von Rinderhirnextrakt,
jedoch mit VEGF und bFGF-Zusatz (Fa. Sigma, jeweils 1% v/v)
jeweils unter Zusatz von fetalem Kälberserum (FKS, 20%) in Kulturmedium (Medium 199) bei 37°C und unter 5% CO2-Begasung kultiviert. Nach 6 Tagen wurde der Anteil adhäsiv wachsender, spindelförmige und kapillarähnliche Strukturen ausbildender Zellen mikroskopisch und der Anteil an Endothelzellen durch Markierung mit endothelzellspezifischen Antikörpern (anti CD31, anti vWF, anti Flik 1) mit Hilfe der FAGS-Analyse ermittelt. Kein Unterschied in der Zahl und Morphologie dieser Zellen wurde zwischen Ansatz a) und Ansatz b) gefunden. In Versuchsserien beider Ansätze schwankte der Anteil von Endothelzellen zwischen 1 und 10%, was belegt, daß die Zugabe der Wachstumsfaktoren VEGF und bFGF die Beschichtung der Kulturflasche mit Fibronektin und die Zugabe von Hirnextrakt ersetzen kann.
12.2.) Kultivierung von Endothelzellen aus mononukleären Zellen des Blutes.
Aus 120 ml Blut wurden mit Hilfe der Zentrifugation über einen
Ficollgradienten die mononukleären Zellen isoliert und durch Inkubation über
1 Stunde in der Zellkulturflasche und nachfolgender Dekantierung die nicht
adhärenten mononukleären Blutzellen abgetrennt.
Diese Zellen wurden in Kulturflaschen entsprechend Ansatz b) ausgesät und
über 6 Tage bei 37°C und 5%iger CO2-Begasung kultiviert.
Nach 6 Tagen wurde der Anteil an Endothelzellen, wie unter 12.1)
beschrieben, ermittelt. Er lag bei unterschiedlichen Versuchsserien zwischen
2 und 20%.
12.3.) Endothelzellspezifische Transformation und Kultur von Endothelzellen aus
mononukleären Zellen des Blutes.
Aus 120 ml Blut wurden mit Hilfe der Zentrifugation über einen
Ficollgradienten die mononukleären Zellen isoliert und durch Inkubation über
1 Stunde in der Zellkulturflasche und nachfolgender Dekantierung die nicht
adhärenten mononukleären Blutzellen abgetrennt. Diese Blutzellen werden
auf eine Konzentration von 1×107/ml Kulturmedium eingestellt, in 60 mm
Kulturschalen eingesät und mit einem Komplex aus dem erfindungsgemäßen
Plasmid und Superfect (Fa. Quiagen) für 10 min bei 37°C inkubiert.
Die Herstellung des Komplexes erfolgt nach Angabe des Herstellers von
Superfect.
Das erfindungsgemäße Plasmid enthält in Leserichtung von 5' nach 3'
folgende DNA-Sequenzen:
- - der Promotor des humanen Endoglingenes (NS1-2415; Patentanmeldung D19704301.1)
- - die cDNA der humanen Cyclin-dependent kinase 4 (cdk-4) mit einer Mutation im Codon 24 [Austausch eines Arginins (CGT) durch ein Cystein (TGT), Wölfel et al. Science 269: 1281 (1997)].
- - Das nukleäre Lokalisationssignal (NLS) von SV40 [SV40 large T; Aminosäuren 126 bis 132; PKKKRKV (SEQ ID NO.: 3); Dingwall et al., TIBS 16: 478 (1991)].
Die Verknüpfung der einzelnen Bestandteile des Konstruktes erfolgt über
geeignete Restriktionsstellen, die über PCR-Amplifikation an den Termini der
verschiedenen Elemente mitgeführt werden. Die Verknüpfung erfolgt mit Hilfe
von dem Fachmann bekannten, für die Restriktionsstellen spezifischen
Enzymen und DNA-Ligasen. Diese Enzyme sind käuflich zu erwerben. Mit
Hilfe dieser Enzyme wird das so hergestellte Nukleotid einkloniert.
