WO2003004701A2 - Procede de determination de la capacite de fusarium a produire des toxines trichothecenes - Google Patents

Abstract

L 'invention conceme un procédé de determination de la capacité de champignons Fusarium à produire des toxines trichothécènes caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection d'au moins une séquence représentative d'un niveau de production déterminé de trichothécène, la dite séquence représentative n'appartenant pas à la séquence consensus commune à d'une part des souches faibles ou non productrices de trichothécènes et d'autre part des souches fortes productrices de trichothécènes.

Description

Procédé de détermination de la capacité de Fusarium à produire des toxines trichothécènes

L'invention concerne une séquence nucléotidique isolée de Fusarium associée à la synthèse par des souches de Fusarium de toxines en particulière de trichothécènes. L'invention concerne également un procédé de mesure quantitative de la capacité d'une souche de Fusarium à produire ces toxines, des kits de détection et de mesure de la capacité à produire des toxines. L'invention concerne également notamment des supports de ces séquences nucléotidiques, des vecteurs de clonage et/ou d'expression, des cellules hôtes de ces séquences, des souches de Fusarium faibles productrices de toxines.

Les Fusarium sont des champignons filamenteux responsables de nombreuses maladies des céréales. En particulier certaines espèces contaminent les grains de blé, maïs, orge,... Cette contamination a une double conséquence. D'une part, elle peut provoquer une réduction significative des rendements. D'autre part, les grains contaminés peuvent contenir des mycotoxines dont la toxicité est de plus en plus mise en évidence.

Les mycotoxines sont des molécules qui appartiennent à différentes familles biochimiques. Parmi ces mycotoxines, les TCT représentent une famille de plus de

140 molécules identifiées (Grove, 1988) et sont classés en 3 groupes structurels (type

A, B, C).

La figure 1 rappelle la structure des trichothécènes. Tous les trichothécènes présentent un squelette 12,13-epoxy-trichothec-9-ene, comme structure commune. Les TCT B comprenant notamment le DON, le NIV et leurs formes acétylées ont été isolés de céréales dans le monde entier (Trenholm et al, 1981, Abbas et al, 1988;

Tanaka et al, 1988, Fujisawa et al, 1992; Kim et al, 1993; Yoshiza a and Jin, 1995,

Ryu et al, 1996; Park et al, 1996, Muller et al., 1997, Dalcero et al, 1997) ".

Les trichothécènes constituent un risque pour la santé des animaux et de l'homme. Les valeurs de toxicité correspondent à une valeur DL₅₀ de 0,5 mg/kg à 250 mg/kg

(Cole et Cox, 1981). L'ingestion et le contact de la peau peuvent provoquer un large spectre de symptômes (Rotter et al., 1996, Eriksen et Alexander,1998 pour revue) tels que l'irritation de la peau (Pan g et al., 1989), la diarrhée (Matsuoka et Kubota, 1987), le vomissement (Ishii et al., 1975), des désordres immunologiques (Taylor et al., 1989), des troubles cardiaques (Bubi-En et al., 1989) et du système nerveux (Feuerstein et Lorenzana, 1989). Des maladies humaines liées à une ingestion de mycotoxines trichothécènes sont VAleucie Alimentaire Toxique (ATA) (Joffe, 1971), la maladie d'Urov (Kashin-Beck-Sindrome) (Joffe, 1986).

Les TCT présents sur les céréales sont thermostables (Wolf and Bullerman, 1998; Wolf-Hall et al, 1999) et ne sont que très peu détruits au cours des procédés utilisés en agro-alimentaire (Scott, 1984; Bennet and Richard, 1996). Dans certaines filières comme la malterie, il a même été démontré que les conditions de production étaient favorables à une croissance de novo des Fusarium et à la biosynthèse de TCT B (Flannigan et al, 1984; Schwarz et al, 1995).

La contamination par des mycotoxines de l'alimentation a été estimée comme l'un des principaux facteurs conduisants à la perte de produits alimentaires dans le monde (Charmley et al., 1994). La présence de ces trichothécènes sur les céréales est donc un problème de santé publique et est un enjeu économique de taille sur le marché des céréales.

A l'échelle du champ, il n'existe pas de corrélation simple entre l'évaluation de l'attaque des céréales (taux de Fusarium et leur teneur en mycotoxines) (Parry et al., 1995). De même au laboratoire il n'y a pas de relation directe entre le niveau de biomasse formée et la quantité de toxine produite. Les moyens de lutte contre le Fusarium développés jusqu'à présent ne sont que très partiellement adaptés à la maîtrise de la formation de ces mycotoxines sur les céréales et malgré l'application de fongicides, tous les céréales peuvent contenir des concentrations plus ou moins fortes de ces mycotoxines. Il est donc très souhaitable d'obtenir une technique permettant de différencier des souches très productrices de ces toxines, des souches peu ou pas productrices.

Il est établi que certaines espèces de Fusarium sont capables de produire des TCTB alors que d'autres espèces de Fusarium ne le peuvent pas (Guadet et al, 1989; Mule et al, 1997, O'Donnell et al, 1998).

La figure 3 rappelle la relation phylogénique entre différentes souches de Fusarium productrices de trichothécènes (d'après O'Donnel et al. 1998). Cependant, de très nombreuses études ont également montré, qu'au sein de ces espèces, la production de TCT B dépendant fortement de la souches. Dans les mêmes conditions optimales de croissance, certaines souches vont produire de grandes quantités de TCTB (de l'ordre des ppm ou ug/g de grains) tandis que d'autres vont produire de très faibles voire non détectables quantité (de l'ordre de quelques ppb ou ng/g de grain) de TCTB (Manka et al, 1985; Blaney et Dodman, 1988, Mirocha et al, 1989; Sydenham et al, 1991; Miller et al, 1991 ; Atanassov et al, 1994; Gang et al, 1998, Langseth et al, 1999; Muthomi et al, 2000; Walker et al, 2001). Ces différents souches sont impossibles à distinguer à partir de caractères phénotypiques conventionnels (aspect du mycélium, forme et taille des spores,...), et il est ainsi nécessaire de les cultiver en laboratoire pendant au moins 3 semaines pour pouvoir ensuite doser les mycotoxines produites et ainsi définir le caractère fort producteur ou non de chaque souche. Les trichothécènes sont le produit d'une chaîne de biosynthèse dont les différentes étapes sont catalysées par des enzymes codés par un ensemble de gènes qui sont, en particulier chez les différentes espèces de Fusarium, organisés sous forme d'un cluster de gènes (Tag et al.,2001, Brown et al,2001,Lee et al.,2001). Par exemple, les gènes TRI5 et TRI6 sont localisés l'un à coté de l'autre. TRI5 code pour la trichodiène synthase (enzyme qui catalyse la cyclisation du farnesyl pyrophosphate (FPP) pour conduire au trichodiène), première étape de la chaîne de biosynthèse des trichothécènes. TRI6 code pour un facteur de transcription qui régule l'expression de nombreux gènes et en particulier de TRI5. Un exemple d'organisation de gènes TRI chez Fusarium est donné en figure 2. Certains des gènes impliqués (TRI3, TRI4, TRI5, TRI6) ont été analysés pour le Fusarium sporotrichioides, principal producteur de toxines T-2 dans des conditions naturels (Hohn et Beremand, 1989). Le gène TRI5 (=tox5) est situé fonctionnellement au tout début du cluster de gène de biosynthèse de trichothecene. La séquence nucléotidique de ce gène a été caractérisée pour Fusarium sporotrichioides (Flohn et Beremand, 1989), Fusarium sambucinum (Hohn et Dejardins, 1992), Fusarium graminearum (Proctor et al., 1996, Lee et al,2001, Brown et al ;2001) et Fusarium poae (Fekete et al., 1994). A l'heure actuelle, on connaît différents documents proposant des amorces PCR permettant la détection d'espèces de Fusarium, notamment le document US 5,827,695, US 5,814,453, O98/50584, qui décrivent également des amorces spécifiques d'après des séquences codant pour le ribosome le plus souvent. Il existe certes une corrélation entre la position phylogenique d'une souche et le type de mycotoxine qu'elle est susceptible de produire. Cependant, comme indiqué plus haut, cette détermination taxonomique n'indique pas s'il s'agit d'une souche fortement ou faiblement productrice de TCTB.

Par ailleurs on connaît également des études visant à identifier des souches de Fusarium potentiellement toxinogènes. Par exemple décrivant des amorces PCR permettant d'amplifier le gène tri5 chez tous les Fusarium possédant ce gène (Niessen et Vogel, 1998). Mais qu'elles soient faiblement ou fortement productrices de TCTB, toutes les souches de Fusarium concernées possèdent le gène tri5. Récemment, une équipe anglaise (Edwards et al. 2001) a mis au point une méthode de PCR quantitative du gène tri5. Cette méthode permet de quantifier le niveau de contamination de céréales par des souches de Fusarium possédant le gène tri5 , quelque soit leur phénotype (fort ou faible producteur de trichothécènes). En conséquence les limites de l'approche exposées ci-dessus sont également applicables. En outre, une technique de RT PCR quantitative sur le gène tri5 (Doohan et al., 1999) a permis de quantifier la transcription du gène tri5. Toutefois, l'expression du gène tri5 n'est pas constante au cours du développement du Fusarium. Autrement dit, jusqu'à présent, les méthodologies proposées permettent d'identifier les souches potentiellement productrices de trichothécènes, mais ne différencient pas les fortes des faibles productrices. L'invention vise à palier les inconvénients de l'art antérieur . L'invention vise également à fournir des outils utilisables directement sur les grains de céréale. L'invention vise également à permettre d'orienter rapidement, dans la chaîne agro-alimentaire, la destination finale de lots de céréales susceptibles d'être fortement contaminés par la toxine, ou porteurs de souches de Fusarium fortement productrices de TCTB.

A cet effet l'invention concerne selon un premier aspect un procédé de détermination de la capacité de champignons Fusarium à produire des toxines trichothécènes, ledit procédé comprenant une étape de détection d'au moins une séquence représentative d'un niveau de production déterminé de trichothecene, la dite séquence représentative n'appartenant pas à la séquence consensus commune à d'une part des souches faibles ou non productrices de trichothécènes et d'autre part des souches fortes productrices de trichothécènes. Le procédé vise à détecter au moins une séquence caractéristique représentative d'un niveau de production fort ou faible, ces séquences étant distinctives entre les souches fortes et faibles productrices.

