DE19710166C1 - Zwei-Schritt-Verfahren der DNA-Amplifikation für MALDI-TOF-Messungen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufbereitung und selektiven Vervielfältigung von Des­ oxy-Ribo-Nukleinsäure (DNA) aus Biomaterial durch PCR (polymerase chain reaction) für die Analyse in Flugzeitmassenspektrometern (TOF) mit matrixunterstützter Laserdesorption und Ionisierung (MALDI) zur Feststellung bestimmter genetischer Merkmale im Biomaterial. Die Erfindung besteht darin, in einem ersten Schritt die zu messenden DNA-Segmente in ge­ wöhnlicher Weise mit dem Verfahren der PCR unmodifiziert zu vervielfältigen, und in einem zweiten PCR-Schritt unter Verwendung von modifizierten Substraten (den zur PCR verwende­ ten Nukleinsäuren) und besonders vorbereiteten Primern zu solchen DNA-Analogen zu verviel­ fältigen, die in besonderer Weise für die Ionisierung durch MALDI geeignet sind. Die Vorbe­ reitung der Primer besteht insbesondere im Einfügen einer geladenen Gruppe, die die Ionisie­ rung verbessert, und die Modifizierung der Substrate dient dazu, die negativen Ladungsgrup­ pen an der Phosphorsäuregruppe des DNA-Rückgrats zu neutralisieren. Es ist besonders zweckmäßig, die DNA für die letzte PCR-Verdoppelung an einer Oberfläche zu immobilisie­ ren, beispielsweise auf einer fertigen MALDI-Schicht, die sich auf magnetischen Kügelchen (magnetic beads) befindet. Im zweiten Schritt wird außerordentlich wenig Reagenz eingesetzt, daher ist es auch preiswert möglich, hier isotopenangereichertes Material einzusetzen, um das Massenauflösungsvermögen zu erhöhen.

Stand der Technik

Das "genetische Fingerabdruckverfahren" ("DNA fingerprinting" oder "DNA typing") revolu­ tioniert zur Zeit die individuelle Identifizierung und die Charakterisierung der Erbanlagen (einschließlich der Anlagen zu Krankheiten) von Menschen, Tieren und Pflanzen. Es beruht letztendlich auf der Molekulargewichtsbestimmung selektiv vervielfältigter, hochvariabler DNA-Segmente ("hypervariable DNA regions", "polymorphic DNA segments"), beispielsweise sogenannter Mikrosatelliten (oder auch STR genannt = short tandem repeats), die aus einer variierenden Zahl von Wiederholungen einer kleinen Sequenz von zwei bis fünf Nukleotiden bestehen, aber auch anderer polymorpher Formen, wie zum Beispiel die der 2-alleligen Poly­ morphismen, die auf Punktmutationen beruhen. Die Messung der Molekulargewichte geschieht zur Zeit noch durch das langsame und nicht voll automatisierbare Verfahren der Polyacryl­ amid-Gelelektrophorese (PAGE). Alle diese Arten der Genotypisierung können aber wesent­ lich besser und genauer durch massenspektrometrische Messungen der Molekulargewichte angegangen werden, wobei für die letztere Art der Polymorphismen besondere Arten der Pro­ benvorbereitung mit einem mutationsabhängigen Zerschneiden der DNA erforderlich sind.

Die Medizin kennt heute weit über 3000 monogene Krankheiten, die auf solche mutierten Ver­ änderungen einzelner Gene zurückzuführen sind, die noch weiter verbreiteten polygenen Krankheiten sind noch weitgehend unerforscht. Es steht zu erwarten, daß wir in fünf Jahren alle Gene kennen, in zehn Jahren alle Mutationen. Es sind heute für den Menschen bereits etwa 10000 Mikrosatelliten bekannt, es ist zu erwarten, daß es mehr als zehnmal so viele gibt.

Die DNA besteht bekanntlich aus zwei komplementären Ketten von vier sich abwechselnden Nukleotiden, deren Reihenfolge den genetischen Code bilden. Die Nukleotide bestehen jeweils aus einem Zucker (Ribose), einer Phosphorsäuregruppe und einer Base. Je zwei Basen sind zueinander komplementär. Zucker und Phosphorsäure bilden die fortlaufende Kette der DNA (oder das sogenannte Rückgrat), die vier charakteristischen Basen sind jeweils seitliche Ab­ zweigungen, sie sind an der Phosphorsäuregruppe befestigt. Die beiden komplementären Ket­ ten der DNA sind in Form einer Doppelhelix verbunden, wobei jeweils zwei komplementäre Nukleotide über Wasserstoffbrücken zwischen den Basen miteinander verbunden sind.

Grundlage des Fingerprint-Analysenverfahren ist die selektiv arbeitende PCR ("polymerase chain reaction"), eine einfache Vervielfältigungsmethode für gezielt aussuchbare DNA-Stücke im Reagenzglas, die erst 1983 von K. B. Mullis (dafür Nobelpreis 1993) entwickelt wurde und nach der Einführung temperaturstabiler Polymerasen einen beispiellosen Siegeszug durch die genetischen Laboratorien angetreten hat. Die heute durch dieses Verfahren ausführbar gewor­ denen gelelektrophoretischen Analysen geringster Anfangsmengen von DNA werden in soge­ nannten Sequenzern auf PAGE-Basis durchgeführt (PAGE = Polyacrylamid-Gelelektropho­ rese). Dieser Art von Analyse wird jedoch von Fachleuten keine Zukunft vorhergesagt, da sie sich durch häufig auftretende, verschiedenartige Artefakte einer oft versuchten Automatisie­ rung immer wieder entzieht und daher sehr personalaufwendig ist. Außerdem ist sie langsam und durch einen relativ hohen Verbrauch an Reagenzien auch recht teuer. Dieses Verfahren war eine Pioniermethode, erweist sich aber zunehmend als Engpaß für die weitere Verbreite­ rung der Methode.