Nach Inkubation der mononukleären Blutzellen mit dem Superfect/Plasmid
Komplex werden die Blutzellen gewaschen und in Zellkulturmedium kultiviert
wie im Abschnitt 12.2) beschrieben.
Nach 6 Tagen wird der Anteil an Endothelzellen wie im Abschnitt 12.1.)
beschrieben bestimmt. Er schwankt bei unterschiedlichen Versuchsserien
zwischen 10 und 60%.
12.4.) Herstellung und Verwendung von transduzierten Endothelzellen als Vektoren
Endothelzellen, isoliert, transduziert und vermehrt, wie in Abschnitt 12.3.)
beschrieben, werden in 60 mm Kulturschalen eingesät und mit einem
Komplex aus einem weiteren erfindungsgemäßen Plasmid und Superfect (Fa.
Quiagen) für 10 min bei 37°C inkubiert.
Die Herstellung dieses Komplexes erfolgt nach Angabe des Herstellers von
Superfect.
Das erfindungsgemäße Plasmid enthält in Leserichtung von 5' nach 3'
folgende DNA-Sequenzen:
- - der Promotor des cdc25C Genes (Nukleinsäuren 290 bis +121; Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995); Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 23, 3822 (1995))
- - das nukleäre Lokalisationssignal (NLS) von SV40 (SV40 Large T, Aminosäuren 126-132; PKKKRKV (SEO ID NO.: 3), Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991))
- - die saure Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV-1 VP16 (Aminosäuren 406 bis 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5, 190 (1995))
- - die cDNA für den zytoplasmatischen Teil des CD4 Glycoproteins (Aminosäuren 397-435; Simpson et al., Oncogene 4, 1141 (1989); Maddon et al., Cell 42, 93 (1985))
- - der Promotor des humanen Endoglingenes (Nukleinsäuren 1 bis 2415; Patentanmeldung D19704301.1)
- - das nukleäre Lokalisationssignal (NLS) von SV40 (SV40 Large T; Aminosäuren 126-132 PKKKRKV (SEQ ID NO.: 3); Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991))
- - die cDNA für die DNA-Bindedomäne des Gal4 Proteins (Aminosäuren 1 bis 147, Chasman und Kornberg, Mol. Cell. Biol. 10, 2916 (1990))
- - die cDNA für die CD4 Bindesequenz des p56 Ick Proteins (Aminosäuren 1-71; Shaw et al., Cell 59, 627 (1989); Turner et al., Cell 60, 755 (1990); Perlmutter et al., J. Cell. Biochem. 38, 117 (1988))
- - 10x die Bindesequenz für Gal4-Bindeprotein mit der Nukleotidsequenz 5'- CGGACAATGTTGACCG-3' (SEO ID NO.: 4, Chasman und Kornberg, Mol. Cell. Biol. 10, 2916 (1989))
- - der basale Promotor von SV40 (Nukleinsäuren 48 bis 5191; Tooze (ed). DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, New York, Cold Spring Harbor Laboratory)
- - die cDNA für die humane β-Glucuronidase (Nukleotidsequenz 93 bis 1982; Oshima et al., PNAS USA 84, 65 (1987))
Die Funktionsweise der beschriebenen Aktivatorsequenz ist wie folgt:
- - Der Promotor cdc25B reguliert zellzyklusspezifisch die Transkription der kombinierten cDNAs für die Aktivierungsdomäne von VP16 und dem zytoplasmatischen Teil von CD4 (Aktivierungsuntereinheit A).
- - Der Promotor des humanen Endoglingenes reguliert endothelzellspezifisch die Transkription der kombinierten cDNAs für das DNA Bindeprotein von Gal4 und des CD4 bindenden Teiles des p56 Ick-Proteins (Aktivierungsuntereinheit B).
- - Die Expressionsprodukte der Aktivatorsubeinheiten A und B dimerisieren durch Bindung der CD4-Domäne an die p56 Ick-Domäne.
- - Das dimere Protein stellt einen chimären Transkriptionsfaktor für den Aktivator-responsiven Promotor (DNA-Sequenz für die Gal4- Bindedomänen/den SV40 Promotor) für die Transkription des Effektorgenes (= Luciferasegen) dar.
