DE19648681A1 - Antiadhäsive Benzoesäure-Derivate - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Derivate der Benzoesäure, bei denen in den 3- und 5- Positionen des aromatischen Ringes über Etherbindungen und kurze Spacergruppen α-C-Fucoside oder α-G-Mannoside sowie Ketten oder Ringe angeknüpft wurden, die mindestens eine Säurefunktion tragen. Die Erfindung betrifft außerdem die Herstellung dieser Verbindungen sowie deren Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln und Diagnostika.

Die Zirkulation von Blutzellen wie z. B. Leukozyten, Neutrophilen, Granulozyten und Monozyten ist auf molekularer Ebene ein vielstufiger, sehr komplexer Prozeß, der nur in Teilschritten bekannt ist (Review: T.A.Springer, Gell 76, 301-314,1994).

Jüngste Forschungsergebnisse zeigten, daß die in der Immunüberwachung entscheidende Rezirkulation der Lymphozyten sowie die Lokalisierung von Neutrophilen und Monozyten an Entzündungsherden sehr ähnlichen molekularen Mechanismen gehorchen. So kommt es bei akuten und chronischen Entzündungsprozessen zur Adhäsion der Leukozyten an Endothelzellen und Auswanderung in den Entzündungsherd und in die sekundären lymphatischen Organe.

An diesem Vorgang sind zahlreiche spezifische Signalmoleküle wie z. B. Interleukine, Leukotriene und Tumornekrosefaktor (TNF), deren G-Protein gekoppelte Rezeptoren und insbesondere gewebespezifische Zelladhäsionsmoleküle beteiligt, die eine genau kontrollierte Erkennung der Immun- und Endothelzellen gewährleisten. Zu den wichtigsten hierbei beteiligten Adhäsionsmolekülen, die im folgenden als Rezeptoren bezeichnet werden sollen, gehören die Selektine (E-, P- und L-Selektine), Integrine und die Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie.

Die drei Selektinrezeptoren bestimmen die Anfangsphase der Leukozytenadhäsion. E-Selektin wird auf Endothelzellen einige Stunden nach der Stimulierung beispielsweise durch Interleukin-1 (IL-1β) oder Tumornekrosefaktor (TNF-α) exprimiert, während P-Selektin in Blutplättchen und Endothelzellen gespeichert wird und nach Stimulierung durch Thrombin, Peroxidradikale oder Substanz P u. a. auf den Zelloberflächen präsentiert wird. L-Selektin wird dauerhaft auf Leukozyten exprimiert, wird im Verlauf der Entzündung jedoch rasch wieder von den Leukozyten abgespalten.

Die in der Anfangsphase entzündlicher Prozesse durch Selektin-Rezeptoren vermittelte Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen ist eine natürliche und notwendige Immunantwort auf diverse Entzündungsreize und Verletzungen des vasculären Gewebes. Der Verlauf einer Reihe von akuten und chronischen Erkrankungen wird jedoch durch die übermäßige Adhäsion von Leukozyten und deren Infiltration in das betroffene Gewebe sowie durch die Schädigung gesunden Gewebes im Sinne einer Autoimmunreaktion ungünstig beeinflußt. Dazu zählen beispielsweise Rheuma, Reperfusionsverletzungen wie myokardiale Ischämie/Infarkt (MI), akute Lungenentzündung nach operativem Eingriff, traumatischer Schock und Schlaganfall, Psoriasis, Dermatitis, ARDS (Atemnotsyndrom bei Erwachsenen) sowie die nach chirurgischen Eingriffen (Beispiel Angioplastie und By-Pass Operationen) auftretende Restenose.

Der natürliche Ligand mit der Struktur des komplexen Oligosaccharids Sialyl Lewis- X (SLeX) (Fig. 1) wurde schon erfolgreich in Tierversuchen bei P-Selektin abhängigen Lungenverletzungen (M.S.Mulligan et al., Nature 1993, 364, 149) und bei myokardialen Reperfusionsverletzungen (M. Buerke et al., J.Clin. Invest. 1994, 93, 1140) verwendet. In ersten klinischen Prüfungen bei Myokarinfarkt mußten jedoch Dosen von mehreren Gramm dieses Wirkstoffes verabreicht werden, da derselbe nur eine sehr geringe Bioverfügbarkeit besitzt (Mitteilung der Firma Cytel Corp,/La Jolla, CA., publiziert in Scrip No 2137, 14. Juni 1996, Seite 22). Diese hohe Wirkstoffdosis steht auch im Einklang mit der bekanntermaßen schwachen Affinität der natürlichen SLeX/A-Liganden zu den Selektin-Rezeptoren in statischen in vitro-Testsystemen: So inhibiert SLeX in allen bekannten in vitro-Testsystemen die Zelladhäsion an Selektinrezeptoren erst bei einer relativ hohen Konzentration im Bereich von IC₅₀ ca. 1 mM oder darüber (Jacob et al., Biochemistry 1995, 34, 1210).

In zahlreichen Publikationen wurde inzwischen über Bemühungen berichtet, durch strukturelle Variation des SLeX-Liganden zu fester bindenden Antagonisten zu gelangen (siehe z. B. Review in Drugs of the Future 1995, 20, 805-816). Ziel dieser Arbeiten ist die Bereitstellung wirksamerer Inhibitoren der Leukozytenadhäsion in vivo. Eine vergleichbare oder sogar höhere spezifische Affinität zu den Selektinrezeptoren und gleichzeitig eine signifikante strukturelle Vereinfachung eines Antagonisten mit dem Potential einer verbesserten Bioverfügbarkeit (auch oral) konnte bisher noch nicht erreicht werden. So handelt es sich bei zahlreichen, sogenannten SLeX-Mimetika tatsächlich immer noch um komplexe Derivate mit der Oligosaccharidstruktur (Beispiele in J.Med.Chem. 1996, 39, 1339-1343), oder die glycosidischen Bindungen wurden durch die im Serum noch labileren Peptidbindungen ersetzt (Beispiele in Bioorgan.Med.Chem. Lett. 1996, 4, 1149-1165).

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Herstellung neuer Selektin-Liganden, die sehr viel einfacher als SLeX selbst herstellbar sind und keinerlei glykosidische oder peptidische Strukturmerkmale enthalten. Diese Substanzen haben deshalb eine inhärent höhere Bioverfügbarkeit im Vergleich zu den natürlichen Liganden mit der SLeX-Struktur bzw. mit peptidischen Strukturelementen und wären wesentlich einfacher und billiger-herstellbar.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß einfache Benzoesäurederivate als Antagonisten der Selektine und Hemmstoffe der Leukozytenadhäsion wirken und offenbar alle minimal erforderlichen Strukturmerkmale des komplexen SLeX Liganden enthalten.

Dementsprechend wird die gestellte Aufgabe gelöst durch eine Verbindung der Formel I

worin bedeuten
X Sauerstoff, Schwefel oder 2 Wasserstoffatome,
Y OH, NH₂, NHCH₂COOH, NHCH(COOH)₂, NHCH₂CH₂OH, NHCH₂CH₂CH₂OH, NHCH₂CH₂CH₂CH₂OH,
R¹ C-glykosidisch verknüpfte Fucose oder Mannose,
R² (CH₂)_nCOOH, (CH₂)_nSO₃H, (CH₂)_nCH(COOH)₂, CH(COOH)₂, oder COR³, wobei
n eine ganze Zahl von 1 bis 5 und
R³ einen Aminosäurerest der Formeln NH(CH₂)_mCOOH, NH(CH₂)_mSO₃H, oder NHCH(R⁴)COOH, Pyrrolidin-2-carbonsäure, Pyrrolidin-3-carbonsäure, Piperidin-2-carbonsäure, Piperidin-3-carbonsäure oder Piperidin-4-carbon­ säure bedeutet und wobei
m eine ganze Zahl von 1 bis 5 und
R⁴ eine Aminosäureseitenkette einer aus der Gruppe der natürlich vorkommenden proteinogenen α-Aminosäuren ausgewählten Aminosäure bedeuten. Die Aminosäureseitenkette von Glycin ist bespielsweise -H, die von Alanin beispielsweise -CH₃, die von Valin beispielsweise -CH(CH₃)₂ und die Aminosäureseitenkette von Phenylalanin beispielsweise -CH₂-C₆H₅.

