DE19628959A1 - Verwendung der Nukleotidsequenz und der Proteinstruktur von Enzymen und regulatorischen Proteinen der Trichothecen-Biosynthese für die qualitative und quantitative analytische Erfassung von Pilzen mit der potentiellen Fähigkeit zur Bildung von Trichothecen-Mykotoxinen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren, die sich die Tatsache zunutze machen, daß Pilze mit der Fähigkeit zur Bildung von Mykotoxinen aus der Gruppe der Trichothecene als gemeinsames Merkmal die Produktion bestimmter Enzyme und regulatorischer Proteine besitzen und das die Nukleotidsequenz der kodierenden Gene sowie die Proteinstruktur dieser Eiweißverbindungen analytisch für die Erfassung solcher Pilze in Reinkulturen und in jeglichem Probenmaterial verwendet werden können.

Stand der Technik Allgemeine Bedeutung der Trichothecen-Mykotoxine

Als Mykotoxine werden Substanzen definiert, die aus dem Sekundärstoffwechsel von Pilzen hervorgehen und die auf Mensch und Tier giftig wirken. Bei den betreffenden Substanzen handelt es sich in aller Regel um Moleküle mit einem relativ niedrigen Molekulargewicht. Die chemischen Eigenschaften solcher Substanzen sind sehr unterschiedlich. Dies trifft auch auf die Wirkungsmechanismen zu, über die sie ihre toxische Wirkung ausüben.

Die Trichothecene bilden eine der größten Gruppen innerhalb der Mykotoxine. Sie besitzen als gemeinsames Merkmal eine chemische Grundstruktur, die als 12,13-Epoxy­ trichothec-9-en bezeichnet wird. Diese Grundstruktur wurde in vielfacher Weise durch Bildung von Derivaten abgewandelt. Zur Zeit sind ca. 140 verschiedene Trichothecene bekannt, die durch Vertreter der Pilzgattungen Fusarium, Stachybotrys, Myrothecium, Trichoderma, Trichothecium, Cephalosporium, Cladosporium und Verticimonosporium gebildet werden. Die meisten der bekannten Verbindungen aus dieser Gruppe wurden jedoch lediglich in Laborkulturen der betreffenden Pilze gefunden. In der Natur treten nur 15-20 verschiedene Trichothecene auf. Man unterteilt die Vielfalt der bekannten Substanzen nach der Art der vorhandenen Substituenten in 3 große Gruppen, die als A, B und C-Trichothecene bezeichnet werden.

In der Gruppe der Trichothecene befinden sich Substanzen mit sehr unterschiedlichem toxischem Potential. Die kennzeichnenden Werte der LD₅₀ liegen zwischen 250 mg/kg Ratte (p. o.) und unter 1 mg/kg Ratte (p. o.). Insbesondere A-Trichothecene wie T-2 Toxin, Scirpenol oder Scirpentriol und C-Trichothecene wie Roridin A oder Satratoxin müssen als hochtoxisch angesehen werden. Die Wirkung von Trichothecenen reicht von der Verweigerung des Futters durch Tiere über Läsionen an Hühnerschnäbeln und Hämorrhagien im Bereich von Darm, Leber und Niere, krankhafte Veränderungen an inneren Organen (vor allem der Leber) bis hin zu Veränderungen des Blutbildes oder Knochendeformationen und Krebs. Beim Menschen sind durch Trichothecene verursachte Krankheitsbilder bekannt, die als red mold disease, Kashin-Beck-Syndrom oder auch Alimentäre Toxische Aleukie (ATA) beschrieben wurden. Durch den Verzehr von Getreide, welches auf dem Feld überwinterte, kam es in den 40er Jahren dieses Jahrhunderts in Rußland zum Tod von ca. 100.000 Menschen durch eine Vergiftung mit T-2 Toxin.