Ein mehrversprechendes Verfahren ist die Kapillarelektrophorese mit einer Vielzahl von Kapil­ laren, die aber noch nicht zu industriell hergestellten, kommerziellen Geräten geführt hat. Bis­ lang sind solche Geräte mit nur einer einzigen Kapillare erhältlich.

PCR ist die gezielte Vervielfältigung eines genau ausgesuchten Stückes der zweisträngigen DNA. Die Auswahl des DNA-Segments erfolgt durch ein sogenanntes Paar von Primern, zweier DNA-Stücke mit je etwa 20 Basen Länge, die (etwas verkürzt und vereinfacht be­ schrieben) die beiderseitigen Enden des ausgesuchten DNA-Stückes codieren. Die Vervielfälti­ gung erfolgt durch ein Enzym namens Polymerase, das eine chemische Fabrik in einem Mole­ kül darstellt, in einem einfachen Temperaturzyklus. Die PCR-Reaktion läuft in wäßriger Lö­ sung ab, in der wenige Moleküle der Ausgangs-DNA und genügende Mengen an Polymerase, Primern, Nukleinsäuren und Stabilisatoren vorhanden sind. In jedem Temperaturzyklus (beispielsweise Aufschmelzen der Doppelhelix bei 92°C, Hybridisieren der Primer bei 43°C, Wiedervervollständigung zu einer Doppelhelix durch Anbau der Substrate durch die Polymera­ se bei 72°C) wird das ausgewählte DNA-Segment im Prinzip verdoppelt. In 30 Zyklen werden also aus einem einzigen Doppelstrang der DNA als Ausgangsmaterial rund eine Milliarde DNA-Segmente erzeugt. (In strenger Beschreibung hybridisieren die beiden Primer auf den beiden verschiedenen Strängen der DNA und die Verkürzung auf das DNA-Segment zwischen den Primern tritt erst statistisch bei weiterem Vervielfachen auf).

Die Polymerase kann unter optimalen Bedingungen etwa 500 bis 1000 Basen pro Sekunde an den Primer anbauen. Bei genügendem Überschuß an Primern, Polymerase und Substraten hängt die Zykluszeit praktisch nur von der Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeit ab, die wie­ derum vom Flüssigkeitvolumen, Gefäßvolumen, Wärmeleitfähigkeit u. a. abhängt. Auf jeder Temperaturstufe sind im Prinzip nur wenige Sekunden vonnöten.

Die Primer werden normalerweise ein Teil der vervielfältigten DNA-Segmente. An den künst­ lich hergestellten Primern lassen sich daher chemische Gruppen anbauen, die für die spätere Detektion benutzt werden können (beispielsweise fluoreszierende Gruppen).

Durch die Zugabe nur eines Primerpaares lassen sich uniforme DNA-Segmente vervielfachen. Werden jedoch gleichzeitig mehrere verschiedenartige Primerpaare zugegeben, so werden auch gleichzeitig mehrere DNA-Segmente vervielfältigt ("multiplexed PCR").

Diese Art der Multiplex-PCR wird häufig angewandt und hat oft besondere Vorteile. Für das sogenannte "Fingerprinting" zur Identifizierung von Individuen durch DNA-Segmente varia­ bler Länge (Methoden der "VNTR = Variable Number of Tandem Repeats" oder "AMP-FLP = Amplified Fragment Length Polymorphism") macht es die Analysen schneller. Dabei kann durch die Wahl der Primer, die das mittlere Molekulargewicht der DNA-Segmente bestimmen, erreicht werden, daß die Variationen der Molekulargewichte der durch die verschiedenen Pri­ merpaare gebildeten DNA-Segmente sich nicht oder nur selten überlappen. Diese Art der Mul­ tiplex-PCR bedingt einen Analysator, der zur gleichzeitigen Messung eines großen Bereichs der Molekulargewichte fähig ist.

Besondere Vorteile hat das Verfahren zur Identifizierung von infektiösen Lebewesen, da bei­ spielsweise gleichzeitig 20 Bakteriensorten (oder Viren, Hefen, Pilze) mit einer einzigen PCR- Vervielfältigung nachgewiesen werden können.

Es ist zu erwarten, daß massenspektrometrische Messungen des Molekulargewichts mit weit höherer Empfindlichkeit und weit höheren Geschwindigkeiten möglich sein werden als mit der Gelektrophorese. Der gegenwärtig rasche Fortschritt in der MALDI-Technik führt zu hohem Automatisierungsgrad der Probenionisierung und zu kurzen Analysenzeiten pro Probe. Es werden damit Molekulargewichtsbestimmungen auch sehr großer Analytmoleküle in Mengen von einigen hundert Attomol in Meßdauern von wenigen Sekunden möglich. Auf einem Pro­ benträger können viele Tausende von Proben untergebracht werden. Die Automatisierung und die hohe Dichte an Proben eröffnen die Möglichkeit zu einer massiv-parallelen Verarbeitung von einigen zehntausend Proben pro Tag auch in der massenspektrometrischen Analyse.

