FR3109494A1 - Methodes pour inhiber la production de mycotoxines par fusarium - Google Patents

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Abstract

La présente invention est relative à des peptides permettant d’inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genre Fusarium ainsi qu’à des compositions les comprenant et des méthodes les mettant en œuvre.

Description

METHODES POUR INHIBER LA PRODUCTION DE MYCOTOXINES PAR FUSARIUM
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention est relative au domaine phytosanitaire. En particulier, elle est relative à des moyens de lutte contre les champignons du genreFusarium, notamment le biocontrôle ou contrôle phytosanitaire des contaminations par les mycotoxines de type trichothécène de catégorie B produites lors de fusarioses.
INTRODUCTION
Fusarium graminearumest un agent causal majeur de la fusariose du blé et de la fusariose du maïs. Ces deux maladies fongiques ont un impact économique important dans de nombreuses régions productrices de céréales dans le monde. De plus,F. graminearumpeut produire des mycotoxines, principalement des trichothécènes de catégorie B ou TCTBs (dont les représentants majeurs sont le déoxynivalenol/DON et ses formes acétylées 15 et 3 acétyldéoxynivalénol/15 et 3-ADON), toxiques pour l'homme et les animaux. En effet, ces toxines ont une toxicité aiguë avérée à l’origine de graves intoxications alimentaires parfois mortelles et une toxicité chronique très fortement suspectée (hématotoxicité et immunotoxicité). En tant que molécules thermostables, les TCTBs , accumulés dans les grains récoltés, ne sont pas totalement éliminés lors de la fabrication de denrées alimentaires et d'aliments pour animaux à base de céréales. Les pratiques agronomiques recommandées pour limiter la contamination des récoltes ne permettent pas de garantir leur conformité vis-à-vis des seuils réglementaires fixés par l’UE (N° 1126/2007). Il est donc urgent de mettre en place de nouvelles stratégies de lutte en pré-récolte pour limiter l’accumulation de TCTBs dans les grains, durables et respectueuses de l'environnement.
Les défensines sont des peptides cycliques de bas poids moléculaire présentant un motif conservé appelé gamma-core, important pour leur activité antimicrobienne. Parmi ces défensines, des défensines de tique appelées DefMT3 et DefMT6 ont été décrites comme ayant une activité antibactérienne et antifongique, notamment vis-à-vis deFusarium culmorumetFusarium graminearum(Tonk et al, 2015, Developmental and Comparative Immunology, 53, 358-365). Dans cet article, les auteurs ont étudié l’activité de peptides présentant uniquement le motif de base gamma de DefMT3 ou DefMT6 et ont observé que ces motifs présentaient une activité antifongique augmentée par rapport à la défensine entière, en particulier sur la germination des spores et la croissance.
Cibler uniquement la croissance de l’espèce fongique ne garantit pas forcément des niveaux moindres de mycotoxines. En effet, le stress perçu par le champignon peut être un facteur de stimulation de la production de toxines. Ainsi, il est essentiel de disposer de moyens de lutte spécifiquement dirigés contre la production de TCTBs.
Il existe donc toujours un besoin pour un moyen de lutter spécifiquement contre la production des mycotoxines de type trichothécène de catégorie B produites lors de fusarioses.
La présente invention décrit une méthode permettant de diminuer la production de mycotoxines par les champignons du genreFusarium, en particulier les trichothécènes de catégorie B (TCTB).
En effet, les inventeurs ont identifié la capacité de certains peptides à inhiber la production de ces mycotoxines. Ils ont observé qu’un peptide portant le motif conservé gamma de DefMT3 ou des variants de celui-ci inhibe sévèrement la production des toxines DON (Déoxinivalénol) et 15-ADON (15-Acétyldéoxynivalénol) parFusarium graminearum. Ils ont montré que les formes peptidiques linéaires présentent une activité inhibitrice de la production de mycotoxines plus puissantes que les formes cycliques. En outre, les formes linéaires présentent une activité d’inhibition de la croissance fongique qui n’est presque pas présente pour les formes cycliques. Il a aussi été montré que la charge cationique des peptides était un élément important pour leur activité antifongique et inhibitrice de la biosynthèse de TCTBs. Enfin, les inventeurs ont montré que les formes PEGylées présentaient une activité antifongique améliorée.
Ainsi, la présente invention est relative à l’utilisation d’un peptide pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genreFusariumsur une plante, le peptide comprenant une séquence choisie parmi
C/S – G/S – N/G – F/R/I – L/W/I – K/T – R/L/Q/T - T - C/S – I/T - C/S – V/I/Y – K/M/R/T – K/N/T SEQ ID NO: 18
C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/T – R/Q/T - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/R/T – K/T SEQ ID NO: 19
C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/T – R/T - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/T – K/T SEQ ID NO: 20,
et
C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/R – R/K - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/R – K/R SEQ ID NO: 21.
et le peptide comprenant au plus 30 acides aminés.
Elle est également relative à une méthode pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genreFusariumsur une plante comprenant la mise en contact de la plante avec une composition comprenant un peptide, le peptide comprenant une séquence choisie parmi
C/S – G/S – N/G – F/R/I – L/W/I – K/T – R/L/Q/T - T - C/S – I/T - C/S – V/I/Y – K/M/R/T – K/N/T SEQ ID NO: 18
C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/T – R/Q/T - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/R/T – K/T SEQ ID NO: 19
C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/T – R/T - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/T – K/T SEQ ID NO: 20,
et
C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/R – R/K - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/R – K/R SEQ ID NO: 21.
et le peptide comprenant au plus 30 acides aminés.
Le peptide mise en œuvre dans cette utilisation ou cette méthode peut comprendre, consister essentiellement en ou consister en une séquence choisie parmi
C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO: 2
C S G I I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO: 3
C G N F L T R T C I C V K K SEQ ID NO: 6
C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7
C G N F L K R T C I C V T K SEQ ID NO: 8
C G N F L K R T C I C V K T SEQ ID NO: 9
C G N F L T T T C I C V T T SEQ ID NO: 10.
S G N F L K R T S I S V K K SEQ ID NO: 11
S S G I I K Q T S T S Y R K SEQ ID NO: 12
S G N F L T R T S I S V K K SEQ ID NO: 13
S G N F L K T T S I S V K K SEQ ID NO: 14
S G N F L K R T S I S V T K SEQ ID NO: 15
S G N F L K R T S I S V K T SEQ ID NO: 16 et
S G N F L T T T S I S V T T SEQ ID NO: 17.
Elle est en outre relative à une composition phytosanitaire destinée au traitement d’une plante comprenant un peptide, notamment pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genreFusariumsur la plante, le peptide comprenant une séquence choisie parmi
C/S – G/S – N/G – F/R/I – L/W/I – K/T – R/L/Q/T - T - C/S – I/T - C/S – V/I/Y – K/M/R/T – K/N/T SEQ ID NO: 18
C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/T – R/Q/T - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/R/T – K/T SEQ ID NO: 19
C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/T – R/T - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/T – K/T SEQ ID NO: 20,
et
C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/R – R/K - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/R – K/R SEQ ID NO: 21.
le peptide comprenant au plus 30 acides aminés et le peptide n’étant pas un peptide non-modifié de séquence
CGNFLKRTCICVKK SEQ ID NO : 2 ou
CSGIIKQTCTCYRK SEQ ID NO : 3.
