DE1957198C - Verfahren und Vorrichtung zur Kon trastmikroskopie mit variabler Phase - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur mikroskopischen Betmchtung im polarisierten Licht nach der Kontrastmethode unter Veriinderung der Phase mit Hilfe einer Phasenlamelle und eine Vor· richtung zur Durchführung dieses Verfahrens. Das s dabei verwendete optische System dient dazu, transparente Objekte, nicht absorbierende oder allgemeiner gesprochen solche Objekte beobachten zu können, die zur Klasse der »Phasen-Objekte« gehören.

Man hat bereits zahlreiche Vorrichtungen zur Beobachtung nach der Kontrastmethode mit variabler Phase vorgeschlagen, welche durchweg mit polarisierenden Mitteln und mit einer Phasenlamelle arbeiteten. Aber diese Vorrichtungen haben die in ihre industrielle Verwendbarkeit gesetzten Hoflnungen enttäuscht. Bei diesen bekannten Einrichtungen · zur Beobachtung mit Pltiasenkontrast wurde die Haupt- oder Grundphasenverschiebung, die normalerweise gleich ± -} sein soll, erreicht durch Einführung einer optischen Verzögerung. Unter diesen Bedingungen, d. h., wenn mit einer Verzögerung des optischen Lichtweges gearbeitet wird, ergibt sich Tür die Phase ψ die Bedingung: ·

20 auf die im' einzelnen erst spüler beschriebene Fig. I der Zeichnungen Bezug genommen, wobei man sich die zur Vereinfachung der Bescnriftungen eingesetzten Pfeile, welche die Vektoren bezeichnen, sowie die Vektordiagramme der Erscheinungen mit der Objektamplitude (Vektor V₁)

einmal fortdenken muß. Man erkennt, daß der Vektor K aufgeteilt ist in zwei Vektoren V₀ und V₁ nach der vektoriellen Gleichung

• V₁ = V₀ + V₂ (F i g. 1 B).

Wenn man nun im Innern des Objektes das Licht zum Verschwinden bringen will, so ist es nötig und ausreichend, daß der Vektor V₀ des Moduls I ersetzt wird durch den Vektor V₃ = -V₂.

Nun stell« aber bei dieser Aufteilung der Vektor V₀ das sogenannte direkte Licht dar, d. h., daß zum »Auslöschen« des Objektes eine Phasenverschiebung V₀ vom Winkel

ψ =

la

wobei die optische Verzögerung I den Wert hat

/.„ ist die mittlere Wellenlänge und λ die vorliegende Wellenlänge: daraus folgt also

und eine Verminderung des Moduls von 1 auf 2 sin \

erforderlich ist. Das bedeutet, daß die optimale Regelung des variablen Phasenkontrastes erhalten wird, wenn die beiden folgenden Bedingungen gleichzeitig erfüllt sind:

1. Die Energie-Durchlässigkeit der sogenannten »konjugierten« Zone der Phasenlamelle muß gebracht werden auf den Wert

35 4sin² — - 2(1 - cos7)

was erklärt, warum bei den genannten Vorrichtungen, in denen mit einer optischen Verzögerung gearbeitet

wird, die Phasenverschiebung nur dann gleich \ ist,

wenn λ = A₀ ist und die Grundphasenverschiebung sich mit der Wellenlänge ^fMer»

-ic Γί»ίιΐιί;):>£ i>,ij s:ch die \iii£abe gestellt, bei der Kontrastmikroskopie mit variabler Phase eine doppelte Regulierung zu vermeiden, und zwar dadurch, daß die Regulierung mittels eines einzigen Steuerorgans ermöglicht wird.

Dadurch würden sich folgende Vorteile ergeben: einesteils kann dieses einzige Regulierorgan geeicht werden und liefert auf diese Weise ein Mittel zum Messen der optischen Dicke des untersuchten Objekts; andererseits hat ein solches Regulier- oder Steuerorgan, wenn es gleichzeitig zur Phasenverstellung und zur Absorption der Phasenlamelle dient, die Wirkung, daß ein Objekt beliebiger optischer Dicke, welche nicht notwendigerweise klein in bezug auf die Wellenlänge zu sein braucht, mit einem Kontrastwert gleich 1 erscheint, d. h., daß das Bild der geprüften Einzelheit schwarz vor hellem Grund erscheint. Diese zuletzt genannte Erscheinung dient als Kriterium der vollständigen Kompensation und kann also leicht für Messungen benutzt werden.

