DE19636042A1 - Optisches Verfahren zur zerstörungsfreien Bestimmung der Tiefenausdehnung von oberflächennah lokalisierten Verteilungen fluoreszierender Stoffe in lichtstreuenden Medien - Google Patents

Description

Optisches Verfahren zur zerstörungsfreien Bestimmung der Tiefenausdehnung von oberflächennah lokalisierten Verteilungen fluoreszierender Stoffe in lichtstreuenden Medien.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Tiefenausdehnung eines fluoreszierenden Stoffes in einem Medium, in dem die Lichtstreuung über der Lichtabsorption dominiert, wo bei die Tiefenausdehnung des Farbstoffes durch Variation des Einfallswinkels des Anregungslichtes bestimmt wird.

Die Erfindung betrifft auch ein Beispiel für eine Vorrichtung zur Durchführung des vorbezeichneten Verfahrens.

Es ist bekannt, daß innere Strukturen opaker Körper mit Ultraschall, Teilchenstrahlen, und elektromagnetischen Strahlen erkundet werden können. Unter den letztgenannten Verfahren sind insbesondere das Röntgenverfahren (kurzwellige Strahlung), photothermische Verfahren (sichtbares Licht) sowie optisch-tomographische und diaphanoskopische Verfahren (tiefrotes und infrarotes Licht) zu nennen. Die auf elektromagnetischer Strahlung basierenden Verfahren sind dazu geeignet, innere Strukturen abzubilden, Lichtabsorption und/oder Lichtstreuung von denen der Umgebung abweichen. Es ist möglich, die Position solcher Inhomogenitäten in einem Körper anhand des elastisch gestreuten Lichts zu ermitteln.

Es ist weiterhin bekannt, daß in einem Medium mit überwiegender Lichtstreuung die Tiefenausdehnung einer farbstoffhaltigen Schicht, die von der Oberfläche bis in eine gewisse Tiefe reicht, beziehungsweise die Tiefe, in der eine solche Schicht beginnt, grob bestimmt werden können, wenn das remittierte (in der Probe elastisch gestreute und die Probe durch die beleuchtete Oberfläche verlassende) Anregungslicht in verschiedenen Abständen vom Einstrahlpunkt und unter verschiedenen Detektionswinkeln gemessen wird (Barbour R et al. Determination of macroscopic optical properties of multilayer random media by remote sensing. Proc. SPIE 1431 (1991); Zeng H et al.: A computerized autofluorescence and diffuse reflectance spectroanlyzer system for in vivo skin studies. Phys Med Biol 38, 231 (1993)).

Die genannten Verfahren nutzen nur die Lichtabsorption zur Informationsgewinnung aus, nicht aber die bei vielen technisch und medizinisch relevanten Stoffen, insbesondere Farbstoffen, vorkommende Fluoreszenz. Der Nachweis von Farbstoffen über deren Absorption durch Messung der Remission und/oder Transmission stellt viel höhere Anforderungen an das Meßverfahren als Fluoreszenzmessungen, weil jene die Messung einer kleinen Signaldifferenz erfordern, bei letzteren dagegen das Nutzsignal das gesamte emittierte Licht ist. Die genannten Verfahren die mit sichtbarem Licht die Tiefenausdehnung aus Remissionsmessungen bestimmen, liefern nur ungenaue Anhaltswerte für die Tiefenausdehnung oder geben keine Quantifizierungsvorschrift an.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen fluoreszierenden Stoff, der oberflächennah in einem überwiegend lichtstreuenden Medium verteilt ist, zerstörungsfrei so nachzuweisen, daß sich eine Information über die Tiefenausdehnung der Farbstoffverteilung ergibt. Dieses Problem tritt etwa bei der Bestimmung der Dicke von fluoreszierenden Lackschichten oder bei der Ermittlung der Dicke von Tumoren auf, die mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert sind, wie sie beispielsweise für die Photodynamische Therapie (PDT) verwendet werden. Dieses Problem wird durch die im Anspruch 1 aufgeführten Merkmale gelöst.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Tiefenausdehnung einer oberflächennahen fluoreszierenden Farbstoffverteilung zerstörungsfrei unter Zuhilfenahme von Licht gemessen werden.