Vorzugsweise bedeutet der Rest R¹ in Formel I

Nachfolgend sind Beispiele für Verbindungen mit den genannten, bevorzugten Eigenschaften angeführt:

• 1. Eine Verbindung der Formel 1a, die sich dadurch auszeichnet, daß
  X Sauerstoff,
  Y OH,
  R¹ α1-(CH₂)₃-glykosidisch verknüpfte L-Fucose,
  R² (CH₂)_nCOOH und n=1 bedeutet.
  
• 2. Eine Verbindung der Formel 1b, die sich dadurch auszeichnet, daß
  X Sauerstoff,
  Y OH,
  R¹ α1-(CH₂)₃-glykosidisch verknüpfte L-Fucose,
  R² COR³, wobei R³ einen 1-(4-Carboxy)-piperidylrest bedeutet.
  
• 3. Eine Verbindung der Formel 1c, die sich dadurch auszeichnet, daß
  X Sauerstoff,
  Y OH,
  R¹ α1-(CH₂)₃-glykosidisch verknüpfte L-Fucose,
  R² CH(COOH)₂ bedeutet.
  
• 4. Eine Verbindung der Formel 1d, die sich dadurch auszeichnet, daß
  X Sauerstoff,
  Y NHCH₂CH₂OH,
  R¹ α1-(CH₂)₃-glykosidisch verknüpfte L-Fucose,
  R² (CH₂)_nCOOH und n=1 bedeutet.
  
• 5. Eine Verbindung der Formel 1e, die sich dadurch auszeichnet, daß
  X 2 Wasserstoffatome,
  Y OH,
  R¹ α1-(CH₂)₃-glykosidisch verknüpfte L-Fucose,
  R² (CH₂)_nCOOH und n=1 bedeutet.
  
• 6. Eine Verbindung der Formel 1f, die sich dadurch auszeichnet, daß
  X Sauerstoff,
  Y OH,
  R¹ α1-CH₂-glykosidisch verknüpfte D-Mannose,
  R² (CH₂)_nCOOH und n=1 bedeutet.
  
• 7. Eine Verbindung der Formel 1g, die sich dadurch auszeichnet, daß
  X Sauerstoff,
  Y OH,
  R¹ α1-(CH₂)₂-glykosidisch verknüpfte L-Fucose,
  R² (CH₂)_nCOOH und n=1 bedeutet.
  

Die eingangs gestellte Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, welches sich dadurch auszeichnet, daß man eine der beiden OH-Gruppen eines käuflich erhältlichen 3,5-Dihydroxybezoesäureesters mit einem elektrophilen, OH-geschützen Fucose- oder Mannosebaustein selektiv in der 3-Position O-alkyliert. Anschließend wird die 5-OH-Position des Zwischenproduktes weiter alkyliert oder acyliert, die Esterfunktion in der 1-Position gegebenenfalls modifiziert und schließlich das Endprodukt der Formel I durch Abspaltung der Schutzgruppen freigesetzt.

Umgekehrt kann auch erst in der 3-Position alkyliert oder acyliert und der Zuckerbaustein erst danach in der 5-Position durch Alkylierung eingeführt werden. Beide Verfahren führen zum selben Endprodukt der Formel I, und für jede speziell herzustellende Verbindung muß die optimale Abfolge dieser 2 alternativen Synthesestrategien je nach Struktur der Reste R¹ und R² geprüft werden. Generell gilt, daß die erstere Variante stets zu den gewünschten Endprodukten führt, da die geschützten Zuckerbausteine im einzuführenden Rest R¹ nicht weiter alkylierbar oder acylierbar sind. Das umgekehrte Vorgehen nach der zweiten Variante ist dann vorteilhaft, wenn im einzuführenden Rest R² keine weiteren alkylierbaren oder acylierbaren Funktionen, insbesondere basische N-Atome vorliegen, so daß die wertvollere Zuckerkomponente erst später in der Synthesefolge eingesetzt wird.

Fig. 3 illustriert die Synthese von Verbindungen der Formel I nach der ersten Variante und Fig. 4 gibt ein Beispiel für die Synthesesequenz nach der zweiten Variante.

Die einzelnen Schritte der Synthesesequenzen können nach dem Fachmann geläufigen Standardverfahren der organischen Synthese durchgeführt werden. Als Synthesebausteine werden die in Fig. 5 aufgeführten Komponenten 2-4 eingesetzt, die ihrerseits nach literaturbekannten Verfahren erhältlich sind. So lassen sich beispielsweise die Fucoside 2 und 3 nach wie in Bioorgan. Med.Chem.Lett. 1996, 4, 1149-1165 beschrieben herstellen. Die Synthese der noch nicht beschriebenen C- Mannoside 4 läßt sich in einem mehrstufigen Verfahren wie in Fig. 6 beschrieben durchführen. Die primären Alkohole 2a, 3a oder 4a können direkt zur Alkylierung der phenolischen OH-Gruppe, z. B. mit

Hilfe der Mitsonobu-Reaktion eingesetzt werden. Alternativ werden erst die reaktiven Bromide 2b, 3b bzw. 4b aus den Alkoholen mittels CBrCl₂CBrCl₂ oder CBr₄/Triphenylphosphin/Triethylamin in Dichlormethan hergestellt, die ihrerseits als Alkylierungsreagenzien in Gegenwart von Basen zur Etherbildung eingesetzt werden.

Nach der Einführung eines Restes R² in eine Verbindung der Formel I läßt sich eine Differenzierung der Säurefunktionen im Rest R² und in der 1-Position des Benzolringes durch geeignete Schutzgruppen erreichen. So wird z. B. selbst die sterisch gehinderte tert.-Butylgruppe in der Glykolseitenkette auf dem Weg zur Synthese von 1d (Fig. 4) leichter alkalisch entfernt als die aromatische Estergruppe. Letztere läßt sich deshalb leicht durch einfaches Erhitzen mit nucleophilen Aminen in die betreffenden Amide überführen. Andererseits läßt sich die aromatische Methylestergruppe leichter als der tert.-Butylester in der Seitenkette eines Restes R² in I durch sterisch gehinderte Hydridreagenzien wie DIBAL oder Li(s-Butyl)₃AlH zur Hydroxylgruppe reduzieren (Beispiel Verbindung 1e). In den letzten beiden Syntheseschritten werden die Benzylschutzgruppen hydrogenolytisch mit Wasserstoff an Palladiumkatalysator entfernt und die Estergruppen werden alkalisch verseift. Die Abfolge dieser beiden Schritte läßt sich auch vertauschen.

Die Endverbindungen der Formel I können als freie Säuren oder in Form ihrer Salze mit organischen oder anorganischen Basen für die biologischen und pharmakologischen Untersuchungen und Anwendungen eingesetzt werden.

Das in Fig. 6 dargestellte α-C-Mannosid 4a, welches als Zwischenverbindung zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen I benötigt wird, ist neu. Zur Herstellung von 4a wird käufliches Methylmannosid 14 zu 15 umgesetzt, die anomere OMe-Gruppe erst gegen eine O-Acetylgruppe ausgetauscht (Verbindung 16) und dann ein Cyanidrest in 1-Stellung mittels Trimethylsilylcyanid/ Bortrifluoridetherat eingeführt. Im Produkt liegt überwiegend das bevorzugte α-C- Anomere der Formel 17 vor, das zum Methylester 18 verseift wird, der seinerseits zum primären Alkohol 4a umgesetzt wird.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch die Bereitstellung der Zwischenverbindung 4a.

