DE19650880C1 - Vorrichtung zur Durchführung von Genexpressionsanalysen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung von Genexpressionsanalysen nach dem Oberbegriff des Pa­ tentanspruchs 1, wie sie aus Rosen, B. et al. (1993). Whole mount in situ hybritisation in the mouse embryo: gene expres­ sion in three dimensions. TIG 9, 162-167, bekannt ist.

Die Analyse von Genexpressionsmustern mit Hilfe der sogenann­ ten In-Situ-Hybridisierung (ISH) ist zu einer der wichtigsten Methoden in der modernen Biologie geworden, und es ist abzuse­ hen, daß diese Technik künftig auch in der Medizin eine bedeu­ tende Rolle spielen wird. Bei einer ISH werden mit spezifi­ schen, speziell markierten Sonden die Orte der Genaktivität in ganzen Embryonen, Organen oder Gewebeproben (hier als Probe bezeichnet) nachgewiesen.

Diese Technik ist sehr arbeitsintensiv und erstreckt sich über mehrere Tage, da viele Inkubationen und Waschschritte notwen­ dig sind. Die einzelnen Schritte wurden bisher in Reagenzröhr­ chen durchgeführt, und es waren für die verschiedenen Sonden und Proben jeweils ein eigenes Röhrchen erforderlich. Aus die­ sem Grund war es nur mit erheblichem Aufwand möglich, eine große Anzahl von Proben mit vielen verschiedenen Sonden gleichzeitig zu hybridisieren.

Bei einer ISH sind eine Reihe von experimentellen Anforderun­ gen zu erfüllen. Zunächst werden alle Proben in der gleichen Weise für die ISH vorbehandelt. Bei der eigentlichen ISH ist es dann erforderlich, Gruppen von Proben mit jeweils verschie­ denen Sonden getrennt zu inkubieren. Anschließend werden alle Proben mit den gleichen Puffern gewaschen. Bei den Wasch­ schritten ist es erforderlich, daß die einzelnen Probengrup­ pen, die mit verschiedenen Sonden hybridisiert wurden, weiter­ hin getrennt bleiben.

Aus der US-5,358,871 ist ein Behältnis mit Deckel bekannt, in das Einsätze eingebracht werden können, die das Untersuchungs­ material in einzelnen Reaktionskammern enthalten, wobei die untere Öffnung der Reaktionskammern durch eine den Flüssig­ keitsaustausch ermöglichende Membran geschlossen ist. Dabei ist es zwar möglich, die Proben mit unterschiedlichen Sonden zu inkubieren, jedoch können die Waschschritte nicht gemeinsam ausgeführt werden. Des weiteren sind aus der US-5,554,536 und aus der US-5,326,533 Behältnisse mit Deckeln und Einsätzen be­ kannt, bei denen die Waschschritte gemeinsam erfolgen. Auf­ grund des fehlenden hermetischen oberen Abschlusses der Reak­ tionskammern kann jedoch keine individuelle Inkubierung des Probenmaterials mit verschiedenen Sonden erfolgen.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung der e. g. Art zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe routinemäßige Ab­ läufe der ISH parallel durchgeführt werden können.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die Merkmale des Pa­ tentanspruchs 1. Die Unteransprüche beschreiben vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt, in einem wesentlich vereinfachten Verfahren, die Hybridisierung vieler Probengrup­ pen mit mehreren verschiedenen Sonden zur gleichen Zeit durch­ zuführen. Dies führt zu einer enormen Zeitersparnis, da der Experimentator nur noch einen Bruchteil der bisherigen Zeit für die einzelnen Prozeduren aufwenden muß.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Ausführungsbei­ spiels mit Hilfe der Figuren näher erläutert. Dabei zeigt die Fig. 1 den Einsatz und die Fig. 2 Gehäuse mit Deckel der Vorrichtung.

Die Fig. 1 zeigt den quaderförmigen Einsatz 4, der in diesem Fall beispielsweise sechs Reaktionskammern enthält. An der Un­ terseite des Einsatzes 4 ist ein mit dem Boden verklebtes Kunststoffnetz 7 angedeutet, das die Böden der Reaktionskam­ mern 1 bildet. An der Unterseite befinden sich auch die Ab­ standshalter 5. Die Reaktionskammern 1 sind oben mit Gewinden versehen, in die die Verschlüsse 6 eingeschraubt werden können. Die Dichtung zwischen den Verschlüssen 6 und dem Einsatz 4 er­ folgt beispielsweise mit Hilfe von Dichtringen, hier nicht dargestellt. Die Oberseite des Einsatzes enthält Ausnehmungen 9 zum Einsetzen von Hebegriffen.

Die Fig. 2 zeigt den Behälter 2, der eine quaderförmige Ausneh­ mung zur Aufnahme des Einsatzes 4 hat. Der obere Rand des Be­ hälters 2 enthält eine Nut 10 zur Aufnahme eines Dichtrings, hier nicht dargestellt. An der Oberseite des Behälters sind an den Schmalseiten zwei Ausleger angeklebt, die Gewindebohrungen zur Befestigung des Deckels 3 tragen. Der Deckel 3 enthält ebenfalls Gewindebohrungen zur Aufnahme von hinterdrehten Rän­ delschrauben zum dichten Verschluß von Behälter 2 und Deckel 3.

Statt der Quaderform können für Behälter 2, Deckel 3 und Ein­ satz 4 auch andere Formen, wie z. B. eine Kreisscheibe, verwen­ det werden.

Die Proben werden für die ISH in einzelne Reaktionskammern 1 eines Einsatzes 4 gelegt. Da die Reaktionskammern 1 auf der Unterseite mit einem Netz 7 verschlossen sind, verbleiben die Proben in den Reaktionskammern 1, können aber alle mit dersel­ ben Lösung behandelt werden. Zur Inkubation der Proben mit den Lösungen wird der gesamte Einsatz 4 in einen Behälter 2 einge­ führt, welche die entsprechende Lösung enthält. Zum Wechseln der Lösungen kann der gesamte Block 4 in einen zweiten Behälter 2 mit der neuen Lösung überführt werden, oder die Lösung im Behälter 2 ausgetauscht werden. Der Einsatz 4 kann dabei zwi­ schenzeitlich auf die sterile Innenseite des Deckels 3 abge­ stellt werden. Auf diese Weise werden alle Proben in der glei­ chen Weise behandelt, die einzelnen Probengruppen bleiben aber getrennt.

Eine Trennung von Probengruppen (nach ihrer Herkunft und Hy­ bridisierung mit unterschiedlichen Sonden) ist bei einer ISH besonders wichtig. So sollen z. B. Proben von Wildtyp-Embryo­ nen (oder -Geweben) und von Mutanten-Embryonen (oder -Geweben) auf Unterschiede in der Genaktivität hin untersucht werden. Im Verlauf der ISH-Prozedur müssen natürlich die Wildtyp- und Mu­ tanten-Embryonen (-Gewebe) stets getrennt bleiben, um an­ schließend Unterschiede zwischen beiden Gruppen festzustellen.

Innerhalb einer Gruppe (Wildtyp bzw. Mutante) können weitere Sub-Gruppen gebildet werden: Z. B. eine Gruppe von Wildtyp-Em­ bryonen, die Embryonen aus drei verschiedenen Entwicklungssta­ dien enthält, die alle mit einer Gensonde A hybridisiert wer­ den. Eine zweite Gruppe könnte aus Embryonen der gleichen Ent­ wicklungsstufen bestehen, die aber mit der Gensonde B zu hy­ bridisieren sind.

Aus diesem Grund ist es deshalb für den Experimentator extrem wichtig, gleich zu Beginn des ISH-Experimentes, Probengruppen zusammenstellen zu können, die im weiteren Verlauf der Analyse getrennt bleiben. Trotzdem bleibt die Notwendigkeit, alle Pro­ bengruppen auf die gleiche Weise zu behandeln, damit konstante Bedingungen (für Wildtyp und Mutanten-Embryonen und -Gewebe) geschaffen werden.