Die Aufgabe ist erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die zu vermessende Probe, wie in Fig. 1 dargestellt, nacheinander unter mindestens zwei verschiedenen Winkeln flächig mit Licht beleuchtet wird, das den nachzuweisenden Farbstoff zur Fluoreszenz anregt, wobei das Fluoreszenzlicht mit einem geeigneten Meßsystem detektiert wird. Aus den Meßwerten der Fluoreszenz wird paarweise für zwei Winkel das Verhältnis gebildet, das unter den genannten Voraussetzungen des Verfahrens ein von der Farbstoffkonzentration unabhängiges Maß für die Tiefenausdehnung der oberflächennahen farbstoffhaltigen Schicht ist. Dieses Verhältnis wird im folgenden Beleuchtungswinkel-Fluoreszenzverhältnis genannt und mit BWFV abgekürzt. Seine Tauglichkeit wurde experimentell überprüft. Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt.

Die Wahl der Beleuchtungswinkel ist grundsätzlich frei, wobei sich die Beleuchtungswinkel 0° und 60° zur Senkrechten bewährt haben. Je größer der zweite Winkel gewählt wird, desto empfindlicher mißt das BWFV die Tiefenausdehnung, desto höher sind auch die Anforderungen an die Meßvorrichtung.

Die erfindungsgemäße Detektion des Fluoreszenzlichts erfolgt mittels geeigneter Lichtdetektoren und optischer Bandpaßfilter entweder über den gesamten Raumwinkel oder einen beliebigen Teil davon, wobei diese Wahl für das Meßergebnis praktisch unerheblich ist.

Die erreichbare Tiefenauflösung wurde experimentell ermittelt und beträgt in Übereinstimmung mit der Theorie der Lichtausbreitung in lichtstreuenden Medien einige reduzierte Streulängen (die reduzierte Streulänge ist der Kehrwert des reduzierten Streukoeffizienten).

Das BWFV ist ein relatives Maß für die Tiefenausdehnung. Es kann auf der Grundlage der bekannten Theorie des Lichttransports in lichtstreuenden Medien in einen Absolutwert umgerechnet werden, wenn der reduzierte Streukoeffizient (das Produkt aus Streukoeffizient und der Differenz zwischen Eins und dem Streuanisotropiefaktor) (a) in der den fluoreszierenden Farbstoff enthaltenden Schicht und (b) im Rest der Probe bekannt ist sowie (c) der Absorptionskoeffizient, der durch nicht zur Fluoreszenz beitragende Stoffe zustande kommt. Dabei ist Bedingung (a) von größerer, die Bedingung (b) beziehungsweise (c) von untergeordneter Bedeutung. Die Zuordnung der Tiefenausdehnung zum gemessenen BWFV kann, wenn es die praktischen Belange zulassen, auch durch Kalibriermessungen hergestellt werden. Dabei müssen alle Störeffekte berücksichtigt werden, wie sie etwa durch die Oberflächenbeschaffenheit der Probe zustandekommen.

Der Streukoeffizient der Probe kann mit einem bekannten Verfahren gemessen werden (Wang L, Jacques SL: Use of a laser beam with an oblique angle of incidence to measure the reduced scattering coefficient of a turbid medium. Appl Opt 34, 2362 (1995)), das mit dem hier beschriebenen Verfahren ohne weiteres kombiniert werden kann.

Das Verfahren der Tiefenausdehnungsbestimmung aus dem BWFV hat den Vorteil, daß die a priori oft unbekannte Fluoreszenzquantenausbeute des Farbstoffes unerheblich ist.

Eine vorteilhafte Erweiterung des Verfahrens ist im Anspruch 3 angegeben. Die Fluoreszenz, wie sie bei den Einzelmessungen ermittelt wird, ist bei hinreichend geringer Tiefenausdehnung der Verteilung ein Maß für die Farbstoffmenge. Die Farbstoffkonzentration folgt aus dieser relativen Mengenangabe und der Tiefenausdehnung, die mit dem im Patentanspruch 1 genannten Verfahren ermittelt wird.