Le peptide de la composition phytosanitaire peut comprendre, consister essentiellement en ou consister en une séquence choisie parmi
C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO: 2, le peptide portant une PEGylation, une amidation en C-terminal, une acétylation en N-terminale, une liaison peptidique modifiée, un acide aminé de forme D, une cystéine modifiée ou une combinaison de ces modifications ;
C S G I I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO: 3, le peptide portant une PEGylation, une amidation en C-terminal, une acétylation en N-terminale, une liaison peptidique modifiée, un acide aminé de forme D, une cystéine modifiée ou une combinaison de ces modifications ;
C G N F L T R T C I C V K K SEQ ID NO: 6
C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7
C G N F L K R T C I C V T K SEQ ID NO: 8
C G N F L K R T C I C V K T SEQ ID NO: 9
C G N F L T T T C I C V T T SEQ ID NO: 10.
S G N F L K R T S I S V K K SEQ ID NO: 11
S S G I I K Q T S T S Y R K SEQ ID NO: 12
S G N F L T R T S I S V K K SEQ ID NO: 13
S G N F L K T T S I S V K K SEQ ID NO: 14
S G N F L K R T S I S V T K SEQ ID NO: 15
S G N F L K R T S I S V K T SEQ ID NO: 16 et
S G N F L T T T S I S V T T SEQ ID NO: 17.
Dans des modes de réalisation particuliers de l’utilisation, de la méthode ou de la composition, le peptide comprend au plus 20 acides aminés.
Dans des modes de réalisation particuliers de l’utilisation, de la méthode ou de la composition, le peptide est PEGylé.
Dans des modes de réalisation particuliers de l’utilisation, de la méthode ou de la composition, le peptide ne comprend pas de pont disulfure.
Dans des modes de réalisation particuliers de l’utilisation, de la méthode ou de la composition, la mycotoxine est une trichothécène de catégorie B, de préférence déoxynivalénol (DON) et/ou déoxynivalénol acétylé (A-DON).
Dans des modes de réalisation particuliers de l’utilisation, de la méthode ou de la composition, le champignon du genreFusariumest choisi parmiFusarium culmorum,Fusarium graminearum,Fusarium tricinctum,Fusarium avenaceum,Fusarium poae,Fusarium sporotrichioides,Fusarium verticillioides,Fusarium proliferatum,Fusarium langsethiae,Fusarium oxysporum,Fusarium roseum,Fusarium arthrosporioides, etFusarium avenaceum, de préférenceFusarium culmorumouFusarium graminearum .
Dans des modes de réalisation particuliers de l’utilisation, de la méthode ou de la composition, la plante est sélectionnée parmi des céréales, comme le blé, l’orge, le maïs, l’avoine, et le riz, la tomate, le melon, le concombre, la courgette, le topinambour, le piment, la pomme de terre, l’asperge, la patate douce, le céleri, l’ail, l’oignon, le chou, le gingembre, la banane, le manioc, la vanille, et des arbres fruitiers comme le palmier dattier, de préférence des céréales choisis parmi le blé, l’orge, le maïs, l’avoine, et le riz.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Définitions
Dans le présent document, les termes « peptide », « oligopeptide », et « polypeptide » sont utilisés indifféremment et se réfèrent à une chaîne d’acides aminés reliés par des liaisons peptidiques, quel que soit le nombre de résidus d’acide aminé constituant cette chaîne.
Les séquences peptidiques définies dans le présent document sont représentées avec le symbole en une lettre tel qu’indiqué dans le tableau 1.
A Ala Alanine
R Arg Arginine
N Asn Asparagine
D Asp Acide aspartique
C Cys Cystéine
Q Gln Glutamine
E Glu Acide glutamique
G Gly Glycine
H His Histidine
I Ile Isoleucine
L Leu Leucine
K Lys Lysine
M Met Méthionine
F Phe Phénylalanine
P Pro Proline
S Ser Sérine
T Thr Thréonine
W Trp Tryptophane
Y Tyr Tyrosine
V Val Valine
Tel qu’utilisé ici, le terme « acide aminé » se réfère aux 20 résidus d'acides aminés standard naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T), aux résidus d'acides aminés naturels rares (par exemple l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 6-N-méthylysine, la N-éthylglycine, la N-méthylglycine, la N-éthylasparagine, l'allo-isoleucine, la N-méthylisoleucine, la N-méthylvaline, l'acide aminobutyrique) et aux acides aminés non naturels (par exemple la norleucine, la norvaline et la cyclohexyl-alanine). De préférence, ce terme se réfère aux 20 résidus d'acides aminés standard naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T).
Le terme « substitution », tel qu'utilisé ici désigne le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standard naturels, les résidus d'acides aminés naturels rares et d'acides aminés non naturels. De préférence, le terme « substitution » se réfère au remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standards naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T). La ou les substitutions peuvent être des substitutions conservatives ou non conservatives. Le terme « substitution conservative » tel qu’utilisé dans ce document, se réfère à une substitution d’un résidu d’acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité). Des exemples de substitutions conservatives sont présentés dans les tableaux suivants.
Groupes d’acides aminés Résidus d’acides aminés
Acide D et E
Basique K, R, et H
Hydrophile non chargé S, T, N, et Q
Aliphatique non chargé G, A, V, L, et I
Non polaire, non chargé C, M, et P
Aromatiques F, Y, et W
1 Alanine (A) Sérine (S) Thréonine (T)
2 Acide Aspartique (D) Acide Glutamique (E)
3 Asparagine (N) Glutamine (Q)
4 Arginine (R) Lysine (K)
5 Isoleucine (I) Leucine (L) Méthionine (M)
6 Phénylalanine (F) Tyrosine (Y) Tryptophane (W)
Résidus avec un groupe alcool S et T
Résidus aliphatiques I, L, V, et M
Résidus avec un cycle aromatique F, H, W, et Y
Résidus hydrophobes A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W, et Y
Résidus chargés négativement D et E
Résidus chargés positivement K, R et H
Résidus polaires C, D, E, H, K, N, Q, R, S, et T
Petits résidus A, C, D, G, N, P, S, T, et V
Très petits résidus A, G, et S
Résidus Flexibles E, Q, T, K, S, G, P, D, E, et R
«Consiste en» une séquence particulière, sauf indication contraire ou clairement contredite par le contexte, doit être compris comme décrivant un peptide consistant en cette séquence. Par « consiste essentiellement en », on entend que le peptide consiste en cette séquence, mais il peut également comprendre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substitutions, additions, délétions ou un mélange de celles-ci, de préférence 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, additions, délétions ou un mélange de celles-ci, et en particulier 1, 2 ou 3 substitutions, additions, délétions ou un mélange de celles-ci. En particulier, par « essentiellement consistant en », on peut envisager que le peptide puisse comprendre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 acides aminés supplémentaires au niveau de l'extrémité N- et / ou C-terminale, de préférence 1, 2, 3, 4 ou 5 acides aminés supplémentaires, et / ou 1, 2 ou 3 acides aminés supplémentaires. De préférence, le nombre de substitutions, d'additions, de délétions ou d'un mélange de celles-ci dépend de la longueur de la séquence. Par exemple, le pourcentage de substitutions, de délétions, d'additions ou d'un mélange de celles-ci peut ne pas dépasser 30%, de préférence pas plus de 25%. Tel qu'utilisé ici, le terme "substitution" se réfère à l'échange d'un seul acide aminé par un autre dans une séquence peptidique ; le terme "délétion" se réfère à l'élimination d'un seul acide aminé dans une séquence peptidique ; le terme "insertion" ou "addition" est équivalent et se réfère à l'addition d'un seul acide aminé dans une séquence peptidique.
