DE19544150C2

DE19544150C2 - Stabile 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin-Lösungen

Info

Publication number: DE19544150C2
Application number: DE1995144150
Authority: DE
Inventors: Helmut Nugel; Tomas Porstmann
Original assignee: Seramun Diagnostica GmbH
Current assignee: Seramun Diagnostica GmbH
Priority date: 1995-11-16
Filing date: 1995-11-16
Publication date: 2002-06-13
Anticipated expiration: 2015-11-17
Also published as: DE19544150A1

Description

Die Erfindung betrifft die Stabilisierung von 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin(TMB)-Lösungen, die als Chromophor für den Produktnachweis, insbesondere in Enzymimmunoassays zum Substanznachweis und zur Substanzquantifizierung auf der Grundlage enzymatischer Reaktionen mit Peroxidasen und Peroxiden Verwendung finden. Sie bezieht sich auch auf Nachweisverfahren für Produkte, die in vorgeschalteten Reaktionen - wie z. B. durch Antigen- Antikörper-Interaktionen oder DNA/RNA-Amplifikationen, z. B. der PCR (Polymerasekettenreaktion) - entstanden sind und mittels Peroxidase markierter Binder (z. B. Antikörper, Protein A oder spezifischer DNA-Sonden) nachgewiesen werden.

Die photometrische Messung der farbgebenden Produktbildung nach enzymatischer Reaktion (Gallati, H. und I. Pracht: Peroxidase aus Merettich, Kinetische Studien und Optimierung der Peroxidase-Aktivitätsbestimmung mit den Substraten H₂O₂ und T-L, J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Vol 23, 1985, 453-460) ist gegenwärtig das am häufigsten angewendete Prinzip bei Immunoassays, das darüber hinaus zunehmend zum Nachweis von Hybridisierungs- oder Amplifikationsprodukten eingesetzt wird.

Um die Teste weitgehend zu standardisieren und zu automatisieren und vom Verhältnis der Anzahl an Kalibratoren zur Probenzahl günstig zu gestalten, werden zunehmend gebrauchsfertige Reagenzien in den Testkits verwendet und diese an Automaten adaptiert, die die erstellten Standardkurven speichern. An diesen Standards werden nach jeweiliger Richtigkeitsbestimmung im aktuellen Test über ein bis zwei Kalibratoren die zu bestimmenden Proben über einen längeren Zeitraum verglichen und die Konzentrationen an der (langzeit)gespeicherten Eichkurve ermittelt.

Das setzt eine hohe Konstanz der Testbesteckbestandteile hinsichtlich ihrer Reaktivität und im Falle der Substratlösung hinsichtlich des Reagenzienleerwertes und der Extinktionsausbeute voraus. In den meisten Fällen wird die Substratlösung am gleichen Tag aus Einzelkomponenten zusammengesetzt, da im Falle von Tetramethylbenzidin (TMB) mit den bisherigen Lösungsvermittlern der Reagenzienleerwert und die Extinktionsausbeute nur über einen sehr begrenzten Zeitraum konstant gehalten werden kann. Dadurch müssen entweder ständig Leerwertkorrekturen erfolgen, wenn man an einer einmal erstellten Standardkurve Proben zu unterschiedlichen Zeiten in unterschiedlichen Ansätzen quantifizieren will, oder aber es muss zu jedem Testansatz eine separate Standardkurve erstellt werden. Auch die sogenannten "ready for use" Substratlösungen zeigen, wenn auch verringert, noch diesen Blankdrift und weisen meistens erheblich geringere Extinktionsausbeuten auf.

Enzymatische Reaktionen mit Peroxidasen und Peroxiden, in denen Tetraalkyl(methyl)benzidin-Lösungen als Chromophor für den Produktnachweis Verwendung findet, sind in der Patentliteratur mehrfach beschrieben worden. Es sind auch Vorschläge zur Stabilisierung solcher Lösungen bekannt. So hat die US (US-Patentschrift) 5206150 eine Zusammensetzung zur Bestimung der Peroxidaseaktivität zum Inhalt, die - neben TMB bzw. Tetraalkylbenzidinen, H₂O₂, mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel und Puffersubstanz - als Stabilisierungsmittel Bacitracin oder seine Derivate (Bacitracin-Precusore oder Hydrolyse-Komponenten) enthält.

Ein Agens zur Bestimmung der Peroxidase- bzw. Pseudoperoxidaseaktivität ist Gegenstand der US-Patentschrift 4891314, derzufolge Penicillin oder dessen Spaltprodukte aus saurer Hydrolyse als Stabilisatoren Verwendung finden.