Die Vorrichtung erfüllt beide Erfordernisse und erlaubt gleichzeitig eine wesentlich einfachere und schnellere Handha­ bung. Da die einzelnen Schritte schneller abgewickelt werden können, bedeutet dies für den Experimentator eine enorme Zeit­ ersparnis.

Bei dem bisherigen Arbeitsablauf mußten z. B. bei der Vorberei­ tung und den anschließenden Hybridisierungs- und Waschschrit­ ten von 10 Probengruppen, alle 10 Gruppen in 10 verschiedene, mit Schraubdeckeln verschlossene, Röhrchen überführt und ge­ trennt behandelt werden. Dazu mußte jedes Röhrchen einzeln aufgeschraubt, die Lösung vorsichtig entfernt, die neue Lösung hinzugefügt und das Röhrchen wieder verschlossen werden. Diese Schritte sind nun derart vereinfacht, daß der gesamte Einsatz in einen Behälter mit neuer Lösung überführt wird, bzw. die Lösung in dem Behälter ausgetauscht wird.

Für die eigentliche ISH wird nun zu jeder Probengruppe (die sich in verschiedenen Reaktionskammern 1 befinden) eine je­ weils andere Sonde hinzugegeben. Dabei dürfen die Lösungen aus verschiedenen Reaktionskammern nicht miteinander vermischt werden. Zu diesem Zweck werden die oberen Öffnungen der Reak­ tionskammern 1 mit Verschlüssen 6 hermetisch abgedichtet, der gesamte Einsatz 4 umgedreht und umgekehrt in den Behälter 2 gesetzt. Damit befinden sich nun die mit dem Netz 7 verschlos­ senen Seiten der Reaktionskammern 1 oben, und zu den einzelnen Gruppen von Proben kann nun jeweils die gewünschte Sonde hin­ zugefügt werden, ohne daß Sonden in einer Reaktionskammer sich mit Sonden in anderen Kammern 1 vermischen.

Anschließend erfolgt die eigentliche Hybridisierung der Proben mit der Sonde bei hoher Temperatur. Hierbei ist es wichtig, daß keine Flüssigkeit verdampft und es so zu einer Konzentrie­ rung von Salzen in der Hybridisierungslösung kommt. Dieses Problem ist derart gelöst, daß der Behälter 2, in dem sich der Einsatz 4 mit den Reaktionskammern 1 befindet, mit einem Verschluß abgedichtet wird. Möglich sind hier neben Rändel­ schrauben auch Filmscharniere, Schrauben und Klemmen mit Feder­ bügeln oder Spannverschlüsse, die über Federdruck arbeiten. Dadurch entsteht in dem gesamten Behälter (einschließlich der Reaktionskammern) ein gasgesättigter Raum.

Die Hybridisierung erfolgt in Formaldehyd enthaltender Lösung und bei hohen Temperaturen. Dies stellt besondere Anforderun­ gen an die verwendeten Materialien und Klebstoffe. Zur Kon­ struktion wurde deshalb Plexiglas verwendet, und ein speziel­ ler Klebstoff entwickelt und verwendet, der den erforderlichen Ansprüchen genügt. Die verwendeten Materialien müssen Tempera­ turen von 70°C standhalten und physiologisch unbedenklich sein. Neben Plexiglas ist hier auch die Verwendung von Edel­ stahl oder Teflon möglich.

Die Herstellung der ISH-Sonden ist verhältnismäßig teuer, und die Volumina der Waschlösungen sollten nur so groß sein, wie es für den entsprechenden Versuch erforderlich ist. Deshalb ist es notwendig, daß bei der Hybridisierung nicht zu große Volumina eingesetzt wird. Die Vorrichtung ist so konstruiert, daß die gleiche Menge an Hybridisierungslösung einsetzbar ist, wie dies zuvor mit einzelnen Reagenzgefäßen erforderlich war. Dies wird dadurch erreicht, daß der Durchmesser der Bohrungen (Re­ aktionskammern 1) dem der üblicherweise verwendeten Reagenzge­ fäße von 12 mm entspricht.