Eine weitere vorteilhafte Erweiterung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 3 ist im Anspruch 4 angegeben. Das Verfahren wird dahingehend erweitert, daß eine räumliche Auflösung auf der Probenoberfläche erzielt werden kann, indem die Probe anstatt flächig nun punktweise mit Anregungslicht beleuchtet wird. Die sich daraus ergebende laterale Ortsauflösung der Tiefenausdehnungsbestimmung ist von der Größenordnung der reduzierten Streulänge.

Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist in Anspruch 5 angegeben. Das Verfahren des Anspruchs 1 kann technisch so realisiert werden, daß es beispielsweise in der medizinischen Endoskopie verwendet werden kann. Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung, aus dem sich weitere erfinderische Merkmale ergeben, ist in den Zeichnungen Fig. 3 bis 5 dargestellt und wird im folgenden näher beschrieben.

Es zeigen

Fig. 1 Prinzipskizze zum Verfahren nach Anspruch 1.

Fig. 2 Ergebnis eines Experiments, durch das die Tauglichkeit des Verfahrens nach Anspruch 1 bestätigt wurde.

Fig. 3 ein Ausführungsbeispiel gemäß Anspruch 5, dargestellt als Schnitt durch die Anordnung, wobei die Schnittebene parallel zur Achse des Lichtleiterbündels liegt und die Beleuchtungslichtleitfasern schneidet.

Fig. 4 einen der Fig. 3 analogen Schnitt durch die Anordnung der Fig. 3, wobei die Schnittebene die Detektionslichtleitfaser schneidet.

Fig. 5 einen Schnitt durch die Anordnung der Fig. 3, wobei die Schnittebene senkrecht zur Faserbündelachse liegt und der Betrachter vom proximalen Ende des Lichtleiterbündels aus schaut.

Fig. 1 zeigt das Prinzip des Verfahrens nach Anspruch 1. Eine Probe (1) enthält einen fluoreszierenden Stoff in einer an die Probenoberfläche grenzenden Schicht (2, schraffiert) der Dicke D. Das Meßsignal ist das Fluoreszenzlicht (3), das von einer geeigneten Meßanordnung registriert wird. Der fluoreszierende Stoff wird mit elektromagnetischer Strahlung angeregt, mit der die Probe sukzessive unter mindestens zwei Einfallswinkeln ϑ₁ und ϑ₂, von der Flächennormalen aus gerechnet, beaufschlagt wird. Die Pfeile (4) und (5) deuten die Richtung an, aus der die Probe flächig nach Anspruch 1 bzw. punktförmig nach Anspruch 4 beleuchtet wird. Die einfallenden Lichtstrahlen werden im allgemeinen an der Probenoberfläche gebrochen und mit zunehmender Tiefe abgeschwächt, wobei die Strahlungsleistung zum Teil absorbiert, zum Teil durch Streuung in diffuses Licht umgewandelt wird. Die sich dabei einstellende Lichtverteilung in der Probe regt den Farbstoff zur Fluoreszenz an. Unterschiedliche Einstrahlrichtungen bewirken unterschiedliche Lichtverteilungen über der Tiefe, die die Tiefenauflösung bewirken.

Fig. 2 zeigt das Ergebnis einer experimentellen Überprüfung der Tauglichkeit des Verfahrens nach Anspruch 1. Die Messungen wurden durchgeführt mittels zwei eigens hergestellten Probengruppen. Die Proben hatten einen Durchmesser von 25 mm und eine Dicke von 0.2 mm bis 5.0 mm. Es wurde für jede Dicke eine Probe mit niedrigerer und höherer Konzentration hergestellt. Der Farbstoff war in den Proben homogen verteilt. Die Absorptionskoeffizienten betrugen 0.015 mm^-1 und 0.064 mm^-1. Die Proben wurden mit einem praktisch lichtundurchlässigen Stück (Durchmesser 25 mm, Dicke 10 mm) stark lichtstreuenden Kunststoffs (Handelsname "Spektralon") kombiniert, der eine vernachlässigbare Lichtabsorption aufweist. Der reduzierte Streukoeffizient der Proben betrug 0.7 mm^-1. Die Messung der Fluoreszenz nach dem Verfahren des Anspruchs 1 ergab für die Probengruppe mit der niedrigeren Farbstoffkonzentration die mit 6, für die Probengruppe mit der größeren Konzentration die mit 7 bezeichnete Kurve. Es ist ersichtlich, daß das BWFV in beiden Fällen im Rahmen der Meßgenauigkeit identische Ergebnisse liefert. Damit ist gezeigt, daß das BWFV von der Farbstoffkonzentration unabhängig ist, und daß es eine Tiefenauflösung im Bereich bis zu einigen reduzierten Streulängen ermöglicht.