Les inventeurs ont en effet démontré l'existence de telles séquences dans la zone intergénique TRI5-TRI6. Toutefois de telles séquences distinctives identifiées dans d'autres régions du cluster TRI font également partie de l'invention. De manière préférée l'invention concerne ainsi un procédé de détermination de la capacité de champignons Fusarium à produire des toxines utilisant les variations de séquence dans la région située entre les gènes TRI5 et TRI6, entre d'une part les souches fortes productrices et d'autre part les souches faibles productrices. Ce procédé vise notamment l'espèce Fusarium culmorum, mais d'autres espèces sont bien entendu concernées, notamment F. graminearum (G zeae), F. culmorum, F. Croo vellense (F. cerealis), F. pseudo graminearum .

Selon une réalisation préférée, le procédé comprend une étape de détection d'au moins une séquence représentative d'un niveau de production déterminé de trichothecene, la dite séquence représentative étant située dans la région intergénique entre les gènes TRI5 et TRI6.

La détection utilise typiquement une technique d'amplification, d'hybridation ou de séquençage.

L'amplification utilise au moins une amorce capable d'amplifier une séquence représentative d'un niveau de production déterminé, ladite séquence représentative n'appartenant pas à la séquence consensus commune à d'une part des souches faibles ou non productrices et d'autre part des souches fortes productrices de toxines. Dans la suite du texte, on entend par la capacité de champignons Fusarium à produire des toxines trichothécènes, le niveau prédéterminé de cette production en fonction de la séquence intergénique située entre les gènes TRI5 et TRI6, comme démontré par les inventeurs.

L'amplification utilise au moins une amorce capable d'amplifier une séquence appartenant à ladite séquence intergénique et n'appartenant pas à une séquence choisie parmi

- a) une séquence consensus commune à d'une part des souches faibles ou non productrices et d'autre part des souches fortes productrices de toxines - b) un fragment représentatif de ladite séquence consensus.

Par séquence consensus on entend une séquence commune à d'une part des souches faibles ou non productrices et d'autre part des souches fortes productrices de toxines. En effet les inventeurs ont démontré qu'il existe des séquences présentes chez les souches faibles productrices testées qui ne sont pas retrouvées chez les souches fortes productrices testées, et inversement. En figure 7 on a indiqué une partie de la séquence consensus commune aux souches faibles productrices K2 et Cl et fortes productrices L2 et NI. Par exemple en position ntl à nt50 les quatre séquences sont identiques, alors qu'en position nt2706 et nt 2707 de la figure 7, les bases C et G présentes chez L2 et NI sont absentes chez K2 et Cl. Ainsi on recherchera selon l'invention à amplifier des séquences distinctives du type de souche, forte ou faible productrice, en amplifiant des séquences qui ne sont pas présentes dans la séquence consensus. Lorsque l'amplification conduit à un produit d'amplification, cela signifie que la séquence amplifiée comprend une séquence nucléotidique que l'on ne retrouve pas à la fois chez les souches fortes productrices et chez les faibles productrices, ce qui permet de les différencier.

Dans l'exemple ci-dessus correspondant à la figure 4, on cherchera à amplifier par exemple un fragment nucléotidique compris entre les positions nt2692 et nt2863 (coordonnées correspondant à la figure 7) cette amplification conduira à un produit d'amplification caractéristique de souches fortes productrices de trichothécènes. Le terme fort producteur correspond à une quantité produite de l'ordre de 1 ppm à 100 ppm. Le terme faible producteur correspond à une quantité produite inférieure à environ 100 ppb. Selon un mode de réalisation la séquence intergénique TRI5-TRI6 est choisie parmi : a) une séquence nucléotidique choisie parmi une séquence correspondant à SEQ ID N° 1 à SEQ ID N°4 b) une séquence nucléotidique comportant au moins 80 % d'identité avec une séquence définie en a) ; c) une séquence nucléotidique hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence définie en a) ou b) ; d) une séquence nucléotidique complémentaire de SEQ ID N° 1 ou complémentaire d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b) ou c) ; e) une séquence nucléotidique de fragment représentatif d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b) , c) ou d) ; f) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), c), d) ou e). Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui sont employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADNs. Ainsi, les séquences nucléiques selon l'invention englobent également les PNA (Peptid Nucleic Acid), ou analogues. Il doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié.

On entend ainsi également désigner les acides nucléiques obtenus par synthèse chimique. Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci- après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981, Ad. App. Math. 2 : 482), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48: 443), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les matrices PAM ou PAM250. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 85 % ou 90 %, de façon plus préférée 95 % voire 98 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation. un allongement, une fusion chimérique et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, 90 %, 95 % ou 98 %, d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences complémentaires sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec les séquences de référence. De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité après alignement optimal entre l'une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre.

Lïne hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre illustratif. des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.

L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % dADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42°C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., (1989, Molecular cloning : a laboratory manual. 2^nd Ed. Cold Spring Harbor). Par fragment représentatif on entend désigner tout fragment nucléotidique présentant au moins 5 nucléotides, de préférence au moins 10, 30, 75, 150 nucléotides consécutifs de la séquence dont il est issu, et déterminant le niveau de production de toxines. Les fragments représentatifs selon l'invention peuvent être obtenus par exemple par amplification spécifique telle que la PCR ou après digestion par des enzymes de restriction appropriés de séquences nucléotidiques selon l'invention, cette méthode étant décrite en particulier dans l'ouvrage de Sambrook et al.. Lesdits fragments représentatifs peuvent également être obtenus par synthèse chimique lorsque leur taille n'est pas trop importante, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.

Parmi les séquences contenant des séquences de l'invention, ou des fragments représentatifs, on entend également les séquences qui sont naturellement encadrées par des séquences qui présentent au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité avec les séquences selon l'invention.

Les inventeurs ont démontré de façon très surprenante que la séquence nucléotidique intergénique TRI5-TRI6 (repérée comme SEQ ID N°l à SEQ ID N°4 dans le listing de séquences annexé respectivement pour quatre souches K2, Cl, C2, NI), isolée par les inventeurs comprend des séquences nucléotidiques dont la présence est directement corrélée à un niveau de production de trichothécènes. Vraisemblablement ces séquences nucléotidiques sont des séquences régulatrices capables de moduler la synthèse par Fusarium de toxines, plus spécialement d'au moins un trichothecene. Pour diagnostiquer un phénotype fort ou faible producteur, on cherchera selon une réalisation à amplifier une séquence représentative. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, les amorces utilisées sont aptes à amplifier une séquence nucléotidique représentative d'une capacité de production déterminée de toxine, choisie parmi : a) une séquence comprenant un fragment d'acide nucléique choisi parmi les fragments compris entre les positions (264 nt-330 nt) de la séquence SEQ ID N°l à SEQ ID N°4 ; (590 nt-660 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (590 nt-657 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (741 nt- 770 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (738 nt-767 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (870 nt-950 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (867 nt-938 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (996 nt-1150 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (984 nt-1138 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (1180 nt-1260 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (1 168 nt-1244 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (1300 nt-1547 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (1284 nt-1526 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (1596 nt-1762 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID

N°2 ; (1575 nt-1745 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (1813 nt-1982 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 / (1795 nt-1961 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (1990 nt-2178 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (1970 nt-2142 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2207 nt-2308 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2170 nt-2230 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2356 nt-2435 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2280 nt-2360 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2474 nt-2718 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2399 nt-2660 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2738 nt-2818 nt) de la séquence

SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2679 nt-2769 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2848 nt-2948 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2799 nt-2899 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2977 nt-3138 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2929 nt-3088 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (3268 nt-3497 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (3216 nt-3446 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (4027 nt-4133 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (3976 nt-4090 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4. b) une séquence nucléotidique comportant au moins 80 % d'identité avec une séquence définie en a) c) un fragment représentatif d'une séquence définie en a) ou b). Ces séquences comprennent une séquence nucléotidique distinctive (ne faisant pas partie de la séquence consensus de la figure 7 pour les quatre souches indiquées) entre les souches fortes et faibles productrices. Les inventeurs ont en effet démontré que les séquences sont en effet extrêmement proches entre des souches d'un même phénotype (fort ou faible producteur) dans la région intergénique TRI5-TRI6 (seulement 0.2% de différences dans le cas présenté ici de Fusarium culmorum) alors que la différence entre les souches d'un phénotype différent est significativement supérieure (de l'ordre de 13%).

Comparaison des séquences intergéniques tri5-tri6 des quatre souches F. culmorum

F. culmorum souches

% Dif K2 Cl L2 NI

(D

K2 0 0,42 13,19 13,44

Cl 0 13,15 13,21

L2 0 0,22

NI 0

^ pourcentage de différences nucléotides entre chaque souche

Coordonnées des fragments polymorphes

frag ;ments alignement seq ID 1 seqlD 2 seqID3 seq ID 4

(figure 7) souche K2 souche Cl souche L2 souche NI

1 264-330 264-330 264-330 264-330 264-330

2 590-660 590-660 590-660 590-657 590-657

3 741-770 741-770 741-770 738-767 738-767

4 870-950 870-950 870-950 867-938 867-938

5 996-1 150 996-1 150 996-1 150 984-1 138 984-1 138

6 1 180-1260 1 180-1260 1 180-1260 1 168-1244 1 168-1244

7 1300-1550 1300-1547 1300-1547 1284-1526 1284-1526

8 1600-1771 1596-1762 1596-1762 1575-1745 1575-1745

9 1 821-1990 1813-1982 1813-1982 1795-1961 1795-1961

10 1999-2190 1990-2178 1990-2178 1970-2142 1970-2142

1 1 2219-2320 2207-2308 2207-2308 2170-2230 2170-2230

12 2361-2450 2356-2435 2356-2435 2280-2360 2280-2360 13 2490-2750 2474-2718 2474-2718 2399-2660 2399-2660

14 2771-2860 2738-2818 2738-2818 2679-2769 2679-2769

15 2891-2990 2848-2948 2848-2948 2799-2899 2799-2899

16 3020-3180 2977-3138 2977-3138 2929-3088 2929-3088

17 3310-3540 3268-3497 3268-3497 3216-3446 3216-3446

18 4070-4184 4027-4133 4027-4133 3976-4090 3976-4090

Selon une réalisation les couples d'amorces sont choisis parmi :

- une amorce sens dont la séquence comprend SEQ ID N°5 (qui correspond au fragment nt2692-nt 271 1 de la figure 7) et une amorce antisens dont la séquence comprend SEQ ID N°6 (qui correspond au fragment nt2844-nt2863 de la figure 7)

- une amorce sens dont la séquence comprend SEQ ID N°7 et une amorce antisens dont la séquence comprend SEQ ID N°8 - une amorce sens dont la séquence comprend SEQ ID N°9 et une amorce antisens dont la séquence comprend SEQ ID N°10.