Die Verknüpfung der einzelnen Bestandteile des Konstruktes erfolgt über
geeignete Restriktionsstellen, die über PCR-Amplifikation an den Termini der
verschiedenen Elemente mitgeführt werden. Die Verknüpfung erfolgt mit Hilfe
von dem Fachmann bekannten, für die Restriktionsstellen spezifischen
Enzyme und DNA-Ligasen. Diese Enzyme sind käuflich zu erwerben.
Mit Hilfe dieser Enzyme wird das so hergestellte Nukleotidkonstrukt in den
pXP2 Plasmidvektor (Nordeen, Bio Techniques 6, 454 (1988)) einkloniert.
Nach Inkubation der mononukleären Blutzellen mit dem Superfect/Plasmid
Komplex werden die Blutzellen gewaschen und in Zellkulturmedium kultiviert
wie im Abschnitt 12.2.) beschrieben.
Nach 6 Tagen wird die Menge an β-Glucuronidase, produziert von den
Endothelzellen, mit Hilfe von 4-Methylumbelliferyl-β-glucuronid als Substrat
gemessen.
Zur Überprüfung der Zellzyklusspezifität werden Endothelzellen durch Entzug
von Methionin über 48 Stunden in G0/G1 synchronisiert (Nettelbeck et al.,
Publikation in Vorbereitung). Der DNA-Gehalt der Zellen wird nach Anfärbung
mit Hoechst 33258 im Fluoreszenzaktivierungs-Gell Sorter bestimmt
(Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)).
Folgende Ergebnisse werden erzielt:
In transfizierten Endothelzellen kann keine Zunahme der β-Glucuronidase im Vergleich zu nichttransfizierten Fibroblasten ermittelt werden.
In transfizierten Endothelzellen kann keine Zunahme der β-Glucuronidase im Vergleich zu nichttransfizierten Fibroblasten ermittelt werden.
Transfizierte Endothelzellen exprimieren deutlich mehr β-Glucuronidase als
nichttransfizierte Endothelzellen.
Proliferierende Endothelzellen (DNA < 2S; S = einfacher Chromosomensatz)
sekretieren deutlich mehr β-Glucuronidase als in G0/G1 synchronisierte
Endothelzellen (DNA = 2S).
Somit führt die beschriebene Aktivator-responsive Promotoreinheit zu einer
zellspezifischen, zellzyklusabhängigen Expression des Strukturgenes
ß-Glucuronidase.
Endothelzellen gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglichen nach lokaler
Applikation beispielsweise an den Ort des Tumors oder nach intrakranieller bzw.
Subarachnoidaler Gabe oder systemischer, bevorzugt intravenöser oder
intraarterieller Gabe, daß diese Endothelzellen sich bevorzugt an Regionen mit
Gefäßschaden ansiedeln und durch die Zellzyklus- und Endothelzellspezifität der
Aktivator-responsiven Promotoreinheit vorwiegend, wenn nicht ausschließlich, nur
proliferierende Endothelzellen β-Glucuronidase ausscheiden. Diese
β-Glucuronidase spaltet ein nunmehr infiziertes, gut verträgliches Doxorubicin. Dieses
hemmt die Endothelzellproliferation und wirkt zytostatisch auf diese Zellen wie auch
auf benachbarte Tumorzellen. Hierdurch kommt es zur Hemmung des
Tumorwachstums.
.
Claims (25)
1. Zellen zur Anwendung in der Gentherapie erhältlich durch
- a) Isolierung von Zellen aus dem Blut oder zellhaltigen Flüssigkeiten des Körpers;
- b) Kultivierung der in Schritt a) gewonnenen Zellen in einem Zellkulturmedium enthaltend Ganglioside, Phospholipide, Glykolipide und/oder Wachstumsfaktoren;
- c) Immortalisierung der in Schritt a) oder b) gewonnenen Zellen durch Transformation mit einem Onkogen, Aktivierung eines Onkogens oder Inaktivierung eines Suppressorgens;
- d) Transfektion der in Schritt c) gewonnenen Zellen mit einem Nukleinsäurekonstrukt für die Gentherapie, enthaltend ein Effektorgen, welches durch geeignete Promotorsysteme zielzellspezifisch, zellzyklusspezifisch, virusspezifisch und/oder durch Hypoxie aktiviert werden kann.