Fig. 3: (Laser-) Licht zur Fluoreszenzanregung wird in die proximalen Enden der Lichtleitfasern (8) und (9), die einen minimierten Durchmesser haben (beispielsweise 100 pm) eingekoppelt und tritt an deren distalen Enden aus, von wo es mit den Mikrolinsen (10) und (11) und einem geeignet geformten Spiegel (14) auf die Probe (15) abgebildet wird. Der Strahlengang ist mit den Linien (12) und (13) angedeutet. Die Lichtleitfasern (8) und (9) werden abwechselnd zur Beleuchtung freigegeben. Durch die Formgebung des Spiegels (14) wird erreicht, daß das von der Lichtleitfaser (8) kommende Licht beispielsweise senkrecht, das von der Lichtleitfaser (9) kommende Licht beispielsweise unter 60° zur Flächen normalen auf die Probe trifft.

Fig. 4: Ein Teil des von der Probe (15) ausgehenden Fluoreszenzlichts wird durch einen zweiten, geeignet angeordneten und geformten Spiegel (17) auf das distale Ende der Detektionslichtleitfaser (18) gelenkt. Der Strahlengang ist durch die Linie (16) angedeutet. Das aus der Lichtleitfaser (18) am proximalen Ende austretende Fluoreszenzlicht wird durch einen der Fluoreszenzemission angepaßten optischen Bandpaßfilter hindurch zu einem geeigneten Lichtdetektionssystem weitergeleitet. Der Baublock mit den distalen Faserenden, den Mikrolinsen und den Spiegel wird geeignet gekapselt. Die Messung erfolgt durch ein Glasfenster.

Fig. 5: Die Anordnung der Lichtleitfasern im Faserbündel ist in der Draufsicht in Richtung der Faserbündelachse vom proximalen Ende aus dargestellt.

Claims (5)

1. Optisches Verfahren zur zerstörungsfreien Bestimmung der Tiefenausdehnung von oberflächennah lokalisierten Verteilungen fluoreszierender Stoffe in lichtstreuenden Medien durch Erfassen des in einen beliebigen Raumwinkel des über der Probe liegenden Halbraums ausgesandten Fluoreszenzlichtes dadurch gekennzeichnet, daß der in der Probe verteilte Stoff durch sukzessive, flächige Beleuchtung mit elektromagnetischer Strahlung unter mindestens zwei unterschiedlichen Einfallswinkeln zur Fluoreszenz angeregt wird und die so erhaltenen Fluoreszenzmeßwerte paarweise für zwei unterschiedliche Einfallswinkel zueinander ins Verhältnis gesetzt werden, wobei dieses sogenannte Beleuchtungswinkel-Fluoreszenzverhältnis ein Maß für die Tiefenausdehnung des den fluoreszierenden Stoff enthaltenden Teilvolumen der Probe ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der sich an den fluoreszierenden Bereich anschließende Teil der Probe beliebige optische Eigenschaften aufweisen darf.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sich ein Maß für die Konzentration des Stoffs aus dem Verhältnis von dem bei mindestens einem der Beleuchtungswinkel gemessenen Fluoreszenzmeßwert und der gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 bestimmten Tiefenausdehnung ergibt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Messung der Tiefenausdehnung eine räumliche Auflösung von der Größenordnung der reduzierten Streulänge der Anregungsstrahlung auf der Probenoberfläche erzielt wird, indem die Probe nicht flächig, sondern punktförmig beleuchtet wird.

5. Exemplarische Vorrichtung nach den Verfahren unter Ansprüchen 1 bis 4 dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung den Anforderungen an den Einsatz in der medizinischen Endoskopie angepaßt wird durch vorteilhafte Miniaturisierung und Kapselung, wobei die Vorrichtung erfindungsgemäß geformte optische Spiegel enthält, die die Eigenschaften des Verfahrens und eine optimale Lichtdetektion gewährleisten.