Massenspektrometer mit MALDI- oder ESI-Technik (ESI = Elektrosprüh-Ionisierung) werden bereits für die Sequenzierung der DNA nach dem Sanger-Schema unter Benutzung von PCR- Verfahren eingesetzt, siehe dazu PCT/US 94/00193 (WO 94/16101, H. Köster).

PCT/GB 94/02527 (WO 95/14108, M. A. Reeve et al.) beschreibt grundlegend die massen­ spektrometerische DNA-Sequenzanalyse durch sehr genaue Massenbestimmung unter Ver­ wendung des an sich bekannten Verfahrens der Primer-Verängerung (primer extension). Die Offenlegung PCT/US 96/06116 (WO 96/37630 J. A. Monforte et al.) legt dar, daß man unter Befestigung der Primer an einer Oberfläche und mit Einbau von Spaltstellen in die anzulagern­ de DNA zu kürzeren DNA-Verlängerungen (primer extension) kommen kann, als unter vollem Einschluß der Primer, was insbesondere als günstig für die massenspektrometrische Analyse angesehen wird. Eine Vereinigung der Probenvorbereitungsgefäße mit der MALDI-Oberfläche auf einer einzigen Dünnschicht ist in DE 196 43 921 (W. S. Hancock et al.) beschrieben. Eine Befestigung von amplifizierten DNA-Mikrosatelliten auf der Oberfläche der MALDI-Matrix für die massenspektrometrische Analyse beschreibt DE 195 43 065 (A. Olek).

Einen Überblick über den Stand massenspektrometrischer DNA-Analysen gibt der Artikel "Analysis of Polymerase Chain Reaction-Amplified DNA Products by Mass Spectrometry Using Matrix-Assisted Laser Desorption and Electrospray: Current Status" by M. J. Doktycz et al., Analytical Biochemistry 230, 205-214 (1995).

In der Literatur werden übereinstimmend folgende Probleme der Ionisierung von DNA im MALDI-Prozeß beschrieben: (1) Geringe Empfindlichkeit. Diese ist um mindestens zwei Zeh­ nerpotenzen geringer als für Proteine. (2) Bildung von Addukten durch die statistisch wech­ selnde Anlagerung von Kationen, besonders der ubiquitären Alkaliionen, und von Matrixionen der MALDI-Präparation. Diese führt zu mangelnder Massenauflösung und mangelnder Mas­ sengenauigkeit. (3) Fragmentierung der instabilen DNA-Moleküle. Diese führt zu unerwünsch­ ten Fragmentionen, die beispielsweise eine Multiplex-PCR unmöglich machen.

Die massenspektrometrische DNA-Analyse ist daher heute auf Längen der DNA von etwa 40 bis 60 Basen beschränkt. Darüber ist die Genauigkeit der Massenbestimmung durch Addukt­ bildung so beschränkt, daß nicht mehr auf ein Nukleotid genau gemessen werden kann. Die Massenauflösung ist noch stärker beschränkt.

In PCT/GB 96/00476 (WO 96/27681, I. Gut et al.) ist eine Methode beschrieben, wie man DNA-Analoge herstellen kann, die für den MALDI-Prozeß wesentlich besser geeignet sind. Es lassen sich für die MALDI-Massenspektrometrie in die Primer elektrisch geladene Gruppen einbauen, die den MALDI-Prozeß der Ionisierung so unterstützen, daß eine sehr hohe Ionen­ ausbeute und damit eine hohe Empfindlichkeit erreicht wird. Anderseits lassen sich die negati­ ven Gruppen des DNA-Rückgrats neutralisieren, was sowohl für eine bessere Stabilität sorgt, als auch besonders die Adduktbildung unterdrückt.

Diese Neutralisierung läßt sich nach den Ausführungen in diesem Patent beispielsweise da­ durch erreichen, daß man bereits zur PCR-Vervielfältigung Nukleotide benutzt, bei denen die negativ geladene OH-Gruppe an der Phosphorsäure durch eine SH-Gruppe ausgetauscht ist. Nach vollendeter PCR-Vervielfachung kann man dann gezielt das Proton der SH-Gruppe durch eine Alkylierungsreaktion austauschen und so das Rückgrat neutralisieren. Die PCR- Reaktion läuft bei Anwendung geeigneter Polymerasen auch mit SH-Nukleotid-Substraten ab, jedoch besteht die Gefahr erhöhter Fehlerraten dieser Reaktionen.

Noch eleganter wäre es, von vornherein neutralisierte (beispielsweise alkylierte oder fluoralky­ lierte) Nukleotide in die PCR-Reaktion einzuführen. Doch steigt die Fehlerrate der PCR- Reaktion dann so stark an, daß eine saubere Vervielfachung nicht mehr möglich ist.

Die zu messenden vervielfältigten DNA-Segmente müssen dann vor der Analyse mit Hilfe der MALDI-Ionisierung noch entsprechend von allen in den PCR-Reaktionen benutzten Reagenzi­ en und Puffern gereinigt werden.

In der Biochemie und der Molekulargenetik haben sich für die parallele (synchrone) Verarbei­ tung vieler Proben sogenannte Mikrotiterplatten durchgesetzt. Es gibt bereits heute kommer­ ziell erhältliche Probenvorbereitungssysteme, die mit Mikrotiterplatten arbeiten. Diese enthiel­ ten ursprünglich auf einer nutzbaren Fläche von 72 mal 108 Millimeter 96 kleine Reaktionsge­ fäße in einem 9-mm-Raster. Heute haben sich Platten der gleichen Größe mit 384 fest im Kunststoff eingelassenen Reaktionsgefäßen im 4,5-mm-Raster durchgesetzt. Platten mit 864 Reaktionsgefäßen im 3-mm-Raster sind im Kommen, und noch viel höhere Dichten sind in Diskussion.