Man hat bereits im einzelnen die physikalischen und mathematischen Grundlagen überprüft, die für die Beobachtung mit Phasenkontrast gelten. Zur besseren Verständlichkeit sei schon vorweg einmal und

2. die Phasenverschiebung ψ der genannten konjugierten Zone muß gleich sein dem Wert

Tt

Diese Bedingungen wurden im einzelnen durrh verschiedene Autoren ermittelt, insbesondere einerseits durch Bennet und andere (Phase microscopy. Principles and applications — John Wiley et Sons editeurs New York, 1957) und andererseits »Les contrastes de phase et Ie contraste par interference (Kolloquium der Internationalen Optischen Kommission 15. bis 21. März 1951) — Maurice Francon odileurs-Editions de la Revue d'Optique). Verschiedene Autoren, z. B. H. O s t e r b e r g mit seinem System, P ο 1 a η r e t und die USA.-Patentschrift 2 516 905 haben vorgeschlagen, das dargelegte Problem dadurch zu lösen, daß die Phasenlamelle aus zwei gekreuzten Polarisatoren bestehen müsse, gefolgt durch eine doppelbrechende Lamelle »Viertel Welle«, ergänzt durch einen variablen Korn

(10 pensator, wobei das Ganze zwischen einen Polarisator und einen Analysator gesetzt wird. In diesem Falle stellt die Lamelle »Viertel Welle« die Hauptphasenverschiebung her gleich ± ,, und der Kom-

'»5 pensator gestattet die kleine Phasenverschiebung gleich \ hinzuzufügen. Der Lichtdurchgang tier konjugierten Zone wird somit geregelt durch Drehung

_)q

des Analysator, Man erkennt sogleich, daß diese Lösung, die bei den vorerwUhnten bekannten Geritten benutzt wurde, die beiden ebenfalls schon angeführten · Nachteile besitzt, welche durch dte Erfindung beseitigt werden sollen, wie weiter unten nöher dargelegt s werden wird. Diese beiden Nachteile sind folgende:

1. Die optimale Regelung muß herbeigeführt werden, indem man zur Einstellung auf zwei unabhängige Parameter einwirkt, und

2, die Hauptphasenverstellung von y wird erreicht

mittels einer Verzögerung von j, welche von wesentlicher farblicher Bedeutung ist, da sie von der Wellenlänge des Beleuchtungslichtes abhängt. '⁵

Wenn man also auf die Schlußfolgerungen zurückkommt, welche aus dem Vektordiagramm der F i g. 1 a zu ziehen sind, so konnte festgestellt werden, daß sich die Lösung des gestellten Problems erreichen läßt, wenn gemäß der Erfindung der Vektor V₀ benutzt wird, ohne ihn der Drehung ψ und der Größenverminderung, wie sie an Hand der Fig. la beschrieben wurden, unterwirft. Wenn man, wie es in F i g. 1 b dargestellt ist, zu dem Vektor V₀ noch den Vektor (- V_x] hinzufügt, so erhält man einen Vektor V₃, der definiert ist durch

V₃ = V₀-V_x, d.h. 1-e'r

Das bedeutet, daß man den der Auslöschung des Lichtes im Innern des Objektes entsprechenden Kontrast erhalten kann, indem man dem Vektor V₀, welcher den zusammenhängenden Hintergrund darstellt, einen Vektor V_x gegenüberstellt, welcher das Objekt darstellt. Das Ergebnis, welches den idealen Betrachti'igsbedingungen eines Objekts der Phase 7 entsprich;, kunr, .'.«^.iclt werden, indan ;nan der konjugierten Zone (dargestellt durch den Vektor K, = 1 -e"*) der Lamelle die Lichtdurchlässigkeit dt: k .npiexcr. Amplitude 1 -c'", und der komplementüren /ioiic (Vektor V₀ = 1) die Lichtdurchlässigkeit gleich I erteil;

Di<> eiitir-iTips i?«*r,aj:nte Aufgabe wird erfir.(Uin<'<gemäß dadurch gelöst, daß bei Verwendung einer Hauptphasenverschiebung von ^ und einer varia-

blen Phasenverschiebung, ohne Verzögerung des optischen Lichtweges, das durch die in zwei als »konjugiert« und »komplementär« bezeichnete Zonen aufgeteilte Phasenlamelle fallende Lichtstrahlenbündel in zwei verschieden polarisierte Teile mit zueinander um 45 geneigten Polarisationswinkeln aufgeteilt wird, deren einer Teil der konjugierten und deren anderer Teil der komplementären Zone zugeordnet ist.