Ceci étant, la liste de séquences amplifiables ci-dessus n'est pas exhaustive : la présente invention enseigne d'amplifier des séquences distinctives entre les souches fortes et faibles productrices de trichothécènes. La toxine est un trichothecene, plus spécialement un trichothecene B, encore plus spécialement choisi parmi le deoxynivalenol (DON), le nivalenol (NIV) et leurs formes acétylées.

Selon un autre aspect l'invention concerne une séquence nucléotidique de Fusarium choisie parmi : a) une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N°l à SEQ

ID N°4 ; b) une séquence nucléotidique comportant au moins 95 % d'identité avec une séquence définie en a), de préférence au moins 96%, 97%, 98% d'identité ; c) une séquence nucléotidique hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence définie en a) ou b) ; d) une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b) ou c) ; e) une séquence nucléotidique de fragment représentatif d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b). c) ou d) ;

Selon un mode de réalisation, une telle séquence nucléotidique comprend une séquence régulatrice représentative de la capacité de production déterminée de toxine, choisie parmi : a) une séquence comprenant un fragment d'acide nucléique choisi parmi les fragments compris entre les positions (264 nt- 330 nt) de la séquence SEQ ID N°l à SEQ ID N°4 ; (590 nt-660 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (590 nt- 657 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (741 nt- 770 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (738 nt- 767 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (870 nt- 950 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (867 nt- 938 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (996 nt- 1 150 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (984 nt- 1138 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (1180 nt- 1260 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (1168 nt- 1244 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (1300 nt- 1547 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (1284 nt-

1526 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 (1596 nt- 1762 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 (1575 nt- 1745 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 (1813 nt- 1982 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 / (1795 nt- 1961 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (1990 nt- 2178 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 (1970 nt- 2142 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 (2207 nt- 2308 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 (2170 nt- 2230 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 (2356 nt- 2435 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 (2280 nt- 2360 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 (2474 nt- 2718 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 (2399 nt- 2660 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2738 nt- 2818 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2679 nt- 2769 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2848 nt- 2948 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2799 nt- 2899 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2977 nt-

3138 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2929 nt- 3088 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (3268 nt- 3497 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (3216 nt- 3446 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (4027 nt- 4133 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (3976 nt-

4090 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4.

- b) une séquence nucléotidique comportant au moins 80 % d'identité avec une séquence définie en a)

- c) un fragment représentatif d'une séquence définie en a) ou b)

Selon un mode de réalisation préféré, une telle séquence représentative régulatrice est une séquence « enhancer » qui présente au moins un site de liaison pour une protéine impliquée dans la transcription du gène Tri5 et/ou du gène Tri6. Selon une variante ces séquences enhancer interviennent dans la liaison de séquences de promoteurs du gène Tri5 et/ou du gène Tri6 avec des protéines impliquées dans la transcription de ces gènes. Typiquement les promoteurs sont « liés de manière opérationnelle » aux gènes Tri5 et/ou Tri6, « liés de manière opérationnelle » signifiant que ces promoteurs ont un lien fonctionnel avec les gènes correspondants, lesdits promoteurs initiant et contrôlant la transcription desdits gènes. Généralement, « lié de manière opérationnelle » signifie que les séquences d'acide nucléiques liées sont contiguës, et lorsqu'il s'agit de joindre deux régions codant pour des protéines, les séquences d'acide nucléiques liées sont contiguës et dans la même phase de lecture. Selon un autre aspect l'invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique intergénique TRI5-TRI6 de Fusarium pour la détermination du niveau de production de trichothécènes par Fusarium.

Selon un autre aspect l'invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique intergénique TRI5-TRI6 de Fusarium pour le contrôle de la production de trichothécènes par Fusarium.

Selon un autre aspect l^'invention concerne une séquence polypeptidique codée par une séquence nucléotidique régulatrice.

Selon un autre aspect l'invention concerne une séquence nucléotidique utilisable comme amorce ou sonde, choisie parmi les séquences nucléotidiques décrites précédemment. Ces séquences nucléotidiques amorces sont aptes à permettre l'amplification d'un fragment d'une séquence intergénique TRI5-TRI6 directement associé à une capacité de production déterminée de toxine par Fusarium.

L'invention concerne selon une réalisation les séquences nucléotidiques amorces choisies parmi les séquences SEQ ID N°5 à SEQ ID N°10 et leurs variants.

Ces sondes ou amorces peuvent en particulier être utilisées dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquences nucléique comme cela sera décrit plus loin.

Une sonde ou amorce se définit, au sens de l'invention, comme étant un fragment d'acide nucléique simple brin ou un fragment double brin dénaturé, et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible.

Selon une réalisation, les sondes et amorces selon l'invention sont marquées directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.

Les séquences de polynucléotides selon l'invention non marquées peuvent être utilisées directement comme sonde ou amorce.

Les séquences sont généralement marquées pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications. Le marquage des amorces ou des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives.

Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le ³²P, le ³³P, le ³⁵S, le ³H ou le

¹²³I. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. L'invention vise également les acides nucléiques susceptibles d^'être obtenus par amplification à l'aide d^'amorces selon l^'invention.

Les polynucléotides de l'invention mentionnés précédemment peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique de PCR (amplification en chaîne par polymérase) (Rolfs et al., 1991, Berlin : Springer-Verlag) . Cette technique nécessite le choix de paires d^'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N° 4,683,202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la fïltration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions, puis séquences. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée en utilisant comme amorce les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention comme matrice, des plasmides contenant ces séquences ou encore les produits d'amplification dérivés. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés. D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entend désigner toutes les méthodes mettant en œuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues, en général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription reverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20 : 1691), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1173), la technique 3SR (Self-Sustained Séquence Replication) décrite par Guatelli et al. (1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874), la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification) décrite par Kievitis et al. (1991, J. Virol. Methods, 35, 273), la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al. (1988, Science 241, 1077), la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev (1992, Kessler C. Springer Verlag, Berlin, New-York, 197-205), la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al. (1990, Biotechniques, 9, 142), la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele et al. (1983, J. Mol. Biol., 171, 281). Certaines de ces techniques ont depuis été perfectionnées. Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARNm, on utilise avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en œuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention. On peut ainsi utiliser les techniques de RT-PCR, de PCR quantitative.

La technique d'hybridation de sondes peut être réalisée de manières diverses (Matthews et al., 1988, Anal. Biochem., 169, 1-25). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support désigné support d'immobilisation (tel que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).

Selon un autre mode de mise en œuvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce cas, une sonde, dite « sonde de capture », est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite « sonde de détection », marquée par un élément facilement détectable. Selon un autre aspect l'invention concerne un support sur lequel sont immobilisées les sondes ou amorces mentionnées précédemment, de manière covalente ou non covalente. En particulier, le support peut être une puce à ADN ou un filtre à haute densité. On entend désigner par puce à ADN ou filtre haute densité, un support sur lequel sont fixées des séquences d'ADN, chacune d^'entre elles pouvant être repérée par sa localisation géographique. Ces puces ou filtres diffèrent principalement par leur taille, le matériau du support, et éventuellement le nombre de séquences d'ADN qui y sont fixées. On peut fixer les sondes ou amorces sur des supports solides, en particulier les puces à ADN, par différents procédés de fabrication. En particulier, on peut effectuer une synthèse in situ par adressage photochimique ou par jet d'encre. D'autres techniques consistent à effectuer une synthèse ex situ et à fixer les sondes sur le support de la puce à ADN par adressage mécanique, électronique ou par jet d'encre. Ces différents procédés sont bien connus de l'homme du métier.

Une séquence nucléotidique (sonde ou amorce) selon l'invention permet donc la détection et/ou l'amplification de séquences nucléiques spécifiques. En particulier, la détection de cesdites séquences est facilitée lorsque la sonde est fixée sur une puce à ADN, ou à un filtre haute densité. Les séquences nucléotidiques de Fusarium entre les gènes Tri 5 et Tri6 mentionnées ci-dessus, telle que présentée dans la présente invention, servent de base à la construction de ces puces à ADN ou filtre.

La préparation de ces filtres ou puces consiste à synthétiser des oligonucléotides, correspondant aux extrémités 5' et 3' de ces séquences. Ces oligonucléotides sont choisis en utilisant la séquence génomique. La température d'appariement des ces oligonucléotides aux places correspondantes sur l'ADN doit être approximativement la même pour chaque oligonucléotide. Ceci permet de préparer des fragments d'ADN correspondant à chaque cette séquence intergénique par l'utilisation de condition de PCR appropriées dans un environnement hautement automatisée. Les fragments amplifiés sont ensuite immobilisés sur des filtres ou des supports en verre, silicium ou polymères synthétiques et ces milieux sont utilisés pour l'hybridation. La disponibilité de tels filtres et/ou puces et de la séquence génomique correspondante annotée permet d'étudier l'expression des séquences étudiées, en préparant les ADN complémentaires, et en les hybridant à l'ADN ou aux oligonucléotides immobilisés sur les filtres ou les puces.

Les différences entre les séquences des différents échantillons font varier l'intensité de l'hybridation et, par conséquent, permettent d'interpréter les résultat, comme cela sera décrit plus loin en détail, en quantifiant rapidement les différences de niveau de production de toxines par les souches échantillon testées.

L'invention concerne selon un autre aspect les oligonucléotides anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression.

Selon un autre aspect l'invention concerne une cassette d'expression comprenant au moins le gène Tri5 et/ou le gène Tri6, au moins un promoteur lié de manière opérationnelle au gène correspondant et qui en médie l'expression, et une séquence nucléotidique régulatrice selon l'invention telle que décrite précédemment capable de moduler, d'augmenter, de diminuer ou d'inhiber la transcription en CIS du gène Tri5 et/ou du gène Tri6 chez Fusarium. Selon un mode préféré de réalisation, la séquence nucléotidique régulatrice diminue la transcription en CIS dudit gène.