Die häufig "massiv-parallel" genannte Verarbeitung von Proben, beispielsweise in der moleku­ laren Genetik, besteht nun einerseits darin, nicht nur mit einer einzigen solchen Mikrotiterplatte zu arbeiten, sondern mit einer großen Anzahl solcher Platten parallel. Beispielsweise können bei gleichzeitiger Behandlung von 120 solcher Platten in einer einzigen PCR-Apparatur mehr als 46000 DNA-Proben gleichzeitig in einer Zeit von etwa 3 Stunden jeweils milliardenfach vervielfältigt werden. Andererseits ist zu erwarten, daß sich die PCR-Zeit für eine Vermilliar­ denfachung mit miniaturisierten Reaktionssystemen in naher Zukunft auf weniger als 10 Minu­ ten reduzieren wird, wobei sich durch die Verkleinerung der Reaktionssysteme auf wenige Mikroliter Inhalt mehr als Tausend solcher Reaktionsysteme auf der Fläche einer heutigen Mi­ krotiterplatte unterbringen lassen. Beispielsweise ergeben sich auf der Fläche heutiger Mikroti­ terplatten 1536 Probengefäße im 2,25-mm-Raster oder 3456 Gefäße im 1,5-mm-Raster. Die Einführung der Mikrosystemtechnik kann zu weiterer Verkleinerung führen. Die synchrone Übertragung aller Proben aus diesen Mikroreaktoren auf MALDI-Trägerplatten wird folgen.

MALDI (matrixunterstützte Laserdesorption und Ionisierung) ist ein Ionisationsverfahren für großmolekulare Analytsubstanzen auf Oberflächen. Die Analytsubstanzen werden zusammen mit geeigneten Matrixsubstanzen mittlerer Größe in Lösung auf eine Oberfläche gebracht, dort eingetrocknet und mit einem Laserpuls von wenigen Nanosekunden Dauer bestrahlt. Es ver­ dampft eine geringe Menge an Matrixsubstanz, einige Moleküle davon als Ionen. Die sehr ver­ dünnte Analytsubstanz, deren Moleküle in der Verdünnung vereinzelt sind, wird dabei mit ver­ dampft, auch wenn ihr Dampfdruck normalerweise für eine Verdampfung nicht ausreicht. Die relativ kleinen Ionen der Matrixsubstanz reagieren mit den großen Molekülen der Analytsub­ stanz mit der Folge, daß die Analytsubstanzmoleküle durch Protonenübergang als Ionen zu­ rückbleiben.

Eine besondere Art des MALDI bedient sich der Mischpräparationen in amorphen Lösungen. So kann man Matrixsubstanzen als feste Lösung in eine Lackschicht aus explosivem Material, beispielsweise Nitrozellulose, bringen. Diese Lackschicht ist hochadsorptiv und kann große Biomoleküle auf ihrer Oberfläche binden. Diese Art der MALDI-Präparation hat Vorteile: sie läßt sich leicht vorab herstellen, und die Analytmoleküle können sehr leicht aufgebracht wer­ den.

Für den höheren Massenbereich von etwa 100000 atomaren Masseneinheiten, also etwa ein­ strängiger DNA mit etwa 250 Basen, muß erwartungsgemäß noch ein weiterer Effekt auftre­ ten, der das Massenauflösungsvermögen begrenzt und in der heutigen Literatur über DNA- Analysen noch gar nicht beschrieben ist. Durch die Isotopie der natürlich vorkommenden Ele­ mente, hier hauptsächlich durch die Isotopie des Kohlenstoffs mit 98,9% ¹²C und 1,1% ¹³C, entstehen Isotopenverteilungen der molekularen Ionen, deren Isotopenmuster nicht mehr mas­ senspektrometrisch aufzulösen ist. Es entsteht dadurch ein einziger, relativ breiter Peak, der das Massenauflösungsvermögen beschränkt. Er hat für eine DNA vom Molekulargewicht 100000 atomarer Masseneinheiten eine Halbwertsbreite von etwa 20 atomaren Masseneinhei­ ten, entsprechend einem Auflösungsvermögen von etwa R = 5000.

Die Nukleotide der DNA haben nur geringe Unterschiede der Massen, die zwischen den vier Nukleotiden differenziell von 9 bis 20 atomaren Masseneinheiten reichen. Möchte man, bei­ spielsweise für die schnelle Aufklärung von Punktmutationen, sehr genaue Massenbestimmun­ gen vornehmen, so ist diese Halbwertsbreite der Isotopenverteilung bereits hinderlich. Hohe Genauigkeiten der Massenbestimmung kann man beispielsweise durch die Verwendung von Flugzeitmassenspektrometern mit Reflektoren, insbesondere aber auch durch die Verwendung von Cyclotron-Resonanzmassenspektrometern mit Fourier-Analyse der Schwingungen errei­ chen.

Eine Lösung für dieses Problem liegt mit der Verwendung von isotopenangereicherten Rea­ genzien auf der Hand, jedoch stehen im allgemeinen die hohen Kosten einer solchen Lösung der Verwendung entgegen. In der normalerweise angewandten PCR-Technik werden die Rea­ genzien mit Primern und Polymerasen gemischt und in großem Überschuß eingesetzt, ein Rückgewinnung der überschüssigen, wertvollen Substratlösungen ist kaum möglich.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein kostengünstiges PCR-Verfahren zu finden, mit dem sich möglich einfach und genügend fehlerfrei ausreichende Mengen von DNA-Segmenten mit neu­ tralem Rückgrat und eingebauter Ladung für den MALDI-Prozeß der massenspektrometri­ schen Messung nach PCT/GB 96/00476 herstellen, waschen und in eine MALDI-Präparation einbringen lassen.