Der Wirkungsmechanismus der Trichothecene beruht in der Regel auf der Beeinflussung verschiedener zellulärer Vorgänge. Es kommt zu Störungen bei der Proteinbiosynthese und der DNA-Synthese. Weitere Beeinträchtigungen beruhen auf einer Störung der Elektronentransportkette in den Mitochondrien. Erythrozyten können darüber hinaus deformiert werden. In schweren Fällen kann es auch zur Lysis dieser Zellen kommen. Wegen der oben genannten toxischen Effekte der Trichothecene ist eine Kontrolle von Getreide und Getreide-haltigen Lebensmitteln auf das Vorhandensein dieser Substanzen von großer Bedeutung für die Volksgesundheit und für den allgemeinen Schutz des Verbrauchers. Ein erst seit kurzem bekanntes Phänomen ist das Auftreten eines Krankheitsbildes, das bei Menschen auftritt, die in Gebäuden mit einer hohen Konzentration von Sporen des Pilzes Stachybotrys chartarum in der Raumluft wohnen oder arbeiten. Die Symptome dieser Krankheit sind Mattigkeit, Benommenheit, Konzentrationsstörungen, Atemnot und ständige Übelkeit, die durch die Ausscheidung eines Mykotoxins aus der Gruppe der C-Trichothecene (Satratoxin) verursacht werden. Die Krankheit tritt auf, wenn Trockenbaumaterialien wie Rigips oder auch Holzmaterialien und Tapete feucht werden und schimmeln. Sie wird seit einigen Jahren in den USA beobachtet, tritt aber auch in Deutschland zunehmend auf.

Bisher eingesetzte Verfahren für die Analyse von Trichothecen-Mykotoxinen

Die Analyse dieser Substanzen erfolgt heute vor allem mit chemisch-physikalischen Methoden wie HPLC, GC/MS oder TLC. Alternativ wurden für einige der Substanzen immunchemische Nachweisverfahren entwickelt. Die heute angewendeten Methoden können die Substanzen mit hoher Empfindlichkeit nachweisen, haben jedoch für den Einsatz in der Praxis entscheidende Nachteile. Diese liegen zum einen darin, daß für die chemisch- physikalischen Methoden sehr arbeits- und zeitaufwendige Aufreinigungsverfahren eingesetzt werden müssen, die Störsubstanzen aus den Extrakten entfernen. Zudem sind die für die Analyse verwendeten Geräte sehr teuer. Man kann jedoch mit solchen Methoden häufig in einem Arbeitsgang mehrere Substanzen aus der Trichothecen-Klasse und andere Mykotoxine detektieren. Ein solches Vorgehen ist dagegen mit immunchemischen Methoden nicht möglich, da hier mit einem Antikörper immer nur eine einzige Substanz detektiert werden kann. Sollen mehrere Trichothecene analysiert werden, so müssen dazu mehrere Tests entwickelt beziehungsweise erworben werden. Der Vorteil der immunchemischen Methoden ist ihre in der Regel sehr hohe Nachweisempfindlichkeit. Häufig ist auch der Anspruch an die Reinheit der vermessenen Extrakte geringer als bei den chemisch-physikalischen Methoden.

Problem

Der in Patentanspruch 1 angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, daß die bisher zur Verfügung stehenden Methoden für eine Überprüfung der möglichen Belastung von Lebensmittelrohstoffen und Lebensmitteln mit Trichothecen-Mykotoxinen sehr arbeits-, zeit- und kostenintensiv sind.

Lösungsvorschlag

Dieses Problem wird durch die in Patentanspruch 1 angegebene Erfindung "Verwendung der Nukleotidsequenz und der Proteinstruktur von Enzymen und regulatorischen Proteinen der Trichothecen-Biosynthese für die qualitative und quantitative analytische Erfassung von Pilzen mit der potentiellen Fähigkeit zur Bildung von Trichothecen-Mykotoxinen" gelöst.

