WO2021214414A1 - Methodes pour inhiber la production de mycotoxines par fusarium - Google Patents

Methodes pour inhiber la production de mycotoxines par fusarium Download PDF

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WO2021214414A1
WO2021214414A1 PCT/FR2021/050702 FR2021050702W WO2021214414A1 WO 2021214414 A1 WO2021214414 A1 WO 2021214414A1 FR 2021050702 W FR2021050702 W FR 2021050702W WO 2021214414 A1 WO2021214414 A1 WO 2021214414A1
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seq
peptide
fusarium
sequence
tickcore3
Prior art date
Application number
PCT/FR2021/050702
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Inventor
Alejandro CABEZAS-CRUZ
Florence FORGET
Vessela ATANASOVA
Original Assignee
Institut National De Recherche Pour L'agriculture, L'alimentation Et L'environnement
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01N63/10—Animals; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/14—Insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins

Definitions

  • the present invention relates to the phytosanitary field.
  • it relates to means for combating fungi of the Fusarium genus, in particular the biocontrol or phytosanitary control of contamination by category B trichothecene type mycotoxins produced during Fusarium wilt.
  • Fusarium graminearum is a major causative agent of Fusarium wilt of wheat and Fusarium wilt of corn. These two fungal diseases have a significant economic impact in many grain-producing regions around the world.
  • F. graminearum can produce mycotoxins, mainly category B trichothecenes or TCTBs (the major representatives of which are deoxynivalenol / DON and its acetylated forms 15 and 3 acetyldeoxynivalenol / 15 and 3-ADON), toxic to humans. and animals. Indeed, these toxins have a proven acute toxicity at the origin of serious food poisoning sometimes fatal and a very strongly suspected chronic toxicity (hematotoxicity and immunotoxicity).
  • thermostable molecules As thermostable molecules, TCTBs, accumulated in harvested grains, are not completely eliminated during the manufacture of food and feed from cereals.
  • the agronomic practices recommended to limit the contamination of crops do not guarantee their compliance with the regulatory thresholds set by the EU (N ° 1126/2007). It is therefore urgent to put in place new pre-harvest control strategies to limit the accumulation of TCTBs in grains, which are sustainable and respectful of the environment.
  • Defensins are low molecular weight cyclic peptides with a conserved motif called gamma-core, important for their antimicrobial activity.
  • tick defensins called DefMT3 and DefMT6 have been described as having antibacterial and antifungal activity, in particular against Fusarium culmorum and Fusarium graminearum (Tonk et al, 2015, Developmental and Comparative Immunology, 53, 358 - 365).
  • the present invention describes a method for reducing the production of mycotoxins by fungi of the genus Fusarium, in particular category B trichothecenes (TCTB).
  • TCTB trichothecenes
  • the inventors have identified the capacity of certain peptides to inhibit the production of these mycotoxins. They observed that the DefMT3 peptide but also a peptide carrying the conserved gamma motif of DefMT3 or variants thereof severely inhibited the production of the DON (Deoxynivalenol) and 15-ADON (15-Acetyldéoxynivalenol) toxins by Fusarium graminearum. They have shown that the linear peptide forms exhibit more potent inhibitory activity on the production of mycotoxins than the cyclic forms. In addition, the linear forms exhibit fungal growth inhibiting activity which is almost not present for the cyclic forms. It has also been shown that the cationic charge of peptides was an important element for their antifungal activity and inhibitory of TCTBs biosynthesis. Finally, the inventors have shown that the PEGylated forms exhibited improved antifungal activity.
  • the present invention relates to the use of a peptide for inhibiting the production of mycotoxins by fungi of the Fusarium genus on a plant, the peptide comprising a sequence chosen from among
  • It also relates to a method for inhibiting the production of mycotoxins by fungi of the Fusarium genus on a plant comprising bringing the plant into contact with a composition comprising a peptide, the peptide comprising a sequence chosen from among
  • the peptide comprises at most 30 amino acids.
  • the peptide comprises a sequence chosen from the sequences SEQ ID Nos: 22 and 23, consists of a sequence chosen from the sequences SEQ. ID Nos: 22 and 23 with the sequence possibly comprising 1, 2, 3, 4 or 5 substitutions, additions, deletions or mixture thereof, or consists of a sequence chosen from the sequences SEQ ID Nos: 22 and 23.
  • the peptide consists of the sequence SEQ ID NO: 22.
  • the peptide implemented in this use or this method can comprise, consist essentially of or consist of a sequence chosen from among
  • phytosanitary composition intended for the treatment of a plant comprising a peptide, in particular for inhibiting the production of mycotoxins by fungi of the Fusarium genus on the plant, the peptide comprising a sequence chosen from among
  • the peptide of the phytosanitary composition can comprise, consist essentially of or consist of a sequence chosen from
  • the peptide comprises at most 20 amino acids.
  • the peptide is PEGylated.
  • the peptide does not include a disulfide bridge.
  • the mycotoxin is Class B trichothecene, preferably deoxynivalenol (DON) and / or acetylated deoxynivalenol (A-DON).
  • the fungus of the genus Fusarium is chosen from Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium tricinctum, Fusarium avenaceum, Fusarium poae, Fusarium sporotrichioides, Fusarium verticillioides, Fusarium proliferatum , Fusarium langsethiae, Fusarium oxysporum, Fusarium roseum, Fusarium arthrosporioides, and Fusarium avenaceum, preferably Fusarium culmorum or Fusarium graminearum_.
  • the plant is selected from cereals, such as wheat (soft and hard), barley, corn, oats, triticale and rice, or fruits and vegetables such as tomato, melon, cucumber, zucchini, Jerusalem artichoke, chili, potato, asparagus, sweet potato, celery, garlic, onion , cabbage, ginger, banana, cassava, vanilla, and fruit trees such as date palm, preferably cereals chosen from wheat (soft and hard), barley, corn, oats, triticale and rice.
  • cereals such as wheat (soft and hard), barley, corn, oats, triticale and rice.
  • peptide oligopeptide
  • polypeptide refers to a chain of amino acids linked by peptide bonds, regardless of the number of amino acid residues constituting this chain.
  • amino acid refers to the 20 naturally occurring standard amino acid residues (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S and T), with rare natural amino acid residues (for example hydroxyproline, hydroxylysine, allohydroxylysine, 6-N-methylysine, N-ethylglycine, N-methylglycine, N-ethylasparagine, allo-isoleucine, N-methylisoleucine, N-methylvaline, aminobutyric acid) and unnatural amino acids (for example norleucine, norvaline and cyclohexyl-alanine ).
  • this term refers to the 20 naturally occurring standard amino acid residues (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E , D, S and T).
  • substitution refers to the replacement of one amino acid residue with one selected from among 20 naturally occurring standard amino acid residues, rare naturally occurring amino acid residues and amino acid residues. unnatural.
  • substitution refers to the replacement of an amino acid residue by another chosen from among the 20 naturally occurring standard amino acid residues (G, P, A, V, L, I, M, C , F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S and T).
  • the substitution (s) can be conservative or non-conservative substitutions.
  • conservative substitution refers to a substitution of one amino acid residue for another which exhibits similar chemical or physical properties (size, charge or polarity). Examples of conservative substitutions are shown in the following tables.
  • the peptide may comprise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 additional amino acids at the level of the N- and / or C-terminal, preferably 1, 2, 3, 4 or 5 additional amino acids, and / or 1, 2 or 3 additional amino acids.
  • the number of substitutions, additions, deletions or a mixture thereof depends on the length of the sequence.
  • the percentage of substitutions, deletions, additions or a mixture thereof may not exceed 30%, preferably not more than 25%.
  • substitution refers to the exchange of a single amino acid for another in a sequence.
  • the term “deletion” refers to the removal of a single amino acid in a peptide sequence
  • the term “insertion” or “addition” is equivalent and refers to the addition of a single amino acid in a peptide sequence.
  • sequence identity refers to the number (%) of matches (identical amino acid residues) at positions resulting from an alignment of two polypeptide sequences. Sequence identity is determined by comparing the sequences when aligned so as to maximize overlap and identity while minimizing sequence interruptions. In particular, the sequence identity can be determined using any of a number of global or local alignment algorithms, depending on the length of the two sequences. Sequences of similar lengths are preferably aligned using global alignment algorithms (eg Needleman & Wunsch, J. Mol.
  • Biol 48: 443, 1970 which optimally align the sequences along the entire length, while sequences of substantially different lengths are preferably aligned using a local alignment algorithm, for example the Smith and Waterman algorithm (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981) or the AltschuI algorithm. (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; Altschul et al (2005) FEBS J. 272: 5101-5109). Alignment for the purpose of determining the percentage identity of amino acid sequence can be carried out by any method known to those skilled in the art, for example by using software available on Internet sites such as http: // blast.ncbi.nlm.
  • the inventors have identified peptides exhibiting an activity which inhibits the production of mycotoxins, in particular of category B trichothecenes, by a fungus of the genus Fusarium.
  • the inhibitory activity of the production of mycotoxins, in particular of category B trichothecenes can be measured by any technique known to those skilled in the art. For example, it can be measured as described in detail in the examples in the section “Mycotoxin production inhibition test” by measuring the amounts of DON and 15-ADON with the Fusarium graminearum CBS 185.32 strain.
  • a peptide exhibits inhibitory activity on the production of mycotoxins when this production is reduced by 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 or 100% relative to the production in the absence of the peptide.
  • the peptide exhibiting an activity for inhibiting the production of mycotoxin by a fungus of the genus Fusarium comprises, consists essentially of or consists of
  • C / S indicates a cysteine (C) or a serine (S), the cysteine possibly being modified so as to prevent the formation of a disulfide bond;
  • Xi is a small amino acid, for example chosen from G, S, A, V, T, D, N and P, in particular G, S or A, more particularly G or S;
  • X2 is a small amino acid, for example chosen from G, S, A, V, T, D, N and P, in particular G, S, A or N, more particularly still G or N;
  • X 3 is chosen from I, L, F, Y, W, M, R or K, in particular I, L, F or Y, more particularly I or F;
  • X4 is chosen from I, L, F, Y, W, or M, in particular I, L, W or F, more particularly I or L;
  • Xs is chosen from K, R, H, T, S, or Q., in particular K, R, S or T, more particularly still K or T, K, R or T, or K or R;
  • Ce is chosen from R, K, L, I, Q. or T, in particular R, K, Q. or T, more particularly still Q, R or T, K, R or T, or K or R;
  • X7 is chosen from I, L, M, T or S, in particular I, L or T, more particularly I or T;
  • Xs is chosen from V, I, L, Y, F, W or M, in particular V, I, L or Y, more particularly still V or Y;
  • Xg is chosen from R, K, H, T, S, N, M or 3 ⁇ 4 in particular R, K, T or M, more particularly R, K or T, preferably K or R; and Xio is chosen from S, T, Q, K, R, N or H, in particular K, R, N or T, more particularly still K or T, K, R or T, or K or R.