2. Zellen gemäß Anspruch 1, wobei die Zellen Endothelzellen sind.
3. Zellen gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß
diese Zellen aus dem Blut in Venen, Kapillaren, Arterien, Nabelschnur oder
Plazenta, aus dem Knochenmark, der Milz, den Lymphknoten, dem Peritonealraum,
dem Pleuralraum, der Lymphe, den Venen, Arterien, Kapillaren und/oder der
Bindegewebsflüssigkeit stammen.
4. Zellen gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der
Wachstumsfaktor in Schritt b) von Anspruch 1 ausgewählt wird aus der Gruppe
enthaltend EGGF, FGFα, FGFβ, VEGF und ECAF.
5. Zellen gemäß einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß
das Onkogen in Schritt c) von Anspruch 1 derartig mutiert ist, daß das Onkogen-
Genprodukt noch voll den Zellzyklus aktivieren kann, aber diese Aktivierung des
Zellzyklus nicht mehr durch zelluläre Inhibitoren inhibierbar ist.
6. Zellen gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Onkogen
ausgewählt wird aus der Gruppe enthaltend mutiertes cdk-4, cdk-6 und cdk-2.
7. Zellen gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die
Nukleotidsequenz für cdk-4 in der Position 24 derartig mutiert ist, daß das eigentlich
kodierte Arginin ausgetauscht ist gegen ein Cystein.
8. Zellen gemäß einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß
die Inaktivierung eines Suppressorgenes gemäß Schritt c) in Anspruch 1 durch
Transformation der Zellen mit einer Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Protein,
welches mindestens ein Suppressorgen-Genprodukt inaktiviert, erreicht wird.
9. Zellen gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das
Suppressorgen-Genprodukt inaktivierende Protein ausgewählt wird aus der Gruppe
enthaltend das E1A-Protein des Adenovirus, das E1B-Protein des Adenovirus, das
large T-Antigen des SV40-Virus, das E6-Protein des Papillomavirus, das E7-Protein
des Papillomavirus, das MDM-2-Protein und ein Protein enthaltend mindestens eine
Aminosäuresequenz LXDXLXXL-II-LXGXEXXXXXSDDE, bei welcher X eine
variable Aminosäure und -II- eine beliebige Aminosäurekette von 7-80 Aminosäuren
bedeutet.
10. Zelle gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die
Zelle eine Endothelzelle ist und das zur Transformation benutzte Onkogen oder die
zur Inaktivierung des Suppressorgens benutzte Nukleinsäuresequenz verknüpft ist
mit einer endothelspezifischen Aktivierungssequenz, welche die Transkription des
Onkogens oder der genannten Nukleotidsequenz steuert.
11. Zellen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß
das Nukleinsäurekonstrukt in Schritt d) im Anspruch 1
- - mindestens eine uneingeschränkt aktivierbare, eine endothelzellspezifische, virusspezifische, eine metabolisch aktivierbare und/oder eine zellzyklus spezifisch aktivierbare Aktivierungssequenz und
- - mindestens ein Effektorgen, dessen Expression von der Aktivierungssequenz
gesteuert wird,
enthält.
12. Zellen nach Anspruch 11, dadurch charakterisiert, daß die Expression des
Effektorgenes durch mindestens zwei gleiche oder verschiedene Aktivie
rungssequenzen gesteuert wird.
13. Zellen nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die Aktivierung der Aktivierungssequenz selbstverstärkend und/oder
pharmakologisch kontrollierbar ist.
14. Zellen nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch charakterisiert, daß
die zweite Aktivatorsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend
Promotorsequenzen von Viren wie HBV, HGV, HSV, HPV, EBV, HTLV, CMV oder
HIV; Promotor- oder Enhancersequenzen aktiviert durch Hypoxie oder;
zellzyklusspezifische Aktivierungssequenzen der Gene für cdc25G, cdc25B, Cyclin
A, cdc2, E2F-1, B-myb und DHFR; Bindesequenzen für zellproliferationsabhängig
auftretende oder aktivierte Transkriptionsfaktoren wie Monomere oder Multimere der
Myc E-Box.