Beschreibung der Erfindung

Es ist der Grundgedanke der Erfindung, den DNA-Strang mit dem genetischen Merkmal in einem ersten Verfahrensschritt zunächst mit einem normalen, sicher arbeitenden PCR-Prozeß genügend oft zu unmodifizierten DNA-Segmenten zu vervielfältigen, dann zu waschen und damit von den bisher verwendeten Reagenzien für die PCR-Reaktion zu befreien, und dann in einem zweiten Verfahrensschritt unter Zugabe entsprechender modifizierter Substrate eine PCR-Reaktion zum Duplizieren der DNA zu verwenden, die nach PCT/GB 96/00476 zu einer modifizierten, leicht neutralisierbaren DNA-Variante oder sogar direkt zu einem neutralisierten DNA-Analogen führt. Selbst wenn bei dieser letzten Duplizierungsreaktion einige Prozente an fehlerhaften DNA-Kopien gebildet werden, ist die nachfolgende massenspektrometrische Ana­ lyse durch diese geringen Mengen an Beimengungen nicht gefährdet.

Es ist ein weiterer Gedanke dieser Erfindung, nach der normalen PCR-Vervielfältigung die erzeugten DNA-Segmente für den Prozeß des Waschens an einer Oberfläche zu immobilisie­ ren. Die Immobilisierung kann durch Hybridisieren an ein DNA-Stück geschehen, welches an einer Oberfläche befestigt ist. Da dazu Einzelstränge notwendig sind, die nach dem Schmelzen und Abkühlen aber schon unvermeidlich mit den Primern der Erstschritt-PCR hybridisiert sein werden, ist es ein weiterer Gedanke der Erfindung, dazu einen Primer zu benutzen, der an an­ derer Stelle im zu messenden DNA-Segment angreift, am günstigsten neben dem Primer des Erstschritts.

Es ist ein weiterer Gedanke der Erfindung, daß dieses DNA-Stück ein Primer ist, der für den zweiten Schritt der PCR-Vervollständigung des DNA-Segments benutzt wird. Dieser Primer kann bereits für die Neutralisierung modifiziert oder bereits neutralisiert sein.

Es entsteht durch den PCR-Prozeß der Vervollständigung des DNA-Segments mit modifizier­ ten Substraten eine doppelsträngige DNA (Doppelhelix), deren einer Strang aus dem modifi­ zierten, erwünschten DNA-Analogen besteht, das für die Neutralisierung vorbereitet oder schon neutral ist, und dessen anderer Strang aus normaler, nicht modifizierter DNA besteht. Der Strang mit den erwünschten DNA-Analogen ist an der Oberfläche befestigt. Wird die Doppelhelix durch Temperaturerhöhung aufgetrennt ("geschmolzen"), so können die unbe­ festigten Stränge mit nicht modifizierter DNA weggewaschen werden. Das gewaschene, er­ wünschte DNA-Analoge kann dann neutralisiert (falls noch nicht neutral), von der Oberfläche gelöst, auf eine MALDI-Schicht aufgebracht und analysiert werden.

Es ist ein weiterer Grundgedanke der Erfindung, die Oberflächen von austauschbaren Parti­ keln, insbesondere von kleinen Magnetkügelchen (sogenannter "magnetic beads") für die Be­ festigung der Primer zu verwenden. Diese Kügelchen lassen sich in geeigneter Weise mit Ma­ gnetpinzetten bewegen, zufügen oder entfernen.

Es ist ein weiterer Grundgedanke der Erfindung, die Oberflächen zur Bindung der DNA- Segmente bereits mit einer MALDI-Grundlage versehen zu haben, so daß diese Oberfläche sofort für den MALDI-Prozeß zur Verfügung steht. Die Primer sind also an der MALDI- Schicht befestigt, beispielsweise an der Oberfläche einer Nitrozellulose-Lackschicht, die genü­ gend freie OH-Stellen für Bindungen aufweist. Es kann sich dabei um ebene Oberflächen, aber auch um Partikeloberflächen, insbesondere die von Magnetkügelchen, handeln. Letztere kön­ nen auf einen Probenträger mit magnetischen Haltestellen überführt und dort dem MALDI- Prozeß ausgesetzt werden.

Der Bedarf an Reagenzien für den zweiten PCR-Schritt ist außerordentlich gering. Da die Pri­ mer für den zweiten Schritt an der Oberfläche befestigt sind, braucht nur eine Lösung mit Po­ lymerase und modifizierten Substraten, die keinerlei spezifischen Reagenzien (Primer) enthält, zugegeben zu werden. Die überschüssige Lösung kann nach der Herstellung der modifizierten DNA-Stränge zurückgewonnen werden.

Es ist daher ein weiterer Gedanke der Erfindung, für Massenbestimmungen hoher Genauigkeit an sich teure, isotopenangereicherte Reagenzien einzusetzen, um das massenspektrometrische Auflösungsvermögen zu erhöhen. Durch den geringen Verbrauch und durch die Wiederge­ winnbarkeit der überschüssigen Lösung bleibt der Preis dieser isotopenangereicherten Rea­ genzien erträglich. Eine Verwendung von Kohlenstoff, der auf 99,8% ¹²C angereichert ist, würde die Halbwertsbreite des Isotopenmusters auf weniger als 5 Masseneinheiten reduzieren. Damit ist eine Massenbestimmung möglich, die auf etwa eine Masseneinheit genau ist.