L'invention vise également les vecteurs de clonage et/ou d'expression, qui contiennent une séquence nucléotidique et/ou une cassette d'expression selon l'invention impliquée dans la synthèse des toxines. Selon un autre aspect, l'invention concerne un vecteur d'expression antisens. Un tel vecteur d'expression contient une séquence de polynucléotide selon l'invention, insérée en orientation inverse dans le vecteur d'expression. Ainsi, l'homme du métier reconnaît aisément qu'un ARNm correspondant à l'ADN dans le vecteur antisens hybride avec un ARNm correspondant à de l'ADN dans le vecteur sens. Un vecteur d'expression antisens est un vecteur qui exprime un ARN antisens d'intérêt dans une cellule hôte appropriée, soit de manière constitutive soit après induction. Le terme antisens se réfère à toute composition contenant une séquence d'acide nucléique spécifique. Les molécules antisens peuvent être produites par des méthodes telles que la synthèse ou la transcription. Lorsque de telles molécules sont introduites dans la cellule, les nucléotides complémentaires se combinent avec les séquences naturelles produites par la cellule pour former des duplexes et ainsi bloquer soit la transcription ou la traduction du polypeptide selon l'invention. Les antisens seront notamment destinées à inhiber la synthèse de toxines par Fusarium

Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou être des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards, telle que la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, ou des méthodes chimiques. Les vecteurs selon l'invention sont par exemple des vecteurs d'origine plasmidique ou virale. Ils sont utiles pour transformer des cellules hôtes afin de cloner ou d'exprimer les séquences nucléotidiques selon l'invention.

L'invention comprend également les cellules hôtes transformées par un vecteur selon l'invention. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, par exemple des bactéries.

L'invention concerne également un procédé de criblage de ligands susceptibles de médier ou de moduler l'activité stimulatrice de la transcription des séquences nucléotidiques régulatrices selon l'invention, ledit procédé comportant les étapes de (i) mise en contact de la cassette d'expression ou d'un vecteur selon l'invention et dudit ligand en présence de réactifs nécessaires à la mise en œuvre d'une réaction de transcription, puis (ii) de détection et/ou de mesure de l'activité transcriptionnelle.

On utilisera un promoteur de préférence choisi parmi le groupe des promoteurs forts tels par exemple les promoteurs viraux, un promoteur endogène du gène d'intérêt Tri5 et/ou Triβ à exprimer

Les enhancer s sont capables d'activer en CIS la transcription du gène d'intérêt Tri5 et/ou Tri6, quelque soit son orientation, sa localisation en amont ou en aval du site d'initiation et dans certaines limites quelque soit la distance qui le sépare du promoteur.

L'invention concerne également un nécessaire pour le criblage de ligand susceptible de médier ou de moduler l'activité régulatrice de la transcription des séquences régulatrices selon l'invention, comprenant une molécule d'ADN et/ou une cassette d'expression et/ou un vecteur et/ou une cellule selon l'invention, ledit nécessaire comprenant le cas échéant, les réactifs nécessaires à la mise en œuvre d'une réaction de transcription.

L'invention concerne également le ligand obtenu par le procédé ou avec le nécessaire précédemment décrit. Par ligand, on entend définir tous les composés susceptibles d'interagir avec les séquences nucléotidiques selon l'invention pour former un complexe susceptible d'affecter l'activité transcriptionnelle, et plu spécialement d'inhiber la transcription des gènes Tri 5 et/ou Tri6. En intervenant sur cette transcription on peut ainsi envisager contrôler l'expression de ces gènes. Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé de mesure quantitative de la capacité d'un champignon Fusarium d'un échantillon biologique à produire des toxines trichothécènes, mettant en œuvre une séquence nucléotidique selon l'invention.

Il doit être entendu que le terme échantillon biologique concerne dans la présente invention les échantillons prélevés à partir d'un organisme vivant (Fusarium) ou un échantillon contenant du matériel biologique, c'est-à-dire de l'ADN. Un tel échantillon biologique englobe donc les compositions alimentaires contenant des Fusarium telles que les farines

Selon un mode de réalisation le procédé de détermination décrit précédemment comprend : l'identification d'au moins une séquence nucléotidique, plus spécialement une séquence régulatrice, telle que décrite précédemment la comparaison de ladite séquence nucléotidique identifiée à une grille de référence attribuant pour ladite séquence un niveau de production par Fusarium de la toxine la déduction de la capacité de production par Fusarium de la toxine Par grille de référence, on entend un support d'information, typiquement informatique, qui associe un niveau d'amplification à un niveau de production de trichothécènes, ou qui contient les séquences nucléotidiques auxquelles sont attribuées par comparaison un niveau de production de trichothécènes. Ainsi la mise en évidence dans l'échantillon biologique d'un signal d'amplification fort traduisant le fait que l'échantillon de Fusarium analysé comprend une séquence repère corrélée à un fort niveau de production de trichothecene par exemple de déoxynivalénol (DON), permet d'en déduire que le Fusarium de l'échantillon analysé est fort producteur de cette toxine. Lorsque l'on séquence, l'identification d'une séquence identique d'une séquence connue comme séquence repère corrélée à un fort niveau de production de trichothecene par exemple de déoxynivalénol (DON), permettra de déduire que les Fusarium de l'échantillon sont fort producteurs de DON.

Selon un mode de réalisation le procédé selon l'invention comporte les étapes suivantes : a) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou éventuellement (lorsqu'il s'agira de séquences codantes de polypeptides) obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ; b) amplification spécifique de l'ADN de Fusarium à l'aide d'au moins une amorce telle que décrite précédemment c) mise en évidence des produits ADN d'amplification d) déduction de la capacité de production de toxine.

En particulier, l'identification des SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 révèle un fort niveau de production de toxine.

Selon un mode de réalisation le procédé comporte les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde nucléotidique telle que décrite précédemment, avec un échantillon biologique, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'acide nucléique d'un champignon Fusarium. et le cas échéant fixé à un support d'immobilisation ; b) mise en évidence de l'hybride éventuellement formé entre la sonde nucléotidique et l'acide nucléique de l'échantillon biologique c) déduction de la capacité de production de toxine

Selon un mode de réalisation le procédé comporte, lorsque l'on utilise des sondes de captures et de révélation décrites précédemment, les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde de capture nucléotidique immobilisée sur un support tel que décrit précédemment avec un échantillon biologique, l'acide nucléique de l'échantillon ayant, le cas échéant, été préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'acide nucléique d'un champignon Fusarium ; b) mise en contact de l'hybride formé entre la sonde nucléotidique de capture immobilisée sur un support et l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'acide nucléique de l'échantillon biologique n'ayant pas hybride avec la sonde, avec une sonde nucléotidique de révélation marquée telle que décrite précédemment ; c) mise en évidence du nouvel hybride formé à l'étape b) d) comparaison avec une grille de référence associant le niveau d'hybridation mis en évidence à 1 'étape c) à la capacité de production de toxine.

Ce procédé est avantageusement utilisé avec une puce à ADN selon l'invention, l'acide nucléique recherché s'hybridant avec une sonde présente à la surface de ladite puce, et étant détecté par l'utilisation d'une sonde marquée. Ce procédé est avantageusement mis en œuvre en effectuant préalablement à l'étape a) une étape d'amplification de l'ADN de l'échantillon biologique ou de l'ADN complémentaire obtenu éventuellement par transcription inverse, à l'aide d'amorces telles que décrites précédemment. Selon un autre aspect l'invention concerne un kit ou nécessaire pour la détermination de la capacité d'un champignon Fusarium à produire des toxines trichothécènes, comprenant les éléments suivants : a) une sonde nucléotidique telle que décrite précédemment ; b) éventuellement, les réactifs nécessaires à la mise en œuvre d'une réaction d'hybridation ; c) éventuellement, au moins une amorce telle que décrite précédemment ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l^'ADN ; d) une grille de référence indiquant la capacité de production de toxine en fonction de l'amplification obtenue. Selon un autre aspect l'invention concerne un kit ou nécessaire pour la détermination de la capacité d'un champignon Fusarium à produire des toxines trichothécènes, comprenant les éléments suivants : a) une sonde nucléotidique, dite sonde de capture, telle que décrite précédemment ; b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, telle que décrite précédemment ; c) éventuellement, au moins une amorce telle que décrite précédemment ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN. d) une grille de référence indiquant la capacité de production de toxine en fonction de l'amplification obtenue. Selon un autre aspect l'invention concerne un kit ou nécessaire pour la détermination de la capacité d'un champignon Fusarium à produire des toxines trichothécènes, comprenant les éléments suivants : a) au moins une amorce telle que décrite précédemment ; b) éventuellement, les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN ; c) éventuellement, un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde oligonucléotidique telle que décrite précédemment d) une grille de référence indiquant la capacité de production de toxine en fonction de la séquence identifiée.

Selon un mode de réalisation certaines des séquences régulatrices isolées par les inventeurs sont en outre susceptibles de coder pour au moins un polypeptide qui active l'expression du gène Tri5 et/ou du gène Tri6. Dans ce cas et selon un autre aspect l'invention concerne donc les polypeptides codés par une séquence nucléotidique régulatrice décrite précédemment et impliquée dans la biosynthèse des trichothécènes par Fusarium. L'invention concerne également les anticorps obtenus à partir de ces polypeptides. L'invention concerne également les polypeptides homologues, présentant par rapport aux polypeptides naturels, certaines modifications, en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé, une troncation, un allongement, une solution chimérique et/ou une mutation, ou les polypeptides présentant des modifications post-traductionnelles. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présentent au moins 80 %, de préférence 85 %. 90 %, 95 % et 98 % d'homologie avec les séquences d'acides aminés des polypeptides selon l'invention.

Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acide(s) aminé(s) consécutifs) ou non consécutifs) sont remplacés par des acides aminés « équivalents ». L'expression « acides aminés équivalents » vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier essentiellement les activités biologiques des peptides correspondant et telles qu'elles seront définies par la suite.

Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s' appuyant sur leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur des résultats d'essais comparatifs d'activité biologique entre les différents polypeptides susceptibles d'être effectués.

Les polypeptides homologues correspondent également aux polypeptides codés par les séquences nucléotidiques homologues ou identiques, telles que définies précédemment et compremient ainsi dans la présente définition des polypeptides mutés ou correspondant à des variations inter ou intra espèces, pouvant exister chez

Fusarium, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions, d'au moins un résidu d'acides aminés.

Selon une réalisation, les séquences nucléotidiques ou de polypeptide mentionnées précédemment (sont) enregistrée(s) sur un support d'enregistrement dont la forme et la nature facilitent la lecture, l'analyse et/ou l'exploitation de ladite ou desdites séquences.