Die Verbindung 4a kann dann gegebenenfalls nach Standardverfahren, z. B. mit Triphenylphosphin/Dibromtetrachlorethan oder Tetrabrommethan) in das reaktive Bromid 4b überführt werden, das zur Alkylierung der 3- bzw. 5-OH-Gruppen in 3,5- Dihydroxybenzoesäuren eingesetzt werden kann.

Die Affinität der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I an Selektine kann anhand der nachfolgend beschriebenen Zelladhäsionsassays überprüft werden.

Primärassays zur Untersuchung der Wirkung der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung auf die Zellanheftung an rekombinante, lösliche Selektin- Fusionsproteine.

Um die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen auf die Interaktion zwischen den E- und P-Selektinen (alte Nomenklatur ELAM-1 bzw. GMP-140) mit ihren Liganden zu testen, wird ein Assay verwendet, der jeweils nur für eine dieser Interaktionen spezifisch ist. Die Liganden werden in ihrer natürlichen Form als Oberflächenstrukturen auf promyelozytischen HL60 Zellen angeboten. Da HL60 Zellen Liganden und Adhäsionsmoleküle unterschiedlichster Spezifität aufweisen, kann die gewünschte Spezifität des Assays nur über den Bindungspartner erbracht werden. Als Bindungspartner wurden gentechnisch hergestellte lösliche Fusionsproteine aus der jeweils extrazytoplasmatischen Domäne von E- bzw. P- Selektin und der konstanten Region eines humanen Immunglobulins der Subklasse IgG1 verwendet.

Herstellung von L-Selektin-IgG1

Zur Herstellung von löslichem L-Selektin-IgG1 Fusionsprotein wurde das von Walz et al., 1990 publizierte genetische Konstrukt "ELAM-Rg" verwendet.

Zur Expression wurde die Plasmid DNA in COS-7 Zellen (ATCC) mittels DEAE- Dextran transfiziert (Molekularbiologische Methoden: siehe Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Struhl, K. und Smith, J. A. 1990. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, New York). Sieben Tage nach der Transfection wird der Kulturüberstand gewonnen, durch Zentrifugation von Zellen und Zellfragmenten befreit und auf 25 mM Hepes pH 7,0, 0,3 mM PMSF 0,02% Natriumazid gebracht und bei +4°C aufgehoben. (Walz, G., Aruffo, A., Kolanus, W., Bevilacqua, M. und Seed, B. 1990. Recognition by ELAM-1 of the sialyl-Lex determinant on myeloid and tumor cells. Science 250, 1132-1135.)

Herstellung von P-Selektin-IgG1

Zur Herstellung des löslichen P-Selektin-IgG1 Fusionsproteins wird das von Aruffo et al., 1991 publizierte genetische Konstrukt "CD62Rg" verwendet. Die weitere Vorgehensweise entspricht der unter A1 dargestellten Herstellung von L-Selektin- IgG1.

Aruffo, A., Kolanus, W., Walz, G., Fredman, P. und Seed, B. 1991. CD62/- P-Selectin recognition of myeloid and tumor cell sulfatides. Cell 67, 35-44.

Herstellung von CD4-IgG1

Zur Herstellung des löslichen CD4-IgG1 Fusionsproteins wird das von Zettlemeissl et al., 1990 publizierte genetische Konstrukt "CD4 : IgG1 hinge" verwendet. Die weitere Vorgehensweise entspricht der unter A1 dargestellten Herstellung von L- Selektin-IgG1. (Zettelmeissl, G., Gregersen, J.-P., Duport, J. M., Mehdi, S., Reiner, G. und Seed, B. 1990. Expression and characterization of human CD4: Immunoglobulin Fusion Proteins. DNA and Cell Biology 9, 347-353.)

Durchführung des HL60 Zelladhäsionsassays auf rekombinanten, löslichen Adhäsionsmolekülen

• 1. 96er Mikrotitertestplatten (Nunc Maxisorb) werden mit 100 µl eines in 50 mM Tris pH 9,5 verdünnten (1+100) Ziege anti human IgG Antikörpers (Sigma) 2 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Entfernen der Antikörperlösung wird einmal mit PBS gewaschen.
• 2. 150 µl des Blockierungspuffers werden für 1 Std. bei Raumtemperatur in den Näpfchen belassen. Die Zusammensetzung des Blockierungspuffers ist: 0,1% Gelatine, 1% BSA, 5% Kalbserum, 0,2 mM PMSF, 0,02% Natriumazid. Nach Entfernen des Blockierungspuffers wird einmal mit PBS gewaschen.
• 3. In die Näpfchen werden je 100 µl Zellkulturüberstand von entsprechend transfektierten und exprimierenden COS-Zellen pipettiert. Die Inkubation erfolgt 2 Std. bei Raumtemperatur. Nach Entfernen des Zellkulturüberstandes wird einmal mit PBS gewaschen.
• 4. In die Näpfchen werden 20 µl Bindungspuffer gegeben. Der Bindungspuffer hat die Zusammensetzung: 50 mM Hepes, pH 7,5; 100 mM NaCl; 1 mg/ml BSA; 2 mM MgCl₂; 1 mM CaCl₂; 3 mM MnCl₂; 0,02% Natriumazid; 0,2 mM PMSF. Dazu werden 5 µl der Testsubstanz pipettiert, durch Schwenken der Platte vermischt und 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert.
• 5. 50 ml einer HL60 Zellkultur mit 200.000 Zellen/ml werden 4 Min. bei 350 g zentrifugiert. Das Pellet wird in 10 ml RPMI 1640 resuspendiert und die Zellen erneut zentrifugiert. Zur Markierung der Zellen werden 50 µg BCECF- AM (Molecular Probes) in 5 µl wasserfreiem DMSO aufgelöst; anschließend werden 1,5 ml RPMI 1640 auf die BCECF-AM/DMSO-Lösung gegeben. Mit dieser Lösung werden die Zellen resuspendiert und 30 Min. bei 37°C inkubiert. Nach zweiminütiger Zentrifugation bei 350 g wird das markierte Zellpellet in 11 ml Bindungspuffer resuspendiert und die resuspendierten Zellen in 100 µl Aliquots in die Mikrotiterplatten-Näpfchen verteilt. Die Platte wird 10 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen, um die Zellen auf den Boden der Testplatte sedimentieren zu lassen. Dabei haben die Zellen Gelegenheit an das beschichtete Plastik zu adhärieren.
• 6. Zum Abstoppen des Tests wird die Mikrotiterplatte im 45 Winkel gänzlich in den Stoppuffer getaucht (25 mM Tris, pH 7,5; 125 mM NaCl; 0,1% BSA; 2 mM MgCl₂; 1 mM CaCl₂; 3 mM MnCl₂; 0,02% Natriumazid). Durch Invertierung wird der Stoppuffer aus den Näpfchen entfernt und die Prozedur noch zweimal wiederholt.
• 7. Die Messung der in den Näpfchen festhaftenden, BCECF-AM-markierten Zellen erfolgt in einem Cytofluorimeter (Millipore), bei einer Empfindlichkeitseinstellung von 4, einer Anregungswellenlänge von 485/22 nm und einer Emissionswellenlänge von 530/25 nm.