Je nach Bedarf kann die Konstruktion aber so variiert werden, daß für größere Proben der Durchmesser vergrößert, bzw. für kleineren Proben verringert wird. Die Vorrichtung kann je nach Bedarf in verschiedenen Größen angefertigt werden. Hierzu wur­ den Apparaturen mit 6, 12 oder 24 Reaktionskammern als Proto­ typen getestet. Beim Einsatz in Screening-Prozessen sind auch Größen mit mehr Reaktionskammern möglich. Bei Verwendung zur individuellen Hybridisierung können auch Einsätze mit ledig­ lich 2 Reaktionskammern verwendet werden. Auf diese Weise ist es möglich, die Volumina der verwendeten Lösungen auf ein Mi­ nimum zu begrenzen und Kosten einzusparen. Ferner können neben der hier verwendeten rechteckigen auch rotationssymmetrische oder andere Formen verwendet werden.

Nach der Hybridisierung müssen die Proben gewaschen werden, um nicht spezifisch gebundene Sonde zu entfernen. Dabei werden wieder alle Proben jeweils mit denselben Waschlösungen behan­ delt. Hierfür wird der gesamte Einsatz 4 aus dem Behälter 2 genommen und umgekehrt (die mit den Netzen 7 verschlossenen Öffnungen nach unten) in einen Behälter mit Waschlösung ge­ setzt. Um einen guten Austausch der Waschlösung mit den Proben zu erreichen, kann der Einsatz 4 mit Behälter 2 auf einen Schüttler gestellt und schwach bewegt werden, oder von Zeit zu Zeit kurz angehoben und wieder abgesenkt werden. Um Waschlö­ sungen zu wechseln, wird die Lösung in dem Behälter 2 ausge­ tauscht oder der gesamte Einsatz 4 in einen Behälter mit neuer Waschlösung überführt.

Die Vorrichtung ist so konstruiert, daß ein optimaler Aus­ tausch zwischen dem zu hybridisierenden Material und der Umge­ bung erfolgen kann, ohne daß das Gewebe zerstört wird. Zu die­ sem Zweck wurde der Einsatz mit den Reaktionskammern auf kleine Füßchen gesetzt.

Je nach der Größe der verwendeten Proben können Netze mit ver­ schiedenen Maschengrößen verwendet werden. Vor allem die Ver­ wendung eines feinmaschigeren Netzes erlaubt so auch die Ver­ arbeitung kleinerer Gewebestücke, Organe und Embryonen.

Außerdem kann bei der Konstruktion der Durchmesser der Bohrlö­ cher den jeweiligen Anforderungen angepaßt werden.

Die Vorrichtung kann nicht nur für ISH, sondern in der glei­ chen Weise für Antikörper-Färbungen an ganzen Embryonen, Orga­ nen oder Gewebestücken verwendet werden.

Claims (6)

1. Vorrichtung zur Durchführung von Genexpressionsanalysen, be­ stehend aus mindestens zwei Reaktionskammern, welche auf einer Seite hermetisch verschließbar sind, gekennzeichnet durch

• a) einen Behälter (2) und einen Deckel (3), wobei Deckel (3) und Behälter (2) dicht verschließbar sind,
• b) einen Einsatz (4), welcher die Reaktionskammern (1) ent­ hält, wobei die Reaktionskammern (1) senkrecht angeord­ net an einer Seite offen sind,
• c) Böden (7), welche die auf der anderen Seite liegenden Öffnungen der Reaktionskammern (1) verschließen, wobei die Böden (7) einen ungehinderten Flüssigkeitsaustausch ermöglichen und das zu analysierende Material in der Reaktionskammer zurückhalten, und
• d) Verschlüsse (6) zur hermetischen Abdichtung der den Bö­ den gegenüberliegenden Öffnungen der Reaktionskammern.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Abstand­ halter (5) an dem Einsatz an der Seite der Böden (7).

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Böden (7) durch ein einziges, alle Öffnungen über­ deckendes Element gebildet werden.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch Ausnehmungen (9) im Einsatz (4) zur Aufnahme von He­ begriffen.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das alle Öffnungen überdeckende Element ein aufgeklebtes Nylonnetz ist.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß das Material des Deckels (3), der Kammer (2) und des Einsatzes (4) aus Plexiglas bestehen.