Selon un autre aspect l'invention concerne un kit ou nécessaire pour la détection

Fusarium, comprenant une telle puce à protéine. Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé pour la détection de la capacité d'un champignon Fusarium à produire des toxines trichothécènes dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps tel que décrit précédemment ; b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps éventuellement formé. Un tel procédé ne doit pas être limité à la détection de la présence de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique attesté, il peut être également mis en œuvre pour détecter TARN contenu dans ledit échantillon. Ce procédé englobe en particulier les Southern et Northern blot.

Selon un autre aspect l'invention concerne un kit ou nécessaire pour la mise en œuvre de ce procédé, comprenant les éléments suivants : a)un anticorps polyclonal ou monoclonal tel que décrit précédemment; b)éventuellement, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; c)éventuellement, les réactifs permettant la mise en évidence des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique d)une grille de référence indiquant la capacité de production de toxine en fonction de la réaction immunologique.

Selon un autre aspect l'invention concerne un polypeptide ou un anticorps tels que décrits précédemment immobilisé sur un support, notamment une puce à protéine. Selon un autre aspect l'invention concerne une puce à protéine comprenant au moins un polypeptide ou au moins un anticorps tels que décrits précédemment immobilisé sur le support de ladite puce. Les puces à protéines ou filtres à haute densité contenant des protéines selon l'invention peuvent être construits de la même manière que les puces à ADN selon l'invention. En pratique, on peut effectuer la synthèse des polypeptides fixés directement sur la puce à protéines, ou effectuer une synthèse ex situ suivie d'une étape de fixation du polypeptide synthétisé sur ladite puce. Cette dernière méthode est préférable, lorsque l'on désire fixer des protéines de taille importante sur le support, qui sont avantageusement préparées par génie génétique. Toutefois, si l'on ne désire fixer que des peptides sur le support de ladite puce, il peut être plus intéressant de procéder à la synthèse desdits peptides directement in situ. Selon un autre aspect l'invention concerne un kit ou nécessaire comprenant une puce à protéine telle que décrit précédemment. Selon un autre aspect l'invention concerne une souche de Fusarium. comprenant au moins une mutation dans au moins une séquence nucléotidique telle que décrite précédemment, impliquée dans la biosynthèse de trichothécènes. On préfère, selon la présente invention, les souches de Fusarium présentant une ou plusieurs mutation(s) dans les séquences nucléotidiques régulatrices. Lesdites mutations peuvent mener à une inactivation des gènes impliqués dans la production de toxines ou à une surexpression de ceux-ci. Ainsi, on recherche en particulier des souches de Fusarium présentant une production faible de toxines.

L'invention permet d'obtenir notamment les avantages suivantes : la technique est souple : les différences de séquences peuvent être mises en évidence par des méthodes variées (PCR, PCR quantitative, puces)de nombresues souches de Fusarium ainsi que sur des grains (blé) sont obtenus notamment pour le déoxynivalénol (DON) et pour le nivalenol (NIV) la technique décrite est facile d'emploi, à l'aide de kits de détection de souches productrices de toxines cette technique peut être utilisée à des fins préventives avant récolte, afin d'optimiser les traitements phytosanitaires, mais aussi après récolte, en particulier dans la filière brasserie malterie où la synthèse de novo de TCT

B a été démontrée en cours de process. Les souches de Fusarium analysées sont choisies par exemple parmi Fusarium. ctdmorum, Fusarium. graminearum. Fusarium cerealis.

D'autres avantages de l'invention apparaîtront lors de la description détaillée d'exemples illustrées par les dessins dans lesquels :

- la figure 1 représente la structure commune des trichothécènes

- la figure 2 rappelle l'organisation des gènes TRI chez Fusarium. - la figure 3 rappelle la relation phylogénique entre différentes souches de Fusarium productrices de trichothécènes - la figure 4 présente l'amplification spécifiques de souches très productrices de DON, à l'aide d'amorces NI -2 et N1-2R sur ADN fongique

- la figure 5 présente l'amplification spécifiques de souches très productrices de DON, à l'aide d'amorces Nl-2 et N1-2R sur extraits d'ADN de grains de blé - la figure 6 représente une amplification PCR multiplex spécifique de souches fortement ou faiblement productrices de DON

- la figure 7 présente la séquence consensus commune à d'une part deux souches K2 et Cl faibles productrices de toxines et d'autre part deux souches fortes productrices L2 etNl. On présente tout d'abord pour des souches test de Fusarium la technique d'isolement et caractérisation de leur pouvoir toxinogène (exemple 1). Le tableau 1 décrit les souches de Fusarium utilisées ainsi que leur origine (géographique, plante hôte) - protocole décrit dans Bakan et al. « Food Additives and Contaminants ». Les souches de Fusarium , sauf les souches de la collection Baarn (CBS), ont été isolées dans nos laboratoires, à partir de céréales sur milieu PDA après 7 jours de culture puis purifiées par culture monosporale (Nelsson et al, 1983). Afin de déterminer leur pouvoir toxinogène, les souches de Fusarium ont été cultivées sur grains de blé stérilisés pendant 25 jours à 25 °C et à a_w maximale. Sur ces substrats, les trichothécènes (DON, ADON , NTV, FX) ont été analysés par GC- ECD et par GC-MS (Bakan et al, 2001). Les résultats sont consignés dans le tableau 2.

On précise ensuite le technique d'extraction d'ADN de Fusarium (exemple 2). Des procédures communément utilisées en biologie moléculaire ont été utilisées pour extraire l'ADN des souches de Fusarium. Les souches de Fusarium ont été cultivées sur milieu malt en boite de Roux . Après 3 jours de culture à 25°C, le mycélium est filtré sur étamine puis lyophilisé et conservé à — 20°C.

Environ 20 mg de mycélium sont extraits par 1 ml de tampon Sarcosyl (TrisHCl pH8 50 mM, EDTA pH8 50 mM, Sarcosyl 2%, NaCl 150 mM) et 1 ml de phénol saturé en TE (Tris HC1 pH8 10 mM, EDTA pH8 ImM) pendant une heure. Après centrifugation et prélèvement du surnageant, l'ADN est précipité par addition d' isopropanol. Le culot est séché, repris dans 300 ul de TE et traité par 10 ul de RNAse (10 mg/ml) pendant une heure. Une purification par un volume de phenol/chloroforme/ alcool isoamyl (25/24/1) est effectuée. Après centrifugation (15 min, 13000 rpm , 4°C) l'ADN contenu dans le surnageant est précipité par un volume d' isopropanol. Après centrifugation (15 min. 13000 rpm , 4°C), le culot d'ADN est resuspendu dans 300 ul de TE.

On précise ensuite la technique d'extraction d'ADN fongique sur grain de céréales (exemple 3). Des procédures communément utilisées en biologie moléculaire ont été utilisées pour extraire l'ADN des souches de Fusarium sur grains. Sur une prise d'essai d'environ 2 g, l'ADN est extrait par 800 μl de tampon CTAB extraction (NaCl 5M, CTAB 10 %, Tris 1M, EDTA pH 8 0,5M , βmercaptoethanol) pendant 30 minutes à 65°C. Les grains, broyés, sont ensuite traités par 8 μl d'aamylase (10 mg/ml) et 12 ul de RNAse (10 mg/ml) et 14 ul de protéinase K (à 20 mg/ml) pendant une heure à 65°C. Après centrifugation (14 000 rpm ; 15 minutes) le surnageant (550 ul) est purifié par 550 ul de (chloroforme/alcool isoamyl) (24+1). Après centrifugation (14 000 rpm, 15 minute, 4 °C), l'ADN contenu dans la phase supérieure est précipité par 1 ml d' isopropanol. Le culot d'ADN est rincé par un mélange (alcool /eau) (70/100), séché, puis repris dans 100 μl d'eau. Des dilutions au 1/20 sont effectuées, ces dernières solutions sont utilisées pour la PCR.

Le sequencage de la région tri5-tri6 et la sélection d'amorces spécifiques ont été effectués de la manière suivante (exemple 4). Sur des souches de références, choisies d'après leur potentiel toxinogène, les gènes tri5, tri6 ainsi que les séquences comprises entre ces deux gènes ont été amplifiés et par PCR à partir de 20 ng d'ADN génomique fongique et en utilisant 50 pmol d'amorce tri6-54 et tox5-2 (Niessen et Vogel, 1998). Les conditions PCR sont décrites dans l'exemple 5 exceptée la programmation de température de 30 cycles à (95°C, 1 minute ; 55° C , 1 minute ; 72°C, 7 minutes). Ce produit d'amplification (5 kb) a été purifié sur colonne GFX (kit Amersham Pharmacia Biotech Inc, Saclay, France) puis clônés (kit Universal Genom alker, Clontech, Palo alto, Ca, USA). Après purification sur colonne GFX. le plasmide a été séquence dans les deux sens avec les amorces tri6-54 (CTTTgATCgTgTTgCgTCTC) et tox5-2 (CTgATCTggTCACgCTCATC). La réaction de dye termation et un séquenceur 310 (Applied Biosystem, Courtaboeuf, France) ont été utilisés. Le sequencage effectué pour les 4 souches de référence produisant du DON (et ADON) (figure 7) a permis d'obtenir les SEQ ID N°l à SEQ ID N°4 annexées. Le sequencage est également réalisé pour les souches de Fusarium produisant du NIV.

En particulier pour le DON, les comparaisons de séquence ont mis en évidence des différences corrélées au potentiel toxinogène des souches de Fusarium et ont permis de sélectionner des amorces spécifiques de la production de DON. Les amorces ont été synthétisées par Gibco BRL Life Technologie, Cergy, France). La même démarche est réalisée de manière à sélectionner des amorces spécifiques des souches fortement et faiblement productrices de NIV.

On précise maintenant la détermination de la spécificité des amorces sur l'ADN de mycélium de Fusarium (exemple 5).

