DE19530769A1 - Lumineszierende Polymerbeads - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft lumineszierende Polymerbeads, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung in der medizinischen Diagnostik.

Unter dem Begriff Beads versteht man Partikel aus organischen oder anorganischen Trägersubstanzen, wie beispielsweise Kunststoff oder Quarz, bzw. Glas, Pigmente, Metalloxide, die eine reguläre Gestalt aufweisen. In der medizinischen Diagnostik werden Beads mit fluoreszierenden organischen Gruppen als Markierungssubstanzen für biologisch aktive Moleküle wie beispielsweise Proteine oder Nukleinsäuren verwendet (Analyt. Biochem. 198 (1991) 308). Proteine und Nukleinsäuren besitzen aber eine Eigenfluoreszenz, deren Abklingzeit in der gleichen Größenordnung wie die der Fluoreszenz der Markierungs­ substanzen liegt. Diese Hintergrundfluoreszenz beeinträchtigt die Nachweis­ empfindlichkeit erheblich.

Nutzt man angeregte Triplettzustände, die eine längere Lebensdauer aufweisen als die zur Fluoreszenz führenden angeregten Singulettzustände, und überträgt die Anregung auf ein Seltenerdmetallkation, so kann man eine zeitverzögerte Lumineszenz des Metallkations messen, wenn die Emission der biologischen Materialien (Hintergrundfluoreszenz) bereits abgeklungen ist. Das so erreichte höhere Signal-/Rauschverhältnis erlaubt einen empfindlicheren Nachweis des biologischen Materials und daher eine frühere Erkennung von potentiellen Krankheitserregern.

Diagnostische Nachweissysteme mit Seltenerdmetallen sind bekannt (CRC Crit. Rev. Anal. Chem. 18 (1987) 105; Scand. J. Clin. Lab. Invest. 48 (1988) 389). Dabei werden Eu³⁺ Metallkationen über Aminopolycarbonsäuren komplexiert und an Proteine (ca. 5-15 Eu³⁺/Protein) wie beispielsweise Streptavidin oder an Antikörper gebunden. Nachdem die Proteine die immunologische Erkennungs­ reaktion mit ihren zugehörigen Haptenen, bzw. mit den hapten-gelabelten Gen­ sonden-DNA-Hybriden verrichtet haben, erfolgt der Nachweis durch Lumineszenz. Dazu muß der in dieser Form nicht lumineszierende Metallkomplex zerstört und das Eu³⁺ mit anderen, neu zuzugebenden UV-Energieüberträger-Liganden komplexiert werden, was einen zusätzlichen Aufwand mit sich bringt (Waschprozesse, unspezifische Wechselwirkungen). Durch die Notwendigkeit dieses Umkomplexierens ist die Nachweismethode nur begrenzt anwendbar.

Neuere Entwicklungen (Anal. Chem. 62 (1990) 1841; Clin. Chem. 36 (1990) 1497) beschreiben Eu³⁺-Komplexe, die zum Nachweis nicht mehr umkomplexiert werden müssen. Bei diesen ist jedes Eu³⁺-Ion aber nur mit genau einem UV-Energieüberträgermolekül komplexiert. Um hohe Lumineszenzintensitäten zu erhalten, was einen empfindlichen Nachweis erst ermöglicht, sind aber mehrere UV Absorber-Liganden pro Metall nötig; bis zur Absättigung genau vier (J. Inorg. Nucl. Chem. 28 (1966) 3005). Daher kann bei dieser Methode eine hohe Nachweisempfindlichkeit nur mit Vielfachmarkierung des Erkennungsproteins (bis zu 450 Eu³⁺/Protein) erreicht werden, was nur in Ausnahmefallen gelingt.

Erfindungsgemäße Polymerbeads zeigen eine hohe Lumineszenzintensität, da sie bis zu vier UV-Überträgerliganden pro Metallion besitzen. Sie erreichen ferner ein wesentlich höheres Eu³⁺/Protein-Verhältnis (typischerweise zwischen 10³-10⁵ Eu³⁺/Protein) als die bisher beschriebenen Systeme.