  • the peptide comprising at most 30 amino acids.
  • cysteines when the peptide comprises at least 2 cysteines, these cysteines are in reduced form (SH), that is to say that they do not together form disulfur bridges.
  • the peptide comprises serines when the sequence indicates C / S.
  • the peptide comprises one or more cysteines modified so as to prevent disulfide bonding.
  • the cysteines can be alkylated on the thiol function, in particular methylated (S-CH3), or by carboxyamidomethylation (addition of a CH2-CONH2 group).
  • S-CH3 methylated
  • carboxyamidomethylation addition of a CH2-CONH2 group.
  • all of the cysteines of the peptide or all of the cysteines except one are modified or replaced by cysteines.
  • the peptide can comprise a sequence identity with the peptide of SEQ ID NO: 2 or 3 of at least 50, 60, 70, 80, 90 or 95%.
  • the peptide can comprise 1, 2, 3, 4, or 5 substitutions relative to the peptide of SEQ. ID NO: 2 or 3, in particular at the level of the positions of the residues chosen from Xi, X2, X3, X4, Xs, Cd, X7, Xs, X9, and X10.
  • the peptide comprises, consists essentially of or consists of a sequence
  • the peptide comprises, consists essentially of or consists of a sequence chosen from the group consisting of
  • TickCore3 CGNFLKRTCICVKK SEQ ID NO: 2
  • TickCore6 CSGIIKQTCTCYRK SEQ ID NO: 3
  • TC3K6T CGNFLTRTCICVKK SEQ ID NO: 6
  • TC3R7T CGNFLKTTCICVKK SEQ ID NO: 7
  • TC3K13T CGNFLKRTCICVTK
  • TickCore3 C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO: 2
  • TickCore6 C S G I I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO: 3
  • TC3K6T C G N F L T R T C I C V K K SEQ ID NO: 6
  • TC3R7T C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7
  • TC3K13T C G N F L K R T C I C V T K SEQ ID NO: 8 and TC3K14T: C G N F L K R T C I C V K T SEQ ID NO: 9; or in the group consisting of
  • TickCore3 C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO: 2
  • TickCore6 C S G I I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO: 3 TC3R7T: C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7 TC3K13T: C G N F L K R T SEQ C T C T C Y R K: SEQ ID NO: 3 TC3R7T: C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7 TC3K13T: C G N F L K R T SEQ T C I C V K SEQ ID NO: 7 TC3K13T: C G N F L K R T SEQ T C I C V T K: C C T 8 and SEQ C I C V T: C K 8 and SEQ C N C T14: C K 8
  • the peptide may also comprise, consist essentially of or consist of a sequence selected from the group consisting of
  • the peptide is not or does not comprise the sequence of a peptide chosen from among
  • the peptide molecule can further comprise other peptide sequences, on the N-terminal or C-terminal side.
  • the peptide can comprise, at the N-terminal or C-terminal, a tag (or label) useful for the purification or the immobilization of the peptide.
  • tags are well known to those skilled in the art and include for example the tags histidine (His6), FLAG, HA (epitope derived from the hemagglutinin of the influenza virus), MYC (epitope derived from the human proto-oncoprotein MYC) or GST (glutathione-S-transferase).
  • the peptide can comprise a cleavage site by a protease or a chemical agent making it possible to delete this tag.
  • the peptide is less than 30 amino acids in length, preferably less than 25, 20, 19, 18, 17, 16 or 15 amino acids.
  • the peptide is not cyclic. Thus, it does not contain a covalent interaction between the side chains of two amino acids or between the ends
  • the peptide bond (s) of the peptide can be modified to make them resistant to proteolysis.
  • all peptide bonds can be replaced.
  • the peptide molecule can comprise either a carboxylic (-COO-) or an amidated (-CONH2) C-terminus.
  • the C-terminus can also be esterified.
  • the peptide can also be optionally modified at its N-terminus, for example with an acetyl radical.
  • the peptide can be PEGylated (polyethylene glycol), partly at its N-terminal end.
  • the peptide can include 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 or more PEG groups.
  • the L and D isomers of amino acids are contemplated.
  • the D isomers are not sensitive to proteases and the present invention also comprises molecules comprising D amino acids, in particular molecules comprising only or essentially D amino acids.
  • the L amino acids are preferred.
  • the peptide can comprise only D amino acids and be in a retro-inverted configuration (same sequence but inverted).
  • the present invention relates to a novel peptide exhibiting an activity which inhibits the production of mycotoxin by a fungus of the genus Fusarium.
  • a new peptide according to the present invention is a peptide as defined above but is not an unmodified peptide of sequence
  • a new peptide can be a peptide of sequence SEQ ID NO: 2 or 3 which carries a PEGylation, a C-terminal amidation, an N-terminal acetylation, a modified peptide bond, an amino acid of form D, a modified cysteine or a combination of these modifications.
  • the peptide comprises a sequence chosen from the sequences SEQ ID Nos: 22 and 23, consists of a sequence chosen from the sequences SEQ ID Nos: 22 and 23 with the sequence possibly comprising 1, 2, 3, 4 or 5 substitutions, additions, deletions or mixture thereof, or consists of a sequence chosen from the sequences SEQ ID Nos: 22 and 23.
  • the peptide can consist of the sequence SEQ. ID NO: 22.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising a novel peptide as described in the present application or a mixture thereof, the composition preferably being a phytosanitary composition, in particular for combating a fungus of the genus Fusarium, and more particularly against the production of mycotoxins.
  • the present invention also relates to the use of a peptide as described in the present application or a mixture thereof for inhibiting the production of mycotoxins by fungi of the genus Fusarium on a plant.
  • It finally relates to a method for inhibiting the production of mycotoxins by fungi of the Fusarium genus on a plant comprising bringing the plant into contact with a composition comprising a peptide as described in the present application or a mixture thereof. .
  • the fungus of the Fusarium genus can in particular be chosen from Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium tricinctum, Fusarium avenaceum, Fusarium poae, Fusarium sporotrichioides, Fusarium verticillioides, Fusarium proliferatum, Fusarium langsethiae, Fusarium oxysporum, Fusarium roseum, Fusarium, Fusarium avenacarium, preferably from Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium tricinctum, Fusarium avenaceum, Fusarium poae, Fusarium sporotrichioides, Fusarium verticillioides, Fusarium proliferatum, Fusarium langsethiae and Fusarium oxysporum.
  • the plants concerned by this treatment can be cereals, such as wheat (soft and hard), barley, corn, oats, triticale and rice, but also fruits and vegetables such as tomatoes, melons, cucumber, zucchini, Jerusalem artichoke, chili, potato, asparagus, sweet potato, celery, garlic, onion, cabbage, ginger, banana, cassava, vanilla , and fruit trees like the date palm.
  • cereals such as wheat (soft and hard), barley, corn, oats, triticale and rice, but also fruits and vegetables such as tomatoes, melons, cucumber, zucchini, Jerusalem artichoke, chili, potato, asparagus, sweet potato, celery, garlic, onion, cabbage, ginger, banana, cassava, vanilla , and fruit trees like the date palm.
  • the mycotoxins are in particular category B trichothecenes.
  • DON deoxynivalenol
  • A- DON acetylated deoxynivalenol
  • 3-acetyl-DON 3-acetyl-DON
  • 15-acetyl-DON 15-acetyl-DON
  • the phytosanitary composition or the peptide is applied to the aerial part of the plant. Preferably, it is applied at the time of flowering or before flowering of the plant. Alternatively, she / he is applied at the time of grain formation.
  • the phytosanitary composition or the peptide can be used at a concentration where it has an inhibitory effect on the production of mycotoxins by fungi of the genus Fusarium and has little or no effect on the production of mycotoxins. growth of fungi of the genus Fusarium.
  • the concentration will be chosen so as to obtain an optimal effect on the production of mycotoxins.
  • the concentration of peptides may for example be less than 100 mM, 75 pM, 50 pM, 25 pM or 15 pM.
  • the phytosanitary composition or the peptide can be used at a concentration where it has an effect on the production of mycotoxins by fungi of the genus Fusarium and also has an inhibitory effect on the growth of the fungi of the genus. genus Fusarium.
  • the peptide is preferably a new peptide as defined in the present application.
  • FIG 1 Antifungal and anti-mycotoxin activity of TickCore3, native and oxidized form. After 10 days of incubation in media supplemented or not with TickCore3 (native form) or TickCore30x (oxidized forms), the mycelia of F. graminearum were separated and weighed. The weight values of the mycelium are presented in grams (g) (Figl a). The TCTB-type mycotoxins, DON (Fig lb) and 15-ADON (Fig le), were quantified and expressed in ⁇ g of mycotoxins per ml of medium, then divided by the weight of the mycelium and expressed in ⁇ g of TCTB mycotoxins by g of dry mycelium biomass (pg / g).
  • FIG 2 Antifungal and antimycotoxin activity of linear and cyclic TickCore3 peptides. After 10 days of incubation in media supplemented or not with TickCore3 CH3-1 Ox, TickCore3 CH3-2 Ox, TickCore3 CH3-3 Ox or TickCore3 CH3-123, the mycelia of F. graminearum were separated and weighed. Mycelium weight values are presented in grams (g) (Fig 2a).
  • TCTB-type mycotoxins DON (Fig 2b) and 15-ADON (Fig 2c), were quantified by mg of mycotoxins per ml of medium, then divided by the weight of the mycelium and expressed as pg of TCTB mycotoxins per g of dry mycelium biomass (pg / g).
  • FIG 3 Antifungal and “anti-mycotoxin” activity of Tickcore3, native form or substituted forms in which the basic amino acids (K in position 6, 13 and 14, and R in position 7) have been replaced by T, a uncharged amino acid.
  • TCTB-type mycotoxins DON (Fig 3b) and 15-ADON (Fig 3c), were quantified in ⁇ g of mycotoxins per ml of medium, then divided by the weight of the mycelium and expressed in ⁇ g of TCTB mycotoxins per g of dry mycelium biomass (pg / g). Three different concentrations of peptide (12.5 mM, 25 mM and 50 mM) were tested.
  • FIG 4 Antifungal and antimycotoxin activity of TickCore3 peptide and of a tickCore3-PEG pegylated version. After 10 days of incubation in media supplemented or not with TickCore3 or TickCore3-PEG, the mycelia of F. graminearum were separated by centrifugation and weighed. The weight values of the mycelium are presented in grams (g) (Fig 4a).
  • TCTB-type mycotoxins DON (Fig 4b) and 15-ADON (Fig 4c), were quantified in ⁇ g of mycotoxins per ml of medium, then divided by the weight of the mycelium and expressed in ⁇ g of TCTB mycotoxins per g of dry mycelium biomass (pg / g).