Die vier Nukleotide haben verschiedene Massen; diese unterscheiden sich im Maximum um fast 10%. Es läßt sich also aus einer Molekulargewichtsbestimmung bei größerer Anzahl von Nu­ kleotiden nicht die Anzahl der Basen ermitteln, da das Verhältnis der Nukleotide zueinander nicht bekannt ist. Es ist jedoch möglich, im letzten Schritt eine PCR-Kopie mit einer "univer­ sellen" Base zu erzeugen. Eine solche universelle Base ist eine Base, die komplementär zu allen vier Basen ist und daher an allen Stellen von der Polymerase eingebaut wird. Es ist nun eine weitere Idee dieser Erfindung, im letzten Schritt der PCR nur diese universelle Base zu ver­ wenden. Das Ergebnis ist ein DNA-Analogon, das nur einen einzigen Basentyp, eben diese universelle Base, enthält, aber in seiner Länge (das heißt: in der Anzahl seiner Basen) genau dem Original entspricht. Die massenspektrometrische Bestimmung des Molekulargewichts ergibt dann sehr genau die Anzahl der Basen dieses DNA-Analogons und damit des ursprüng­ lichen DNA-Abschnitts zwischen den Primern.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt ein vereinfachtes Schema eines DNA-Doppelstranges. Die vier Nukleotide ko­ dieren in bekannter Weise die Gene, jeweils komplementäre Basen sind aneinander gekoppelt und formen den helixförmig gewendelten Doppelstrang. Die Helixstruktur ist nicht gezeigt.

In Fig. 2 ist die DNA des einfachen Schemas "aufgeschmolzen", die beiden Einzelstränge sind voneinander getrennt. Das geschieht bei etwa 90°C.

In Fig. 3 sind die beiden Einzelstränge mit den beiden Primern hybridisiert. Die Primer stellen für die Polymerase einen Vektor dar, der die Aufbaurichtung vorgibt. Diese Richtungen sind durch Pfeile symbolisiert. Die Hybridisierung findet bei etwa 40°C statt, bei etwa 70°C arbei­ tet die Polymerase im Temperaturoptimum und regeneriert die Doppelstränge durch den An­ bau von Nukleotiden aus den Substraten. Es entstehen dann zwei Doppelstränge.

Fig. 4 zeigt die Hybridisierung eines Einzelstrangs bei etwa 40°C mit einem zweiten Primer, der auf einer Oberfläche fixiert ist. Wieder ist die Aufbaurichtung durch einen Pfeil symboli­ siert. Der Primer besteht aus modifizierter DNA, symbolisiert durch die Kreuzchen.

Fig. 5 zeigt den durch die Arbeit der Polymerase mit modifizierten Substraten bei etwa 70°C vervollständigten Doppelstrang. Der neue Teil besteht vollständig aus modifizierter DNA, symbolisiert durch die Kreuzchen.

Fig. 6 stellt den erschmolzenen, and der Oberfläche befestigten Einzelstrang aus modifizierter DNA dar. Der zweite, unmodifizierte Strang ist durch Waschen entfernt. Der modifizierte Ein­ zelstrang kann durch Auflösen der Bindung an der Oberfläche wieder in Lösung gebracht und auf eine MALDI-Schicht aufgebracht werden.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen

Das Verfahren wird insbesondere für das sogenannte "Fingerprinting" eingesetzt, bei dem so­ genannte Mikrosatelliten variabler Länge oder STR (short tandem repeats) gemessen werden.

Deren Länge läßt sich leicht über eine massenspektrometrische Molekulargewichtsbestimmung bestimmen. Als Primer werden Kopien aus beidseitig anschließenden DNA-Regionen geringer Variabilität benutzt.

Die schwerer direkt meßbaren Punktmutationen lassen sich durch biochemische Mittel, bei­ spielsweise durch Hybridisierung mit anschließendem enzymatischen Zerschneiden (oder mit anschließender chemischer Behandlung) gezielt in zwei DNA-Teilstücke zerlegen, und damit wieder in Analytmoleküle umwandeln, deren charakteristisches Molekulargewicht leicht zu messen ist.

In einem besonders bevorzugten Verfahren werden zunächst in üblicher Weise aus der ausge­ lösten DNA einer Bioprobe mit mindestens 10 bis höchstens 1000 Zellen (beispielsweise etwa 100 Zellen aus einer Haarwurzel) durch jeweilige Verdoppelung in 26 PCR-Zyklen etwa 600 Millionen bis 60 Milliarden DNA-Segmente gebildet, das entspricht etwa 10 bis 1000 Femto­ mol an DNA-Segmenten. Die letzten Zyklen sind in Fig. 1, 2 und 3 schematisch dargestellt, wobei allerdings die Längen der DNA-Segmente stark verkürzt gezeigt sind. Die Primer haben normalerweise Längen von etwa 20 Basen.