Tel qu'utilisé ici, le terme "identité de séquence" ou "identité" se réfère au nombre (%) d'appariements (résidus d'acides aminés identiques) aux positions provenant d'un alignement de deux séquences polypeptidiques. L'identité de séquence est déterminée en comparant les séquences lorsqu'elles sont alignées de manière à maximiser le chevauchement et l'identité tout en minimisant les interruptions de séquence. En particulier, l'identité de séquence peut être déterminée en utilisant l'un quelconque des nombreux algorithmes d'alignement global ou local, en fonction de la longueur des deux séquences. Des séquences de longueurs similaires sont de préférence alignées en utilisant des algorithmes d'alignement global (e.g. Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970) qui alignent les séquences de manière optimale sur toute la longueur, tandis que des séquences de longueurs sensiblement différentes sont de préférence alignées en utilisant un algorithme d'alignement local, par exemple l'algorithme de Smith et Waterman (Smith et Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981) ou l'algorithme d'Altschul (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 ; Altschul et al (2005) FEBS J. 272:5101-5109). L'alignement dans le but de déterminer le pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés peut être réalisé par toute méthode connue de l’homme du métier, par exemple en utilisant un logiciel disponible sur des sites Internet tels que http: //blast.ncbi.nlm. nih.gov / ou http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/. L'homme de l'art peut aisément déterminer les paramètres appropriés pour mesurer l'alignement. Aux fins de la présente invention, les valeurs de pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés désignent des valeurs générées en utilisant le programme EMBOSS Needle d'alignement de séquences par paires qui crée un alignement global optimal de deux séquences en utilisant l'algorithme de Needleman-Wunsch dans lequel les paramètres sont les paramètres par défaut : Scoring matrix = BLOSUM62, Gap open = 10, Gap extend = 0.5, End gap penalty = false, End gap open = 10 and End gap extend = 0.5.
Peptides
Les inventeurs ont identifié des peptides présentant une activité inhibitrice de la production de mycotoxines, en particulier de trichothécènes de catégorie B, par un champignon du genreFusarium.
L’activité inhibitrice de la production de mycotoxines, en particulier de trichothécènes de catégorie B, peut être mesurée par toute technique connue de l’homme du métier. Par exemple, elle peut être mesurée comme décrit en détail dans les exemples dans la section « Test d’inhibition de la production de mycotoxines » en mesurant les quantités de DON et 15-ADON avec la soucheFusarium graminearumCBS 185.32.
Un peptide présente une activité inhibitrice de la production de mycotoxines lorsque cette production est diminuée de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 % par rapport à la production en absence du peptide.
Le peptide présentant une activité inhibitrice de la production de mycotoxine par un champignon du genreFusariumcomprend, consiste essentiellement en ou consiste en
C/S - X1- X2- X3- X4- X5- X6- T - C/S - X7- C/S - X8- X9- X10SEQ ID NO: 1
dans laquelle
C/S indique une cystéine (C) ou une sérine (S), la cystéine pouvant éventuellement être modifiée de sorte à empêcher la formation de pont disulfure;
X1est un petit acide aminé, par exemple choisi parmi G, S, A, V, T, D, N et P, en particulier G, S ou A, plus particulièrement encore G ou S ;
X2est un petit acide aminé, par exemple choisi parmi G, S, A, V, T, D, N et P, en particulier G, S, A ou N, plus particulièrement encore G ou N ;
X3est choisi parmi I, L, F, Y, W, M, R ou K, en particulier I, L, F ou Y, plus particulièrement encore I ou F ;
X4est choisi parmi I, L, F, Y, W, ou M, en particulier I, L, W ou F, plus particulièrement encore I ou L ;
X5est choisi parmi K, R, H, T, S, ou Q, en particulier K, R, S ou T, plus particulièrement encore K ou T, K, R ou T, ou K ou R ;
X6est choisi parmi R, K, L, I, Q ou T, en particulier R, K, Q ou T, plus particulièrement encore Q, R ou T, K, R ou T, ou K ou R;
X7est choisi parmi I, L, M, T ou S, en particulier I, L ou T, plus particulièrement encore I ou T ;
X8est choisi parmi V, I, L, Y, F, W ou M, en particulier V, I, L ou Y, plus particulièrement encore V ou Y ;
X9est choisi parmi R, K, H, T, S, N, M ou Q, en particulier R, K, T ou M, plus particulièrement encore R, K ou T, de préférence K ou R ; et
X10est choisi parmi S, T, Q, K, R, N ou H, en particulier K, R, N ou T, plus particulièrement encore K ou T, K, R ou T, ou K ou R,
le peptide comprenant au plus 30 acides aminés.
Dans un mode de réalisation préféré, lorsque le peptide comprend au moins 2 cystéines, ces cystéines sont sous forme réduite (SH), c’est-à-dire qu’elles ne forment pas ensemble de ponts disuflures.
Dans un autre aspect, le peptide comprend des sérines lorsque la séquence indique C/S.
Dans un autre aspect, le peptide comprend une ou plusieurs cystéines modifiées de sorte à empêcher la formation de pont disulfure. En particulier, les cystéines peuvent être alkylés sur la fonction thiol, en particulier méthylés (S-CH3), ou par carboxyamidométhylation (ajout d’un groupement CH2-CONH2). Dans un mode de réalisation particulier, toutes les cystéines du peptide ou toutes les cystéines sauf une sont modifiées ou remplacées par des cystéines.
Le peptide peut comprendre une identité de séquence avec le peptide de SEQ ID NO : 2 ou 3 d’au moins 50, 60, 70, 80, 90 ou 95%. Ainsi, le peptide peut comprendre 1, 2, 3, 4, ou 5 substitutions par rapport au peptide de SEQ ID NO : 2 ou 3, notamment au niveau des positions des résidus choisis parmi X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, et X10.