  • FIG 5 Antimycotoxin activity of tick defensin DefMT3. After 10 days of incubation in media supplemented or not with DefMT3, the mycotoxins of type TCTB, DON (Fig 5A) and 15-ADON (Fig 5B), were quantified in pg of mycotoxins per ml of medium, then divided by the weight of the mycelium and expressed in pg of TCTB mycotoxins per g of dry mycelium biomass (pg / g). Two concentrations of DefMT3 were tested, 25 and 50 mM.
  • TickCore3 the conserved linear gamma core motif, with reduced cysteine (Cys) residues, of the tick defensin DefMT3, here called “TickCore3”, inhibits the production of category B trichothecenes (TCTB) by F. graminearum. . Alkylation of all Cys residues of TickCore3 with methyl groups (TickCore3-CH3) had little effect on the inhibitory effect affecting TCTB production. Conversely, the oxidation of all Cys residues of TickCore3 greatly reduced the inhibitory effect on TCTB production. A loss of Major inhibitory function was observed when the specific disulfide bonds Cys4-Cys6 and Cys4-Cys5 were formed. The inventors have also shown that the cationic charge of the peptide is an important factor in its biological activity. Substitution of the positively charged amino acids with a neutral residue led to a sometimes very significant reduction in antifungal activity and inhibition of TCTB production.
  • TickCore3 is a very effective inhibitor of TCTB production by F. graminearum.
  • FIG. 1 shows the results obtained after 10 days of culture of the F. graminearum CBS 185.32 strain in MS medium supplemented with TickCore3 and its oxidized variant (TickCore3 Ox) at three different concentrations (12.5, 25 and 50 mM).
  • the untreated (control) culture media were not supplemented with any of the TickCore3 peptides.
  • TickCore3 Ox had no effect on dry fungal biomass, TickCore3 significantly inhibited fungal growth at all concentrations tested compared to the control condition (Fig. La).
  • TickCore3 may have effects on the inhibition of TCTB production.
  • peptides derived from TickCore3 were synthesized by alkylating each Cys residue individually with a methyl group (CH3), followed by an oxidation protocol which generated peptides with disulfide bridges established between Cys5-Cys6 (TickCore3 CH3-1 Ox), Cys4-Cys6 (TickCore3 CH3-2 Ox) and Cys4- Cys5 (TickCore3 CH3-3 Ox).
  • TickCore3-CH3-1 Ox, TickCore3-CH3-2 Ox and TickCore3-CH3-3 Ox had no effect on fungal growth at any of the concentrations tested, compared to the control (Fig. 2a).
  • the production of mycotoxins by F. graminearum was then measured in the media supplemented with TickCore3-CH3-1 Ox, TickCore3-CH3-2 Ox and TickCore3-CH3-3 Ox at three different concentrations: 12.5, 25 and 50 mM. (figure 2b).
  • the increase in the concentrations of TickCore3-CH3-2 Ox and TickCore3-CH3-3 Ox resulted in a significant increase in the production of DON (Fig. 2b) and 15-ADON (Fig.
  • TickCore3-CH3-2 Ox for which the production of 15-ADON did not change significantly.
  • treatment with 50 mM PickCore3-CH3-1 Ox resulted in a significant reduction in the levels of DON and 15-ADON (Fig. 2bc).
  • the cationic charge is a key element of the antifungal and "anti-mycotoxin" activity of.
  • TickCore 3 The inventors hypothesized that the cationic charge of TickCore 3 was an important element of its biological activity.
  • substituted peptides of TickCore3 were synthesized by substituting the so-called basic amino acids (arginine and lysine, R and K) by an uncharged residue, threonine (T).
  • TickCore3-K6T substitution of lysine in position 6 by a threonine residue
  • TickCore3-R7T substitution of arginine in position 7 by a threonine residue
  • Tickcore3-K13T substitution of lysine at position 13 by a threonine residue
  • TickCore3-K14T substitution of lysine at position 14 by a threonine residue
  • the substituted forms exhibit strong antifungal activity only at 50mM while TickCore3-K6T has no antifungal activity below the concentration at 50mM.
  • the production of mycotoxins by F. graminearum was then measured in media supplemented with TickCore3, TickCore3-K13T, TickCore3-K6T, TickCore3-K14T and TickCore3-R7T at three different concentrations: 12.5, 25 and 50 mM ( Figures 3b and 3c).
  • TickCore3 pegylation increases antifungal activity
  • TickCore3-PEG peptide was synthesized in the same way as TickCore3, except that two PEG units were sequentially attached to the N-terminus of the peptide.
  • TickCore3-PEG at 50 mM showed a greater antifungal effect with a 3.3-fold decrease in fungal growth (Fig 4a).
  • TickCore3-PEG would also exhibit improved inhibitory activity on mycotoxin production (Fig 4bc).
  • Defensin DefMT3 is able to inhibit the production of mycotoxins.
  • the DefMT3 peptide was synthesized in the same way as TickCore3. This peptide exhibits inhibitory activity on the production of DON and 15-ADON mycotoxins (Figs 5a and 5b).
  • TickCore3 TickCore3 (CGNFLKRTCRTCICVKKK, SEQ ID NO: 2) is the conserved gamma core motif of DefMT3 (GenBank accession number: JAA71488; Tonk et al., 2015).
  • the peptide synthesis was commissioned from Pepmic (Suzhou, China) which uses the solid phase peptide synthesis (SPPS) to obtain peptides with a high degree of purity as described previously in Cabezas-Cruz et al., 2016, (Front Microbiol., 7, 1682).
  • SPPS solid phase peptide synthesis
  • peptide synthesis was carried out using a 2-chlorotrityl chloride resin as a solid support, and a labile 9-fluorenyl-methyloxy-carbonyl (Fmoc) base as a protecting group.
  • Peptides purified by reverse phase HPLC were then optionally oxidized using refolding buffer containing 1 M urea, 100 mM Tris (pH 8.0), 1.5 mM oxidized glutathione, 0.75 mM reduced glutathione and 10 mM methionine.
  • Oxidation of Cys residues has been confirmed by Ellman's reaction and the formation of disulfide bonds was characterized by electrospray mass spectroscopy (ESI-MS) using an LCMS-2020 mass spectrometer (Shimadzu, Kyoto, Kyoto Prefecture, Japan).
  • the composition of the sequence was also verified by ESI-MS using an LCMS-2020 mass spectrometer (Shimadzu, Kyoto, Kyoto Prefecture, Japan).
  • the Peptides TickCore3-CH3-123 (C (CH3) GNFLKRTC (CH3) IC (CH3) VKK), TickCore3-CH3-l (C (CH3) GNFLKRTCRICVKK), TickCore3-CH3-2 (CGNFLKRTC (CH3) ICVKK) and TickCore3 -CH3-3 (CGNFLKRTCIC (CH3) VKK) were synthesized as described previously, with the difference that Fmoc-Cys (Me) -OH was added to replace Fmoc-Cys (Trt) -OH. Alkylation of the sulfur (S) thiol groups of all Cys residues prevents cyclization of these residues (i.e.
  • TickCore3-PEG peptide was synthesized as TickCore3 but two PEG units were sequentially attached to the N terminal end of the peptide using protected groups Fmoc-NH-PEG2-CH2CH2COOH.
  • the DefMT3 peptide exhibiting the sequence GGYYCPFRQDKCHRHCRSFGRKAGYCGNFLKRTCICVKK (SEQ. I D NO: 22) was synthesized according to a protocol identical to that of TickCore3 by the company Pepmic (Suzhou, China).
  • the F. graminearum CBS 185.32 strain which produces DON and 15-ADON was used throughout this study.
  • the fungal culture was maintained at 4 ° C. on dextrosed potato agars (PDA) (Difco, Le Ponts de Claix, France) in inclined tubes, under mineral oil.
  • PDA dextrosed potato agars
  • the strain was grown at 25 ° C in the dark on tilted PDA agars for 7 days and the spore suspension was prepared by adding 6 mL of sterile distilled water to the PDA agar. tilted with a gentle agitation.
  • TCTBs were quantified by HPLC-DAD using an Agilent Technologies 1100 Series Liquid Chromatograph equipped with an automatic sampling system, an Agilent Diode Array Detector (DAD) and software. management of ChemStation chromatography (Agilent, France).

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Abstract

La présente invention est relative à des peptides permettant d'inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genre Fusarium ainsi qu'à des compositions les comprenant et des méthodes les mettant en œuvre.

Description

METHODES POUR INHIBER LA PRODUCTION DE MYCOTOXINES PAR FUSARIUM DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention est relative au domaine phytosanitaire. En particulier, elle est relative à des moyens de lutte contre les champignons du genre Fusarium, notamment le biocontrôle ou contrôle phytosanitaire des contaminations par les mycotoxines de type trichothécène de catégorie B produites lors de fusarioses.
INTRODUCTION
Fusarium graminearum est un agent causal majeur de la fusariose du blé et de la fusariose du maïs. Ces deux maladies fongiques ont un impact économique important dans de nombreuses régions productrices de céréales dans le monde. De plus, F. graminearum peut produire des mycotoxines, principalement des trichothécènes de catégorie B ou TCTBs (dont les représentants majeurs sont le déoxynivalenol/DON et ses formes acétylées 15 et 3 acétyldéoxynivalénol/15 et 3-ADON), toxiques pour l'homme et les animaux. En effet, ces toxines ont une toxicité aiguë avérée à l'origine de graves intoxications alimentaires parfois mortelles et une toxicité chronique très fortement suspectée (hématotoxicité et immunotoxicité). En tant que molécules thermostables, les TCTBs, accumulés dans les grains récoltés, ne sont pas totalement éliminés lors de la fabrication de denrées alimentaires et d'aliments pour animaux à base de céréales. Les pratiques agronomiques recommandées pour limiter la contamination des récoltes ne permettent pas de garantir leur conformité vis-à-vis des seuils réglementaires fixés par l'UE (N° 1126/2007). Il est donc urgent de mettre en place de nouvelles stratégies de lutte en pré-récolte pour limiter l'accumulation de TCTBs dans les grains, durables et respectueuses de l'environnement.
Les défensines sont des peptides cycliques de bas poids moléculaire présentant un motif conservé appelé gamma-core, important pour leur activité antimicrobienne. Parmi ces défensines, des défensines de tique appelées DefMT3 et DefMT6 ont été décrites comme ayant une activité antibactérienne et antifongique, notamment vis-à-vis de Fusarium culmorum et Fusarium graminearum (Tonk et al, 2015, Developmental and Comparative Immunology, 53, 358- 365). Dans cet article, les auteurs ont étudié l'activité de peptides présentant uniquement le motif de base gamma de DefMT3 ou DefMT6 et ont observé que ces motifs présentaient une activité antifongique augmentée par rapport à la défensine entière, en particulier sur la germination des spores et la croissance. Cibler uniquement la croissance de l'espèce fongique ne garantit pas forcément des niveaux moindres de mycotoxines. En effet, le stress perçu par le champignon peut être un facteur de stimulation de la production de toxines. Ainsi, il est essentiel de disposer de moyens de lutte spécifiquement dirigés contre la production de TCTBs.