Fig. 1 zeigt einen durch Selektion mit den Primern verkürzten DNA-Doppelstrang, der bei etwa 70°C durch die Polymerase vervollständigt wurde. Fig. 2 zeigt die beiden bei etwa 90°C aufgeschmolzenen Einzelstränge, an die sich bei etwa 40°C die endständigen Primer angesetzen, wie in Fig. 3 gezeigt. Die Primer, die dem Gemisch aus Polymerase und Substrat beigegeben werden, bestimmen die Auswahl des DNA-Stückes, das dabei vervielfacht wird. Das Substrat besteht in bekannter Weise aus den vier Triphosphat-Nukleotiden, aus denen die Nukleotide von der Polymerase Stück für Stück als komplementäre Kopie des Stranges an den Primer angebaut werden, bis das Ende des komplementären Stranges erreicht ist. Es entstehen dann zwei in Form einer Doppelhelix verbundene DNA-Segmente, wie sie prinzipiell (aller­ dings nur in ebener Anordnung, nicht in Form der gewendelten Doppelhelix) in Fig. 1 gezeigt sind.

Nach diesen 26 Zyklen wird der Lösung, in der sich die DNA nach Abkühlung von 90°C auf 40°C im Einzelstrangzustand wie in Fig. 3 befindet, ein Magnetkügelchen beigegeben, das auf der Oberfläche eine genau festgelegte Menge (beispielsweise fünf Femtomol) eines modifi­ zierten Zweitschritt-Primers fixiert enthält. Dieser Primer ist aus modifizierter, rückgrat­ neutralisierter DNA gebildet und enthält eine chemische Gruppe mit einer positiven Ladung ("charge tag"), wie in PCT/GB 96/00476 beschrieben, beispielsweise durch Anhängen einer quaternären Ammonium-Gruppe.

Ein winziges Magnetkügelchen von nur drei Mikrometer Durchmesser vermag auf seiner Oberfläche etwa 10 bis 100 Femtomol zu binden. Die Bindung an die Oberfläche ist so gestal­ tet, daß sie leicht gelöst werden kann, beispielsweise einfach durch Änderung des pH-Wertes der Lösung, oder reaktiv durch ein Schneideenzym. Der Zweitschritt-Primer hat eine Codie­ rung, die einem DNA-Stück neben dem bereits anhybridisierten Erstschritt-Primer der ersten PCR-Schritte komplementär entspricht.

Die in Lösung befindlichen DNA-Einzelstränge hybridisieren sich nun an die festsitzenden Zweitschritt-Primer, wie in Fig. 4 gezeigt. Dabei wird nur einer der komplementären DNA- Stränge benutzt. Es werden durch die Dosierung der fixierten Primer vorbestimmte Mengen an DNA gebunden, beispielsweise fünf Femtomol, damit im Massenspektrometer eine bestimmte Signalgröße erreicht wird. Der Überschuß an DNA und die bisherige PCR-Reagenzienlösung werden nun fortgewaschen, und eine Lösung aus Polymerase und Substraten mit modifizierten Nukleotiden wird zugegeben. Diese Lösung enthält keine analysenspezifischen Primer und kann daher rückgewonnen und wieder benutzt werden. Die Nukleotide dieser Lösung sind an der Phosphorsäuregruppe neutralisiert, beispielsweise durch Alkylierung. In PCT/GB 96/00476 sind verschiedenartige Möglichkeiten für diese Neutralisierung detailliert beschrieben.

Eine Erwärmung auf etwa 70°C führt nun zur Vervollständigung des DNA-Stranges, wobei als Kopie ein Strang aus modifizierter DNA gebildet wird, der mit der unmodifizierten DNA- Kopiervorlage einen Doppelstrang bildet, wie in Fig. 5 schematisch dargestellt. Dieser PCR- Prozeß verläuft wegen der Modifizierung der Substrate nicht vollkommem fehlerfrei, es wer­ den einige Prozent fehlerhafte DNA gebildet, die jedoch den massenspektrometrischen Nach­ weis nicht stört, da ja das Signal eine vorprogrammierte Höhe haben muß. Die überschüssige Lösung für den PCR-Prozeß kann wieder abgezogen und weiterverwendet werden, da sie im wesentlichen unverändert ist.

Diese DNA-Doppelstränge, die an der Oberfläche festsitzen, können nun in einer Waschflüs­ sigkeit bei etwa 90°C erschmolzen werden, worauf die unbefestigten und unmodifizierten DNA-Stränge fortgewaschen werden. Es bleiben die modifizierten DNA-Einzelstränge übrig. Diese sind an der Oberfläche befestigt, wie in Fig. 6 schematisch gezeigt.

In einem weiteren Schritt werden die Einzelstränge durch ein Schneideenzym (oder durch ein­ fache Änderung des pH-Wertes, beispielsweise durch Zugabe von etwas Ammoniak) von der Oberfläche gelöst und mit Hilfe einer Mikropipette auf eine MALDI-Schicht aufgetragen. Die DNA-Stücke werden von der MALDI-Schicht adsorbiert. Nach Eintrocknen der Lösung kann diese Schicht gewaschen werden, um restliche Puffersalze und andere Bestandteile fortzuwa­ schen. Die DNA-Probeflecken sind dann fertig für die Analyse im Massenspektrometer mit einer Ionisierung durch Beschuß mit gepulstem Laserlicht.

Diese Methode, nur im letzten Schritt modifizierte DNA zu erzeugen, hat den Vorteil größerer Sicherheit der PCR-Reaktionen. Würden von Anfang an modifizierte Primer und modifizierte Substrate verwendet, so werden erwartbar in einigen Prozent der Proben Fehler bereits in den ersten PCR-Generationen auftreten, die sich dann im weiteren Verlauf der PCR-Amplifizierung exponentiell fortpflanzen und zu falschen Analysenresultaten führen.

Der Vorteil der Verwendung von Magnetkügelchen liegt darin, daß alle Reaktionen in der sel­ ben Mikrotiterplatte ausgeführt werden können, daß also ein Schritt der Umpipettierung ent­ fällt.