Dans un mode de réalisation particulier, le peptide comprend, consiste essentiellement en ou consiste en une séquence
C/S – G/S – N/G – F/R/I – L/W/I – K/T – R/L/Q/T - T - C/S – I/T - C/S – V/I/Y – K/M/R/T – K/N/T SEQ ID NO: 18
ou
C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/T – R/Q/T - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/R/T – K/T SEQ ID NO: 19
ou
C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/T – R/T - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/T – K/T SEQ ID NO: 20
ou
C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/R – R/K - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/R – K/R SEQ ID NO: 21.
Dans un mode de réalisation très particulier, le peptide comprend, consiste essentiellement en ou consiste en une séquence choisie dans le groupe consistant en
TickCore3: C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO: 2
TickCore6: C S G I I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO: 3
TC3K6T: C G N F L T R T C I C V K K SEQ ID NO: 6
TC3R7T: C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7
TC3K13T: C G N F L K R T C I C V T K SEQ ID NO: 8
TC3K14T: C G N F L K R T C I C V K T SEQ ID NO: 9 et
TC3KRKKT: C G N F L T T T C I C V T T SEQ ID NO: 10 ;
de préférence choisie dans le groupe consistant en
TickCore3: C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO: 2
TickCore6: C S G I I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO: 3
TC3K6T: C G N F L T R T C I C V K K SEQ ID NO: 6
TC3R7T: C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7
TC3K13T: C G N F L K R T C I C V T K SEQ ID NO: 8 et
TC3K14T: C G N F L K R T C I C V K T SEQ ID NO: 9;
ou dans le groupe consistant en
TickCore3: C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO: 2
TickCore6: C S G I I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO: 3
TC3R7T: C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7
TC3K13T: C G N F L K R T C I C V T K SEQ ID NO: 8 et
TC3K14T: C G N F L K R T C I C V K T SEQ ID NO: 9.
Facultativement, le peptide peut également comprendre, consister essentiellement en ou consister en une séquence choisie dans le groupe consistant en
S G N F L K R T S I S V K K SEQ ID NO: 11
S S G I I K Q T S T S Y R K SEQ ID NO: 12
S G N F L T R T S I S V K K SEQ ID NO: 13
S G N F L K T T S I S V K K SEQ ID NO: 14
S G N F L K R T S I S V T K SEQ ID NO: 15
S G N F L K R T S I S V K T SEQ ID NO: 16 et
S G N F L T T T S I S V T T SEQ ID NO: 17;
de préférence choisie dans le groupe consistant en
S G N F L K R T S I S V K K SEQ ID NO: 11
S S G I I K Q T S T S Y R K SEQ ID NO: 12
S G N F L K T T S I S V K K SEQ ID NO: 14
S G N F L K R T S I S V T K SEQ ID NO: 15 et
S G N F L K R T S I S V K T SEQ ID NO: 16.
Dans un aspect très particulier, le peptide n’est pas ou ne comprend pas la séquence d’un peptide choisi parmi
CGGRWKLTCICVRG SEQ ID NO : 4
CNGPFNIVCSCY SEQ ID NO : 5
Facultativement, la molécule peptidique peut comprendre en outre d’autres séquences peptidiques, du côté N-terminal ou C-terminal. Par exemple, le peptide peut comprendre, en N-terminal ou C-terminal, un tag (ou étiquette) utile pour la purification ou l’immobilisation du peptide. De tels tags sont bien connus de l’homme du métier et incluent par exemple les tags histidine (His6), FLAG, HA (épitope dérivé de l’hémagglutinine du virus de la grippe), MYC (épitope dérivé de la proto-oncoprotéine humaine MYC) ou GST (glutathion-S-transférase). Optionnellement, le peptide peut comprendre un site de clivage par une protéase ou un agent chimique permettant de supprimer ce tag.
Dans un mode de réalisation préféré, le peptide a une longueur inférieure à 30 acides aminés, de préférence inférieure à 25, 20, 19, 18, 17, 16 ou 15 acides aminés.
Dans un mode de réalisation préféré, le peptide n’est pas cyclique. Ainsi, il ne contient pas d’interaction covalente entre les chaînes latérales de deux acides aminés ou entre les extrémités N-terminale et C-terminale.
Les ou des liaisons peptidiques du peptide peuvent être modifiées pour les rendre résistantes à la protéolyse. Par exemple, au moins une liaison peptidique (-CO-NH-) peut être remplacée par une liaison divalente choisie parmi (-CH2-NH-), (-NH-CO-), (-CH2-O-), (-CH2-S-), (-CH2-CH2-), (-CO-CH2-), (-CHOH-CH2-), (-N=N-), et (-CH=CH-). Facultativement, toutes les liaisons peptidiques peuvent être remplacées.
La molécule peptidique peut comprendre soit une extrémité C terminale carboxylique (-COO-) ou amidée (-CONH2). L’extrémité C-terminale peut également être estérifiée. Le peptide peut également être facultativement modifié à son extrémité N-terminale, par exemple par un radical acétyle. Dans un mode de réalisation particulier, le peptide peut être PEGylé (polyéthylène glycol), en partie à son extrémité N-terminale. Par exemple, le peptide peut comprendre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus groupes PEG.
Les isomères L et D des acides aminés sont envisagés. En effet, les isomères D ne sont pas sensibles aux protéases et la présente invention comprend également des molécules comprenant des acides aminés D, notamment des molécules comprenant uniquement ou essentiellement des acides aminés D. Dans un mode particulier, les acides aminés L sont préférés. Dans un autre mode particulier, le peptide peut comprendre uniquement des acides aminés D et être en configuration rétro-inversée (même séquence mais inversée).
Dans un aspect particulier, la présente invention est relative à un nouveau peptide présentant une activité inhibitrice de la production de mycotoxine par un champignon du genreFusarium.
Notamment, un nouveau peptide selon la présente invention est un peptide tel que défini ci-dessus mais n’est pas un peptide non-modifié de séquence
CGNFLKRTCICVKK SEQ ID NO : 2 ou
CSGIIKQTCTCYRK SEQ ID NO : 3.
Ainsi, un nouveau peptide peut être un peptide de séquence SEQ ID NO : 2 ou 3 qui porte une PEGylation, une amidation en C-terminal, une acétylation en N-terminale, une liaison peptidique modifiée, un acide aminé de forme D, une cystéine modifiée ou une combinaison de ces modifications.
Compositions et Utilisations
La présente invention est relative à une composition comprenant un nouveau peptide tel que décrit dans la présente demande ou un mélange de ceux-ci, la composition étant de préférence une composition phytosanitaire, notamment pour lutter contre un champignon du genreFusarium, et plus particulièrement contre la production de mycotoxines.
La présente invention est également relative à l’utilisation d’un peptide tel que décrit dans la présente demande ou un mélange de ceux-ci pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genreFusariumsur une plante.