Il existe donc toujours un besoin pour un moyen de lutter spécifiquement contre la production des mycotoxines de type trichothécène de catégorie B produites lors de fusarioses.
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention décrit une méthode permettant de diminuer la production de mycotoxines par les champignons du genre Fusarium, en particulier les trichothécènes de catégorie B (TCTB).
En effet, les inventeurs ont identifié la capacité de certains peptides à inhiber la production de ces mycotoxines. Ils ont observé que le peptide DefMT3 mais aussi un peptide portant le motif conservé gamma de DefMT3 ou des variants de celui-ci inhibent sévèrement la production des toxines DON (Déoxynivalénol) et 15-ADON (15-Acétyldéoxynivalénol) par Fusarium graminearum. Ils ont montré que les formes peptidiques linéaires présentent une activité inhibitrice de la production de mycotoxines plus puissantes que les formes cycliques. En outre, les formes linéaires présentent une activité d'inhibition de la croissance fongique qui n'est presque pas présente pour les formes cycliques. Il a aussi été montré que la charge cationique des peptides était un élément important pour leur activité antifongique et inhibitrice de la biosynthèse de TCTBs. Enfin, les inventeurs ont montré que les formes PEGylées présentaient une activité antifongique améliorée.
Ainsi, la présente invention est relative à l'utilisation d'un peptide pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genre Fusarium sur une plante, le peptide comprenant une séquence choisie parmi
C/S - G/S - N/G - F/R/I - L/W/I - K/T - R/L/Q/T - T - C/S - I/T - C/S
- V/I/Y - K/M/R/T - K/N/T SEQ ID NO: 18
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/T - R/Q/T - T - C/S - I/T - C/S - V/Y
- K/R/T - K/T SEQ ID NO: 19
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/T - R/T - T - C/S - I/T - C/S - V/Y - K/T - K/T SEQ ID NO: 20, et C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/R - R/K - T - C/S - I/T - C/S - V/Y - K/R - K/R SEQ ID NO: 21.
Elle est également relative à une méthode pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genre Fusarium sur une plante comprenant la mise en contact de la plante avec une composition comprenant un peptide, le peptide comprenant une séquence choisie parmi
C/S - G/S - N/G - F/R/I - L/W/I - K/T - R/L/Q/T - T - C/S - I/T - C/S
- V/I/Y - K/M/R/T - K/N/T SEQ ID NO: 18
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/T - R/Q/T - T - C/S - I/T - C/S - V/Y
- K/R/T - K/T SEQ ID NO: 19
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/T - R/T - T - C/S - I/T - C/S - V/Y - K/T - K/T SEQ ID NO: 20, et
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/R - R/K - T - C/S - I/T - C/S - V/Y - K/R - K/R SEQ ID NO: 21.
Dans un aspect particulier, le peptide comprend au plus 30 acides aminés.
Dans un aspect particulier, le peptide comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID Nos : 22 et 23, consiste en une séquence choisie parmi les séquences SEQ. ID Nos : 22 et 23 avec la séquence pouvant comprendre 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, additions, délétions ou mélange de celles-ci, ou consiste en une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID Nos : 22 et 23. Dans un aspect encore plus particulier, le peptide consiste en la séquence SEQ ID NO : 22. Le peptide mis en œuvre dans cette utilisation ou cette méthode peut comprendre, consister essentiellement en ou consister en une séquence choisie parmi
C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO 2 C S G I I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO 3 C G N F L T R T C I C V K K SEQ ID NO 6 C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO 7 C G N F L K R T C I C V T K SEQ ID NO 8 C G N F L K R T C I C V K T SEQ ID NO 9 C G N F L T T T C I C V T T SEQ ID NO 10. S G N F L K R T S I S V K K SEQ ID NO 11 S S G I I K Q T S T S Y R K SEQ ID NO 12 S G N F L T R T S I S V K K SEQ ID NO 13 S G N F L K T T S I S V K K SEQ ID NO 14 S G N F L K R T S I S V T K SEQ ID NO 15 S G N F L T T T S I S V T T SEQ ID NO : 17.
Elle est en outre relative à une composition phytosanitaire destinée au traitement d'une plante comprenant un peptide, notamment pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genre Fusarium sur la plante, le peptide comprenant une séquence choisie parmi
C/S - G/S - N/G - F/R/I - L/W/I - K/T - R/L/Q/T - T - C/S - I/T - C/S
- V/I/Y - K/M/R/T - K/N/T SEQ ID NO: 18
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/T - R/Q/T - T - C/S - I/T - C/S - V/Y
- K/R/T - K/T SEQ ID NO: 19
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/T - R/T - T - C/S - I/T - C/S - V/Y - K/T - K/T SEQ ID NO: 20, et
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/R - R/K - T - C/S - I/T - C/S - V/Y - K/R - K/R SEQ ID NO: 21, le peptide comprenant au plus 30 acides aminés et le peptide n'étant pas un peptide non-modifié de séquence CGNFLKRTCICVKK SEQ ID NO : 2 ou CSGIIKQTCTCYRK SEQ ID NO : 3.
Le peptide de la composition phytosanitaire peut comprendre, consister essentiellement en ou consister en une séquence choisie parmi
C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO: 2, le peptide portant une PEGylation, une amidation en C-terminal, une acétylation en N-terminale, une liaison peptidique modifiée, un acide aminé de forme D, une cystéine modifiée ou une combinaison de ces modifications ; C S G I I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO: 3, le peptide portant une PEGylation, une amidation en C-terminal, une acétylation en N-terminale, une liaison peptidique modifiée, un acide aminé de forme D, une cystéine modifiée ou une combinaison de ces modifications ; C G N F L T R T C I C V K K SEQ ID NO: 6
C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7
C G N F L K R T C I C V T K SEQ ID NO: 8
C G N F L K R T C I C V K T SEQ ID NO: 9
C G N F L T T T C I C V T T SEQ ID NO: 10.
S G N F L K R T S I S V K K SEQ ID NO: 11 S G N F L T R T S I S V K K SEQ ID NO : 13
S G N F L K T T S I S V K K SEQ ID NO : 14
S G N F L K R T S I S V T K SEQ ID NO : 15
S G N F L K R T S I S V K T SEQ ID NO : 16 et
S G N F L T T T S I S V T T SEQ ID NO : 17.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'utilisation, de la méthode ou de la composition, le peptide comprend au plus 20 acides aminés.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'utilisation, de la méthode ou de la composition, le peptide est PEGylé.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'utilisation, de la méthode ou de la composition, le peptide ne comprend pas de pont disulfure.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'utilisation, de la méthode ou de la composition, la mycotoxine est une trichothécène de catégorie B, de préférence déoxynivalénol (DON) et/ou déoxynivalénol acétylé (A-DON).
Dans des modes de réalisation particuliers de l'utilisation, de la méthode ou de la composition, le champignon du genre Fusarium est choisi parmi Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium tricinctum, Fusarium avenaceum, Fusarium poae, Fusarium sporotrichioides, Fusarium verticillioides, Fusarium proliferatum, Fusarium langsethiae, Fusarium oxysporum, Fusarium roseum, Fusarium arthrosporioides, et Fusarium avenaceum, de préférence Fusarium culmorum ou Fusarium graminearum_.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'utilisation, de la méthode ou de la composition, la plante est sélectionnée parmi des céréales, comme le blé (tendre et dur), l'orge, le maïs, l'avoine, le triticale et le riz, ou des fruits et légumes comme la tomate, le melon, le concombre, la courgette, le topinambour, le piment, la pomme de terre, l'asperge, la patate douce, le céleri, l'ail, l'oignon, le chou, le gingembre, la banane, le manioc, la vanille, et des arbres fruitiers comme le palmier dattier, de préférence des céréales choisis parmi le blé (tendre et dur), l'orge, le maïs, l'avoine, le triticale et le riz. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Définitions
Dans le présent document, les termes « peptide », « oligopeptide », et « polypeptide » sont utilisés indifféremment et se réfèrent à une chaîne d'acides aminés reliés par des liaisons peptidiques, quel que soit le nombre de résidus d'acide aminé constituant cette chaîne.
Les séquences peptidiques définies dans le présent document sont représentées avec le symbole en une lettre tel qu'indiqué dans le tableau 1.
[Tableau 1]
Figure imgf000007_0001
Tel qu'utilisé ici, le terme « acide aminé » se réfère aux 20 résidus d'acides aminés standard naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T), aux résidus d'acides aminés naturels rares (par exemple l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 6-N- méthylysine, la N-éthylglycine, la N-méthylglycine, la N-éthylasparagine, l'allo-isoleucine, la N- méthylisoleucine, la N-méthylvaline, l'acide aminobutyrique) et aux acides aminés non naturels (par exemple la norleucine, la norvaline et la cyclohexyl-alanine). De préférence, ce terme se réfère aux 20 résidus d'acides aminés standard naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T).
Le terme « substitution », tel qu'utilisé ici désigne le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standard naturels, les résidus d'acides aminés naturels rares et d'acides aminés non naturels. De préférence, le terme « substitution » se réfère au remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standards naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T). La ou les substitutions peuvent être des substitutions conservatives ou non conservatives. Le terme « substitution conservative » tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à une substitution d'un résidu d'acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité). Des exemples de substitutions conservatives sont présentés dans les tableaux suivants.
[Tableau 2]
Figure imgf000008_0001
[Tableau 3]
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000009_0001
[Tableau 4]
Figure imgf000009_0002
«Consiste en» une séquence particulière, sauf indication contraire ou clairement contredite par le contexte, doit être compris comme décrivant un peptide consistant en cette séquence. Par « consiste essentiellement en », on entend que le peptide consiste en cette séquence, mais il peut également comprendre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substitutions, additions, délétions ou un mélange de celles-ci, de préférence 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, additions, délétions ou un mélange de celles-ci, et en particulier 1, 2 ou 3 substitutions, additions, délétions ou un mélange de celles-ci. En particulier, par « essentiellement consistant en », on peut envisager que le peptide puisse comprendre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 acides aminés supplémentaires au niveau de l'extrémité N- et / ou C-terminale, de préférence 1, 2, 3, 4 ou 5 acides aminés supplémentaires, et / ou 1, 2 ou 3 acides aminés supplémentaires. De préférence, le nombre de substitutions, d'additions, de délétions ou d'un mélange de celles-ci dépend de la longueur de la séquence. Par exemple, le pourcentage de substitutions, de délétions, d'additions ou d'un mélange de celles-ci peut ne pas dépasser 30%, de préférence pas plus de 25%. Tel qu'utilisé ici, le terme "substitution" se réfère à l'échange d'un seul acide aminé par un autre dans une séquence peptidique ; le terme "délétion" se réfère à l'élimination d'un seul acide aminé dans une séquence peptidique ; le terme "insertion" ou "addition" est équivalent et se réfère à l'addition d'un seul acide aminé dans une séquence peptidique.