Les couples d'amorces sélectionnés (figure 8) ont été utilisés sur l'ADN des souches- test de Fusarium. Dans tous les cas, le mélange réactionnel contenait dans 50 ul :

- tampon Taq IX - dNTP lOO μM - MgC12 18,75 mM

- 25 uM de chaque primer - 2U de Taq Polymérase (Silverstar DNA polymérase, Eurogentec, Seraing, Belgium)

- eau qsp 50 μl

La programmation de température était de 30 cycles à (95°C, 1 minute ; 55°C, 1 minute ; 72°C, 1 minute). Les produits d'amplification étaient visualisés sur gel d'agarose à 1 % dans du TBE ( tris 8 mM, Acide borique 8 mM, EDTA pH8 2 mM) . Pour les souches testées, une corrélation absolue a été observée entre la production de TCTB in vitro et la réponse obtenue par PCR (figure 4, tableau 6). Dans le cas des souches DON+, un amplifiât de ~ 200 pb est obtenu avec les amorces (N1-2/N1-2R) et de ~ 1000 pb avec les amorces (3992/330). Dans le cas des souches DON- la taille de l'amplifiât obtenu avec les amorces (BB4056 et BB 3551) est de ~ 650 pb

Les résultats suivants présentent la validation des amorces sur des échantillons de céréales naturellement contaminés par des Fusarium (exemple 6). Les conditions PCR utilisées étaient les mêmes que celles décrites dans l'exemple 5. Les amorces sélectionnées sont donc directement utilisables sur céréales même faiblement contaminées (figure 2).

On présente aussi la technique PCR multiplex (exemple 7).

Les réponses négatives en PCR sont difficiles à interpréter. L'utilisation de combinaisons d'amorces spécifiques des souches DON-, DON+,(ainsi que des souches NIV- et NIV+ ) permet d'observer un signal dans tous les cas. Des exemples de réponse obtenue avec les amorces ((N1-2/N1-2R) et (3551/4056)) sont présentés en figure 3.

Tableau 1

Espèces numéro origine hôte

F.culmotvm A1 calvados, France blé

F. culmorum A2 calvados, France blé

F.culmorum A3 calvados, France blé

F.culmorum A4 calvados, France blé

F.culmotvm A5 calvados, France blé

F.culmorum A6 calvados, France blé

F.culmorum B3 Loire atlantique, France blé

F.culmorum B4 Loire atlantique, France blé

F.culmorum B5 Loire atlantique, France blé

F.culmorum B6 Loire atlantique, France blé

F.culmorum B7 Loire atlantique, France blé

F.culmorum B8 Loire atlantique, France blé

F.culmorum B10 Loire atlantique, France blé

F.culmorum C1 Marne, France blé

F.culmorum C4 Marne, France blé

F.culmorum es Marne, France blé .

F.culmorum C8 Marne, France blé

F.culmorum C8 Marne, France Wé

F.culmorum C9 Marne, France blé

F.culmorum E1 Seine Maritime, France blé

F-culmorum E2 Seine Maritime, France blé

F.culmorum E10 Seine Marilime, France blé

F.culmorum F1 Somme, France blé

F.culmorum F3 Somme, France blé

F.culmorum F4 Somme, France blé

F.culmorum . ^• G1 Gard, France blé

F.culmorum H1 Gers, France blé

F.culmorum 11 Vienne, France blé

F.culmorum J1 Loir et Cher, France blé

F.culmorum K2 Loir et Cher, France blé

F.culmorum K5 Loir et Cher, France blé

F.cυlmorum L1 Loir et Cher, France blé

F.culmorum L2 Loir et Cher, France blé

F.cυlmorum L3 Loir et Cher, France blé

F.culmorum L4 Loir et Cher, France blé

F.culmorum L5 Loir et Cher, France blé

F.culmorum 1 Charente Maritime, France blé dur

F.culmorum N1 Gard, France blé dur

F.culmorum P2 Gers, France blé dur

F.cυlmorum Q1 Loir et Cher, France blé dur

F.culmorum Q2 Loir et Cher, France blé dur

F.culmorum Fcbar Haute Garonne, France blé

F.culmorum 131094 Haute Garonne, France blé

F.culmorum R964 Haute Garonne, France blé

Fgraminearum CBS 18532 collection Baam maïs

F graminearum CBS 31673 collection Baarn maïs

F. proliferatum PS France maïs Tableau 2 souche Production de mycotoxins (mg/kg)

DON 3-ADON 15-ADON FX NIV

A1 - - o 5

A2 1 - -

A3 - - o 2

A4 1 - -

A5 - - 0 4

A6 - - o 2

B3 26 2 - ^"

B4 - - - 1

B5 1 - - "

B6 - - 1 5

B7 - - - 1

B8 - - - 0

B10

C1 - - -

C4 - - - 0

- • - - 1

C5

C6 4 - -

C8 7 1 -

- - - 1

C9

E1 6 1 -

E2 9 o -

9

E10 ^" 0

F1

*~ 2 12

F3

F4 1 0 1 -

G1 27 3 -

H1 26 2 -

11 52 5 0

- 0

J1

— 0

K2

1

K5 - ~

L1 - - o 8

L2 24 - 26

L3 8 0 "

L4 16 - ~

L5. 4 o - -

0

M1 "

N1 37 4 28

" 0

P2

Q1 23 21 -

Q2 1 0 - 12

- o 1

Fcbar 0

0

131094 0 - -

R964 42 38 -

CBS 18532 1 0 - 1 2

CBS 31673 0

-. - FS

"-" non détecté, "0" < 0,07 ppm Tableau 3

REFERENCES

Abbas H.K., Mirocha C.J., MERONUCK R.A., POKORNY J.D., GOULD S.L. & KOMMEDAHL T.1988 Mycotoxins and Fusarium spp. associated with infected ears of corn in Minnesota Applied and Environmental Microbiology. 54, 8, 1930- 1933.

Atanassov, Z., Nakamura, C, Mon, N., Kaneda, C, Kato, H., Jin, Y.Z., Yoshizawa, T., and Murai K. 1994. Mycotoxin production and pathogenicity of Fusarium species and wheat résistance to Fusarium head blight. Canadian Journal ofBotany. 72: 161- 167.

Bakan B. Approche physiologique de la biosynthèse des trichothécènes de Fusarium. 1998. Thèse Doctorat. INA-PG.

Bakan, B, Pinso L, Cahagnier, B, .Melcion,D, Sémon ,E, Richard-Molard D. 2001. Toxigenic potential of Fusarium culmorum strains isolated from French wheat. Food Additives and Contaminants, vol. 18, n°l 1, pages 998-1003.

Bennett G. A. and Richard J.L. 1996. Influence of processing on Fusarium mycotoxins in contaminated grains. Food Technology. 50. 5. 235-238.

Blaney, BJ. and Dodman, R.L. 1988. Production of the mycotoxins zearalenone, 4- deoxynivalenol and nivalenol by isolâtes of Fusarium graminearum Groups 1 and 2 from cereals in Queensland. Australian Journal ofAgricultural Research, 39 : 21-29.

Brown D.W., Alexander N.J., McCormick S.P., Proctor R.H., Desjardins A.E.. 2001. Gibberella zeae strain GZ3639 trichothecene gène cluster, complète séquence. EMBLNEW:AF359361

Bubien J.K., Lundeen G., Templeton C, Woods W.T. : Effects on the circulatory system. In: Trichothecene Mycotoxins: Pathophysiologic Effects, vol.2 (Beasley, V.R.. éd.) CRC Press. Boca Raton. FI., USA, pp. 91 -109 (1989).

Charmley L.L., Rosenberg A., Trenholm H.L.: Factors responsible for économie losses due to Fusarium mycotoxin contamination of grain, foods, and feedstuffs. In: Mycotoxins in Grain - Compounds other than Aflatoxin (J.D. Miller and H.L. Trenholm, eds.) Eagan Press, St. Paul, Minnesota, USA, pp. 471-486 (1994).

Cole R.J., Cox R.H.: Handbook of Toxic Fungal Metabolites. Académie Press, New York, USA (1981).

Dalcero, A., Torres, A., Etcheverry, M., Chulze, S., Varsavsky, E., 1997, Occurrence of déoxynivalénol and Fusarium graminearum in Argentinian wheat. Food Additives and Contaminants, 14, 11-14.

Doohan F.M., Weston G., Rezanoor H.N., Parry D.W., Nicholson P. 1999. Development and use of a reverse transcription-PCR assay to study expression of Tri5 by Fusarium species in vitro and in planta. Applied and Environmental Microbiology, 65, 9, 3850-385.

Edwards SG; Pirgozliev SR; Hare MC; Jenkinson P. 2001. Quantification of trichothecene-producing Fusarium species in harvested grain by compétitive PCR to détermine efficacies of fungicides against Fusarium head blight of winter wheat. Applied and Environmental Microbiology. 67, 4, 1575-1580.

Eriksen, G.S.and Alexander (Editors) 1998, Fusarium toxins in cereals : a risk assessment (Copenhaggen, Nordic council of Ministers).

Fekete C, Giczkey G., Papp I., Toborhegyi E., Szabo L., Hornok L.: Fusarium poae trichodiène synthase (Tox5) gène, complète cds., GenBank, Accession Number U15658 (1994).

Feuerstein G., Lorenzana R.M.: Effects of trichothecene mycotoxins on the nervous System, In: Trichothecene Mycotoxins: Pathophysiologic Effects. vol.2 (Beasley. V.R., éd.). CRC Press. Boca Raton, FI., USA, pp 1 11-122 (1989).

Flannigan B., Day S.W., Douglas P.E. ;McFarlane G.B. 1984. Growth of Mycotoxin-producing Fungi Associated with Malting of Barley. Dev. Food Sci. 7. 52-60.

Fujisawa T., Mori M. , Ichinoe M.. 1992. Natural Occurrence of Trichothécènes in domestic Wheats and Barley harvested in 1990 and 1991, and production of Mycotoxins by Fusarium Isolâtes from thèse samples Proc. Jpn. Assoc. Mycotoxicol.

35, 37-39.

Gang, G., Miedaner, T., Schuhmacher, U., Schollenberger, M., Geiger, H. H, 1998, Déoxynivalénol and nivalenol production by Fusarium culmorum isolâtes differing in aggressiveness toward winter rye. Phytopathology, 88, 879-884.

Grove, JF. 1988. Non-macrocyclic trichothécènes. Nat. Prod. Repts. P 187.

Guadet J., Julien J., Lafay J.F. , Brygoo Y.1989. Phylogeny of some Fusarium species, as determined by Large-Subunit rRNA. Séquence comparison. Molecular Biology and Evolution. 6. 3. 227-242.

Hohn T.M., Beremand M.N.: Isolation and nucleotide séquence of a sesquiterpene cyclase gène from the trichothecene-producing fungus Fusarium sporotrichioides. Gène 79, 131-138 (1989).

Hohn T.M., Desjardins A.E.: Isolation and gène disruption of the Tox5 encoding trichodiène synthase in Gibberella pulicaris. Mol. Plant. Mie. Int. 5, 149-256 (1992).