Leukozyten-Adhäsion - Prüfung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen in vivo (Intravitalmikroskopie an der Ratte)

Bei entzündlichen Prozessen und anderen, die Zytokine aktivierenden Zuständen spielt die Gewebszerstörung durch einwandernde oder die Mikrozirkulation blockierende Leukozyten eine entscheidende Rolle. Die erste und für den weiteren Krankheitsprozeß entscheidende Phase ist die Aktivierung von Leukozyten innerhalb der Blutbahn, insbesondere im prä- und postkapillären Bereich. Dabei kommt es, nachdem die Leukozyten den Axialstrom des Blutes verlassen haben, zu einem ersten Anheften der Leukozyten an der Gefäßinnenwand, d. h. am Gefäßendothel. Alle darauffolgenden Leukozyteneffekte, d. h. die aktive Durchwanderung durch die Gefäßwand und die anschließende orientierte Wanderung im Gewebe, sind Folgereaktionen (Harlan, J.M., Leukocyte-endothelial interaction, Blood 65, 513-525, 1985).

Diese rezeptorvermittelte Interaktion von Leukozyten und Endothelzellen wird als ein initiales Zeichen des Entzündungsprozesses angesehen. Neben den schon physiologisch exprimierten Adhäsionsmolekülen kommt es unter der Einwirkung von Entzündungsmediatoren (Leukotriene, PAF) und Zytokinen (TNF-alpha, Interleukinen) zur zeitlich gestuften, massiven Expression von Adhäsionsmolekülen auf den Zellen. Sie werden derzeit in drei Gruppen eingeteilt: 1. Immunglobulin- Gensuperfamilie, 2. Integrine und 3. Selektine. Während die Adhäsion zwischen Molekülen der Ig-Gensuperfamilie und den Protein-Protein-Bindungen abläuft, stehen bei der Kooperation zwischen Selektinen Lektin-Kohlehydrat-Bindungen im Vordergrund (Springer, T.A., Adhesion receptors of the immune system. Nature 346, 425-434, 1990; Huges, G., Cell adhesion molecules - the key to an universal panacea, Scrips Magazine 6, 30-33, 1993; Springer, T.A., Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration; The multistep paradigm. Cell 76, 301-314, 1994).

Methode

Die induzierte Adhäsion von Leukozyten wird mit einer intravitalmikroskopischen Untersuchungstechnik im Mesenterium der Ratte quantifiziert (Atherton A. and Born G.V.R., Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphnuclear leukocytes to blood vessel walls. J. Physiol. 222, 447-474,1972; Seiffge, D. Methoden zur Untersuchung der Rezeptor-vermittelten Interaktion zwischen Leukozyten und Endothelzellen im Entzündungsgeschehen, in: Ersatz- und Ergänzungsmethoden zu Tierversuchen in der biomedizinischen Forschung, Schöffl, H. et al., (Hrsg.) Springer, 1995 (im Druck)). Unter Inhalations-Äthernarkose wird eine Dauernarkose durch intramuskuläre Injektion von Urethan (1,25 mg/kg KG) eingeleitet. Nach Freipräparation von Gefäßen (V. femoralis zur Injektion von Substanzen und A. carotis zur Blutdruckmessung) werden Katheter in diese eingebunden. Danach wird das entsprechende transparente Gewebe (Mesenterium) nach den in der Literatur bekannten Standardmethoden freigelegt und auf dem Mikroskoptisch ausgelagert und mit 37°C warmen Paraffinöl überschichtet (Menger, M.D. and Lehr, H., A. Scope and perspetives of intravital microscopy-bridge over from in vitro to in vivo, Immunology Today 14, 519-522, 1993). Die Applikation der Testsubstanz erfolgt i.v. am Tier (10 mg/kg). Die experimentelle Erhöhung der Blutzel I-Adhäsion wird durch systemische Verabreichung von Lipopolysaccharid (LPS, 15 mg/kg) 15 Minuten nach Applikation aus Testsubstanz durch Zytokin- Aktivierung ausgelöst (Foster S.J., Mc Cormick L.M., Ntolosi B.A. and Campbell D., Production of TNF-alpha by LPS-stimulated murine, rat and human blood and its pharmacological modulation, Agents and Actions 38, C77-C79, 1993, 18.01.1995). Die dadurch verursachte erhöhte Adhäsion von Leukozyten am Endothel wird direkt vitalmikroskopisch oder mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoffen quantifiziert. Alle Meßvorgänge werden per Videokamera aufgenommen und auf einem Videorekorder gespeichert. Über einen Zeitraum von 60 Minuten wird alle 10 Minuten die Anzahl der rollenden Leukozyten (d. h. alle sichtbar rollenden Leukozyten, die langsamer als die strömenden Erythrozyten sind) und die Anzahl an haftenden Leukozyten am Endothel (Verweildauer länger als 5 Sekunden) erfaßt. Nach Beendigung des Versuches werden die narkotisierten Tiere schmerzfrei durch systemische Injektion von T61 exzitationsfrei eingeschläfert. Zur Auswertung werden die Ergebnisse jeweils von 8 behandelten mit 8 unbehandelten Tieren (Kontrollgruppe) verglichen (Angabe der Ergebnisse in Prozenten).

Reperfusionsmodell zur Untersuchung des Einflusses der Adhäsion von Neutrophilen im Verlauf der Ischämie/Reperfusion am offenen Kaninchen-Herzen

Die Herzen werden bei konstantem Druck nach der Langendorff-Technik mit Nährlösung sowie mit/ohne Leukozyten bzw. Wirkstoff perfundiert. Danach wird eine Ischämie durch Unterbinden der linken Koronarartherie (30 min) hervorgerufen. Nach Reperfusion (30 min) wird die Leukozytenakkumulierung histologisch ausgewertet. Im Versuchsverlauf werden außerdem an 256 Elektroden Potentiale und Arrhythmien gemessen (Gesamtversuchsdauer ca. 90 min). Bei 6 von 7 unbehandelten mit Leukozyten perfundierten Herzen treten ausgeprägte Arrhythmien aufgrund der Leukozyteninfiltration auf, während die mit einem Wirkstoff (RGDS-Peptide, Chondroitinsulfat) behandelten Herzen verminderte Leukozyten Akkumulierung und Arrhythmien entwickeln. Die untersuchte Verbindung 3a war im Bereich von ca. 1 pM hochwirksam (starke Verminderung der Arrhythmien).

Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sowie deren physiologisch verträglichen Salze eignen sich aufgrund ihrer wertvollen pharmakologischen Eigenschaften sehr gut zur Anwendung als Heilmittel bei Säugern, insbesondere dem Menschen.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ferner ein Arzneimittel enthaltend wenigstens eine Verbindung gemäß Formel I sowie deren Verwendung für die Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie oder Prophylaxe von Krankheiten, welche mit einer übermäßigen, durch Selektinrezeptoren vermittelten Zelladhäsion in dem von der Krankheit betroffenen Gewebe einhergehen, beispielsweise Rheuma, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, wie Reperfusionsverletzungen, Ischämie oder Herzinfarkt.