Tel qu'utilisé ici, le terme "identité de séquence" ou "identité" se réfère au nombre (%) d'appariements (résidus d'acides aminés identiques) aux positions provenant d'un alignement de deux séquences polypeptidiques. L'identité de séquence est déterminée en comparant les séquences lorsqu'elles sont alignées de manière à maximiser le chevauchement et l'identité tout en minimisant les interruptions de séquence. En particulier, l'identité de séquence peut être déterminée en utilisant l'un quelconque des nombreux algorithmes d'alignement global ou local, en fonction de la longueur des deux séquences. Des séquences de longueurs similaires sont de préférence alignées en utilisant des algorithmes d'alignement global (e.g. Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970) qui alignent les séquences de manière optimale sur toute la longueur, tandis que des séquences de longueurs sensiblement différentes sont de préférence alignées en utilisant un algorithme d'alignement local, par exemple l'algorithme de Smith et Waterman (Smith et Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981) ou l'algorithme d'AltschuI (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 ; Altschul et al (2005) FEBS J. 272:5101-5109). L'alignement dans le but de déterminer le pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés peut être réalisé par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple en utilisant un logiciel disponible sur des sites Internet tels que http: //blast.ncbi.nlm. nih.gov / ou http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/. L'homme de l'art peut aisément déterminer les paramètres appropriés pour mesurer l'alignement. Aux fins de la présente invention, les valeurs de pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés désignent des valeurs générées en utilisant le programme EMBOSS Needle d'alignement de séquences par paires qui crée un alignement global optimal de deux séquences en utilisant l'algorithme de Needleman-Wunsch dans lequel les paramètres sont les paramètres par défaut : Scoring matrix = BLOSUM62, Gap open = 10, Gap extend = 0.5, End gap penalty = false, End gap open = 10 and End gap extend = 0.5.
Peptides
Les inventeurs ont identifié des peptides présentant une activité inhibitrice de la production de mycotoxines, en particulier de trichothécènes de catégorie B, par un champignon du genre Fusarium. L'activité inhibitrice de la production de mycotoxines, en particulier de trichothécènes de catégorie B, peut être mesurée par toute technique connue de l'homme du métier. Par exemple, elle peut être mesurée comme décrit en détail dans les exemples dans la section « Test d'inhibition de la production de mycotoxines » en mesurant les quantités de DON et 15-ADON avec la souche Fusarium graminearum CBS 185.32.
Un peptide présente une activité inhibitrice de la production de mycotoxines lorsque cette production est diminuée de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 % par rapport à la production en absence du peptide.
Le peptide présentant une activité inhibitrice de la production de mycotoxine par un champignon du genre Fusarium comprend, consiste essentiellement en ou consiste en
C/S - Xi - X2 - X3 - X4 - Xs - Xe - T - C/S - X7 - C/S - X8 - X9 - X10 SEQ ID NO : 1 dans laquelle
C/S indique une cystéine (C) ou une sérine (S), la cystéine pouvant éventuellement être modifiée de sorte à empêcher la formation de pont disulfure;
Xi est un petit acide aminé, par exemple choisi parmi G, S, A, V, T, D, N et P, en particulier G, S ou A, plus particulièrement encore G ou S ;
X2 est un petit acide aminé, par exemple choisi parmi G, S, A, V, T, D, N et P, en particulier G, S, A ou N, plus particulièrement encore G ou N ; X3 est choisi parmi I, L, F, Y, W, M, R ou K, en particulier I, L, F ou Y, plus particulièrement encore I ou F ;
X4 est choisi parmi I, L, F, Y, W, ou M, en particulier I, L, W ou F, plus particulièrement encore I ou L ;
Xs est choisi parmi K, R, H, T, S, ou Q., en particulier K, R, S ou T, plus particulièrement encore K ou T, K, R ou T, ou K ou R ;
Ce est choisi parmi R, K, L, I, Q. ou T, en particulier R, K, Q. ou T, plus particulièrement encore Q, R ou T, K, R ou T, ou K ou R;
X7 est choisi parmi I, L, M, T ou S, en particulier I, L ou T, plus particulièrement encore I ou T ; Xs est choisi parmi V, I, L, Y, F, W ou M, en particulier V, I, L ou Y, plus particulièrement encore V ou Y ;
Xg est choisi parmi R, K, H, T, S, N, M ou ¾ en particulier R, K, T ou M, plus particulièrement encore R, K ou T, de préférence K ou R ; et Xio est choisi parmi S, T, Q, K, R, N ou H, en particulier K, R, N ou T, plus particulièrement encore K ou T, K, R ou T, ou K ou R.
Dans un mode de réalisation particulier, le peptide comprenant au plus 30 acides aminés.
Dans un mode de réalisation préféré, lorsque le peptide comprend au moins 2 cystéines, ces cystéines sont sous forme réduite (SH), c'est-à-dire qu'elles ne forment pas ensemble de ponts disuflures.
Dans un autre aspect, le peptide comprend des sérines lorsque la séquence indique C/S.
Dans un autre aspect, le peptide comprend une ou plusieurs cystéines modifiées de sorte à empêcher la formation de pont disulfure. En particulier, les cystéines peuvent être alkylés sur la fonction thiol, en particulier méthylés (S-CH3), ou par carboxyamidométhylation (ajout d'un groupement CH2-CONH2). Dans un mode de réalisation particulier, toutes les cystéines du peptide ou toutes les cystéines sauf une sont modifiées ou remplacées par des cystéines.
Le peptide peut comprendre une identité de séquence avec le peptide de SEQ ID NO : 2 ou 3 d'au moins 50, 60, 70, 80, 90 ou 95%. Ainsi, le peptide peut comprendre 1, 2, 3, 4, ou 5 substitutions par rapport au peptide de SEQ. ID NO : 2 ou 3, notamment au niveau des positions des résidus choisis parmi Xi, X2, X3, X4, Xs, Cd, X7, Xs, X9, et X10.
Dans un mode de réalisation particulier, le peptide comprend, consiste essentiellement en ou consiste en une séquence
C/S - G/S - N/G - F/R/I - L/W/I - K/T - R/L/Q/T - T - C/S - I/T - C/S
- V/I/Y - K/M/R/T - K/N/T SEQ ID NO: 18 ou
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/T - R/Q/T - T - C/S - I/T - C/S - V/Y
- K/R/T - K/T SEQ ID NO: 19 ou C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/T - R/T - T - C/S - I/T - C/S - V/Y - K/T - K/T SEQ ID NO: 20
OU
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/R - R/K - T - C/S - I/T - C/S - V/Y - K/R - K/R SEQ ID NO: 21.
Dans un mode de réalisation très particulier, le peptide comprend, consiste essentiellement en ou consiste en une séquence choisie dans le groupe consistant en
TickCore3: C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO: 2 TickCore6: C S G I I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO: 3 TC3K6T: C G N F L T R T C I C V K K SEQ ID NO: 6 TC3R7T: C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7 TC3K13T: C G N F L K R T C I C V T K SEQ ID NO: 8 TC3K14T: C G N F L K R T C I C V K T SEQ ID NO: 9 et TC3KRKKT: C G N F L T T T C I C V T T SEQ ID NO: 10 ; de préférence choisie dans le groupe consistant en
TickCore3: C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO: 2 TickCore6: C S G I I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO: 3 TC3K6T: C G N F L T R T C I C V K K SEQ ID NO: 6 TC3R7T: C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7 TC3K13T: C G N F L K R T C I C V T K SEQ ID NO: 8 et TC3K14T: C G N F L K R T C I C V K T SEQ ID NO: 9; ou dans le groupe consistant en
TickCore3: C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO: 2 TickCore6: C S G I I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO: 3 TC3R7T: C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7 TC3K13T: C G N F L K R T C I C V T K SEQ ID NO: 8 et TC3K14T: C G N F L K R T C I C V K T SEQ ID NO: 9.
Facultativement, le peptide peut également comprendre, consister essentiellement en ou consister en une séquence choisie dans le groupe consistant en
S G N F L K R T S I S V K K SEQ ID NO: 11 S G N F L T R T S I S V K K SEQ ID NO : 13
S G N F L K T T S I S V K K SEQ ID NO : 14
S G N F L K R T S I S V T K SEQ ID NO : 15
S G N F L K R T S I S V K T SEQ ID NO : 16 et S G N F L T T T S I S V T T SEQ ID NO : 17; de préférence choisie dans le groupe consistant en
S G N F L K R T S I S V K K SEQ ID NO: 11
S S G I I K Q T S T S Y R K SEQ ID NO: 12
S G N F L K T T S I S V K K SEQ ID NO: 14
S G N F L K R T S I S V T K SEQ ID NO: 15 et
S G N F L K R T S I S V K T SEQ ID NO: 16.
Dans un aspect très particulier, le peptide n'est pas ou ne comprend pas la séquence d'un peptide choisi parmi
CGGRWKLTCICVRG SEQ ID NO : 4 CNGPFNIVCSCY SEQ ID NO : 5
Facultativement, la molécule peptidique peut comprendre en outre d'autres séquences peptidiques, du côté N-terminal ou C-terminal. Par exemple, le peptide peut comprendre, en N- terminal ou C-terminal, un tag (ou étiquette) utile pour la purification ou l'immobilisation du peptide. De tels tags sont bien connus de l'homme du métier et incluent par exemple les tags histidine (His6), FLAG, HA (épitope dérivé de l'hémagglutinine du virus de la grippe), MYC (épitope dérivé de la proto-oncoprotéine humaine MYC) ou GST (glutathion-S-transférase). Optionnellement, le peptide peut comprendre un site de clivage par une protéase ou un agent chimique permettant de supprimer ce tag.
Dans un mode de réalisation préféré, le peptide a une longueur inférieure à 30 acides aminés, de préférence inférieure à 25, 20, 19, 18, 17, 16 ou 15 acides aminés.
Dans un mode de réalisation préféré, le peptide n'est pas cyclique. Ainsi, il ne contient pas d'interaction covalente entre les chaînes latérales de deux acides aminés ou entre les extrémités
N-terminale et C-terminale. Les ou des liaisons peptidiques du peptide peuvent être modifiées pour les rendre résistantes à la protéolyse. Par exemple, au moins une liaison peptidique (-CO-NH-) peut être remplacée par une liaison divalente choisie parmi (-CH2-NH-), (-NH-CO-), (-CH2-0-), (-CH2-S-), (-CH2-CH2-), (- CO-CH2-), (-CHOH-CH2-), (-N=N-), et (-CH=CH-). Facultativement, toutes les liaisons peptidiques peuvent être remplacées.