Die Vorrichtung für die Durchführung dieses Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß bei dem mit einer Phasenlamcllc für die Polarisation des Lichts mit einem doppelbrechenden Kompensator und mit einem Analysator ausgestalteten optischen System die Phasenlamelle aus zwei zueinander um 45 verdrehten Polurisatorcn besteht, deren einer der konjugierten, und deren anderer der komplementären Zone der Phasenlamelle zugeordnet ist, und vor denen' ein Polarisator derart angeordnet ist, daß er beide Zonen bedeckt und parallel zu dem, die konjugierte Zone einnehmenden Polarisator liegt und <1sil.l ein in bekannter Weise aus einem doppelbrechenden Kompe.^saior und einem Analysator bestehendes Aggregai im Sinne der Lichtausbreitung hinter der Umelle derurt ungeordnet ist, daß der Durchgang der komplexen Amplituden der konjugierton Zone gleich I ~e'^v und der der komplementären Zone gleich I ist,

zwei G asp IU tenon zusammengeklebt, dall die so entstanden!* Phasenlamelle zwei Zonen bildet, welche _{diq kon}j_{ugierte bzWi die} komplementäre Zone darstellen, in welchen die polarisierende Wirkung durch irgendeine geeignete bekannte fotochemische Behandjung unterdrückt ist, ^Al* Kompensator kannι ein,solcher von demι an

Vornahme von Messungen der Phasenobjekte gestatten.

Vorzugsweise liegt die Phasenlamelle in einer Ebene, die konjugiert zu der Brennebene des Objektivs in bezug auf einen optischen Träger einer Vergrößerung von vorzugsweise -1 ist. Die konjugierte Zone der Phasenlamelle hat vorzugsweise eine ringförmige Zone, deren relative Oberfläche nicht Über 12% der auf die Phasenlamelle projizierten Fläche beträgt, die dem Bild der Ausgangsöffnung des verwendeten Objektivs entspricht.

^'^e Erdung ^w'^rd im folgenden an Hand der Figuren in einigen Ausführungsbeispielen beschrieben. Dabei stellen dar >

Fig. la und 1 b Vektordiagramme der zur Verständnis der Erfindung wichtigen Vorgänge, wie sie oben behandelt worden sind,

F i g. 2 eine schematische Ansicht eines ersten Ausführungsbeispiels der Erfindung, angewandt auf ein mikroskopisches Gerät,

F i g. 3 eine entsprechende Ansicht einer abgeänderen AusfUhrursgsfosm,

Fig. 4 und 5 tiiagramniaiische Darstellungen der Bedingungen, welch. Ciiur.ii;·. >n üer konjugierten und andcs'erse»!* in der Ku.i-r«jr;ne:iuiren 7one "leri-oLei·.

i _t. (, ■)>.(* 7 Ansicfrter im 5f<-l»»ii:i 1/* ^;.n ■■'·-w Draufsicht des ersten Polarisators der Phasenlamelle

F i g. 8 ein Diagramm, nach welchem sich der Energiedurchgang T und die Phasenverschiebung ψ der konjugierten Zone der Phasenlamelle in Abhängigkeit von der Phase 7 bestimmen läßt.