15. Zellen nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei dem Effektorgen um ein Gen handelt, das für einen Wirkstoff kodiert, der
ausgewählt ist aus der Gruppe enthaltend Cytokine, Chemokine,
Wachstumsfaktoren, Rezeptoren für Cytokine, Chemokine oder
Wachstumsfaktoren, antiproliferativ oder zytostatisch oder apoptotisch wirkende
Proteine, Antikörper, Antikörperfragmente, Angiogeneseinhibitoren, Peptidhormone,
Gerinnungsfaktoren, Gerinnungshemmer, fibrinolytische Proteine, auf den
Blutkreislauf wirksame Peptide oder Proteine, Blutplasmaproteine und Antigene von
Infektionserregern oder von Zellen oder von Tumoren, wobei das ausgewählte
Antigen eine Immunreaktion bewirkt.
16. Zellen nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei dem Effektorgen um ein Gen handelt, das für ein Enzym kodiert, welches
eine Vorstufe eines Pharmakons in ein Pharmakon spaltet.
17. Zellen nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich bei dem Effektorgen um ein Gen handelt, das für ein Ligand-Wirkstoff-
Fusionsprotein oder ein Ligand-Enzym-Fusionsprotein kodiert, wobei der Ligand
ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend Cytokine, Wachstumsfaktoren,
Antikörper, Antikörperfragmente, Peptidhormone, Mediatoren,
Zelladhäsionsproteine und LDL-Rezeptor bindende Proteine.
18. Zellen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei dem in die Endothelzelle eingeführten Nukleinsäurekonstrukt um
DNS handelt.
19. Zellen gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß das
Nukleinsäurekonstrukt eingefügt ist in einen Vektor.
20. Zellen gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen
Plasmidvektor handelt.
21. Zellen gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen
viralen Vektor handelt.
22. Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie
äußerlich, peroral, intravesikal, nasal, intrabronchial oder in den Magen-Darm-Trakt
verabreicht oder in ein Organ, in eine Körperhöhle, in die Muskulatur, subkutan oder
in den Blutkreislauf injiziert wird zur Prophylaxe oder Therapie eine Erkrankung.
23. Verwendung einer Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 22 zur Herstellung
eines Heilmittels zur Behandlung einer Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe
enthaltend Tumore, Leukämien, Autoimmunerkrankungen, Allergien, Arthritiden,
Entzündungen, Organabstoßungen, Transplantat gegen Wirt-Reaktionen,
Blutgerinnungserkrankungen, Kreislauferkrankungen, Blutarmut, Infektionen
Hormonerkrankungen und ZNS-Schäden.
24. Verfahren zur Herstellung einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22,
dadurch gekennzeichnet, daß folgende Schritte durchgeführt werden:
- a) Isolierung von Zellen aus dem Blut oder zellhaltigen Flüssigkeiten des Körpers;
- b) Kultivierung der in Schritt a) gewonnenen Zellen in einem Zellkulturmedium enthaltend Ganglioside, Phospholipide, Glykolipide und/oder Wachstumsfaktoren;
- c) Immortalisierung der in Schritt a) oder b) gewonnenen Zellen durch Transformation mit einem Onkogen, Aktivierung eines Onkogens oder Inaktivierung eines Suppressorgens;
- d) Transfektion der in Schritt c) gewonnenen Zellen mit einem Nukleinsäurekonstrukt für die Gentherapie, enthaltend ein Effektorgen, welches durch geeignete Promotorsysteme zielzellspezifisch, zellzyklusspezifisch, virusspezifisch und/oder durch Hypoxie aktiviert werden kann.
25. Arzneimittel, enthaltend Zellen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 22.
Priority Applications (15)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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EP98113137A EP0893493A3 (de) | 1997-07-21 | 1998-07-15 | Genetisch veränderte Zellen und deren Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen |
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ARP980103512A AR015926A1 (es) | 1997-07-21 | 1998-07-17 | Celulas modificadas geneticamente y su utilizacion en la profilaxis o terapia de enfermedades |
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