La molécule peptidique peut comprendre soit une extrémité C terminale carboxylique (-COO-) ou amidée (-CONH2). L'extrémité C-terminale peut également être estérifiée. Le peptide peut également être facultativement modifié à son extrémité N-terminale, par exemple par un radical acétyle. Dans un mode de réalisation particulier, le peptide peut être PEGylé (polyéthylène glycol), en partie à son extrémité N-terminale. Par exemple, le peptide peut comprendre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou plus groupes PEG.
Les isomères L et D des acides aminés sont envisagés. En effet, les isomères D ne sont pas sensibles aux protéases et la présente invention comprend également des molécules comprenant des acides aminés D, notamment des molécules comprenant uniquement ou essentiellement des acides aminés D. Dans un mode particulier, les acides aminés Lsont préférés. Dans un autre mode particulier, le peptide peut comprendre uniquement des acides aminés D et être en configuration rétro-inversée (même séquence mais inversée).
Dans un aspect particulier, la présente invention est relative à un nouveau peptide présentant une activité inhibitrice de la production de mycotoxine par un champignon du genre Fusarium. Notamment, un nouveau peptide selon la présente invention est un peptide tel que défini ci- dessus mais n'est pas un peptide non-modifié de séquence
CGNFLKRTCICVKK SEQ ID NO : 2 ou
CSGIIKQTCTCYRK SEQ ID NO : 3.
Ainsi, un nouveau peptide peut être un peptide de séquence SEQ ID NO : 2 ou 3 qui porte une PEGylation, une amidation en C-terminal, une acétylation en N-terminale, une liaison peptidique modifiée, un acide aminé de forme D, une cystéine modifiée ou une combinaison de ces modifications.
Dans un mode de réalisation particulier, le peptide comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID Nos : 22 et 23, consiste en une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID Nos : 22 et 23 avec la séquence pouvant comprendre 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, additions, délétions ou mélange de celles-ci, ou consiste en une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID Nos : 22 et 23. Notamment, le peptide peut consister en la séquence SEQ. ID NO : 22.
Compositions et Utilisations
La présente invention est relative à une composition comprenant un nouveau peptide tel que décrit dans la présente demande ou un mélange de ceux-ci, la composition étant de préférence une composition phytosanitaire, notamment pour lutter contre un champignon du genre Fusarium, et plus particulièrement contre la production de mycotoxines.
La présente invention est également relative à l'utilisation d'un peptide tel que décrit dans la présente demande ou un mélange de ceux-ci pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genre Fusarium sur une plante.
Elle est enfin relative à une méthode pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genre Fusarium sur une plante comprenant la mise en contact de la plante avec une composition comprenant un peptide tel que décrit dans la présente demande ou un mélange de ceux-ci.
Le champignon du genre Fusarium peut notamment être choisi parmi Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium tricinctum, Fusarium avenaceum, Fusarium poae, Fusarium sporotrichioides, Fusarium verticillioides, Fusarium proliferatum, Fusarium langsethiae, Fusarium oxysporum, Fusarium roseum, Fusarium arthrosporioides, et Fusarium avenaceum, de préférence parmi Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium tricinctum, Fusarium avenaceum, Fusarium poae, Fusarium sporotrichioides, Fusarium verticillioides, Fusarium proliferatum, Fusarium langsethiae et Fusarium oxysporum. Dans un aspect particulier, le champignon est Fusarium culmorum ou Fusarium graminearum_.
Les plantes concernées par ce traitement peuvent être des céréales, comme le blé (tendre et dur), l'orge, le maïs, l'avoine, le triticale et le riz, mais également des fruits et légumes comme la tomate, le melon, le concombre, la courgette, le topinambour, le piment, la pomme de terre, l'asperge, la patate douce, le céleri, l'ail, l'oignon, le chou, le gingembre, la banane, le manioc, la vanille, et des arbres fruitiers comme le palmier dattier.
Les mycotoxines sont en particulier les trichothécènes de catégorie B. Notamment, parmi les trichothécènes de catégorie B, on trouve le déoxynivalénol (DON), le déoxynivalénol acétylé (A- DON) dont le type 3-acétyl-DON (3-ADON) et 15-acétyl-DON (15-ADON), la nivalénol et la fusarénone X.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition phytosanitaire ou le peptide est appliqué sur la partie aérienne de la plante. De préférence, elle/il est appliqué au moment de la floraison ou avant la floraison de la plante. Alternativement, elle/il est appliqué au moment de la formation du grain.
Dans un aspect particulier, la composition phytosanitaire ou le peptide peut être mis en œuvre à une concentration où elle/il a un effet inhibiteur sur la production de mycotoxines par des champignons du genre Fusarium et n'a pas ou peu d'effet sur la croissance des champignons du genre Fusarium. En effet, la concentration sera choisie de manière à obtenir un effet optimal sur la production de mycotoxines. Ainsi, la concentration de peptides peut par exemple être inférieure à 100 mM, 75 pM, 50 pM, 25pM ou 15 pM.
Dans un autre aspect particulier, la composition phytosanitaire ou le peptide peut être mis en œuvre à une concentration où elle/il a un effet sur la production de mycotoxines par des champignons du genre Fusarium et a également un effet inhibiteur sur la croissance des champignons du genre Fusarium. Dans ce contexte, le peptide est de préférence un nouveau peptide tel que défini dans la présente demande.
FIGURES
[Fig 1] : Activité antifongique et anti-mycotoxine de TickCore3, forme native et oxydée. Après 10 jours d'incubation dans des milieux supplémentés ou non en TickCore3 (forme native) ou TickCore30x (formes oxydées), les mycelia de F. graminearum ont été séparés et pesés. Les valeurs pondérales du mycélium sont présentées en grammes (g) (Figl a). Les mycotoxines de type TCTB, DON (Fig lb) et 15-ADON (Fig le), ont été quantifiées et exprimées en pg de mycotoxines par ml de milieu, puis divisées par le poids du mycélium et exprimées en pg de mycotoxines de TCTB par g de biomasse sèche de mycélium (pg / g).
[Fig 2] : Activité antifongique et antimycotoxine de peptides TickCore3 linéaires et cycliques. Après 10 jours d'incubation dans des milieux supplémentés ou non en TickCore3 CH3-1 Ox, TickCore3 CH3-2 Ox, TickCore3 CH3-3 Ox ou TickCore3 CH3-123, les mycelia de F. graminearum ont été séparés et pesés. Les valeurs pondérales du mycélium sont présentées en grammes (g) (Fig 2a). Les mycotoxines de type TCTB, DON (Fig 2b) et 15-ADON (Fig 2c), ont été quantifiées en mg de mycotoxines par ml de milieu, puis divisées par le poids du mycélium et exprimées en pg de mycotoxines de TCTB par g de biomasse sèche de mycélium (pg / g).
[Fig 3] : Activité antifongique et « anti-mycotoxine » de Tickcore3, forme native ou formes substituées dans lesquelles les acides aminés basiques (K en position 6, 13 et 14, et R en position 7) ont été remplacés par T, un acide aminé non chargé. Après 10 jours d'incubation dans des milieux supplémentés ou non en TickCore3, TickCore3-K6T, TickCore3-R7T, TickCore3-K13T, et TickCore3-K14T, les mycelia de F. graminearum ont été séparés et pesés. Les valeurs pondérales du mycélium sont présentées en grammes (g) (Fig 3a). Les mycotoxines de type TCTB, DON (Fig 3b) et 15-ADON (Fig 3c), ont été quantifiées en pg de mycotoxines par ml de milieu, puis divisées par le poids du mycélium et exprimées en pg de mycotoxines de TCTB par g de biomasse sèche de mycélium (pg / g). Trois concentrations différentes de peptide (12.5 mM, 25 mM and 50 mM) ont été testées.
[Fig 4] : Activité antifongique et antimycotoxine de peptide TickCore3 et d'une version pégylée TickCore3-PEG. Après 10 jours d'incubation dans des milieux supplémentés ou non en TickCore3 ou TickCore3-PEG, les mycelia de F. graminearum ont été séparés par centrifugation et pesés. Les valeurs pondérales du mycélium sont présentées en grammes (g) (Fig 4a). Les mycotoxines de type TCTB, DON (Fig 4b) et 15-ADON (Fig 4c), ont été quantifiées en pg de mycotoxines par ml de milieu, puis divisées par le poids du mycélium et exprimées en pg de mycotoxines de TCTB par g de biomasse sèche de mycélium (pg / g).
[Fig 5] : Activité antimycotoxine de la défensine de tique DefMT3. Après 10 jours d'incubation dans des milieux supplémentés ou non en DefMT3, les mycotoxines de type TCTB, DON (Fig 5A) et 15-ADON (Fig 5B), ont été quantifiées en pg de mycotoxines par ml de milieu, puis divisées par le poids du mycélium et exprimées en pg de mycotoxines de TCTB par g de biomasse sèche de mycélium (pg / g). Deux concentration de DefMT3 ont été testées, 25 et 50 mM.
EXEMPLES
Les inventeurs ont montré que le motif conservé gamma core linéaire, avec des résidus de cystéine (Cys) réduits, de la défensine de tique DefMT3, ici nommée « TickCore3 », inhibe la production de trichothécènes de catégorie B (TCTB) par F. graminearum. L'alkylation de tous les résidus Cys de TickCore3 avec des groupes méthyles (TickCore3-CH3) a eu peu d'effet sur l'effet inhibiteur affectant la production des TCTB. Inversement, l'oxydation de tous les résidus Cys de TickCore3 a fortement diminué l'effet inhibiteur sur la production des TCTB. Une perte de fonction inhibitrice majeure a été observée lorsque les ponts disulfures spécifiques Cys4-Cys6 et Cys4-Cys5 ont été formés. Les inventeurs ont aussi montré que la charge cationique du peptide était un facteur important de son activité biologique. La substitution des acides aminés chargés positivement par un résidu neutre a conduit à une réduction parfois très significative de l'activité antifongique et d'inhibition de la production de TCTB.