Hohn T.M., McCormick S. P., Desjardins A.E.: Evidence of a gène cluster involving trichothecene-pathway biosyntheric gènes in Fusarium sporotrichioides. Curr. Genêt. 24, 291-295 (1993). Ioos R. Bakan B. Study of the Fusarium spp. from cereal grains and their related mycotoxins. 2000. Sixième Conférence Internationale sur les Maladies des Plantes. Tours- France. 6-8 décembre 2000. Ishii K., Ando Y., Ueno Y.: Toxicological approaches to the metabolites of Fusaria. 9. Isolation of vomiting factors from moldy corn infested with Fusarium Species. Chem. Pharmacol. Bull. 23, 2162-2164 (1975).

Joffe A.Z.: Alimentary Toxic Aleucia, In: Microbial Toxins. Vol 7 (Algal and Fungal Toxins), Académie Press, New York. USA, pp. 139-189 (1971).

Matsuoka Y., Kubota K.: Studies on mechanisms of diarrhea induced by fusarenon- X, a trichothecene mycotoxin from Fusarium species: fusarenon-X induced diarrhea is not medicated by cyclic nucléotides. Toxicol. Appl. Pharmacol. 91. 326-332 (1987).

Kim J.C.. Kang H.J., Lee D.H., Lee Y.W. ,Yoshizawa T. 1993. Naturel Occurrence of Fusarium Mycotoxins (Trichothécènes and Zearalenone) in Barley and Corn in Korea. Applied and Environmental Microbiology. 59. 11. 3798-3802.

Langseth, W., Bernhoft, A., Rundberget, T., Kosiak, B., Gareis, M., 1999, Mycotoxin production and cytotoxicity of Fusarium strains isolated from Norwegian cereals. Mycopathologia, 144, 103-113.

Lee T., Oh D., Kim H.-S., Lee J.-K., Kim Y.-H., Yun S.-H., Lee Y.-W. 2001. Gibberella zeae 88-1 trichothecene biosynthesis gène cluster. EMBLNEW:AF336365

Lee T., Oh D., Kim H.-S., Lee J.-K., Kim Y.-H., Yun S.-H., Lee Y.-W.. 2001. Gibberella zeae H-l l trichothecene biosynthesis gène cluster. EMBLNEW:AF336366

Manka, M. ; Visconti, A. ; Chelkowski, J. ; Bottalico, A. 1985 Pathogenicity of Fusarium isolâtes from wheat, rye and triticale towards seedlings and their ability to produce trichothécènes and zearalenone. Phytopathology. 13. 24-29.

Mirocha, CL, Abbas, H.K., Windels, CE., Xie, W., 1989, Variation in Déoxynivalénol, 15-Acetyldeoxynivalenol. 3-Acetyldeoxynivalenol, and Zearalenone Production by Fusarium graminearum Isolâtes. Applied and Environmental Microbiology , 55,1315-1316.

Miller, J.D., Greenhalgh, R., Wang, Y., Lu, M., 1991, Trichothecene chemotypes of three Fusarium species. Mycologia. 83, 121-130.

Mule G.. Logrieco A., Stea G., Bottalico A. 1997 Clustering of trichothecene- producing Fusarium strains determined from 28S ribosomal DNA séquences. Applied and Environmental Microbiology. 63:1843-1846.

Muller, H.M. , Reimann, J. , Schumacher, U. , Schwadorf, K.,1997, Occurrence of Fusarium toxins in barley harvested during five years in an area of southwest Germany. Mycopathologia, 137, 185-192.

Muthomi, J.W., Schϋtze, A., Dehne, H.W., Mutitu, E.W., Oerke, E.C.,2000, Characterization of Fusarium culmorum isol tes by mycotoxin production and aggressiveness to winter wheat. Journal of Plant Diseases and Protection. 107, 113- 123.

Nelson, P.E., Toussoun. T.A., Marasas, W.F.O, 1983, Fusarium species : an illustrated manual for identification(Pennsylvania State University).

Niessen M.L., Vogel R.F. 1998. Group spécifie PCR-Detection of potential trichothecene-producing Fusarium species in pure cultures and cereal samples System Applied Microbiology 21 4 618-631.

O'Donnell, K., Cigelnik, E., and Casper, H.H. 1998. Molecular phylogenetic, moiphological, and mycotoxin data support reidentification of the Quorn mycoprotein fungus as Fusarium venenatum. Fυngal Genetics and Biology. 23,1 ,57- 67.

PARK J.L, SMALLEY E.B. & CHU F.S.1996 Natural occurrence of Fusarium mycotoxins in field samples from the 1992 Wisconsin corn crop. Applied and Environmental Microbiology.62, 5, 1642-1648.

Rotter, B.A. , Prelusky, D.B., Pestka, J J, 1996, Toxicology of déoxynivalénol (vomitoxin). Journal of Toxicology and Environmental Health, 48, 1-34.

Ryu, J.C, Yang, J.S., Song, Y.S., Kwon, O.S., Park, J., Chang, I.M., 1996, Survey of natural occurrence of trichothecene mycotoxins and zearalenone in Korean cereals harvested in 1992 using gas chromatography/mass spectrometry. Food Additives and Contaminants, 13, 333-341.

Schwarz, P.B., Casper, H.H. and Beattie, S.1995. Fate and development of naturally occurring Fusarium Mycotoxins during malting and brewing. Journal of the American Society of Brewing Chemists. 53, 3, 121-127.

Scott P.M.1984. Effects of food processing on mycotoxins. Journal of Food Protection. 47, 6, 489-499.

Sydenham, E.W., Marasas, W.F.O., Thiel, P. G., Shepard, G.S., Nieuwenhius, J.L, 1991, Production of mycotoxins by selected Fusarium graminearum and F. crookwellense isolâtes. Food Additives and Contaminants, 8, 31-41.

Tag A.G., Hohn T.M., Beremand M.N. 2001. Fusarium sporotrichioides trichothecene pathway gène cluster, partial séquence. EMBLNEWAF364179

Tanaka, T., Hasegawa, A., Yamamoto, S., Lee, U.S., Sugiura, Y., Ueno, Y, 1988, Worlwide Contamination of Cereals by the Fusarium mycotoxins nivalenol, déoxynivalénol, and zearalenone : survey of 19 countries. Journal of Agriculture and Food chemistr , 36, 979-983.

Trenholm, H.L., Cochrane, W.P.. Cohen. H., Elliot, J.L, Farnworth, E.R., Friend, D.W., Hamilton, R.M.G., Neish, G. A., Standish, J.F, 1981, Survey of Vomitoxin contamination of the 1980 White Winter Wheat crop in Ontario, Canada. Journal of the American OU Chemists' Society, 992A-994A.

Walker, SL; Leath S; Hagler WM; Murphy JP. 2001. Variation among isolâtes of Fusarium graminearum associated with Fusarium head blight in north Carolina. Plant Disease. 85, 4, 404-410.

Wolf CE., Bullerman L.B.1998. Heat and pH alter the concentration of déoxynivalénol in an aqueous enviroment. Journal of Food Protection. 61, 3, 365- 367. Wolf-Hall, CE; Milford A. H; Bullerman, LB. 1999. Stability of Déoxynivalénol in Heat-Treated Foods. . Journal of Food Protection. 62, 8, 962-964.

Yoshizawa, T., Jin Y.Z., 1995, Natural occurrence of acetylated derivatives of déoxynivalénol and nivalenol in wheat and barley in Japan. Food Additives and Contaminants, 12, 689-694

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de détermination de la capacité de champignons Fusarium à produire des toxines trichothécènes caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection d'au moins une séquence représentative d'un niveau de production déterminé de trichothecene, la dite séquence représentative n'appartenant pas à la séquence consensus commune à d'une part des souches faibles ou non productrices de trichothécènes et d'autre part des souches fortes productrices de trichothécènes. 2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la dite séquence représentative est située dans la région intergénique entre les gènes TRI5 et TRI6.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce que la détection utilise une technique d'amplification, d'hybridation ou de sequencage ; l'amplification utilisant au moins une amorce capable d'amplifier une séquence représentative d'un niveau de production déterminé.

4. Procédé selon la revendication 2 à 3, caractérisé en ce que la séquence intergénique TRI5-TRI6 est choisie parmi : a) une séquence nucléotidique choisie parmi une séquence correspondant à SEQ ID N° l à SEQ ID N°4 b) une séquence nucléotidique comportant au moins 80 % d'identité avec une séquence définie en a) ; c) une séquence nucléotidique hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence définie en a) ou b) ; d) une séquence nucléotidique complémentaire de SEQ ID

N° 1 ou complémentaire d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b) ou c) ; e) une séquence nucléotidique de fragment représentatif d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b) , c) ou d) ; f) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), c), d) ou e).

5. Procédé selon la revendication 4 caractérisé en ce que les amorces utilisées sont aptes à amplifier une séquence nucléotidique régulatrice, représentative d'un niveau de production déterminé de toxine, choisie parmi : a) une séquence comprenant un fragment d'acide nucléique choisi parmi les fragments compris entre les positions (264 nt- 330 nt) de la séquence SEQ ID N°l à SEQ ID N°4 ; (590 nt-660 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (590 nt-657 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (741 nt-770 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (738 nt-767 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (870 nt-950 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (867 nt-938 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (996 nt-1150 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (984 nt-1138 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 1180nt-1260nt)dela séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 1168nt-1244nt)dela séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 1300nt-1547nt)dela séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; 1284nt-1526nt)dela séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; 1596 t-1762nt)dela séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; 1575 nt-1745 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; 1813 t-1982 t)dela séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 / 1795 nt-1961 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 1990nt-2178nt)dela séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 1970 nt-2142 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 2207 nt-2308 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 2170 nt-2230 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 2356 nt-2435 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 2280 nt-2360 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 2474nt-2718nt)dela séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 2399 nt-2660 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; 2738nt-2818nt)dela séquence SEQ ID N°l ou SEQ D N°2; (2679 nt-

2769 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2848 nt-

2948 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2799 nt- 2899 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2977 nt- 3138 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2929 nt- 3088 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (3268 nt- 3497 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (3216 nt- 3446 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (4027 nt-

4133 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (3976 nt- 4090 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4. b) une séquence nucléotidique comportant au moins 80 % d'identité avec une séquence définie en a) c) un fragment représentatif d'une séquence définie en a) ou b)

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5 caractérisé en ce que les couples d'amorces sont choisis parmi : une amorce sens dont la séquence comprend SEQ ID N°5 et une amorce antisens dont la séquence comprend SEQ ID N°6 - une amorce sens dont la séquence comprend SEQ ID N°7 et une amorce antisens dont la séquence comprend SEQ ID N°8 une amorce sens dont la séquence comprend SEQ ID N°9 et une amorce antisens dont la séquence comprend SEQ ID N°10.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que la toxine est un trichothecene, plus spécialement un trichothecene B, encore plus spécialement choisi parmi le déoxynivalénol (DON), le nivalenol (NIV) et leurs formes acétylées.