Bei dem Gerät nach Fig. 2 fällt von einer als punktförmig angesehenen Lichtquelle 1 ein paralleles Strahlenbündel durch einen Kondensator 2 auf das Phasenobjekt ii. An der Austrittsseite des Objektes .'.' wird das Strahlenbündel zerlegt in ein direktes Bündel, welches nach Passieren des Objektivs 3 durch einen Polarisator 4 tritt, der eingestellt (fokussiert) ist auf den Mittelteil der Phasenhimclle 5, nämlich die sogenannte »konjugierte Zone«, und ein abgelenktes Bündel, welches durch die ganze Phascnlamelle 5 hindurchgeht und von dieser hauptsächlich beeinflußt wird durch den Lichtdurchgang in dem Teil, welcher die konjugierte Zone umgibt und als »komplementäre Zone« bezeichnet wird. Der Polarisator 4 ist ein solcher vom nicht unterteilten Typ. Die eigentliche Phasenlamellc 5 besteht aus einem Polarisator 6, welcher dieselbe Ausrichtung hat wie der Polarisator 4 und in der konjugierten Zone liegt, und aus einem gegenüber dem Polarisator 4 um 45

verdrehten Polarisator 7, welcher die komplementäre Zone einnimmt (vgl. die F i g. 6 und 7). Die Phascnlamcllc 5. die im Ausführungsbeispiel in der Brennebene F' des Objektivs 3 liegt,, ist konjugiert der Lichtquelle 1 in bezug auf die Gesamtanordnung: Kondensator 2 plus Objektiv 3. Die Vorrichtung enthält hinter der Lamelle 5 einen doppelbrcchcndcn Kompensator 8, dargestellt durch eine doppclbreehendc Lamelle variabler Dicke zum Einführen einer Phasendifferenz Φ zwischen den beiden in Bezug aufeinander um 90 polarisierten Wellen. Die neutralen Linien dieses Kompensator liegen um ± 45 versetzt gegenüber dem Polarisator 4. Den Abschluß bildet ein Analysator 9, der mit dem Polarisator gekreuzt ist. Das reelle Bild des Objektes wird über den Zeichnungsbildrand hinausgeworfen und ist deshalb nicht dargestellt.

In den Fig. 4 und 5 ist die Entwicklung dargestellt, welcher die komplexen Amplituden der direkten bzw. der durch die verschiedenen Elemente der Vorrichtung gebrochenen Welle unterworfen sind.

Für das direkte Licht erfährt das durch den Polarisator 4 polarisierte Licht keine Modifikation durch die Einwirkung des Polarisators 6. aber das Licht ist durch den Kompensator 8 in zwei zueinander rechtwinkligen Schwingungsebenen zerlegt, deren beide komplexe Amplituden \/}fj und l/y^e"^p sind. Der Analysator 9 läßt nur zwei antiparallele Komponenten der Amplituden _Ί und ., e"¹ durch.

Für das gebrochene Licht erkennt man, daß der Polarisator? der komplementären Zone nur eine auf +4? gerichtete Komponente durchläßt.

Der Kompensator 8 modifiziert in keiner Weise

seine Amplitude, welche den Wert 1/ VT behält; und

der Analysator 9 schließlich läßt eine rechtwinklig zum Polarisator 4 gerichtete Komponente der Amplitude j durch.

Im Endergebnis erhält man also einen Strahlendurchgang einer komplexen Amplitude des direkten Lichtes, die gleich ist einer Konstante nahe dem Wert 1 -e'* und derjenigen des direkten Lichtes gleich I.

Bringt man nun die Phasenverschiebung Φ des Kompensators 8 auf den Wert q der örtlichen Objektphasenverschiebung ίλ so erhält man ein optimales Bild der untersuchten Einzelheit des Objektes.

Man erkennt somit, daß unter den erfindungsgemäßen Bedingungen der einzige variable Parameter hier der Wert Φ ist. welcher regelbar ist mittels des doppelbrechendcn Kompensators 8 bekannten Typs.

Anstatt des in I i g. 2 dargestellten Kompcnsators kann man vorteilhaft auch einen SENAR-MONT-Kompcnsator benutzen, der sich durch F.infachheit und Linearität auszeichnet. Wie in F i g. 3 dargestellt, besteht ein solcher Kompensator aus einer Viertel-Wcllcn-Lamelle 10. im allgemeinen aus Glimmer, deren ruhende Achse parallel /um Polarisator liegt, und einem drehbaren Analysator 9. Man erhalt eine Phasenverschiebung Φ. wenn man den Analysator um den Winkel Φ/2 dreht

In den F i g. f» und 7 ist eine vorteilhafte Ausruhrungsfonri einer Phasenlamelle »auseinandergenommen·· dargestellt, die aus drei Polarisatoren A und 7 besteht, die in Form von drei polarisierenden Blättchen zwischen zwei Glaslamellcn geklebt sind. Das erste Blättchen 4 ist ungeteilt, während die Blättchen 6 und 7 nicht polarisierende Zonen 6' und 7' aufweisen, die sich gegenseitig ergänzen. Die Form der konjugierten Zone, ebenso wie die der Lichtquelle kann zweckmäßig ringförmig sein, wie es an sich bekannt ist.