Es ist aber nicht unbedingt notwendig, die DNA von der Oberfläche der Magnetkügelchen zu lösen. Sind die modifizierten Primer an einer unlöslichen MALDI-Schicht befestigt, die sich auf den Kügelchen befindet, so können die Magnetkügelchen mit magnetischen Pinzetten auf die Probenträger des Massenspektrometers übertragen, dort angeklebt oder magnetisch festgehal­ ten und dem MALDI-Prozeß unterworfen werden. Die unlösliche MALDI-Schicht kann bei­ spielsweise aus vernetzter Nitrozellulose bestehen.

Das beschriebene Verfahren kann natürlich vielfältig variiert werden. So brauchen nicht unbe­ dingt Magnetkügelchen für die Fixierung benutzt werden. Es kann beispielsweise ein zweiter Satz an Mikrotiterplatten am Boden der Mikrogefäße mit befestigten, modifizierten Zweit­ schritt-Primern versehen sein. Nach normaler PCR in einem ersten Satz an Mikrotiterplatten wird dann die Lösung in diesen zweiten Satz umpipettiert, und es wird das Waschen und der letzte Schritt der PCR in den Mikrotiterplatten des zweiten Satzes ausgeführt.

Für die DNA-Analytik ist es manchmal erforderlich, auch im hohen Massenbereich sehr genaue Massenbestimmungen vorzunehmen. Hier ist die Breite der Massenpeaks, die durch die Iso­ topenverteilung vorgegeben ist, hinderlich. Es kann aber in diesem Falle eine Lösung von Po­ lymerase mit isotopenangereicherten Substraten verwendet werden. Da diese Lösung wieder­ verwendet werden kann und sich nur äußerst langsam verbraucht, ist selbst bei einem hohen Preis der eingesetzten Reagenzien ein geringer Preis für die einzelne Analyse zu erzielen.

Andererseits ist es häufig erforderlich, die genaue Anzahl der Basen in einem DNA-Segment, das durch die beiden Primer bestimmt ist, zu kennen, ohne daß die Verhältnisse der vier Nu­ kleotide zueinander in diesem Segment genau bekannt sind. In diesem Fall kann man im letzten PCR-Schritt mit nur einer einzigen Basenart arbeiten, die komplementär zu allen vier Nukleoti­ den des zu kopierenden Originals von der Polymerase an den Zweitschritt-Primer angebaut wird. Die Kopie besteht dann nur aus dieser "Universalbase", die allerdings genau so oft vor­ kommt, wie die vier Nukleotide des Originals zusammen. Da die Masse dieser Universalbase bekannt ist, ergibt die Massenbestimmung die genaue Anzahl der Basen des Originals.

Besonders für Zwecke der Sequenzierung nach einem der dazu entwickelten Schemata (wie beispielsweise das bekannte Sanger-Verfahren), für die das massenspektrometrische Verfahren zur Bestimmung der Molekulargewichte von DNA-Teilstücken ebenfalls eingesetzt werden kann, ist die Verwendung der "Universalbase" vorteilhaft. Die Verwendung kalibriert die Ba­ senskala; die Basenskala ist damit nicht mehr von der zufälligen Verteilung der vier Nukleotide in dem zu messenden DNA-Teilstück abhängig.

Claims (11)

1. Verfahren für die biochemische Aufbereitung der DNA aus Biomaterialproben für die massenspektrometrische Analyse durch eine Ionisierung mit matrixunterstützter Laser­ desorption, mit einer Vervielfältigung der durch ein Primerpaar selektiv ausgewählten DNA-Segmente durch PCR, und mit einer solchen Modifizierung der zu analysierenden DNA-Segmente, daß die modifizierten DNA-Segmente in an sich bekannter Weise frag­ mentierungsstabil, leicht zu ionisieren und inert gegen Adduktbildung werden, dadurch gekennzeichnet, daß auf erste PCR-Zyklen mit normaler Vervielfältigung unmodifizierter DNA-Segmente als erstem Schritt nach Reagenzienaustausch ein zweiter Schritt mit min­ destens einem PCR-Zyklus folgt, der die modifizierten DNA-Segmente erzeugt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Einzelstränge vor dem zweiten Schritt an einer Oberfläche fixiert werden und daß im zweiten Schritt nur ein einziger PCR-Zyklus durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Fixierung der einzelsträngi­ gen DNA-Segmente an der Oberfläche modifizierte Primer benutzt werden, die an der Oberfläche befestigt sind und die für den PCR-Zyklus im zweiten Schritt benutzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der oberflächenfixierte, modifi­ zierte Primer für den zweiten Schritt nicht mit einem der beiden Primer des ersten Schrit­ tes sequenz-identisch ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Zweitschritt-Primer ein Stück des DNA-Segmentes neben einem der Erstschritt-Primer codiert.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Fixierung an der Oberfläche auf einer MALDI-Grundschicht erfolgt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche von austauschbaren Partikeln zur Fixierung benutzt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche von magnetisier­ baren Kügelchen zur Fixierung verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die im zweiten Schritt zur PCR verwendete, primer-freie Lösung von Polymerase, Substrate und Puffern zurückgewonnen und wiederverwendet wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß im zweiten Schritt isotopenangereicherte Substrate verwendet werden.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß im zweiten Schritt als Substrat einzig eine Universalbase verwendet wird, die von der Poly­ merase als zu allen vier Nukleotiden komplementär erkannt wird und von ihr zur Herstel­ lung der DNA-Kopie verwendet wird.