Elle est enfin relative à une méthode pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genreFusariumsur une plante comprenant la mise en contact de la plante avec une composition comprenant un peptide tel que décrit dans la présente demande ou un mélange de ceux-ci.
Le champignon du genreFusariumpeut notamment être choisi parmiFusarium culmorum,Fusarium graminearum,Fusarium tricinctum,Fusarium avenaceum,Fusarium poae,Fusarium sporotrichioides,Fusarium verticillioides,Fusarium proliferatum,Fusarium langsethiae,Fusarium oxysporum,Fusarium roseum,Fusarium arthrosporioides, etFusarium avenaceum, de préférence parmiFusarium culmorum,Fusarium graminearum,Fusarium tricinctum,Fusarium avenaceum,Fusarium poae,Fusarium sporotrichioides,Fusarium verticillioides,Fusarium proliferatum,Fusarium langsethiaeetFusarium oxysporum. Dans un aspect particulier, le champignon estFusarium culmorumouFusarium graminearum .
Les plantes concernées par ce traitement peuvent être des céréales, comme le blé, l’orge, le maïs, l’avoine, et le riz, mais également la tomate, le melon, le concombre, la courgette, le topinambour, le piment, la pomme de terre, l’asperge, la patate douce, le céleri, l’ail, l’oignon, le chou, le gingembre, la banane, le manioc, la vanille, et des arbres fruitiers comme le palmier dattier.
Les mycotoxines sont en particulier les trichothécènes de catégorie B. Notamment, parmi les trichothécènes de catégorie B, on trouve le déoxynivalénol (DON), le déoxynivalénol acétylé (A-DON) dont le type 3-acétyl-DON et 15-acétyl-DON, la nivalénol et la fusarénone X.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition phytosanitaire ou le peptide est appliqué sur la partie aérienne de la plante. De préférence, elle/il est appliqué au moment de la floraison ou avant la floraison de la plante. Alternativement, elle/il est appliqué au moment de la formation du grain.
Dans un aspect particulier, la composition phytosanitaire ou le peptide peut être mis en œuvre à une concentration où elle/il a un effet inhibiteur sur la production de mycotoxines par des champignons du genreFusariumet n’a pas ou peu d’effet sur la croissance des champignons du genreFusarium. En effet, la concentration sera choisie de manière à obtenir un effet optimal sur la production de mycotoxines. Ainsi, la concentration de peptides peut par exemple être inférieure à 100 µM, 75 µM, 50 µM, 25µM ou 15 µM.
Dans un autre aspect particulier, la composition phytosanitaire ou le peptide peut être mis en œuvre à une concentration où elle/il a un effet sur la production de mycotoxines par des champignons du genreFusariumet a également un effet inhibiteur sur la croissance des champignons du genreFusarium. Dans ce contexte, le peptide est de préférence un nouveau peptide tel que défini dans la présente demande.
FIGURES
: Activité antifongique et anti-mycotoxine de TickCore3, forme native et oxydée. Après 10 jours d'incubation dans des milieux supplémentés ou non en TickCore3 (forme native) ou TickCore3Ox (formes oxydées), les mycelia de F. graminearum ont été séparés et pesés. Les valeurs pondérales du mycélium sont présentées en grammes (g) (Fig1 a). Les mycotoxines de type TCTB, DON (Fig 1b) et 15-ADON (Fig 1c), ont été quantifiées et exprimées en µg de mycotoxines par ml de milieu, puis divisées par le poids du mycélium et exprimées en µg de mycotoxines de TCTB par g de biomasse sèche de mycélium (µg / g).
: Activité antifongique et antimycotoxine de peptides TickCore3 linéaires et cycliques. Après 10 jours d'incubation dans des milieux supplémentés ou non en TickCore3 CH3-1 Ox, TickCore3 CH3-2 Ox, TickCore3 CH3-3 Ox ou TickCore3 CH3-123, les mycelia de F. graminearum ont été séparés et pesés. Les valeurs pondérales du mycélium sont présentées en grammes (g) (Fig 2a). Les mycotoxines de type TCTB, DON (Fig 2b) et 15-ADON (Fig 2c), ont été quantifiées en µg de mycotoxines par ml de milieu, puis divisées par le poids du mycélium et exprimées en µg de mycotoxines de TCTB par g de biomasse sèche de mycélium (µg / g).
: Activité antifongique et « anti-mycotoxine » de Tickcore3, forme native ou formes substituées dans lesquelles les acides aminés basiques (K en position 6, 13 et 14, et R en position 7) ont été remplacés par T, un acide aminé non chargé. Après 10 jours d'incubation dans des milieux supplémentés ou non en TickCore3, TickCore3-K6T, TickCore3-R7T, TickCore3-K13T, et TickCore3-K14T, les mycelia de F. graminearum ont été séparés et pesés. Les valeurs pondérales du mycélium sont présentées en grammes (g) (Fig 3a). Les mycotoxines de type TCTB, DON (Fig 3b) et 15-ADON (Fig 3c), ont été quantifiées en µg de mycotoxines par ml de milieu, puis divisées par le poids du mycélium et exprimées en µg de mycotoxines de TCTB par g de biomasse sèche de mycélium (µg / g). Trois concentrations différentes de peptide (12.5 µM, 25 µM and 50 µM) ont été testées.
: Activité antifongique et antimycotoxine de peptide TickCore3 et d’une version pégylée TickCore3-PEG. Après 10 jours d'incubation dans des milieux supplémentés ou non en TickCore3 ou TickCore3-PEG, les mycelia de F. graminearum ont été séparés par centrifugation et pesés. Les valeurs pondérales du mycélium sont présentées en grammes (g) (Fig 4a). Les mycotoxines de type TCTB, DON (Fig 4b) et 15-ADON (Fig 4c), ont été quantifiées en µg de mycotoxines par ml de milieu, puis divisées par le poids du mycélium et exprimées en µg de mycotoxines de TCTB par g de biomasse sèche de mycélium (µg / g).
EXEMPLES
Les inventeurs ont montré que le motif conservé gamma core linéaire, avec des résidus de cystéine (Cys) réduits, de la défensine de tique DefMT3, ici nommée « TickCore3 », inhibe la production de trichothécènes de catégorie B (TCTB) parF. graminearum. L’alkylation de tous les résidus Cys de TickCore3 avec des groupes méthyles (TickCore3-CH3) a eu peu d'effet sur l'effet inhibiteur affectant la production des TCTB. Inversement, l'oxydation de tous les résidus Cys de TickCore3 a fortement diminué l'effet inhibiteur sur la production des TCTB. Une perte de fonction inhibitrice majeure a été observée lorsque les ponts disulfures spécifiques Cys4-Cys6 et Cys4-Cys5 ont été formés. Les inventeurs ont aussi montré que la charge cationique du peptide était un facteur important de son activité biologique. La substitution des acides aminés chargés postivement par un résidu neutre a conduit à une réduction parfois très significative de l’activité antifongique et d’inhibition de la production de TCTB.
Résultats
TickCore3 est un inhibiteur très efficace de la production de TCTB par F. graminearum
La Fig. 1 montre les résultats obtenus après 10 jours de culture de la souche F.graminearumCBS 185.32 dans un milieu MS supplémenté avec TickCore3 et sa variante oxydée (TickCore3 Ox) à trois concentrations différentes (12,5, 25 et 50 µM). Les milieux de culture non traités (contrôle) n'ont été supplémentés par aucun des peptides TickCore3. Bien que TickCore3 Ox n'ait eu aucun effet sur la biomasse fongique sèche, TickCore3 a inhibé de façon significative la croissance fongique à toutes les concentrations testées comparativement à la condition contrôle (Fig. 1a). L'effet d'inhibition de la croissance fongique de TickCore3 était dose-dépendant puisque l'augmentation de la concentration du peptide avait un effet proportionnel sur la quantité de biomasse sèche. En ce qui concerne la production de mycotoxines, le 15-ADON était le principal TCTB produit dans les milieux liquides par la souche étudiée. Dans les conditions contrôles, la production de 15-ADON (moyenne 21867 SD ±3259 µg/g de biomasse sèche) était 26 fois supérieure à celle de DON (835±68 µg/g). La supplémentation avec TickCore3 a conduit à des niveaux non détectables de DON (Fig. 1b) et 15-ADON (Fig. 1c) pour toutes les concentrations testées. Toutefois, des niveaux résiduels de 15-ADON ont été observés avec la concentration 12,5 µM (figure 1c). En revanche, une concentration de 12,5 µM de TickCore3 Ox n'a pas réduit significativement la production de DON (Fig. 1b) ni de 15-ADON (Fig. 1c).
La cyclisation de TickCore3 réduit l'activité antifongique
Les inventeurs ont émis l'hypothèse que la formation de cycle dans TickCore3 peut avoir des effets sur l’inhibition de la production de TCTB. Afin de vérifier cette hypothèse, des peptides dérivés de TickCore3 ont été synthétisés en alkylant chaque résidu Cys individuellement avec un groupe méthyle (CH3), suivi d'un protocole d'oxydation qui a généré des peptides avec des ponts disulfures établis entre Cys5-Cys6 (TickCore3 CH3-1 Ox), Cys4-Cys6 (TickCore3 CH3-2 Ox) et Cys4-Cys5 (TickCore3 CH3-3 Ox).
TickCore3-CH3-1 Ox, TickCore3-CH3-2 Ox et TickCore3-CH3-3 Ox n'ont eu aucun effet sur la croissance fongique à aucune des concentrations testées, comparativement au contrôle (Fig. 2a). La production de mycotoxines parF. graminearuma ensuite été mesurée dans les milieux supplémentés avec TickCore3-CH3-1 Ox, TickCore3-CH3-2 Ox et TickCore3-CH3-3 Ox à trois concentrations différentes : 12,5, 25 et 50 µM (figure 2b). L'augmentation des concentrations de TickCore3-CH3-2 Ox et TickCore3-CH3-3 Ox a entraîné une augmentation significative de la production de DON (Fig. 2b) et de 15-ADON (Fig. 2c), sauf pour les champignons exposés à TickCore3-CH3-2 Ox pour lesquels la production de 15-ADON n'a pas changé significativement. Par ailleurs, le traitement avec TickCore3-CH3-1 Ox à 50 µM a entraîné une réduction significative des niveaux de DON et de 15-ADON (Fig. 2bc). Un peptide supplémentaire, TickCore3-CH3-CH3-123, avec tous les résidus Cys alkylés par des groupes méthyles, a été synthétisé.F. graminearumexposé à TickCore3-CH3-123 a produit significativement moins de DON et 15-ADON comparativement aux conditions contrôle.
La charge cationique est un élément clef de l’activité antifongique et « anti-mycotoxine » de TickCore3.
Les inventeurs ont émis l’hypothèse que la charge cationique de TickCore 3 était un élément important de son activité biologique. Afin de vérifier cette hypothèse, des peptides substitués de TickCore3 ont été synthétisés en substituant les acides aminés dits basique (arginine et lysine, R et K) par un résidu non chargé, la thréonine (T). Les peptides suivants ont ainsi été générés : TickCore3-K6T (substitution de la lysine en position 6 par un résidu thréonine), TickCore3-R7T (substitution de l’arginine en position 7 par un résidu thréonine), Tickcore3-K13T (substitution de la lysine en position 13 par un résidu thréonine), et TickCore3-K14T (substitution de la lysine en position 14 par un résidu thréonine) . Pour l’ensemble des peptides substitués, l’activité antifongique a été réduite, comparée à celle du peptide natif (Fig3a). Les formes substituées (TickCore3-K13T, TickCore3-K14T et TickCore3-R7T) présentent une activité antifongique forte uniquement à 50µM alors que TickCore3-K6T ne possède aucune activité antifongique en dessous de la concentration à 50µM. La production de mycotoxines parF. graminearuma ensuite été mesurée dans les milieux supplémentés avec TickCore3, TickCore3-K13T, TickCore3-K6T, TickCore3-K14T et TickCore3-R7T à trois concentrations différentes : 12,5, 25 et 50 µM (figures 3b et 3c). Pour l’ensemble des peptides substitués, que ce soit vis-à-vis de la production de DON (Fig 3b) ou de 15 ADON (Fig3c), la capacité à inhiber la production de mycotoxines est inférieure à celle de la forme native TickCore3. Cette réduction de capacité à inhiber la production de TCTB est particulièrement marquée pour TickCore3-K6T et dans une moindre mesure TickCore3-K13T, suggérant que les acides aminés lysine en position 13 et 6 jouent un rôle important dans l’activité « anti-mycotoxine ».
La pégylation de TickCore3 augmente l'activité antifongique
Le peptide TickCore3-PEG a été synthétisé de la même façon que TickCore3, à la différence que deux unités PEG ont été fixées séquentiellement à l'extrémité N-terminale du peptide. Comparativement à TickCore3, TickCore3-PEG à 50 μM a montré un effet antifongique plus important avec une diminution d’un facteur 3,3 de la croissance fongique (Fig 4a). De plus, TickCore3-PEG présenterait également une activité inhibitrice améliorée sur la production de mycotoxines (Fig 4bc).
Matériel et Méthodes
Synthèse du noyau gamma de TickCore3
TickCore3 (CGNFLKRTCRTCICVKKK, SEQ ID NO : 2) est le motif conservé gamma core de DefMT3 (numéro d'accès GenBank : JAA71488 ; Tonk et al., 2015). La synthèse de peptides a été commandée à Pepmic (Suzhou, Chine) qui utilise la synthèse de peptides en phase solide (SPPS) pour obtenir des peptides à haut degré de pureté comme décrit précédemment dans Cabezas-Cruz et al., 2016, (Front Microbiol., 7, 1682). Brièvement, la synthèse peptidique a été effectuée en utilisant une résine de 2-chlorotrityle chlorure comme support solide, et une base labile de 9-fluorényl-méthyloxy-carbonyle (Fmoc) comme groupe protecteur. Les acides aminés ont été protégés comme suit : Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Ile-OH et Fmoc-Val-OH. Toutes les séquences peptidiques ont été synthétisées selon les principes du SPPS. Les peptides ont été purifiés par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) selon les protocoles standard de couplage chimique des peptides.
Les peptides purifiés par HPLC en phase inverse, ont été ensuite facultativement oxydés à l'aide d'un tampon de repliement contenant 1 M urée, 100 mM Tris (pH 8,0), 1,5 mM glutathion oxydé, 0,75 mM glutathion réduit et 10 mM méthionine. L'oxydation des résidus Cys a été confirmée par la réaction d'Ellman et la formation de liaisons disulfures a été caractérisée par spectroscopie de masse par électrospray (ESI-MS) à l’aide d’un spectromètre de masse LCMS-2020 (Shimadzu, Kyoto, Kyoto Prefecture, Japon). La composition de la séquence a également été vérifiée par ESI-MS à l'aide d'un spectromètre de masse LCMS-2020 (Shimadzu, Kyoto, préfecture de Kyoto, Japon). Les peptides TickCore3-CH3-123 (C(CH3)GNFLKRTC(CH3)IC(CH3)VKK), TickCore3-CH3-1 (C(CH3)GNFLKRTCRICVKK), TickCore3-CH3-2 (CGNFLKRTC(CH3)ICVKK) et TickCore3-CH3-3 (CGNFLKRTCIC(CH3)VKK) ont été synthétisés comme décrit précédemment, à la différence que Fmoc-Cys(Me)-OH a été ajouté en remplacement de Fmoc-Cys(Trt)-OH. L’alkylation du soufre (S) des groupes thiols de tous les résidus Cys empêche la cyclisation de ces résidus (c'est-à-dire qu'aucun pont disulfure ne peut se former). Inversement, l’alkylation du S du groupe thiol d’un seul résidu Cys, suivi de son oxydation, dirige la cyclisation des résidus Cys réduits (c'est-à-dire ceux qui n'ont pas été alkylés).
Le peptide TickCore3-PEG a été synthétisé comme TickCore3 mais deux unités PEG ont été séquentiellement attachées à l’extrémité N terminal du peptide en utilisant des groupes protégés Fmoc-NH-PEG2-CH2CH2COOH.
Test d'inhibition de la production de mycotoxines
Souche de fusarium et conditions de culture
La soucheF. graminearumCBS 185.32 qui produit du DON et 15-ADON (Centraal bureau voor Schimmelkulturen, Pays-Bas) a été utilisée tout au long de cette étude. La culture fongique a été maintenue à 4°C sur des géloses dextrosées à la pomme de terre (PDA) (Difco, Le Ponts de Claix, France) dans des tubes inclinés, sous huile minérale. Pour la réalisation de l’inoculum, la souche a été cultivée à 25 °C dans l'obscurité sur des géloses PDA inclinées pendant 7 jours et la suspension de spores a été préparée en ajoutant 6 mL d'eau distillée stérile à la gélose PDA inclinée avec une agitation douce.
Des expériences en culture liquide ont été réalisées à l’aide de plaques statiques de 24 puits. Chaque puits contenant 2 ml d'un milieu synthétique (milieu MS) qui favorise l’induction rapide de la production de TCTB, préparé tel que publié précédemment (Boutigny et al., 2009, Mycol. Res., 113, 746), supplémenté ou non avec le peptide, a été inoculé avec 2x104spores/mL. Les cultures liquides fongiques ont été incubées à 25°C dans l'obscurité pendant 10 jours. Après incubation, les mycéliums ont été récupérés par centrifugation et la biomasse fongique a été mesurée en pesant les mycéliums après 48 h de cryodessiccation (Flexi-Dry®, OErlikon Leybold, Allemagne). Les milieux de culture ont été conservés à -20°C jusqu'à l'analyse des TCTB. Tous les peptides ont été testés à trois concentrations de 12,5, 25 et 50 µM. Cinq répétitions ont été faites pour chaque condition. Des contrôles appropriés utilisant des milieux contrôles dépourvus de peptides et des milieux contrôles non inoculés ont été inclus.
Extraction et analyse des TCTB
Un échantillon de 1,5 mL de milieu de culture a été extrait avec 3 mL d'acétate d'éthyle. Un volume de 2,5 mL de la phase organique a été évaporé à sec à 45 °C sous flux d'azote. Les échantillons séchés ont été dissout dans 200 µL de méthanol/eau (1/1, v/v) et filtrés à travers un filtre de 0,2 µm avant analyse. Les TCTB ont été quantifiés par HPLC-DAD à l'aide d'un chromatographe en phase liquide Agilent Technologies 1100 series équipé d'un système d'échantillonnage automatique, d'un détecteur à barette de diodes (DAD) Agilent et du logiciel de gestion de chromatographie ChemStation (Agilent, France). La séparation a été réalisée sur une colonne Kinetex XB-C18 100 Å (4,6 X 150 mm, 2,6 μm) (Phenomenex, France) maintenue à 45°C. La phase mobile était constituée d'eau acidifiée avec de l'acide orthophosphorique à pH 2,6 (solvant A) et de l'acétonitrile (solvant B). Le débit a été maintenu à 1 mL.min-1. Le volume d'injection était de 5 μL. Les TCTB ont été séparés au moyen d’un gradient d’élution: 7 à 30% B en 10 min, 30-90% B en 5 min, 90% B en 5 min, 90 à 7% B en 2 min, 7% B en 5 min. Les spectres UV-Vis ont été enregistrés de 190 à 400 nm et les surfaces de pic ont été mesurées à 230 nm. La quantification a été effectuée par un étalonnage externe avec des solutions étalons (Romer Labs, Autriche). Les rendements en toxines ont été exprimés en μg.g-1 de la biomasse sèche.
Analyses statistiques
Toutes les valeurs présentées sont des moyennes ± écart-type incluant quatre réplications biologiques. Comme les données ne suivaient pas une distribution normale (test de normalité de Shapiro-Wilk), l'analyse unidirectionnelle de Kruskal-Wallis a été utilisée, avec des comparaisons de moyennes effectuées à l'aide du test Connover-Inman. L'analyse statistique a été réalisée avec le logiciel XLSTAT 2017 (Addinsoft, Rennes, France). Le seuil statistique de signification p = 0,05 a été utilisé tout au long de l'étude.

Claims (11)

  1. Utilisation d’un peptide pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genreFusariumsur une plante, le peptide comprenant une séquence choisie parmi
    C/S – G/S – N/G – F/R/I – L/W/I – K/T – R/L/Q/T - T - C/S – I/T - C/S – V/I/Y – K/M/R/T – K/N/T SEQ ID NO: 18
    C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/T – R/Q/T - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/R/T – K/T SEQ ID NO: 19
    C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/T – R/T - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/T – K/T SEQ ID NO: 20,
    et
    C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/R – R/K - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/R – K/R SEQ ID NO: 21
    et le peptide comprenant au plus 30 acides aminés.
  2. Méthode pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genreFusariumsur une plante comprenant la mise en contact de la plante avec une composition comprenant un peptide, le peptide comprenant une séquence choisie parmi
    C/S – G/S – N/G – F/R/I – L/W/I – K/T – R/L/Q/T - T - C/S – I/T - C/S – V/I/Y – K/M/R/T – K/N/T SEQ ID NO: 18
    C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/T – R/Q/T - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/R/T – K/T SEQ ID NO: 19
    C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/T – R/T - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/T – K/T SEQ ID NO: 20,
    et
    C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/R – R/K - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/R – K/R SEQ ID NO: 21
    et le peptide comprenant au plus 30 acides aminés.
  3. Composition phytosanitaire destinée au traitement d’une plante comprenant un peptide, notamment pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genreFusariumsur la plante, le peptide comprenant une séquence choisie parmi
    C/S – G/S – N/G – F/R/I – L/W/I – K/T – R/L/Q/T - T - C/S – I/T - C/S – V/I/Y – K/M/R/T – K/N/T SEQ ID NO: 18
    C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/T – R/Q/T - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/R/T – K/T SEQ ID NO: 19
    C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/T – R/T - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/T – K/T SEQ ID NO: 20,
    et
    C/S – G/S – N/G – F/I – L/I – K/R – R/K - T - C/S – I/T - C/S – V/Y – K/R – K/R SEQ ID NO: 21
    le peptide comprenant au plus 30 acides aminés et le peptide n’étant pas un peptide non-modifié de séquence
    CGNFLKRTCICVKK SEQ ID NO : 2 ou
    CSGIIKQTCTCYRK SEQ ID NO : 3.
  4. Utilisation selon la revendication 1 ou méthode selon la revendication 2 ou composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que le peptide comprend en une séquence choisie parmi les suivantes, ou consiste en une séquence choisie parmi les suivantes avec la séquence pouvant comprendre 1, 2, 3, 4 or 5 substitutions, additions, délétions ou un mélange de celles-ci, ou consiste en une séquence choisie parmi les suivantes
    C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO: 2
    C S G I I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO: 3
    C G N F L T R T C I C V K K SEQ ID NO: 6
    C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7
    C G N F L K R T C I C V T K SEQ ID NO: 8
    C G N F L K R T C I C V K T SEQ ID NO: 9
    C G N F L T T T C I C V T T SEQ ID NO: 10.
    S G N F L K R T S I S V K K SEQ ID NO: 11
    S S G I I K Q T S T S Y R K SEQ ID NO: 12
    S G N F L T R T S I S V K K SEQ ID NO: 13
    S G N F L K T T S I S V K K SEQ ID NO: 14
    S G N F L K R T S I S V T K SEQ ID NO: 15
    S G N F L K R T S I S V K T SEQ ID NO: 16 et
    S G N F L T T T S I S V T T SEQ ID NO: 17.
  5. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que le peptide comprend une séquence choisie parmi les suivantes, ou consiste en une séquence choisie parmi les suivantes avec la séquence pouvant comprendre 1, 2, 3, 4 or 5 substitutions, additions, délétions ou un mélange de celles-ci, ou consiste en une séquence choisie parmi les suivantes
    C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO: 2, le peptide portant une PEGylation, une amidation en C-terminal, une acétylation en N-terminale, une liaison peptidique modifiée, un acide aminé de forme D, une cystéine modifiée ou une combinaison de ces modifications ;
    C S G I I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO: 3, le peptide portant une PEGylation, une amidation en C-terminal, une acétylation en N-terminale, une liaison peptidique modifiée, un acide aminé de forme D, une cystéine modifiée ou une combinaison de ces modifications ;
    C G N F L T R T C I C V K K SEQ ID NO: 6
    C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7
    C G N F L K R T C I C V T K SEQ ID NO: 8
    C G N F L K R T C I C V K T SEQ ID NO: 9
    C G N F L T T T C I C V T T SEQ ID NO: 10.
    S G N F L K R T S I S V K K SEQ ID NO: 11
    S S G I I K Q T S T S Y R K SEQ ID NO: 12
    S G N F L T R T S I S V K K SEQ ID NO: 13
    S G N F L K T T S I S V K K SEQ ID NO: 14
    S G N F L K R T S I S V T K SEQ ID NO: 15
    S G N F L K R T S I S V K T SEQ ID NO: 16 et
    S G N F L T T T S I S V T T SEQ ID NO: 17.
  6. Utilisation selon la revendication 1 ou 4, méthode selon la revendication 2 ou 4 ou composition selon la revendication 3 ou 5, caractérisée en ce que le peptide comprend au plus 20 acides aminés.
  7. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1, 4 et 6, méthode selon l’une quelconque des revendications 2, 4 et 6 ou composition selon l’une quelconque des revendications 3, 5 et 6, caractérisée en ce que le peptide est PEGylé.
  8. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1, 4 et 6-7, méthode selon l’une quelconque des revendications 2, 4 et 6-7 ou composition selon l’une quelconque des revendications 3, 5 et 6-7, caractérisée en ce que le peptide ne comprend pas de pont disulfure.
  9. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1, 4 et 6-8, méthode selon l’une quelconque des revendications 2, 4 et 6-8 ou composition selon l’une quelconque des revendications 3, 5 et 6-8, caractérisée en ce que la mycotoxine est une trichothécène de catégorie B, de préférence déoxynivalénol (DON) et/ou déoxynivalénol acétylé (A-DON).
  10. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1, 4 et 6-9, méthode selon l’une quelconque des revendications 2, 4 et 6-9 ou composition selon l’une quelconque des revendications 3, 5 et 6-9, caractérisée en ce que le champignon du genreFusariumest choisi parmiFusarium culmorum,Fusarium graminearum,Fusarium tricinctum,Fusarium avenaceum,Fusarium poae,Fusarium sporotrichioides,Fusarium verticillioides,Fusarium proliferatum,Fusarium langsethiae,Fusarium oxysporum,Fusarium roseum,Fusarium arthrosporioides, etFusarium avenaceum, de préférenceFusarium culmorumouFusarium graminearum .
  11. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1, 4 et 6-10, méthode selon l’une quelconque des revendications 2, 4 et 6-10 ou composition selon l’une quelconque des revendications 3, 5 et 6-10, caractérisée en ce que la plante est sélectionnée parmi des céréales, comme le blé, l’orge, le maïs, l’avoine, et le riz, la tomate, le melon, le concombre, la courgette, le topinambour, le piment, la pomme de terre, l’asperge, la patate douce, le céleri, l’ail, l’oignon, le chou, le gingembre, la banane, le manioc, la vanille, et des arbres fruitiers comme le palmier dattier, de préférence des céréales choisis parmi le blé, l’orge, le maïs, l’avoine, et le riz.
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