Die Erfindung zielt darauf ab, eine Substratlösung mit Tetraalkyl(methyl)benzidin-Lösungen so zu stabilisieren, dass sie als "ready for use" Lösung einen für die Richtigkeit der Ergebnisse ohne notwendige Leerwertkorrektur akzeptablen Blankwertdrift hat und eine hohe, der frisch aus Einzelkomponenten angesetzten Lösung vergleichbare Extinktionsausbeute liefert. Der Erfindung liegt des weiteren die Aufgabe zugrunde, den Leerwert einer Tetraalkyl(methyl)benzidin-Substratlösung bei der niedrigsten Extinktion konstant zu halten. Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß durch eine neue Formulierung gelöst, die neben Tetraalkyl(methyl)benzidin ein mit Wasser unbegrenzt mischbares organisches Lösungsmittel als Stabilisator, Chelatbildner, Citrat, Wasserstoffperoxid und ein Konservierungsmittel enthält und die einen pH-Wert von 3,5 bis 5 aufweist. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass bestimmte mit Wasser mischbare Lösungsmittel als Stabilisatoren verwendet werden können. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist beispielsweise 2-Pyrrolidon (Gamma- Butyrolactam).

Das Wesen der Erfindung besteht darin, dass die Bildungsgeschwindigkeit des TMB- Radikalanions immer etwas geringer gehalten wird als die Reaktionsgeschwindigkeit des TMB-Radikalanions mit dem Radikalfänger (Stabilisator).

Die erfindungsgemäßen Formulierungen lassen sich zur Herstellung stabiler TMB- Substratlösungen für den allgemeinen Aktivitätsnachweis von Peroxidase in Enzymimmunoassays, Immunoblottechniken und DNA/RNA-Amplifikationstechniken verwenden.

Als mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel kommen beispielsweise Diethylenglycoldiethylether, 1,3-Dimethyl-2-imidazolidinon, Dimethylsulfoxid, Dipropylenglycol, Ethylenglycolmonoisopropylether, 1-Methoxy-2-propanol, 1-Methyl-2- pyrrolidon, 2-Pyrrolidon oder Tetrahydrofurfurylalkohol (THFA) zur Anwendung, weiterhin alle Lösungsmittel, die mit Wasser unbegrenzt mischbar sind, einen Siedepunkt über 100°C haben und TMB lösen können, z. B. aus den Stoffklassen aliphatische Ether, zyklische Ether, Lactame, Lactone oder Carbonsäureamide.

Als Chelatbildner eignen sich z. B. Nitrilotriessigsäure, Ethylendinitrilotetraessigsäure, 1,2- Cyclohexandiamin-N,N,N,N'-tetraessigsäure, 3-Aza-3-(carboxymethyl)- pentamethylendinitrilo-tetraessigsäure, Ethylendioxybis(ethylennitrilo)tetraessigsäure, N-(2- Hydroxyethyl)-ethylendiamin-N,N',N'-triessigsäure oder Triethylentetraminhexaessigsäure. Als Konservierungsmittel kommen 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-on und 2-Methyl-4- isothiazolin-3-on zur Anwendung.

Die Erfindung beruht auf einer Kombination bekannter Substanzen und organischer Lösungsmittel zu einem neuen Zweck sowie auf der neuen Lehre, dass die Bildungsgeschwindigkeit des TMB-Radikalanions immer etwas geringer gehalten werden muss als die Reaktionsgeschwindigkeit des TMB-Radikalanions mit dem Radikalfänger (Stabilisator).

Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass durch die erfindungsgemäße Zusammensetzung sämtliche Teste, deren Substanznachweis auf dem Peroxidase-TMB- System als Indikator beruhen, besser standardisiert und autokalibriert und ohne aktuelle Bezugskurve quantifiziert werden können.

Insbesondere kann durch die Verwendung langzeitstabiler (mehrere Monate) TMB- Gebrauchslösungen eine separate, testbesteck-unabhängige Bestückung der Automaten mit Substratlösung erfolgen (Fig. 1).

Die Ursache der Leerwertextinktion ist das TMB-Radikalanion, dessen Konzentration möglichst gering sein sollte, weil es eine Kette von noch nicht vollständig aufgeklärten radikalischen Folgereaktionen auslöst, die ihrerseits in einem Kreisprozess wieder das TMB- Radikalanion bilden. Letztendlich führt der ganze Vorgang zu einer allgemeinen Substratverarmung, die sich in steigenden Leerwerten und zunehmend geringeren Extinktionsausbeuten niederschlägt. Hält man die Konzentration des Radikalanions niedrig, so wird die Reaktionsgeschwindigkeit der Folgereaktionen dermaßen gesenkt, dass eine Stabilität der TMB-Substratlösung über Wochen und Monate erreicht werden kann.

Erfindungsgemäß wird die Konzentration des Radikalanions mit geeigneten Radialfängern, die einerseits Bestandteil des Lösungsmittelsystems - z. B. 2-Pyrrolidon - andererseits aber auch besondere Zusätze - z. B. EDTA - sein können, niedrig gehalten. Dazu wird das System so eingestellt, dass die Bildungsgeschwindigkeit des TMB-Radikalanions immer etwas geringer ist als die Reaktionsgeschwindigkeit des Radikalfängers mit dem Radikalanion. Die Einstellung erfolgt durch die Wahl der Lösungsmittelkonzentration. Das hat zur Folge, dass ein geringer Leerwertanstieg (z. B. durch Lichteinwirkung) reversibel ist (Fig. 2). Die Reaktionsgeschwindigkeit des Radikalfängers mit dem Radikalanion darf auf der anderen Seite aber nicht so groß werden, dass bei der eigentlichen Indikatorreaktion im EIA eine Verringerung der Extinktionsausbeute resultiert. Das wird durch ein optimiertes Lösungsmittel-Puffer-Stabilisatorsystem definierter Zusammensetzung erreicht.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in einer Zusammensetzung folgender Art:
0,3 bis 2 mmol/l: 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)
362 bis 2415 mmol/l: 2-Pyrrolidon
0,5 bis 10 mmol/l: Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA)
5 bis 200 mmol/l: Citrat
0,5 bis 10 mmol/l: Wasserstoffperoxid
1 bis 24 µmol/l: Konservierungsmittel
pH 3,5 bis 5.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne dass sie auf die Beispiele eingeschränkt wird.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 Allgemeine Formulierung

1. 0,3 bis 2 mmol/l: 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)
2. 362 bis 2415 mmol/l: 2-Pyrrolidon
3. 0,5 bis 10 mmol/l: Chelatbildner
4. 5 bis 200 mmol/l: Citrat
5. 0,5 bis 10 mmol/l: Wasserstoffperoxid
6. 1 bis 24 µmol/l: Konservierungsmittel
7. pH 3,5 bis 5.

Unter Punkt 2 kommen folgende mit Wasser unbegrenzt mischbare Lösungsmittel zur Anwendung:
Diethylenglycoldiethylether
1,3-Dimethyl-2-imidazolidinon
Dimethylsulfoxid
Dipropylenglycol
Ethylenglycolmonoisopropylether
1-Methoxy-2-propanol
1-Methyl-2-pyrrolidon
2-Pyrrolidon
Tetrahydrofurfurylalkohol.

Weiterhin kommen alle Lösungsmittel, die mit Wasser unbegrenzt mischbar sind, einen Siedepunkt über 100°C haben und TMB lösen können, aus folgenden Stoffklassen zum Einsatz:
aliphatische Ether
zyklische Ether
Lactame
Lactone
Carbonsäureamide.

Unter Punkt 3 kommen alle Chelatbildner zur Anwendung, z. B.:
Nitrilotriessigsäure
Ethylendinitrilotetraessigsäure
1,2-Cyclohexandiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure
3-Aza-3-(carboxymethyl)-pentamethylendinitrilotetraessigsäure
Ethylendioxybis(ethylennitrilo)tetraessigsäure
Triethylentetraminhexaessigsäure.

Beispiel 2 Spezielle Zusammensetzung

1. 1 mmol/l: 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)
2. 966 mmol/l: 2-Pyrrolidon
3. 2 mmol/l: Ethylendinitrilotetraessigsäure (EDTA)
4. 24,6 mmol/l: Citrat
5. 2,4 mmol/l: Wasserstoffperoxid
6. 6,08 µmol/l: 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-on
7. 1,97 µmol/l: 2-Methyl-4-isothiazolin-3-on
8. pH 4,1.

Claims

1. Stabile 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin(TMB)-Lösungen, die als Formulierungen einen pH- Wert von 3,5 bis 5,5 aufweisen, bestehend aus 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB), einem mit Wasser unbegrenzt mischbaren organischen Lösungsmittel als Stabilisator, ferner aus Chelatbildner, Citrat und Wasserstoffperoxid, dadurch gekennzeichnet, dass sie Konservierungsmittel enthalten.

2. Formulierung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Zusammensetzung

3. Formulierung nach den Ansprüchen 1 und 2, gekennzeichnet durch die Zusammensetzung

4. Verwendung der Formulierungen nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur Herstellung stabiler TMB-Substratlösungen für den allgemeinen Aktivitätsnachweis von Peroxidase in Enzymimmunoassays, Immunoblottechniken und DNA/RNA-Amplifikationstechniken.