Eine schnelle Einschätzung der Qualität und der möglichen Gefahren eines in der Lebensmittelproduktion eingesetzten Rohstoffes ist mit den oben beschriebenen chemisch- physikalischen Verfahren nicht möglich, da sie keine "Screening"-Methoden darstellen. Aufgabe der Erfindung ist es daher, alternative Verfahren bereitzustellen, die die schnelle Unterscheidung von bedenklichen und unbedenklichen Proben in der Qualitätskontrolle erlauben. Dabei wird von der Überlegung ausgegangen, daß nur mit einer Belastung der Probe mit Trichothecen-Mykotoxinen zu rechnen ist, wenn auch ein produzierender Pilz darin vorhanden ist. Diese Feststellung kann mit Verfahren nach der in Patentanspruch 1 angegebenen Erfindung schnell und mit geringem Aufwand und Zeit und Kosten getroffen werden. Erst nachdem eine Probe als mit Trichothecen-bildenden Pilzen belastet erkannt wurde, können immunchemische oder chemisch-physikalische Methoden zum Einsatz kommen, mit denen dann die vorher beanstandeten Proben genauer zu untersuchen sind. Durch diese Vorgehensweise läßt sich die Menge an aufwendig zu untersuchenden Proben deutlich einschränken. Von einem solchen Vorgehen ist eine deutliche Kostenersparnis bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung des Sicherheitsstandards zu erwarten. Auch in der Analyse des oben erwähnten Pilzes Stachybotrys chartarum in der Raumluft kann die in Patentanspruch 1 angegebene Erfindung eingesetzt werde. Dort kommt es auf ein schnelles Erkennen der Ursachen für ein vom Arzt festgestelltes Syndrom an, um möglichst schnell therapeutisch einzugreifen. Ein Verfahren nach diesem Patentanspruch würde die Zeit für eine mikrobiologische Diagnose des Pilzes von ca. 1 Woche auf wenige Stunden verkürzen und kann damit für den betroffenen Patienten einen möglicherweise entscheidenden Zeitvorteil erbringen.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Verfahren nach den Unteransprüchen zum Hauptanspruch angegeben. Die Weiterbildung nach diesen Unteransprüchen ermöglicht die Entwicklung von praxistauglichen Analyseverfahren, die in Form von vorgefertigten Testsystemen in besonders Anwender-freundlicher Form bereitgestellt werden können.

Ein Ausführungsbeispiel für ein Verfahren nach Anspruch 1 (Anspruch 2 der Patentansprüche) ist in Fig. 1 und Fig. 2 dargestellt und wird im folgenden beschrieben.

Es zeigen

Fig. 1: Nachweis des Vorhandenseins des Gens Tri5 für das Enzym Trichodien Synthase in der isolierten DNA verschiedener Arten der Gattung Fusarium, die systematisch in andere Sektionen eingeordnet werden, mit Hilfe der Polymerase Chain Reaction (PCR). Die mit den Primern Tox5-1 und Tox5-2 amplifizierten Fragmente wurden in einem 2%igen Agarosegel elektrophoretisch getrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt. Als Kontrollen diente Wasser ohne DNA.

Fig. 2: Nachweis des Vorhandenseins des Gens Tri5 für das Enzym Trichodien Synthase in der isolierten DNA verschiedener Arten der Gattung Fusarium, die taxonomisch in die Sektion Discolor eingeordnet werden, mit Hilfe der Polymerase Chain Reaction (PCR). Die mit den Primern Tox5-1 und Tox5-2 amplifizierten Fragmente wurden in einem 2%igen Agarosegel elektrophoretisch getrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt. Als Kontrollen diente Wasser ohne DNA und Proben mit DNA von Pilzen anderer Gattungen, Hefe, Bakterien, Gerste und Weizen.

Die Polymerase Chain Reaction (PCR) ist ein heute sehr vielfach eingesetztes Verfahren für die enzymatische Vervielfältigung von Abschnitten der DNA von Organismen. Dabei ist das Zustandekommen der Amplifikation von der Bindung zweier Oligonukleotide (Primer) an die Ziel-DNA abhängig. Der zwischen den Bindungsstellen der Primer liegende Bereich der DNA wird bei der zyklisch sich mehrfach wiederholenden Reaktion logarithmisch so stark vermehrt, das sie sichtbar gemacht werden kann. Bei entsprechender Spezifität der gewählten Primer für die Ziel-DNA kann aus dem Vorhandensein eines amplifizierten Fragmentes von definierter Größe auf die Identität des getesteten Organismus geschlossen werden.

Für das hier zu beschreibende Verfahren wurde DNA mit Standard-Methoden aus pilzlichen Reinkulturen isoliert und gereinigt. Für die enzymatische Amplifikation wurden zwei Oligonukleotid-Primer aus konservativen Teilen der DNA Sequenz des Genes Tri5 der Pilze Fusarium poae, Fusarium sporotrichioides und Gibberella pulicaris (= Fusarium sambucinum) abgeleitet. Die Nukleotidsequenz der mit Tox5-1 und Tox5-2 bezeichneten Primer lautet:
Tox5-1 (5′-GCT GCT CAT CAC TTT GCT CAG-3′)
Tox5-2 (5′-CTG ATC TGG TCA CGC TCA TC-3′).

Die Primer wurden in einer Konzentration von 0,5 µM in 50 µl-Ansätzen mit 1 µl der reinen DNA gemischt. Der Amplifikationspuffer enthielt 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCL, 2 mM MgCl₂, 5 mM (NH₄)₂SO₄, 0,5% Glycerin (pH 9,2). Es wurden 2,5 U taq-Polymerase pro Ansatz zugesetzt. Die Amplifikation erfolgte in einem handelsüblichen Thermocycler nach folgendem Temperaturprotokoll: initiale Denaturierung bei 96°C, 5 Zyklen (1 min 96°C, 2 min 68°C, 3 min 75°C), 30 Zyklen (30 sec 96°C, 30 sec 68°C, 1 min 75°C), finale Kettenverlängerung bei 72°C für 10 min. Die Ansätze wurden mit 30 µl Mineralöl überschichtet.

Aus den PCR-Ansätzen wurden je 10 µl auf ein 2% Agarosegel aufgetragen und für 90 min bei 80 V und 120 mA getrennt. Anschließend wurde das Gel in Ethidiumbromid (0,5 µg/ml) gefärbt. Die gefärbten Banden wurden unter kurzwelligem UV Licht sichtbar gemacht. Fig. 1 und Fig. 2 zeigen Abbildungen solcher Gele.

Es konnten bei denjenigen Arten die Bildung eines DNA-Fragmentes der Länge 600 Basenpaare (bp) beobachtet werden, die in der Literatur als Produzenten von Trichothecen- Mykotoxinen beschrieben wurden und die typischerweise von Materialien isoliert werden, in denen mit anderen Methoden diese Toxine nachweisbar sind. Von den Arten, die in dem hier dargestellten Verfahren keine Bande zeigten, wurde bisher nicht über die Bildung von Trichothecen-Mykotoxinen berichtet. Damit kann ein Pilz, der in diesem Verfahren positiv unter Bildung eines DNA-Fragmentes mit einer Länge von 600 bp reagiert, als potentieller Produzent von Trichothecen-Mykotoxinen identifiziert werden. Besonders vorteilhaft ist bei dieser Art der Analytik, daß sie auch solche Pilze erfaßt, die durch lange Lagerung oder auch durch den Verarbeitungsprozeß abgetötet wurden, jedoch zuvor bereits Trichothecene etwa in befallenem Getreide gebildet haben können.

Zu Anspruch 3 der Patentansprüche

Aus Sequenzinformationen die aus Genen, die an der Biosynthese von Trichothecen- Mykotxinen gewonnen wurden, können Teilsequenzen abgeleitet werden, die spezifisch den Nachweis einzelner Arten aus dem Spektrum der Trichothecen-bildenden Pilze zulassen. Die eingesetzten Methoden entsprechen den in den Verfahren nach Anspruch 2 der Patentansprüche beschriebenen Methoden.

Zu Anspruch 4 der Patentansprüche

Aus der Nukeotidsequenz anderer, an der Biosynthese von Trichothecen-Mykotoxinen beteiligter Enzyme und regulatorischer Proteine können in der gleichen Weise wie unter dem Ausführungsbeispiel zum Anspruch 1 (=Anspruch 2 der Patentansprüche) beschrieben, Oligonukleotid-Sonden und -Primer abgeleitet werden. Diese können in Kombination mit den in Anspruch 2 der Patentansprüche aufgeführten Oligonukleotiden in einem gemeinsamen oder auch in zwei oder mehr analytischen Reaktionsansätzen eingesetzt werde. Aus der resultierenden Anzahl von DNA Fragmenten und deren Größe kann ein Rückschluß auf das Vorhandensein von Untergruppen zu der Gruppe der Trichothecen-bildenden Pilze gezogen werde. Dies kann von Bedeutung sein, wenn es darum geht, etwa nur die Bildner der toxikologisch potenteren Gruppe der A-Trichothecene analytisch zu erfassen.

Zu Anspruch 5 der Patentansprüche

Wenn Gene in ein Genprodukt, welches eine biosynthetische Reaktion katalysiert, übersetzt werden, so geschieht dies nach einem in der Biochemie als Translation bezeichneten Vorgang. Dabei wird von dem Bereich des DNA-Moleküles, auf dem das Enzym kodiert ist eine Abschrift erstellt. Diese Abschrift besteht aus einer Ribonukleinsäure, und wird als messenger RNA (mRNA) bezeichnet. Die Nukleotidsequenz der mRNA stellt die Matrize dar, nach der die Zelle mit Hilfe eines als Translation bezeichneten Vorgang die Aminosäuresequenz für ein Proteinmolekül synthetisiert, das schließlich seine katalytische oder regulatorische Funktion in der Biosynthese von Stoffen übernimmt.

Mit Standardmethoden kann man mRNA sehr gezielt analytisch nutzen. Voraussetzung dafür ist jedoch die Kenntnis ihrer Nukleotidsequenz. Diese kann, wenn die DNA-Sequenz eines Genes bekannt ist, leicht erhalten werden. Die für Verfahren nach Anspruch 2 und Anspruch 3 der Patentansprüche verwendeten Nukleotidsequenzen können hier eingesetzt werden. Verfahren, die mRNA analytisch ausnutzen, haben gegenüber den auf der reinen Gensequenz beruhenden Verfahren den Vorteil, daß sie ein positives Signal nur in solchen Fällen geben, wenn die Gene, die letztlich zur Synthese von Trichothecenen führen, auch aktiv sind. Damit können nicht nur potentielle Kontaminationen durch solche Mykotoxine angezeigt werden, sondern indirekt die tatsächliche Bildung der Substanzen angezeigt werden. Die Methode hat gegenüber der Verwendung von DNA als analytisches Zielmolekül den Nachteil, daß nur lebende Pilze erfaßt werden können, da mRNA nach dem Absterben der Zellen innerhalb kurzer Zeit zerfällt.

Zu Anspruch 6 der Patentansprüche

Die Proteine, die Schritte in der Biosynthese von Trichothecen-Mykotoxinen katalysieren oder regulieren, können durch den Aufschluß stoffwechselaktiver Zellen der produzierenden Pilze mit Standardmethoden gewonnen werden. Diese Eiweißmoleküle können gereinigt und für die Immunisierung von Säugetieren oder Vögeln verwendet werden. Das Immunsystem dieser Tiere bildet gegen die Strukturen solcher Enzyme Antikörper. Nach Gewinnung der Antikörper als Serum oder auch in gereinigter Form können diese analytisch für den Nachweis des Vorhandenseins der entsprechenden Antigene eingesetzt werden, da sie sich spezifisch an diese binden. Mit Hilfe solcher spezifischen Antikörper können nach Standardmethoden Testsysteme erstellt werden, die Enzyme der Trichothecen-Biosynthese in Lebensmitteln oder auch in Reinkulturen nachweisen. Durch den Einsatz solcher Nachweissysteme kann eine eventuell in einem Lebensmittel oder einem Lebensmittelrohstoff vorliegende Kontamination mit Trichothecen-Mykotoxinen im Sinne einer Qualitätsbeurteilung abgeschätzt werden. Dabei geht man davon aus, daß bei einem Vorhandensein der für die Biosynthese notwendigen Enzyme auch das Produkt gebildet wird. Durch Variation des Testaufbaues nach verschiedenen immunchemischen Standardmethoden kann eine Anpassung des Systems an unterschiedliche Problemstellungen erreicht werden.

Claims (6)

1. Verwendung der Nukleotidsequenz und der Proteinstruktur von Enzymen und regulatorischen Proteinen der Trichothecen-Biosynthese für die qualitative und quantitative analytische Erfassung von Pilzen mit der potentiellen Fähigkeit zur Bildung von Trichothecen-Mykotoxinen, dadurch gekennzeichnet, daß Verfahren eingesetzt werden, die sich die Tatsache zunutze machen, daß potentiell Trichothecene-bildende Pilze als gruppenspezifische Gemeinsamkeit eine sehr große Ähnlichkeit im strukturellen Aufbau einzelner Gene der Biosynthese dieser Substanzen besitzen und sich die Nukleotidsequenz dieser Gene sowie die Proteinstruktur der darauf kodierten Enzyme und regulatorische Proteine für einen Nachweis solcher Pilze nutzen lassen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß aus Nukleotid-Sequenzen, die für solche Enzyme kodieren, die Schritte in der Biosynthese von Trichothecen-Mykotoxinen katalysieren oder regulieren, Oligonukleotid-Sonden oder Oligonukleotid-Primer für eine enzymatische DNA Amplifikation abgeleitet werden und deren Bindung an eine Ziel-DNA oder die Entstehung spezifisch amplifizierter DNA-Fragmente als analytisches Merkmal für das Vorhandensein potentiell Trichothecene-bildender Pilze in Reinkulturen und in jeglichem Probenmaterial verwendet wird (gruppenspezifischer Nachweis).

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Methoden eingesetzt werden, bei denen Oligonukleotid-Sonden oder Oligonukleotid-Primer verwendet werden, die aus Sequenzinformationen einzelner Gene abgeleitet wurden, die Schritte in der Biosynthese von Trichothecen- Mykotoxinen katalysieren oder regulieren, um mit diesen spezifisch einzelne Arten von Trichothecen-bildenden Pilzen in Reinkulturen oder in jeglichem Probenmaterial nachzuweisen (artspezifischer Nachweis).

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Oligonukleotid-Sonden oder Oligonukleotid-Primer, die spezifisch mit beliebigen Teilen der Nukleotidsequenz einzelner Enzyme oder regulatorischer Proteine der Trichothecen-Biosynthese hybridisieren, in Kombination mit anderen Oligonukleotid- Sonden oder Oligonukleotid-Primern, die spezifisch mit der Nukleotidsequenz anderer an der Trichothecen-Biosynthese beteiligter Enzyme oder regulatorischer Proteine hybridisieren, als analytisches Merkmal für das Vorhandensein von Trichothecen- bildenden Pilzen in Reinkulturen und jeglichem Probenmaterial verwendet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Zielmolekül für Methoden nach Anspruch 1 messenger RNA (mRNA) verwendet wird, die durch den Vorgang der Transkription aus der Nukleotid-Sequenz von Enzymen oder regulatorischen Proteinen der Trichothecen-Biosynthese entstanden sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die Identifizierung von Trichothecen-bildenden Pilzen in Reinkulturen und jeglichem Probenmaterial, Antikörper jeglichen Subtyps eingesetzt werden, die durch die Immunisierung von Tieren mit Enzymen oder regulatorischen Proteinen der Trichothecen-Biosynthese sowie einzelnen daraus isolierten Epitopen erhalten wurden. Der Anspruch erstreckt sich auf ungereinigte und gereinigte polyklonale Antiseren, ungereinigte und gereinigte monoklonale Antikörper und solche Antikörper oder deren Teile in gereinigter oder ungereinigter Form, die durch Expression in anderen Organismen entstanden sind.