Résultats
TickCore3 est un inhibiteur très efficace de la production de TCTB par F. graminearum La Fig. 1 montre les résultats obtenus après 10 jours de culture de la souche F. graminearum CBS 185.32 dans un milieu MS supplémenté avec TickCore3 et sa variante oxydée (TickCore3 Ox) à trois concentrations différentes (12,5, 25 et 50 mM). Les milieux de culture non traités (contrôle) n'ont été supplémentés par aucun des peptides TickCore3. Bien que TickCore3 Ox n'ait eu aucun effet sur la biomasse fongique sèche, TickCore3 a inhibé de façon significative la croissance fongique à toutes les concentrations testées comparativement à la condition contrôle (Fig. la). L'effet d'inhibition de la croissance fongique de TickCore3 était dose-dépendant puisque l'augmentation de la concentration du peptide avait un effet proportionnel sur la quantité de biomasse sèche. En ce qui concerne la production de mycotoxines, le 15-ADON était le principal TCTB produit dans les milieux liquides par la souche étudiée. Dans les conditions contrôles, la production de 15-ADON (moyenne 21867 SD ±3259 pg/g de biomasse sèche) était 26 fois supérieure à celle de DON (835±68 pg/g). La supplémentation avec TickCore3 a conduit à des niveaux non détectables de DON (Fig. lb) et 15-ADON (Fig. le) pour toutes les concentrations testées. Toutefois, des niveaux résiduels de 15-ADON ont été observés avec la concentration 12,5 pM (figure le). En revanche, une concentration de 12,5 pM de TickCore3 Ox n'a pas réduit significativement la production de DON (Fig. lb) ni de 15-ADON (Fig. le).
La cyclisation de TickCore3 réduit l'activité antifongique
Les inventeurs ont émis l'hypothèse que la formation de cycle dans TickCore3 peut avoir des effets sur l'inhibition de la production de TCTB. Afin de vérifier cette hypothèse, des peptides dérivés de TickCore3 ont été synthétisés en alkylant chaque résidu Cys individuellement avec un groupe méthyle (CH3), suivi d'un protocole d'oxydation qui a généré des peptides avec des ponts disulfures établis entre Cys5-Cys6 (TickCore3 CH3-1 Ox), Cys4-Cys6 (TickCore3 CH3-2 Ox) et Cys4- Cys5 (TickCore3 CH3-3 Ox). TickCore3-CH3-l Ox, TickCore3-CH3-2 Ox et TickCore3-CH3-3 Ox n'ont eu aucun effet sur la croissance fongique à aucune des concentrations testées, comparativement au contrôle (Fig. 2a). La production de mycotoxines par F. graminearum a ensuite été mesurée dans les milieux supplémentés avec TickCore3-CH3-l Ox, TickCore3-CH3-2 Ox et TickCore3-CH3-3 Ox à trois concentrations différentes : 12,5, 25 et 50 mM (figure 2b). L'augmentation des concentrations de TickCore3-CH3-2 Ox et TickCore3-CH3-3 Ox a entraîné une augmentation significative de la production de DON (Fig. 2b) et de 15-ADON (Fig. 2c), sauf pour les champignons exposés à TickCore3-CH3-2 Ox pour lesquels la production de 15-ADON n'a pas changé significativement. Par ailleurs, le traitement avecTickCore3-CH3-l Ox à 50 mM a entraîné une réduction significative des niveaux de DON et de 15-ADON (Fig. 2bc). Un peptide supplémentaire, TickCore3-CH3-CH3- 123, avec tous les résidus Cys alkylés par des groupes méthyles, a été synthétisé. F. graminearum exposé à TickCore3-CH3-123 a produit significativement moins de DON et 15-ADON comparativement aux conditions contrôle.
La charge cationigue est un élément clef de l'activité antifongigue et « anti-mycotoxine » de
TickCore3.
Les inventeurs ont émis l'hypothèse que la charge cationique de TickCore 3 était un élément important de son activité biologique. Afin de vérifier cette hypothèse, des peptides substitués de TickCore3 ont été synthétisés en substituant les acides aminés dits basique (arginine et lysine, R et K) par un résidu non chargé, la thréonine (T). Les peptides suivants ont ainsi été générés : TickCore3-K6T (substitution de la lysine en position 6 par un résidu thréonine), TickCore3-R7T (substitution de l'arginine en position 7 par un résidu thréonine), Tickcore3-K13T (substitution de la lysine en position 13 par un résidu thréonine), et TickCore3-K14T (substitution de la lysine en position 14 par un résidu thréonine). Pour l'ensemble des peptides substitués, l'activité antifongique a été réduite, comparée à celle du peptide natif (Fig3a). Les formes substituées (TickCore3-K13T, TickCore3-K14T et TickCore3-R7T) présentent une activité antifongique forte uniquement à 50mM alors que TickCore3-K6T ne possède aucune activité antifongique en dessous de la concentration à 50mM. La production de mycotoxines par F. graminearum a ensuite été mesurée dans les milieux supplémentés avec TickCore3, TickCore3-K13T, TickCore3-K6T, TickCore3-K14T et TickCore3-R7T à trois concentrations différentes : 12,5, 25 et 50 mM (figures 3b et 3c). Pour l'ensemble des peptides substitués, que ce soit vis-à-vis de la production de DON (Fig 3b) ou de 15-ADON (Fig3c), la capacité à inhiber la production de mycotoxines est inférieure à celle de la forme native TickCore3. Cette réduction de capacité à inhiber la production de TCTB est particulièrement marquée pour TickCore3-K6T et dans une moindre mesure TickCore3-K13T, suggérant que les acides aminés lysine en position 13 et 6 jouent un rôle important dans l'activité « anti-mycotoxine ».
La pégylation de TickCore3 augmente l'activité antifongique
Le peptide TickCore3-PEG a été synthétisé de la même façon que TickCore3, à la différence que deux unités PEG ont été fixées séquentiellement à l'extrémité N-terminale du peptide. Comparativement à TickCore3, TickCore3-PEG à 50 mM a montré un effet antifongique plus important avec une diminution d'un facteur 3,3 de la croissance fongique (Fig 4a). De plus, TickCore3-PEG présenterait également une activité inhibitrice améliorée sur la production de mycotoxines (Fig 4bc).
La défensine DefMT3 est capable d'inhiber la production de mycotoxines.
Le peptide DefMT3 a été synthétisé de la même façon que TickCore3. Ce peptide présente une activité inhibitrice sur la production de mycotoxines DON et 15-ADON (Fig 5a et 5b).
Matériel et Méthodes
Synthèse du noyau qamma de TickCore3 TickCore3 (CGNFLKRTCRTCICVKKK, SEQ ID NO : 2) est le motif conservé gamma core de DefMT3 (numéro d'accès GenBank : JAA71488 ; Tonk et al., 2015). La synthèse de peptides a été commandée à Pepmic (Suzhou, Chine) qui utilise la synthèse de peptides en phase solide (SPPS) pour obtenir des peptides à haut degré de pureté comme décrit précédemment dans Cabezas- Cruz et al., 2016, (Front Microbiol., 7, 1682). Brièvement, la synthèse peptidique a été effectuée en utilisant une résine de 2-chlorotrityle chlorure comme support solide, et une base labile de 9- fluorényl-méthyloxy-carbonyle (Fmoc) comme groupe protecteur. Les acides aminés ont été protégés comme suit : Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc- Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-lle-OH et Fmoc-Val- OH. Toutes les séquences peptidiques ont été synthétisées selon les principes du SPPS. Les peptides ont été purifiés par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) selon les protocoles standard de couplage chimique des peptides.
Les peptides purifiés par HPLC en phase inverse, ont été ensuite facultativement oxydés à l'aide d'un tampon de repliement contenant 1 M urée, 100 mM Tris (pH 8,0), 1,5 mM glutathion oxydé, 0,75 mM glutathion réduit et 10 mM méthionine. L'oxydation des résidus Cys a été confirmée par la réaction d'Ellman et la formation de liaisons disulfures a été caractérisée par spectroscopie de masse par électrospray (ESI-MS) à l'aide d'un spectromètre de masse LCMS-2020 (Shimadzu, Kyoto, Kyoto Préfecture, Japon). La composition de la séquence a également été vérifiée par ESI- MS à l'aide d'un spectromètre de masse LCMS-2020 (Shimadzu, Kyoto, préfecture de Kyoto, Japon). Les peptides TickCore3-CH3-123 (C(CH3)GNFLKRTC(CH3)IC(CH3)VKK), TickCore3-CH3-l (C(CH3)GNFLKRTCRICVKK), TickCore3-CH3-2 (CGNFLKRTC(CH3)ICVKK) et TickCore3-CH3-3 (CGNFLKRTCIC(CH3)VKK) ont été synthétisés comme décrit précédemment, à la différence que Fmoc-Cys(Me)-OH a été ajouté en remplacement de Fmoc-Cys(Trt)-OH. L'alkylation du soufre (S) des groupes thiols de tous les résidus Cys empêche la cyclisation de ces résidus (c'est-à-dire qu'aucun pont disulfure ne peut se former). Inversement, l'alkylation du S du groupe thiol d'un seul résidu Cys, suivi de son oxydation, dirige la cyclisation des résidus Cys réduits (c'est-à-dire ceux qui n'ont pas été alkylés).
Le peptide TickCore3-PEG a été synthétisé comme TickCore3 mais deux unités PEG ont été séquentiellement attachées à l'extrémité N terminal du peptide en utilisant des groupes protégés Fmoc-NH-PEG2-CH2CH2COOH.
Le peptide DefMT3 présentant la séquence GGYYCPFRQDKCHRHCRSFGRKAGYCGNFLKRTCICVKK (SEQ. I D NO : 22) a été synthétisé selon un protocole identique à celui de TickCore3 par la société Pepmic (Suzhou, Chine).
Test d'inhibition de la production de mycotoxines
Souche de fusa rium et conditions de culture
La souche F. graminearum CBS 185.32 qui produit du DON et 15-ADON (Centraal bureau voor Schimmelkulturen, Pays-Bas) a été utilisée tout au long de cette étude. La culture fongique a été maintenue à 4°C sur des géloses dextrosées à la pomme de terre (PDA) (Difco, Le Ponts de Claix, France) dans des tubes inclinés, sous huile minérale. Pour la réalisation de l'inoculum, la souche a été cultivée à 25 °C dans l'obscurité sur des géloses PDA inclinées pendant 7 jours et la suspension de spores a été préparée en ajoutant 6 mL d'eau distillée stérile à la gélose PDA inclinée avec une agitation douce.
Des expériences en culture liquide ont été réalisées à l'aide de plaques statiques de 24 puits. Chaque puits contenant 2 ml d'un milieu synthétique (milieu MS) qui favorise l'induction rapide de la production de TCTB, préparé tel que publié précédemment (Boutigny et al., 2009, Mycol. Res., 113, 746), supplémenté ou non avec le peptide, a été inoculé avec 2xl04 spores/mL. Les cultures liquides fongiques ont été incubées à 25°C dans l'obscurité pendant 10 jours. Après incubation, les mycéliums ont été récupérés par centrifugation et la biomasse fongique a été mesurée en pesant les mycéliums après 48 h de cryodessiccation (Flexi-Dry®, OErlikon Leybold, Allemagne). Les milieux de culture ont été conservés à -20°C jusqu'à l'analyse des TCTB. Tous les peptides ont été testés à trois concentrations de 12,5, 25 et 50 mM. Cinq répétitions ont été faites pour chaque condition. DefMT3 a été testé à 25 et 50 pM. Des contrôles appropriés utilisant des milieux contrôles dépourvus de peptides et des milieux contrôles non inoculés ont été inclus.