Die Arzneimittel eignen sich im besonderen zur Behandlung von akuten und chronischen Entzündungen, die sich pathophysiologisch durch eine Störung der Zellzirkulation, beispielsweise von Lymphozyten, Monozyten und neutrophilen Granulozyten, kennzeichnen lassen. Hierzu zählen Autoimmunerkrankungen wie akute Polyarthritis, rheumatoide Arthritis und Insulin-abhängige Diabetes (Diabetes mellitus IDDM) akute und chronische Transplantatabstoßungen, Schocklunge (ARDS, adult respiratory distress syndrome), entzündliche und allergische Hauterkrankungen wie beispielsweise Psoriasis und Kontakt-Ekzeme, Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Myokardinfarkt, Reperfusionsverletzungen nach Thrombolyse, Angioplastie oder By-Pass-Operationen, septischer Schock und systemischer Schock. Eine weitere potentielle Indikation ist die Behandlung metastasierender Tumoren, denn Tumorzellen tragen Oberflächenantigene, die sowohl Sialyl-Lewis-X als auch Sialyl-Lewis-A-Strukturen als Erkennungsepitope besitzen. Darüber hinaus können diese Arzneimittel, die stabil im sauren Milieu des Magens sind, zur antiadhäsiven Therapie von Helicobacter pylori und verwandten Mikroorganismen ggf. auch in Kombination mit Antibiotika eingesetzt werden. Ferner ist mit Hilfe dieser Arzneimittel eine Therapie der cerebralen Form der Malaria denkbar.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden im allgemeinen intravenös, oral oder parenteral oder als Implantate verabreicht, aber auch eine rektale Anwendung ist prinzipiell möglich. Geeignete feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Tabletten, Dragees, (Mikro-)Kapseln, Zäpfchen, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole, Tropfen oder injizierbare Lösungen in Ampullenform sowie Präparate mit protrahierte Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung üblicherweise Trägerstoffe und Zusätze und/oder Hilfsmittel wie Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel oder Lösungsvermittler Verwendung finden. Als häufig verwendete Träger- oder Hilfsstoffe seien z. B. Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Vitamine, Cellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle, Poly­ ethylenglykole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser, Alkohole, Glycerin und mehrwertige Alkohole genannt.

Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Präparate in Dosierungseinheiten hergestellt und verabreicht. Feste Dosierungseinheiten sind Tabletten, Kapseln und Suppositorien.

Für die Behandlung eines Patienten sind je nach Wirksamkeit der Verbindung, Art der Applikation, Art und Schwere der Erkrankung, Alter und Körpergewicht des Patienten, unterschiedliche Tagesdosen notwendig. Unter Umständen können jedoch auch höhere oder niedrigere Tagesdosen angebracht sein. Die Verabreichung der Tagesdosis kann sowohl durch Einmalgabe in Form einer einzelnen Dosierungseinheit oder aber mehrerer kleiner Dosierungseinheiten als auch durch Mehrfachgabe unterteilten Dosen in bestimmten Intervallen erfolgen. Die zu verabreichende Tagesdosis kann außerdem von der Anzahl der während des Krankheitsverlaufs exprimierten Rezeptoren abhängig sein. Es ist vorstellbar, daß im Anfangsstadium der Krankheit nur wenige Rezeptoren auf der Zelloberfläche exprimiert werden und demzufolge die zu verabreichende Tagesdosis geringer ist als bei stark erkrankten Patienten.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel werden dadurch hergestellt, daß man eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung mit üblichen Träger- sowie gegebenenfalls Zusatz- und/oder Hilfsstoffen in die bzw. eine geeignete Darreichungsform bringt.

Ferner ist die Verwendung von Verbindungen gemäß der Formel I für die Herstellung eines Mittels zur Diagnose einer Krankheit, welche mit einer übermäßigen, durch Selektinrezeptoren vermittelten Zelladhäsion in dem von der Krankheit betroffenen Gewebe einhergeht, denkbar.

Beispiele für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen Beispiel 1 Synthese der Verbindung 6

1.434 g (2.66 mmol) 3-(Tri-O-benzyl-α-L-fucopyranosyl)propyl-bromid und 1.34 g (7.98 mmol) 3,5-Dihydroxybenzoesäure-methylester (5) werden mit 0.553 g (3.99 mmol) Kaliumcarbonat in 20 ml DMF 12 h bei 0°C und dann 24 h bei 20°C gerührt. Nach Zugabe von 50 ml gesättigter Ammoniumchloridlösung wird mit Essigsäure­ ethylester (EE) mehrfach ausgeschüttelt, die EE-Phasen werden mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, getrocknet und eingeengt. Aus Toluol/EE kristallisieren 1.03 g (61.4%) Produkt 6.
¹H-NMR (300 MHz, δ [ppm] rel. TMS, CDCl₃): 7.23-7.37 (m, Phe, 15H), 7.10/7.13 (2 dd, ArH-2, ArH-5, 2H), 6.56 (t, ArH-4, 1H), 5.33 (s, OH, 1H), 4.50-4.80 (m, H-benzyl, 6H), 3.88 (s, OMe), 3.70-4.10 (m, FucH-1'/2'/-3'/-4'/5', OCH ₂CH₂CH₂, OMe, 10H), 1.60-1.90 (m, OCH₂ CH ₂ CH ₂, 4H), 1.26 (d, Fuc-6', 3H).

Beispiel 2 Synthese der Verbindung 7

0.839 g (1.34 mmol) Verbindung 6 und 0.247 ml(2.68 mmol) Bromessigsäure­ methylester werden mit 0.555 g (4.02 mmol) Kaliumcarbonat in 10 ml DMF 5 h bei 50°C gerührt. Nach Zugabe von 50 ml gesättigter Ammoniumchloridlösung wird mit (EE) mehrfach ausgeschüttelt, die EE-Phasen werden mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, getrocknet und eingeengt. Säulenchromatographie an Kieselgel 60 in Hexan/EE (311) liefert 0.78 g (83.5%) Produkt 7.
¹H-NMR (300 MHz, δ [ppm] rel. TMS, CDCl₃): 7.23-7.37 (m, Phe, 15H), 7.22/7.14 (2 dd, ArH-2, ArH-5, 2H), 6.67 (t, ArH-4, 1 H), 4.50-4.80 (m, H-benzyl, OCH ₂CO₂Me, 8H), 3.88 (s, 1-CO₂ Me), 3.80 (s, OCH₂CO₂ Me), (3.70-4.20 (m, FucH-1'/-2'/-3'/-4'/-5', OCH ₂CH₂CH₂, OMe, 13H), 1.60-1.92 (m, OCH₂ CH ₂ CH ₂, 4H), 1.26 (d, Fuc-6', 3H).

Beispiel 3 Synthese der Verbindung 8

0.782 g (1.12 mmol) Verbindung 7 werden in 15 ml trockenem Methanol und 0.5 ml Essigsäure gelöst und bei 20°C über 0.50 g 10%-Pd/C hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Entfernung der Lösungsmittel erhält man 0.400 g (83%) der Verbindung 8.
¹H-NMR (300 MHz, δ [ppm] rel. TMS, CD₃OD): 7.21/7.13 (2 dd, ArH-2, ArH-5, 2H), 6.72 (t, ArH-4, 1H), 4.73 (s, OCH₂CO₂Me, 2H), 3.90 (s, 1-CO₂Me), 3.81 (s, OCH₂CO₂ Me),(3.65-4.10 (m, FucH-1'/2'/-3'/-4'/-5', OCH ₂CH₂CH₂, 2xOMe, 13H), 01.60-1.92 (m, OCH₂ CH ₂ CH ₂, 4H), 1.22 (d, Fuc-6', 3H).

Beispiel 4 Synthese der Verbindung 1a

0.400 mg (0.935 mmol) der Verbindung 8 werden mit 5 ml 2N NaOH 0.5 h bei 20°C gerührt. Die erhaltene Lösung wird mit 1 N HCl neutralisiert (pH 5.73), über ein 0.45 µm-Filter filtriert und eingeengt. Nach Mitteldruckchromatographie an RP (reversed phase) erhält man 0.409 g (98%) der Endverbindung 1a als DC- einheitliches (EE/MeOH/H₂0/AcOH 5/3/1/0.5) Dinatriumsalz der Formel C₁₈H₂₂O₁₀Na₂ (444.3 g/mol);
¹H-NMR (300 MHz, δ [ppm], D₂O): 7.17/7.05 (2 dd, ArH-2, ArH-5, 2H), 6.70 (t, ArH- 4,1H), 4.79 (s, OCH ₂CO₂H, 2H), 4.10-4.25(m, OCH₂, 2H), 3.93-4.04 und 3.74-3.88 (2 m, 2H bzw. 3H, FucH-1'/-2'/-3'/-4'/-5'), 1.65-1.97 (m, OCH₂ CH ₂ CH ₂, 4H), 1.11 (d, Fuc6', 3H).
¹³C-NMR (75.4 MHz, APT, δ [ppm], D₂O): 176.48,174.55 (C=O), 158.90, 158.73 ArC-3/-5), 138.98 (ArC-1), 108.24,107.96 (ArC-2/-6), 104.39 (ArC-4), 75.68, 71.81, 69.77, 67.99, 66.78 (FucC-1'/-2'/-3'/-4'1-5'), 68.23 (OCH₂CH₂CH₂), 66.91 (OCH₂CO₂H), 24.77, 19.74 (CH₂ CH₂), 15.57 (C-6'_Fuc).