8. Séquence nucléotidique de Fusarium caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi : a) une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N°l à SEQ ID N°4 ; b) une séquence nucléotidique comportant au moins 95 % d'identité avec une séquence définie en a), de préférence au moins 96%, 97%, 98% d'identité ; c) une séquence nucléotidique hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence définie en a) ou b) ; d) une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b) ou c) ; e) une séquence nucléotidique de fragment représentatif d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b), c) ou d) ; 9. Séquence nucléotidique selon la revendication 8 caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence régulatrice représentative de la capacité de production déterminé de toxine, choisie parmi : a) une séquence comprenant un fragment d'acide nucléique choisi paπni les fragments compris entre les positions (264 nt-

330 nt) de la séquence SEQ ID N°l à SEQ ID N°4 ; (590 nt-660 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (590 nt-657 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (741 nt-770 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (738 nt-767 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (870 nt-950 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (867 nt-938 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (996 nt-1150 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (984 nt-1138 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 (1180 nt-1260 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 (1168 nt-1244 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 (1300 nt-1547 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 (1284 nt-1526 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 (1596 nt-1762 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 (1575 nt-1745 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (1813 nt-1982 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 / (1795 nt-1961 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (1990 nt-2178 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (1970 nt-2142 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2207 nt-2308 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2170 nt-2230 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2356 nt-2435 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2280 nt -

2360 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2474 nt- 2718 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2399 nt- 2660 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2738 nt- 2818 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2679 nt- 2769 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2848 nt- 2948 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2799 nt- 2899 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (2977 nt-

3138 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (2929 nt- 3088 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (3268 nt- 3497 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (3216 nt- 3446 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4 ; (4027 nt- 4133 nt) de la séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°2 ; (3976 nt-

4090 nt) de la séquence SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°4. - b) une séquence nucléotidique comportant au moins 80 % d'identité avec une séquence définie en a) c) un fragment représentatif d'une séquence définie en a) ou b) 10. Séquence nucléotidique selon la revendication 9 caractérisée en ce que la séquence régulatrice est une séquence « enhancer » qui présente au moins un site de liaison pour une protéine impliquée dans la transcription du gène Tri5 et/ou du gène Tri6.

1 1. Utilisation d'une séquence nucléotidique intergénique TRI5-TRI6 de Fusarium pour la détermination du niveau de production de trichothécènes par Fusarium.

12. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 8 à 10 pour le contrôle de la production de trichothécènes par Fusarium. 13. Séquence polypeptidique caractérisée en ce qu'elle est codée par une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 8 à 10. 14. Séquence nucléotidique utilisable comme amorce ou sonde, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences nucléotidiques selon l'une des revendications 8 ou 9. 15. Séquence nucléotidique amorce selon la revendication 14, apte à permettre l'amplification d'un fragment d'une séquence intergénique TRI5-TRI6 directement associé à un niveau de production déterminé de toxine par Fusarium. 16. Séquence nucléotidique selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce qu'elle est marquée par un composé radioactif ou par un composé non radioactif. 17. Séquence nucléotidique selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est immobilisée sur un support, de manière covalente ou non-covalente.

18. Séquence nucléotidique selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est immobilisée sur un support du type filtre à haute densité ou puce à ADN.

19. Puce à ADN ou filtre, caractérisée en ce qu'elle contient au moins une séquence nucléotidique selon la revendication 8.

20. Kit ou nécessaire pour la quantification du potentiel de production de toxines, plus spécialement de trichocéthènes de champignons appartenant à l'espèce Fusarium, caractérisé en ce qu'il comprend une puce à ADN ou un filtre selon la revendication 19. 21. Cassette d'expression caractérisée en ce qu'elle comprend au moins le gène

Tri5 et/ou le gène Tri6, au moins un promoteur lié de manière opérationnelle au gène correspondant et qui en médie l'expression, et au moins une séquence nucléotidique régulatrice telle que définie dans la revendication 10 capable de moduler, d'augmenter, de diminuer ou d'inhiber la transcription du gène Tri5 et ou du gène Tri6 chez Fusarium.

22. Vecteur de clonage, et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il contient une séquence nucléotidique selon la revendication 10.

23. Vecteur de clonage, et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il contient une cassette d'expression selon la revendication 21. 24. Utilisation d'un vecteur selon la revendication 22 ou 23 pour générer une souche bactérienne présentant une synthèse de trichothécènes réduite.

25. Cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon l'une des revendications 22 ou 23.

26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : amplification d'une séquence nucléotidique régulatrice représentative d'un niveau de production déterminée de toxine définie selon la revendication 4 ; - comparaison du niveau d'amplification obtenu avec un niveau de référence correspondant à une souche forte ou à une souche faible productrice de toxine ; - déduction de la capacité de production de toxine du Fusarium de l'échantillon analysé.

27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 26, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou éventuellement obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique b) amplification spécifique de 1ADN de Fusarium à l'aide d'au moins une amorce selon l'une des revendications 14 ou 15 c) mise en évidence des produits ADN d'amplification d) déduction de la capacité de production de toxine

28. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 26, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'une sonde nucléotidique selon la revendication 14, avec un échantillon biologique, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'acide nucléique d'un champignon Fusarium, et le cas échéant fixé sur un support d'immobilisation b) mise en évidence de l'hybride éventuellement formé entre la sonde nucléotidique et l'acide nucléique de l'échantillon biologique c) comparaison avec une grille de référence et déduction de la capacité de production de toxine

29. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 et 26, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - a) mise en contact d'une sonde nucléotidique de capture selon la revendication 17 immobilisée sur un support avec un échantillon biologique, l'acide nucléique de l'échantillon ayant, le cas échéant, été préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde de capture à l'acide nucléique d'un champignon Fusarium ; b) mise en contact de l'hybride formé entre la sonde nucléotidique de capture immobilisée sur un support et l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'acide nucléique de l'échantillon biologique n'ayant pas hybride avec la sonde de capture, avec une sonde nucléotidique de révélation marquée selon la revendication 16 ; - c) mise en évidence du nouvel hybride formé à l'étape b) ; d) comparaison avec une grille de référence associant le niveau d'hybridation mis en évidence à l 'étape c) à la capacité de production de toxine.

30. Procédé selon la revendication 29, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape a), l'ADN de l'échantillon biologique ou l'ADNc obtenu éventuellement par transcription inverse de l' ARN de l'échantillon, est amplifié à l'aide d'au moins une amorce selon la revendication 14 ou 15.

31. Kit ou nécessaire pour la détermination de la capacité d'un champignon Fusarium à produire des toxines trichothécènes, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : une sonde nucléotidique selon la revendication 14 ; éventuellement, les réactifs nécessaires à la mise en œuvre d'une réaction d'hybridation ; éventuellement, au moins une amorce selon l'une des revendications 14 ou 15 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN ; une grille de référence indiquant la capacité de production de toxine en fonction de l'amplification révélée.

32. Kit ou nécessaire pour la détermination de la capacité d'un champignon Fusarium à produire des toxines trichothécènes, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) une sonde nucléotidique, dite sonde de capture, selon la revendication 17 ; b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, selon la revendication 16 ; c) éventuellement, au moins une amorce selon l'une des revendications 14 ou 15 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN ; d) une grille de référence indiquant la capacité de production de toxine en fonction de l'amplification identifiée.

33. Kit ou nécessaire pour la détermination de la capacité d'un champignon Fusarium à produire des toxines trichothécènes, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) au moins une amorce selon l'une des revendications 14 ou 15; b) éventuellement, les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN ; c) éventuellement, un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde oligonucléotidique selon la revendication 17 ; d) une grille de référence indiquant la capacité de production de toxine en fonction de la séquence identifiée.

34. Procédé de criblage de ligands susceptibles de médier ou de moduler l'activité régulatrice, plus spécialement stimulatrice, de la transcription d'une séquence nucléotidique selon la revendication 8 ou 9, ledit procédé comportant les étapes de : mise en contact de la cassette d'expression selon la revendication

21 ou d'un vecteur selon la revendication 22 ou 23, et dudit ligand en présence de réactifs nécessaires à la mise en œuvre d'une réaction de transcription, détection et/ou mesure de l'activité transcriptionnelle.

35. Nécessaire pour le criblage de ligand susceptible de médier ou de moduler l'activité stimulatrice de la transcription d'une séquence nucléotidique selon la revendication 8 ou 9, comprenant une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, et/ou un vecteur selon la revendication 22 ou 23 et/ou une cellule selon la revendication 25, ledit nécessaire comprenant le cas échéant, les réactifs nécessaires à la mise en œuvre d'une réaction de transcription. 36. Ligand obtenu par le procédé selon la revendication 35 ou le nécessaire selon la revendication 36. 37. Anticorps monoclonal ou polyclonal, ses fragments, ou anticorps chimérique, caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon la revendication 13. 38. Procédé pour la détection de la capacité d'un champignon Fusarium à produire des toxines trichothécènes dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : c) mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon la revendication 37 ; d) mise en évidence du complexe antigène-anticorps éventuellement formé. 39. Kit ou nécessaire pour la mise en œuvre d'un procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : a) un anticorps polyclonal ou monoclonal selon la revendication 37; b) éventuellement, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; c) éventuellement, les réactifs permettant la mise en évidence des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique d) une grille de référence indiquant la capacité de production de toxine en fonction de la réaction immunologique.

40. Puce à protéine, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un polypeptide selon la revendication 13, ou au moins un anticorps selon l'une des revendications 37, immobilisé sur le support de ladite puce.

41. Kit ou nécessaire pour la détection Fusarium, caractérisé en ce qu'il comprend une puce à protéine selon la revendication 40.

42. Souche de Fusarium, caractérisée en ce qu'elle contient au moins une mutation dans au moins une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 8 ou 9, impliquée dans la biosynthèse de trichothécènes, la mutation conduisant à l'inactivation d'une séquence régulatrice selon la revendication 5.

3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 26 à 30 et 27 à 30 caractérisé en ce que les souches de Fusarium analysées sont choisies parmi Fusarium.culmorum, Fusarium.graminearum. Fusarium cerealis.