Es ist nun tatsächlich nicht immer möglich, die Einheit, welche die Phasenlamelle 4, 6, 7 darstellt,

ίο in der Brennebene F' des Objektivs 3 unterzubringen. In diesem Falle kann man sich eines optischen Trägers jedes beliebigen Typs bedienen, welcher das reelle Bild dieser Brennebene in größere Entfernung reproduziert, die im allgemeinen in einem üblichen Mikroskop-Objektiv nicht zugänglich ist.

Die F i g. 8 gibt ein Diagramm, welches gestattet, den Strahiendurchgang T zu bestimmen als Funktion der Phase q (Kosinuskurve) und der Phasenverschiebung ν¹ als Funktion der gleichen Phase 7 (gestrichelte Sägezahnkurve):

T = t² = 2(1 -cos,)

-Sin η _tg„, ₌ _..___s

35

40

Claims (7)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur mikroskopischen Betrachtung im polarisierten Licht nach der Kontrastmethode unter Veränderung der Phase mit Hilfe einer Phasenlamclle, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung einer Hauplphasenverschiebung von ^ und einer variablen Phasenverschiebung, ohne Verzögerung des optischen Lichtweges, das durch die in zwei als »konjugiert« und »komplementär« bezeichnete Zonen aufgeteilte Phasenlamelle fallende Lichtstrahlcnbündcl in zwei verschieden polarisierte Teile mit zueinander um 45 geneigten Polarisationswinkeln aufgeteilt wird, deren einer Teil.der konjugierten und deren anderer Teil der komplementären Zone zugeordnet ist.

2. Vorrichtung für die mikroskopische Beobachtung nach der Kontrastmethode mit variabler Phase nach dem Verfahren des Anspruchs I dadurch gekennzeichnet, daß bei dem mit einei Phasenlamelle (S) Tür die Polarisation des Lichts mit einem doppelbrechenden Kompensator (8 und mit einem Analysator (9) ausgestatteten opti sehen System die Phascnlamelle aus zwei zucin ander um 45 verdrehten Polarisatoren (6. 7 besieht, deren einer der konjugierten und derei anderer der komplementären Zone der Phasen lamelle zugeordnet ist. und vor denen ein Polari sator (4) derart angeordnet ist. daß er beide /one bedeckt und parallel zu dem. die konjugierte /on einnehmenden Polarisator (6) liegt und daß ei in bekannter Weise aus einem doppelbrechende Kompensator (8) und einem Analysator (9) Ih stehendes Aggregat im Sinne der Lichtausbreituti hinter der Lamelle derart angeordnet ist. daß di Durchgang der komplexen Amplituden der koi jugiertcn /one gleich 1 c'"¹ und der der kompl motMiircn /one ult'iih I iM

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Polarisatoren (4, 6, 7) so zwischen zwei Glasplältchen zusammengeklebt sind, daß die so entstandene Phasenlamelle zwei Zonen bildet, welche die konjugierte bzw. die komplementäre Zone darstellen, in welchen die polarisierende Wirkung durch irgendeine geeignete bekannte fotochemische Behandlung unterdrückt ist (Fig. 6 und 7).

4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Kompensator ein solcher vom Typ SENARMONT (10) dient.

5. Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 2, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Kompensator Winkelmarken trägt, die

die Vornahme von Messungen der Phasenobjekte gestatten.

6. Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Phasenlamelle (5) in einer Ebene liegt, die konjugiert zu der Brennebene (F') des Objektivs (3) in bezug auf einen optischen Träger einer Vergrößerung von vorzugsweise —1 ist.

7. Vorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die konjugierte Zone der Phasenlamelle eine ringförmige Zone hat, deren relative Oberfläche nichl über 12% der auf die Phasenlamelle projizierten Fläche beträgt, die dem Bild der Ausgangsöffnunf des verwendeten Objektivs entspricht.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen