DE19728698A1 - Verfahren zur Detektion eines Elementes in einer Probe - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion eines Elementes in einer Probe, bei dem mit einem Transmissionselektronenmikroskop ein erstes Bild der Intensitäten der Probe in einem Energieverlustbereich vor der Elementkante und ein zweites Bild der Intensitäten der Probe bei einem Energieverlust im Bereich der Elementkante gemessen wird.

Dieses Verfahren wird auch als 2-Fenster-Differenzmethode bezeichnet. Die Schwierigkeit bei dieser Methode liegt darin, daß die Intensität des Untergrundes eine Funktion des Energieverlustes ist und somit innerhalb des Energiefensters verschiedene Untergrundintensitäten festzustellen sind. Die Untergrundintensität hängt im wesentlichen von der Dicke der Probenstelle ab und nimmt zu höherem Energieverlust hin ab. Um das reine elementspezifische Signal, d. h. die element­ spezifische Intensität zu ermitteln, wird zunächst in dem für das zu detektierende Element spezifischen Energieverlustbereich die Intensität gemessen und von diesen gemessenen Werten ein Untergrundwert im Energieverlustbereich subtrahiert, wobei der Untergrund im elementspezifischen Energiefenster eine Funktion des Untergrunds außerhalb des elementspezifischen Energiefensters ist.

Bei der bekannten Methode wird davon ausgegangen, daß die Intensität des Untergrunds im Bereich des Energiefensters eine lineare Funktion der Intensität vor dem Energiefenster ist.

Für viele Anwendungen ist die Annahme näherungsweise gerechtfertigt. Es ist jedoch einerseits im Stand der Technik nicht befriedigend beschrieben, wie die Parameter der linearen Funktion zu berechnen sind, und andererseits ist davon auszugehen, daß in vielen Fällen eine lineare Funktion den natürlichen Gegebenheiten nicht entspricht.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein gattungsgemäßes Verfahren so weiterzuentwickeln, daß die beschriebene Funktion reproduzierbar bestimmbar ist, um ein genaueres Bild der elementspezifischen Intensitäten zu berechnen.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß an einer Vergleichsprobe, die das Element nicht enthält, für verschiedene Punkte die elementunspezifischen Intensitäten I₁ bei einem Energieverlust vor der Elementkante ermittelt wer­ den, die elementunspezifischen Intensitäten I₂ bei einem Energieverlust im Bereich der Elementkante ermittelt werden, aus diesen Werten eine Näherungsfunktion I₂ (I₁) berechnet wird und ein drittes Bild der elementspezifischen Intensitäten I_E berechnet wird, indem für jeden Punkt des ersten Bildes mit der Intensität I_1P mit der Näherungsfunktion die entsprechende Intensität I_2P berechnet wird und für den entsprechenden Punkt des zweiten Bildes die Differenz aus gemessener Intensität I_2'P und berechneter Intensität I_2P als elementspezifische Intensität I_E ermittelt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, experimentell die Funktion I₂ (I₁) zu bestimmen und mittels dieser experimentell bestimmten Funktion das gemessene Bild der Intensitäten bei einem Energieverlust im Bereich der Elementkante vom elementunspezifischen Untergrund zu bereinigen. Dadurch wird der systematische Fehler deutlich verfingert und der Untergrundabzug kann für jede Probe und für alle variablen Parameter, die am Mikroskop eingestellt werden können, angepaßt werden.

Die Intensitätspaare I₁/I₂ können graphisch dargestellt werden, so daß auch optisch leicht zu erkennen ist, ob die berechnete Näherungsfunktion den gemessenen Werten entspricht.

Vorteilhaft ist es, wenn die Vergleichsprobe einen Verlauf mit unterschiedlichen Probedicken aufweist. Da die Probendicke am stärksten das Untergrundsignal beeinflußt, ermöglicht ein Verlauf mit unterschiedlichen Probedicken die Messung verschiedener Untergrundsignale und somit die Ermittlung verschiedener Intensitätspaare I₁/I₂.

Dieser Verlauf sollte möglichst keine Stufen aufweisen und hat vorzugsweise die Form einer Rampe.

Vorzugsweise weist die Vergleichsprobe mindestens die Dicke der Probe auf. Dadurch wird sichergestellt, daß für alle im Bereich der Probe auftretenden Untergrundsignale ein entsprechendes Untergrundsignal an der Vergleichsprobe zu ermitteln ist.

Besonders bewährt haben sich Vergleichsproben, die aus reinem Kohlenstoff bestehen. Derartige Vergleichsproben lassen sich in allen elektronenmikroskopisch orientierten Labors ohne Probleme herstellen und eignen sich vorallem für biologische Proben, sofern sie nicht nachträglich mit Schwermetallen behandelt wurden.

Um das Rauschen in den von den Bildern abgeleiteten Graphen zu reduzie­ ren, wird vorgeschlagen, daß die Intensität eines jeden Punktes als Mittel­ wert seiner Umgebung gemessen wird. Bspw. kann jedes der Bilder aus 1014×1024 Bildpunkten bestehen, wobei der Intensitätswert jedes Bild­ punktes durch den Mittelwert aus der Umgebung von 10×10 Bildpunkten ersetzt wird. Nach Erhalt der errechneten Funktion wird jedoch mit den Originalbildern weitergearbeitet.

Um die Güte der Näherungsfunktion zu bestimmen und ggfls. die Näherungsfunktion durch eine weiter angenäherte Funktion zu ersetzen, wird vorgeschlagen, daß die Güte der Funktion I₂ (I₁) durch statistische Funktionen bestimmt wird. Dies ermöglicht es, auch den Fehler des Verfahrens reproduzierbar zu bestimmen.

Das erfindungsgemäße Verfahren wurde mit großem Erfolg am Element Phosphor erprobt. Dieses Verfahren kann aber auch für die Detektion anderer Elemente wie bspw. Eisen angewandt werden. Da DNA Phosphor enthält, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren den Verlauf der DNA z. B. in Viren oder anderen DNA-Protein-Komplexen nachzuweisen.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand eines Ausführungsbeispiels näher beschrieben.

Es zeigt

Fig. 1 die Intensität I des Elektronenstrahls über dem Energieverlust E an einer dicken Probenstelle,

Fig. 2 die Intensität I über dem Energieverlust E an einer dünnen Probenstelle,

Fig. 3 einen Querschnitt durch ein Präparat mit einer Probe und einer Vergleichsprobe und

Fig. 4 eine graphische Darstellung der Intensität I₂ bei einem Energieverlust im Bereich der Elementkante über der Intensität I₁ bei einem Energieverlust vor der Elementkante für verschiedene Punkte der Vergleichsprobe,

Fig. 5 Aufnahme von Bildern, eines bei E₁ = 115 eV, also vor der Phosphor­ kante und eines bei E₂ = 160 eV, beim Maximum der Phosphorkante (Abb. 5a/b). Jedes der Bilder besteht aus 1024×1024 Bildpunkten.

Für jedes Element des Periodensystems gibt es charakteristische Energieverlustbereiche, in denen die Intensität des Elektronenstrahls erhöht ist, wenn dieses Element in der Probe vorhanden ist. Die Fig. 1 und 2 zeigen die Intensität des Elektronenstrahls in Abhängigkeit vom Energieverlust modellhaft für zwei verschieden dicke Probenstellen, in denen sich das gesuchte Zielelement befindet. In diesem Fall ist das Zielelement Phosphor. In beiden Figuren lassen sich zwei verschiedene Signalarten unterscheiden: ein elementunspezifischer Untergrund 1 bzw. 1', der zu höherem Energieverlust hin abnimmt und ein elementspezifisches Signal 2 bzw. 2', das ab einer für das Element typischen Energie auftritt. Für Phosphor tritt dieses Signal am E_P = 130 eV auf und erreicht das Maximum bei E₂ = 160 eV. Wegen der Form des elementspezifischen Signals wird auch von einer "Elementkante" gesprochen. Die Lage dieser Elementkante ist für jedes Element spezifisch.

Im vorliegenden Fall soll Phosphor nachgewiesen werden und daher werden die Elektronen herausgefiltert, die 160 eV (E₂) verloren haben. Der Bereich um 160 eV unterhalb des elementspezifischen Signals 2 beschreibt eine Fläche 3, die der Intensität I_2'P der Probe bei einem Energieverlust im Bereich der Elementkante entspricht. Dieser Intensitätsbereich 3 bzw. 3' besteht aus dem Anteil 4 bzw. 4' des reinen Elementsignals und dem Anteil 5 bzw. 5' des Untergrunds. Um das reine Elementsignal 4 bzw. 4' zu erhalten, muß dieser Untergrund 5 bzw. 5' herausgerechnet werden. Im Stand der Technik wird dieser Untergrund aus Bildern vor der Kante unter Verwendung eines vorbestimmten Rechenalgorithmus berechnet. Diese Algorithmen heißen beispielsweise "power-law, exponential-law, two-windows-differential-law". Das vorliegende Verfahren basiert auf der 2-Fenster-Differenzmethode und zur Berechnung des Untergrundes wird zunächst für einen Energieverlust E₁ = 115 eV vor der Kante der Intensitätbereich 6 gemessen. Da das Verhältnis zwischen dem Intensitätsbereich 5 auf der Kante und dem Intensitätsbereich 6 vor der Kante vor allem von der Schichtdicke der Probenstelle abhängt, aber auch von den gewählten Energieverlustbereichen, wird zunächst eine Vergleichsstruktur untersucht, um für bestimmte Energieverluste E₁ vor der Kante und E₂ auf der Kante die Funktion zwischen der Intensität auf der Kante und der Intensität vor der Kante zu ermitteln.

Als Vergleichsstruktur oder Vergleichsprobe dient ein Präparat oder ein Teil der zu untersuchenden Probe, bei dem das zu detektierende Element mit Sicherheit nicht enthalten ist. Die Vergleichsprobe kann somit ein Teil der zu untersuchenden Präparate sein, in dem das zu untersuchende Element nicht vorhanden ist. Vorzugsweise wird jedoch auf dem Objektträger neben der zu untersuchenden Probe als Extrapräparat eine Vergleichsstruktur erzeugt, von der bekannt ist, daß diese die gleichen Eigenschaften bezüglich des Untergrundsignals hat, wie die zu untersuchende Probe. Die Vergleichsstruktur enthält das gesuchte Element nicht.

Für die Untersuchung von Makromolekülen wird das zu untersuchende Material auf eine Kohlenstoffolie aufgebracht, weiche auf einem Kupfernetz liegt. Dieses Verfahren ist allgemein etabliert und wurde so modifiziert, daß auf die Trägerfolie zusätzlich mindestens eine Kohlenstofframpe aufgedampft wird. Diese Rampe wird auch als Massendickemarker bezeichnet, da sie verschiedene Dicken aufweist. Erst dann wurde das zu untersuchende Material aufgebracht.

Fig. 3 zeigt die Trägerfolie 7 aus Kohlenstoff, auf die als Massendickemarker eine Kohlenstofframpe 8 zusätzlich aufgebracht wurde. Neben der Kohlen­ stofframpe 8 ist auf die Trägerfolie 7 das zu untersuchende Material 9 aufgebracht. Beim Aufbringen des Massendickemarkers 8 wurde darauf geachtet, daß eine Rampe und keine Stufe entsteht, so daß der Untergrund für alle Dicken zwischen dem Minimum (der Trägerfolie) und dem Maximum des Massendicke­ markers ermittelt werden kann. Die maximale Dicke des Markers wurde so gewählt, daß mindestens die Dicke der zu untersuchenden Struktur erreicht wird.

Als Testpräparat wurde im vorliegenden Fall der Turnip Yellow Mosaic Viruses (TYMV) benutzt.

Von dem Testpräparat mit Virus und Kohlenstofframpe wurden Bilder mit 1024 mal 1024 Bildpunkten aufgenommen. Für das erste Bild wurde ein Elektronenstrahl mit einem Energieverlust E₁ = 115 eV, also vor der Phosphorkante verwendet und für das zweite Bild wurde ein Elektronenstrahl mit einem Energieverlust E₂ = 160 eV beim Maximum der Phosphorkante genutzt.

Um das Rauschen in den von den Bildern abgeleiteten Graphen zu reduzie­ ren, wurde der Intensitätswert jedes Bildpunktes durch den Mittelwert seiner Umgebung, bestehend aus 10×10 Bildpunkten ersetzt, wobei da­ nach mit den Originalbildern weitergearbeitet wird.

Anschließend wird ein Bereich ausgewählt, von dem ausgegangen werden kann, daß dieser kein Phosphor enthält. Innerhalb dieses Bereiches wird für viele Bildpunkte die Intensität vor und auf der Kante gemessen, so daß eine Tabelle aus Wertepaaren I₁ (vor der Kante) zu I₂ (auf der Kante) entstand. Diese Wertepaare werden in einem Graphen aufgetragen, in dem die Intensität I₂ (auf der Kante) über der Intensität I₁ (vor der Kante) für einzelne Bildpunkte dargestellt ist. Bei der Auswahl der Wertepaare wurde darauf geachtet, daß sich die Punkte im Graphen gleichmäßig über den ganzen Intensitätsbereich verteilen, so daß sich eine lückenlose Darstellung ergibt.

Durch die Punkte wird eine Kurve gefittet. Im vorliegenden Fall hat sich ein Polynom dritter Ordnung als gute Näherungsfunktion 10 ergeben. Die Güte der Näherungsfunktion 10 läßt sich aufgrund statistischer Kriterien überprüfen. Diese Funktion ergibt für den untersuchten Bereich des Massendickenmarkers 8 das Verhältnis von I₂ zu I₁ für den elementunspezifischen Untergrund.

Vom zuvor erzeugten Bild auf der Kante bei einem Energieverlust E₂ von 160 eV wird nun mit Hilfe der errechneten Funktion und dem Bild vor der Kante der Untergrund subtrahiert, so daß nur das reine Elementsignal übrigbleibt. Dabei entsteht ein drittes Bild, das nur die elementspezifischen Intensitäten I_E angibt. Hierzu wird zunächst für jeden Punkt des ersten Bildes mit der Intensität I_1P mit der Näherungsfunktion die entsprechende Intensität I_2P berechnet und für den entsprechenden Punkt des zweiten Bildes wird die Differenz aus der gemessenen Intensität I_2'P und der berechneten Intensität I_2P als elementspezifische Intensität I_E ermittelt.

Claims (10)

1. Verfahren zur Detektion eines Elementes in einer Probe, bei dem mit einem Transmissionselektronenmikroskop ein erstes Bild der Intensitäten I_1P der Probe bei einem Energieverlust vor der Elementkante gemessen wird und ein zweites Bild der Intensitäten I_2P bei einem Energieverlust im Bereich der Elementkante gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß an einer Ver­ gleichsprobenstelle, die das Element nicht enthält, für verschiedene Punkte die elementunspezifischen Intensitäten I₁ bei einem Energieverlust vor der Elementkante ermittelt werden, die elementunspezifischen Intensitäten I₂ bei einem Energieverlust im Bereich der Elementkante ermittelt werden, aus diesen Werten eine Näherungsfunktion I₂ (I₁) berechnet wird und ein drittes Bild der elementspezifischen Intensitäten I_E berechnet wird, indem für jeden Punkt des ersten Bildes mit der Intensität I_1P mit der Näherungsfunktion die entsprechende Intensität I_2P berechnet wird und für den entsprechenden Punkt des zweiten Bildes die Differenz aus gemessener Intensität I_2'P und berechneter Intensität I_2P als elementspezifische Intensität I_E ermittelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vergleichs­ probe einen Verlauf mit unterschiedlichen Probedicken aufweist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Verlauf die Form einer Rampe hat.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Vergleichsprobe mindestens die Dicke der Probe aufweist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Vergleichsprobe den Hauptbestandteil der Probe enthält.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Vergleichsprobe aus reinem Kohlenstoff oder Silizium besteht.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Intensität eines jeden Punktes als Mittelwert seiner Umge­ bung angegeben wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Güte der Näherungsfunktion I₂ (I₁) durch statische Funktio­ nen bestimmt wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das detektierte Element eine Energieverlustkante zwischen 40 und 300 eV hat.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das detektierte Element Phosphor oder Eisen ist.