Beispiel 5 Synthese der Verbindung 9

0.690 g (1.10 mmol) Verbindung 6, 0.245 g (1.21 mmol) Chlorameisensäure-4-nitro­ phenylester, 15 mg (0.12 mmol) 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) und 0.17 ml (1.21 mmol) Triethylamin werden in 10 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Nach 5 h Rühren bei 0°C werden 0.47 ml (2.76 mmol) N-Ethyl-N,N-diisoprpylamin (DIPEA) und 0.187 ml (1.21 mmol) Piperidin-4-carbonsäure-ethylester zugegeben. Nach 12 h Rühren bei 0°C wird mit 30 ml Dichlormethan verdünnt und 3mal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und getrocknet. Nach Einengen der organischen Phase erhält man 0.81 g Rohprodukt, das über das Biotage-Flash-40 System gereinigt wird (Kartusche Flash 40 M, 90 g Kieselgel 32-63 µ, Laufmittel 600 ml EE/Hexan 1/4, 800 ml EE1Hexan 113, 600 ml EE/Hexan 1/2). Ausbeute Produkt 9: 0.845 g (94.6%).
¹H-NMR (300 MHz, δ [ppm] rel. TMS, CDCl₃): 7.23-7.42 (m, Phe, ArH-2, ArH-5, 17H), 6.85 (t, ArH-4, 1H), 4.49-4.80 (m, H-benzyl, 6H), 4.17 (q, CO₂ CH ₂CH₃), 2H), 3.88 (s, CO₂Me), 3.78-4.05 (m, FucH-1'/-2'/-3'/-4'/-5 OCH ₂CH₂CH₂, OMe, 10H), 1.60-2.04 (m, OCH ₂ CH ₂CH₂, 4H), 1.28 (t, CO₂CH₂ CH ₃, 3H), 1.26 (d, Fuc-6', 3H).

Beispiel 6 Synthese der Verbindung 1b

0.835 g (1.03 mmol) Verbindung 9 werden in 30 ml trockenem Methanol und 0.5 ml Essigsäure gelöst und bei 20°C über 0.30 g 10%-Pd/C hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators, Abziehen der Lösungsmittel und Säulenchromatographie an Kieselgel 60 (Dichlormethan/Methanol 17/1) erhält man 0.365g (65%) des debenzylierten Zwischenproduktes, das mit 5 ml 1 N NaOH 12 h bei 0°C gerührt wird. Die erhaltene Lösung wird mit 1N HCl neutralisiert (pH 3), über ein 0.45 µm- Filter filtriert und eingeengt. Nach Mitteldruckchromatographie an RP-Material (Methanol/Wasser 1/1) erhält man (ohne Optimierung) 0.110 g (32%) Endprodukt 1b der Formel C₂₃H₃₁NO₁₁ (497.5);
¹H-NMR (300 MHz, δ [ppm], D₂O): 7.37/7.22 (2 dd, ArH-2, ArH-5, 2H), 6.90 (t, ArH-4, 1H), 3.71-4.35 (FucH-1'/-2'/-3'/-4'/-5', 2xCH₂CHHN, OCH₂, 9H), 2.90-3.20 (2xCH₂CHHN, 2H), 2.36-2.50 (tt, CH₂CHCO₂H, 1H), 1.52-2.20 (m, OCH₂ CH ₂ CH ₂, CH ₂CHCO₂H, 8H), 1.13 (d, Fuc-6', 3H).
¹³C-NMR (75.4 MHz, APT, δ [ppm], D₂O): 183.94 (pip-C=O), 173.78 (ArC=O), 158.61, 155.18, 151.59 (ArC-3/-5, NC=O), 139.01 (ArC-1), 114.96, 112.96, 112.42 (ArC-2/-6/-4), 75.63, 71.78, 69.76, 67.96, 66.76 (FucC-1'/-2'/-3'/-4'/-5'), 68.38 (OCH₂), 43.91 (CCH₂CH₂N), 43.97 (CCH₂ CH₂N), 28.53 (CCH₂CH₂N), 24.74, 19.73 (OCH₂ CH₂ CH₂), 15.57 (C-6'_Fuc).

Beispiel 7 Synthese der Verbindung 1c

0.493 g (0.788 mmol) Verbindung 6 und 0.172 ml (0.87 mmol) Brommalonsäure­ diethylesterwerden mit 0.10g (1.2 mmol) Natriumhydrogencarbonat in 20 ml DMF 48 h bei 0°C gerührt. Nach Zugabe von 50 ml gesättigter Ammoniumchloridlösung wird mit (EE) mehrfach ausgeschüttelt, die EE-Phasen werden mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, getrocknet und eingeengt. Säulenchromatographie an Kieselgel 60 (40-63 µ) in Hexan/EE (3.5/1) liefert 0.31 g (50%) des Zwischenproduktes C₄₅H₅₂O₁₂ (784.9), das wie folgt weiter umgesetzt wird:
0.30 g (0.38 mmol) der Zwischenverbindung werden in 10 ml trockenem Methanol und 0.4 ml Essigsäure gelöst und bei 20°C über 0. 12 g 10%-Pd/C hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Entfernung der Lösungsmittel erhält man 0.15 g (75%) des debenzylierten Zwischenproduktes, das wie folgt weiter umgesetzt wird:
0.148 mg (0.287 mmol) des Zwischenproduktes werden mit 1.5 ml 2N NaOH 2 h bei 20°C gerührt. Die erhaltene Lösung wird mit 1 N HCl neutralisiert (pH 2) und eingeengt. Nach MPLC-Reinigung an RP-Material (Methanol/Wasser) erhält man 0.090 g (68%) Endverbindung 1c als DC-einheitliches (EE/MeOH/H₂O/AcOH 5/3/110.5) Produkt der Formel C₂₀H₂₆O₁₂ (458.4);
¹H-NMR (300 MHz, δ [ppmi, D₂O): 7.13/7.07 (2 m, ArH-2, ArH-5, 2H), 6.77 (m, ArH-4, 1H), 3.70-4.30 (m, FucH-1'/-2'/-3'/-4'/-5', OCH₂), 1.65-2.00 (m, OCH₂ CH ₂ CH ₂, 4H), 1.11 (d, Fuc-6', 3H).
¹³C-NMR (75.4 MHz, APT, δ [ppm], D₂O): 158.90, 158.18 (ArC-3/-5), 138.59 (ArC-1), 108.45, 108.36 (ArC-2/-6), 104.86 (ArC-4), 75.65, 71.81, 69.74, 67.97, 66.75 (FucC-1'/-2'/-3'/-4'/-5'), 68.23 (OCH₂), 24.74, 19.73 (CH₂ CH₂), 15.56 (C-6'_Fuc).