Extraction et analyse des TCTB
Un échantillon de 1,5 mL de milieu de culture a été extrait avec 3 mL d'acétate d'éthyle. Un volume de 2,5 mL de la phase organique a été évaporé à sec à 45 °C sous flux d'azote. Les échantillons séchés ont été dissout dans 200 pL de méthanol/eau (1/1, v/v) et filtrés à travers un filtre de 0,2 pm avant analyse. Les TCTB ont été quantifiés par HPLC-DAD à l'aide d'un chromatographe en phase liquide Agilent Technologies 1100 sériés équipé d'un système d'échantillonnage automatique, d'un détecteur à barette de diodes (DAD) Agilent et du logiciel de gestion de chromatographie ChemStation (Agilent, France). La séparation a été réalisée sur une colonne Kinetex XB-C18 100 A (4,6 X 150 mm, 2,6 pm) (Phenomenex, France) maintenue à 45°C. La phase mobile était constituée d'eau acidifiée avec de l'acide orthophosphorique à pH 2,6 (solvant A) et de l'acétonitrile (solvant B). Le débit a été maintenu à 1 mL.min-1. Le volume d'injection était de 5 pL. Les TCTB ont été séparés au moyen d'un gradient d'élution: 7 à 30% B en 10 min, 30-90% B en 5 min, 90% B en 5 min, 90 à 7% B en 2 min, 7% B en 5 min. Les spectres UV-Vis ont été enregistrés de 190 à 400 nm et les surfaces de pic ont été mesurées à 230 nm. La quantification a été effectuée par un étalonnage externe avec des solutions étalons (Romer Labs, Autriche). Les rendements en toxines ont été exprimés en pg.g 1 de la biomasse sèche.
Analyses statistiques
Toutes les valeurs présentées sont des moyennes ± écart-type incluant quatre réplications biologiques. Comme les données ne suivaient pas une distribution normale (test de normalité de Shapiro-Wilk), l'analyse unidirectionnelle de Kruskal-Wallis a été utilisée, avec des comparaisons de moyennes effectuées à l'aide du test Connover-lnman. L'analyse statistique a été réalisée avec le logiciel XLSTAT 2017 (Addinsoft, Rennes, France). Le seuil statistique de signification p = 0,05 a été utilisé tout au long de l'étude.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un peptide pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genre Fusarium sur une plante, le peptide comprenant une séquence choisie parmi
C/S - G/S - N/G - F/R/I - L/W/I - K/T - R/L/Q/T - T - C/S - I/T - C/S - V/I/Y - K/M/R/T - K/N/T SEQ ID NO: 18
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/T - R/Q/T - T - C/S - I/T - C/S - V/Y
- K/R/T - K/T SEQ ID NO: 19
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/T - R/T - T - C/S - I/T - C/S - V/Y - K/T - K/T SEQ ID NO: 20, et
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/R - R/K - T - C/S - I/T - C/S - V/Y - K/R - K/R SEQ ID NO: 21.
2. Méthode pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genre Fusarium sur une plante comprenant la mise en contact de la plante avec une composition comprenant un peptide, le peptide comprenant une séquence choisie parmi
C/S - G/S - N/G - F/R/I - L/W/I - K/T - R/L/Q/T - T - C/S - I/T - C/S
- V/I/Y - K/M/R/T - K/N/T SEQ ID NO: 18
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/T - R/Q/T - T - C/S - I/T - C/S - V/Y
- K/R/T - K/T SEQ ID NO: 19 C/S - G/S - N/G - F/l - L/I - K/T - R/T - T - C/S - I/T - C/S - V/Y - K/T - K/T SEQ ID NO: 20, et
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/R - R/K - T - C/S - I/T - C/S - V/Y - K/R - K/R SEQ ID NO: 21.
3. Composition phytosanitaire destinée au traitement d'une plante comprenant un peptide, notamment pour inhiber la production de mycotoxines par des champignons du genre Fusarium sur la plante, le peptide comprenant une séquence choisie parmi
C/S - G/S - N/G - F/R/I - L/W/I - K/T - R/L/Q/T - T - C/S - I/T - C/S
- V/I/Y - K/M/R/T - K/N/T SEQ ID NO: 18 C/S - G/S - N/G - F/l - L/I - K/T - R/Q/T - T - C/S - I/T - C/S - V/Y
- K/R/T - K/T SEQ ID NO: 19 C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/T - R/T - T - C/S - I/T - C/S - V/Y - K/T - K/T SEQ ID NO: 20, et
C/S - G/S - N/G - F/l - L/l - K/R - R/K - T - C/S - I/T - C/S - V/Y - K/R - K/R SEQ ID NO: 21 le peptide comprenant au plus 30 acides aminés et le peptide n'étant pas un peptide non-modifié de séquence
CGNFLKRTCICVKK SEQ ID NO : 2 ou
CSGIIKQTCTCYRK SEQ ID NO : 3.
4. Utilisation selon la revendication 1 ou méthode selon la revendication 2 ou composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que le peptide comprend au plus 30 acides aminés.
5. Utilisation selon la revendication 1 ou 4 ou méthode selon la revendication 2 ou 4, caractérisée en ce que le peptide comprend une séquence choisie parmi les séquences suivantes, consiste en une séquence choisie parmi les séquences suivantes avec la séquence pouvant comprendre 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, additions, délétions ou mélange de celles-ci, ou consiste en une séquence choisie parmi les séquences suivantes
C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO: 2
C S G I I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO: 3
C G N F L T R T C I C V K K SEQ ID NO: 6
C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7
C G N F L K R T C I C V T K SEQ ID NO: 8
C G N F L K R T C I C V K T SEQ ID NO: 9
C G N F L T T T C I C V T T SEQ ID NO: 10.
S G N F L K R T S I S V K K SEQ ID NO: 11
S S G I I K Q T S T S Y R K SEQ ID NO: 12
S G N F L T R T S I S V K K SEQ ID NO: 13
S G N F L K T T S I S V K K SEQ ID NO: 14 S G N F L K R T S I S V K T SEQ ID NO: 16 et
S G N F L T T T S I S V T T SEQ ID NO: 17.
6. Composition selon la revendication 3, caractérisée en ce que le peptide comprend, consiste essentiellement en ou consiste en une séquence choisie parmi
C G N F L K R T C I C V K K SEQ ID NO: 2, le peptide portant une PEGylation, une amidation en C-terminal, une acétylation en N-terminale, une liaison peptidique modifiée, un acide aminé de forme D, une cystéine modifiée ou une combinaison de ces modifications ; C S G i I K Q T C T C Y R K SEQ ID NO: 3, le peptide portant une PEGylation, une amidation en C-terminal, une acétylation en N-terminale, une liaison peptidique modifiée, un acide aminé de forme D, une cystéine modifiée ou une combinaison de ces modifications ;
C G N F L T R T C I C V K K SEQ ID NO: 6
C G N F L K T T C I C V K K SEQ ID NO: 7
C G N F L K R T C I C V T K SEQ ID NO: 8
C G N F L K R T C I C V K T SEQ ID NO: 9
C G N F L T T T C I C V T T SEQ ID NO: 10.
S G N F L K R T S I S V K K SEQ ID NO: 11
S S G I I K Q T S T S Y R K SEQ ID NO: 12
S G N F L T R T S I S V K K SEQ ID NO: 13
S G N F L K T T S I S V K K SEQ ID NO: 14
S G N F L K R T S I S V T K SEQ ID NO: 15
S G N F L K R T S I S V K T SEQ ID NO: 16 et
S G N F L T T T S I S V T T SEQ ID NO: 17.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1, 4 ou 5, méthode selon l'une quelconque des revendications 2, 4 ou 5 ou composition selon l'une quelconque des 3, 4 et 6 , caractérisée en ce que le peptide comprend au plus 20 acides aminés.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1, 4, 5 et 7, méthode selon l'une quelconque des revendications 2, 4, 5 et 7 ou composition selon l'une quelconque des revendications 3, 4 et 6-7, caractérisée en ce que le peptide est PEGylé.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1, 4, 5 et 7-8, méthode selon l'une quelconque des revendications 2, 4, 5 et 7-8 ou composition selon l'une quelconque des revendications 3, 4 et 7-8, caractérisée en ce que le peptide ne comprend pas de pont disulfure.
10. Utilisation selon la revendication 1 ou méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que le peptide comprend une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID Nos : 22 et 23, consiste en une séquence choisie parmi les séquences SEQ. ID Nos : 22 et 23 avec la séquence pouvant comprendre 1, 2, 3, 4 ou 5 substitutions, additions, délétions ou mélange de celles-ci, ou consiste en une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID Nos : 22 et 23.
11. Utilisation selon la revendication 1 ou méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que le peptide consiste en la séquence SEQ ID NO : 22.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1, 4-5 et 7-11, méthode selon l'une quelconque des revendications 2, 4-5 et 7-11 ou composition selon l'une quelconque des revendications 3-4 et 6-9, caractérisée en ce que la mycotoxine est une trichothécène de catégorie B, de préférence déoxynivalénol (DON) et/ou déoxynivalénol acétylé (A-DON).
13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1, 4-5 et 7-12, méthode selon l'une quelconque des revendications 2, 4-5 et 7-12 ou composition selon l'une quelconque des revendications 3-4, 6-9 et 12, caractérisée en ce que le champignon du genre Fusarium est choisi parmi Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium tricinctum, Fusarium avenaceum, Fusarium poae, Fusarium sporotrichioides, Fusarium verticillioides, Fusarium proliferatum, Fusarium langsethiae, Fusarium oxysporum, Fusarium roseum, Fusarium arthrosporioides, et Fusarium avenaceum, de préférence Fusarium culmorum ou Fusarium graminearum_.
14. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1, 4-5 et 7-13, méthode selon l'une quelconque des revendications 2, 4-5 et 7-13 ou composition selon l'une quelconque des revendications 3, 4, 6-9 et 12-13, caractérisée en ce que la plante est sélectionnée parmi des céréales, comme le blé (tendre et dur), l'orge, le maïs, l'avoine, le triticale et le riz, des fruits et légumes comme la tomate, le melon, le concombre, la courgette, le topinambour, le piment, la pomme de terre, l'asperge, la patate douce, le céleri, l'ail, l'oignon, le chou, le gingembre, la banane, le manioc, la vanille, et des arbres fruitiers comme le palmier dattier, de préférence des céréales choisis parmi le blé (tendre et dur), l'orge, le maïs, l'avoine, le triticale et le riz.
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