Beispiel 8 Synthese der Verbindung 10

5.74 g (34.1 mmol) 3,5-Dihydroxybenzoesäure-methylester (5) und 3.78 ml Bromessigsäure-tert.-butylester (portionsweise Zugabe) werden mit 7.08 g (25.6 mmol) Kaliumcarbonat in 60 ml DMF 12 h bei 0°C gerührt. Nach Zugabe von 200 ml gesättigter Ammoniumchloridlösung wird mit Diethylether mehrfach ausgeschüttelt, die Ether-Phasen werden mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, getrocknet und eingeengt. Aus Toluol/EE (7/1 )kristallisieren 5.64 g (58% bezüglich 5; 78% bezüglich Benzoesäureester) Produkt 10.
¹H-NMR (300 MHz, δ [ppm] rel. TMS, CDCl₃): 7.17/7.07 (2 dd, ArH-2, ArH-5, 2H), 6.67 (t, ArH-4, 1H), 6.30 (s, OH, 1H), 4.54 (s, OCH₂), 2H), 3.88 (s, OMe), 1.50 (s, tert.-Bu, 9H).

Beispiel 9 Synthese der Verbindung 11

0.885 g (1.64 mmol) 3-(Tri-O-benzyl-α-L-fucopyranosyl)propyl-bromid und 0.695 g (2.46 mmol) Verbindung 10 werden mit 0.51 g (3.69 mmol) Kaliumcarbonat in 10 ml DMF 12 h bei 20°C und dann 7 h bei 60°C gerührt. Nach Zugabe von 50 ml gesättigter Ammoniumchloridlösung wird mit EE mehrfach ausgeschüttelt, die EE- Phasen werden mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, getrocknet und eingeengt. Nach Säulenchromatographie an Kieselgel 60 (EE/Hexan 5/1) erhält man 1.20 g (98% bez.auf Fuc.-Komponente) des Produktes 11.
¹H-NMR (300 MHz, δ [ppm] rel. TMS, CDCl₃): 7.24-7.38 (m, Phe, 15H), 7.20/7.13 (2 dd, ArH-2, ArH-5, 2H), 6.67 (t, ArH-4, 1H), 4.52 (s, OCH ₂CO₂tBu), 4.50-4.80 (m, H-benzyl, OCH ₂CO₂tBu, 8H), 3.89 (s, OMe), 3.70-4.10 (m, FucH-1'/-2'/-3'/-4'/-5', CH ₂CH₂CH₂, OMe, 10H), 1.60-1.90 (m, OCH₂ CH ₂ CH ₂, 4H), 1.49 (s, tBu, 9H), 1.25 (d, Fuc-6', 3H).

Beispiel 10 Synthese der Verbindung 12

0.901 mg (1.217 mmol) Verbindung 11 werden 12 h bei 0°C in 20 ml Methanol und 3 ml 1N NaOH gerührt. Nach Zugabe von 1N HCl (pH 50-5.5) und 200 ml EE wird die organische Phase mit verdünnter wäßriger Zitronensäurelösung gewaschen, getrocknet und eingeengt. Nach Säulenchromatographie an Kieselgel 60 (EE/Hexan 1/1 mit 0.1% AcOH) erhält man 0.48 g (57.6%) der Verbindung 12.
¹H-NMR (300 MHz, δ [ppm] rel. TMS, CDCl₃): 7.26-7.38 (m, Phe, 15H), 7.23/7.15 (2 dd, ArH-2, ArH-5, 2H), 6.68 (t, ArH-4, 1H), 4.67 (s, OCH ₂CO₂H), 4.50-4.80 (m, H- benzyl, OCH ₂CO₂H, 8H), 3.89 (s, OMe), 3.70-4.10 (m, FucH-1'/-2'/-3'/-4'/-5', OCH ₂CH₂CH₂, OMe, 10H), 1.60-1.90 (m, OCH₂ CH ₂ CH ₂, 4H), 1.26 (d, Fuc-6', 3H).

Beispiel 11 Synthese der Verbindung 13

0.462 g (0.675 mmol) Verbindung 12 werden mit 7 ml Ethanolamin 1 h auf 100°C erhitzt. Die gekühlte Lösung wird in EE aufgenommen und mit gesättigter NaCl- Lösung gewaschen. Nach Trocknung und Einengen wird über Kieselgel filtriert (Dichlormethan/Methanol 1011,1% HOAc). Man erhält 482 mg (100%) der Verbindung 13.
¹H-NMR (300 MHz, δ [ppm] rel. TMS, CDCl₃): 7.25-7.36 (m, Phe, 15H), 6.81/6.89 (2 m, ArH-2, ArH-5, 2H), 6.50 (m, ArH-4, 1H), 4.50-4.80 (m, H-benzyl, OCH ₂CO₂H, 8H), 3.70-4.10 (m, FucH-1'/-2'/-3'/-4'/-5', OCH ₂CH₂CH₂, OCH₂CH₂N, 11H), 1.60-1.90 (m, OCH₂ CH ₂ CH ₂, 4H), 1.25 (d, Fuc-6', 3H).

Beispiel 12 Synthese der Verbindung 1d

0.484 g (0.678 mmol) Verbindung 13 in 6 ml Dioxan und 0.2 ml Essigsäure werden bei 20°C über 0.200 g 10%-Pd/C hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators und Abziehen der Lösungsmittel wird der Rückstand in Wasser gelöst. Die steril filtrierte Lösung wird gefriergetrocknet und man erhält 0.213 g (70.7%) Endverbindung 1d der Formel C₂₀H₂₉NO₁₀ (443.5);
¹H-NMR (300 MHz, δ [ppm], D₂O): 6.93/6.87 (2 dd, ArH-2, ArH-5, 2H), 6.95 (t, ArH- 4,1H), 4.79 (s, OCH ₂CO₂H, 2H), 3.90-4.10 (2m, OCH ₂CH₂CH₂, CH ₂OH, 4H), 3.72-3.83 (2m, FucH-1'/-2'/-3'/-4'/-5', 5H), 3.51 (t, J=6Hz, CH₂N, 2H), 1.68-1.94 (m, OCH₂ CH ₂ CH ₂, 4H), 1.12 (d, J=6Hz, Fuc-6', 3H).
¹³C-NMR (75.4 MHz, APT, δ [ppm], D₂O): 174.57, 169.75 (2 C=O), 159.37,158.56 (ArC-3/-5), 135.81 (ArC-1), 106.77, 105.92, 104.83 (ArC-2/6/-4), 75.61, 71.74, 69.80, 67.92, 66.77 (FucC-1'/-2'/-3'/-4'/-5'), 68.21 (OCH₂CH₂CH₂), 65.75 (OCH₂CO₂H), 59.93 (CH₂OH), 42.01 (CH₂N), 24.84, 19.76 (CH₂ CH₂), 15.58 (C-6'_Fuc).

Beispiel 13 Synthese von (2,3,4,6-Tetra-O-benzyl-α-D-mannopyranosyl)-cyanid (17)

Zu einer Mischung aus 17.3 g (576.8 mmol) NaH (80% in Mineralöl)und 63.6 ml (535,6 mmol) Benzylbromid in DMF (325 ml) gibt man eine Lösung aus 20 g (103 mmol) α-D-Methyl-mannopyranosid in DMF (300 ml). Nach 18 h Rühren bei 20°C werden Methanol (13 ml) und Wasser (1.25 l) zugegeben. Die Mischung wird mit Diethylether extrahiert, eingeengt und an Kieselgel chromatographiert (Hexan/EE 5/1). Man erhält 44 g (77%) des Tetrabenzylmannosids 15.

Die Acetolyse von 22.5 g (40.6 rnmol) Tetrabenzylmannosid 15. in Acetanhydrid/Essigsäure/Schwefelsäure (340/590/2.3 ml) liefert nach Aufarbeitung

• 1. Eiswasser;
• 2. Extraktion mit EE;
• 3. Neutralisation der organischen Phase mit Natriumhydrogencarbonat;
• 4. Chromatographie mit Hexan/EE 4/1)

das anomere Acetat 16 in einer Ausbeute von 20 g (76%).

8.8 g (15.12 mmol) des anomeren Acetats 16 werden am anomeren C-Atom glycosyliert durch Umsetzung mit 8.7 ml (69.55 mmol) Cyanotrimethylsilan in Acetonitril (200 ml) unter der Katalyse von Bortrifluorid-Diethyletherat-Komplex. Nach 15 min Rühren wird mit wäßrigem Natriumhydrogencarbonat neutralisiert und an Kieselgel chromatographiert (Hexan/EE 6/1).
Ausbeute: 17 (α-anomer) 4.0 g (50%)
und 17 (β-anomer) 1.75g (22%).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃, rel. TMS, δ [ppm]): 3.69-4.11 (m, 2-H, 3-H, 4-H, 5-H, 6-H_a, 6-H_e, 6H); 4.78 (d, J_1,2 = 2.3 Hz, 1-H_α, 1H), 7.15-7.39 (m, 5Ph, 20H).

Beispiel 14 Synthese von C-1-Hydroxymethyl-2,3,4,6-tetra-O-benzyl-α-D-manno­ pyranosid (4a)

4.6 g (8.38 mmol) Cyanid 17(α), werden in einer 0.015 M Natrium-methanolatlösung (838 ml) gelöst. Nach 8 h Rühren bei 20°C wird 1 M Salzsäure (100 ml) zugegeben. Einengen und Chromatographie an Kieselgel (Hexan/EE 5/1 bis 4/1) liefert 2.9 g (91%, bezogen auf umgesetztes Edukt) des Methylesters 18 und 1.6 g Edukt 17.

Zur Reduktion des Esters 18 werden 3.25 g (5.58 mmol) in Diethylether (85 ml) gelöst und bei 0°C in eine Mischung aus Diethyether (43 ml) und 1 M etherischer LiAlH₄-Lösung (5.75 ml) getropft. Nach 10 min Rühren werden vorsichtig EE (20 ml) und dann Wasser (10 ml) zugegeben. Es wird mit Essigester verdünnt, die organische Phase mit Kochsalzlösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, eingeengt und der Rückstand an Kieselgel (Hexan/EE 3/2 bis 1/1) chromatographiert. Ausbeute der Verbindung 4a: 2.7 g (87%).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ = 2.05 (bt, OH, 1H), 3.64 (dd, 1H), 3.70 (dd, 1H), 3.95, 4.06 (2m, CH ₂OH, 2H), 3.72-3.88 (m, 5H), 4.42-4.57 (m, 4CH ₂Ph, 8H), 7.18-57.36 (m, 4Ph).

Beispiel 15 Hemmung der Zelladhäsion in vitro

IC₅₀

-Werte für E-Selektin [mM] und für P-Selektin [mM]:

Hemmung der Leukozytenadhäsion in vivo (Intravitalmikroskopie), Applikation 3 mg/kg i.v.

Hemmung der Leukozytenadhäsion in vivo (Intravitalmikroskopie), Applikation 3 mg/kg i.v.

Claims (21)

1. Verbindung der Formel I
worin bedeuten
X Sauerstoff, Schwefel oder 2 Wasserstoffatome,
Y OH, NH₂, NHCH₂COOH, NHCH(COOH)₂, NHCH₂CH₂OH, NHCH₂CH₂CH₂OH, NHCH₂CH₂CH₂CH₂OH,
R¹ C-glykosidisch verknüpfte Fucose oder Mannose,
R² (CH₂)_nCOOH, (CH₂)_nSO₃H, (CH₂)_nCH(COOH)₂, CH(COOH)₂, oder COR³, wobei
n eine ganze Zahl von 1 bis 5 und
R³ einen Aminosäurerest der Formeln NH(CH₂)_mCOOH, NH(CH₂)_mSO₃H, oder NHCH(R⁴)COOH, Pyrrolidin-2-carbonsäure, Pyrrolidin-3- carbonsäure, Piperidin-2-carbonsäure, Piperidin-3-carbonsäure oder Piperidin-4-carbonsäure bedeutet und wobei
m eine ganze Zahl von 1 bis 5 und
R⁴ eine Aminosäureseitenkette einer aus der Gruppe der natürlich vorkommenden proteinogenen α-Aminosäuren ausgewählten Aminosäure bedeuten.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest R¹ in Formel I
bedeutet.

3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest R¹ in Formel I
bedeutet.

4. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rest R¹ in Formel I
bedeutet.

5. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
X Sauerstoff,
Y OH,
R² (CH₂)_nCOOH und
n=1 bedeutet.

6. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
X Sauerstoff,
Y OH und
R² COR³, wobei
R³ einen 1-(4-Carboxy)-piperidylrest bedeutet.

7. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
X Sauerstoff,
Y OH und
R² CH(COOH)₂ bedeutet.

8. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
X Sauerstoff,
Y NHCH₂CH₂OH,
R² (CH₂)_nCOOH und
n 1 bedeutet.

9. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
X 2 Wasserstoffatome,
Y OH,
R² (CH₂)_nCOOH und
n 1 bedeutet.

10. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß
X Sauerstoff,
Y OH,
R² (CH₂)_nCOOH und
n 1 bedeutet.

11. Verbindung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
X Sauerstoff,
Y OH,
R² (CH₂)_nCOOH und
n 1 bedeutet.

12. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 dadurch gekennzeichnet, daß man eine der beiden OH- Gruppen in 3,5-Dihydroxybezoesäureestern mit einem OH-geschützen Fucose- oder Mannosebaustein selektiv in der 3-Position O-alkyliert und dann die 5-OH-Position des Zwischenproduktes weiter alkyliert oder acyliert, die Esterfunktion in der 1-Position hydrolysiert oder mit Aminen kuppelt und schließlich das Endprodukt der Formel I durch Abspaltung aller Schutzgruppen freisetzt.

13. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man eine der beiden OH- Gruppen in 3,5-Dihydroxybezoesäureestern in der 3-OH-Position alkyliert oder acyliert und dann mit einem OH-geschützen 1-C-Fucose- oder 1-C- Mannosebaustein in der 5-Position O- alkyliert, die Esterfunktion in der 1- Position hydrolysiert oder an Amine kuppelt und schließlich das Endprodukt der Formel I durch Abspaltung aller Schutzgruppen freisetzt.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13 zur Herstellung einer Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 3 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der 1-C- Mannosebaustein eine Verbindung der Formel III
ist, wobei OBn eine O-Benzylschutzgruppe bedeutet.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Formel III gemäß Anspruch 14 aus einem primären Alkohol der Formel II
herstellt, wobei man zunächst ein Methylmannosid mit O- Benzylschutzgruppen versieht, die anomere O-Methyl-Gruppe gegen eine O- Acetyl-Gruppe austauscht, anschließend unter Substitution der besagten O- Acetyl-Gruppe einen Cyanidrest in 1-Stellung einführt, das hauptsächlich gebildete α-C-Anomere des so erhaltenen Nitrils abtrennt und zu einem Esther verseift, der schließlich zu dem primären Alkohol der Formel II reduziert wird, wonach man den primären Alkohol der Formel II zu dem entsprechenden Bromid umsetzt.

16. Verbindung der Formel II gemäß Anspruch 15.

17. Arzneimittel enthaltend wenigstens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.

18. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie oder Prophylaxe einer Krankheit, welche mit einer übermäßigen, durch Selektinrezeptoren vermittelten Zelladhäsion in dem von der Krankheit betroffenen Gewebe einhergeht.

19. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit eine Herz-Kreislauf-Erkrankung ist.

20. Verwendung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit eine Autoimmunerkrankung wie rheumatoide Arthritis oder Osteoarthritis ist.

21. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 für die Herstellung eines Mittels zur Diagnose einer Krankheit, welche mit einer übermäßigen, durch Selektinrezeptoren vermittelten Zelladhäsion in dem von der Krankheit betroffenen Gewebe einhergeht.