Polymerisierbare Mischungen aus flüssigen Monomeren und Seltenerdsalzen halogenierter aliphatischer Carbonsäuren sind in der WO 89/08682 beschrieben. Bei den daraus hergestellten Polymerisaten handelt es sich um Bulkmaterialien ohne Partikelstruktur. In diesen Materialien werden die Seltenerdmetallionen direkt angeregt, was zu einer um Größenordnungen schwächeren Lumineszenz führt als bei Energieübertragung über UV-absorbierende Liganden.

In der DE-OS 43 05 959 sind lumineszierende Copolymerisate mit Seltenerd­ metallkomplexen beschrieben. Zu ihrer Herstellung werden die für die Energie­ übertragung auf das Seltenerdmetallion optimierten Liganden so funktionalisiert, daß sie copolymerisierbar werden. Dadurch wird allerdings auch das Energie­ niveau der Liganden verändert, was eine schlechtere Energieübertragung vom Ligand zum Zentralatom zur Folge hat. Die erhaltenen Seltenerdmetallkomplexe fungieren bei der Copolymerisation als multifunktionale Vernetzer. Sie können deshalb bei Emulsionspolymerisationen nur in geringen Konzentrationen zugesetzt werden, da sonst Agglomerationserscheinungen auftreten.

In der EP-A 0 483 416 wird ein Verfahren zur Beladung von Beads mit hydro­ phoben Verbindungen beschrieben. Dazu werden die hydrophoben Verbindungen in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel aufgelöst, die Lösung wird in Wasser dispergiert und mit einer Suspension von Polymerteilchen vermischt. Anschließend wird das Lösungsmittel entfernt.

Es ist nun gelungen, nicht polymerisierbare Seltenerdmetallkomplexe so in Polymerbeads einzubringen, daß sie in der Polymermatrix festgehalten und nicht in eine in direktem Kontakt befindliche Nachbarphase abgegeben werden. Die erfin­ dungsgemäßen Polymerbeads weisen höhere Luminiszenzintensitäten auf als die in der DE-OS 43 05 959 beschriebenen, zusätzlich ist ihre Herstellung durch das Ein­ sparen der Funktionalisierungsreaktion beträchtlich vereinfacht. Da die lumineszie­ renden Komplexe unter den Anwendungsbedingungen stabil sind, ist keine Um­ komplexierung erforderlich. Dadurch vereinfachen sich ihre Handhabung und die Durchführung der Nachweisreaktionen. Die erfindungsgemäßen Polymerbeads sind auch unter Bedingungen stabil, bei denen Proteine denaturiert werden, z. B. bei erhöhten Temperaturen oder in Lösungen hoher Ionenstärke.

Die erfindungsgemäßen Polymerbeads weisen einen mittleren Teilchendurchmesser von 0,02 bis 10 µm auf und enthalten 0,001 bis 25 Gew.-% eines nicht kovalent an das Polymer gebundenen lumineszierenden Seltenerdmetallkomplexes.

Die Partikel können sphärisch, ellipsoid, stäbchenförmig oder zylindrisch sein. Be­ vorzugt sind sphärische Teilchen. Der mittlere Durchmesser der Partikel, bestimmt durch Laserkorrelationsspektroskopie oder Streulichtmessungen, beträgt zwischen 0,02 und 10 µm, bevorzugt 0,03 bis 5 µm, besonders bevorzugt 0,04 bis 3 µm. Die Teilchengrößenverteilung der Partikel, über die Sedimentation in einer Ultra­ zentrifuge nach bekanntem Verfahren analytisch zu ermitteln, kann monomodal oder eng bis breit sein. Bevorzugt ist eine enge Teilchengrößenverteilung, beson­ ders bevorzugt eine monomodale Verteilung.

Die für erfindungsgemäße Polymerbeads eingesetzten Polymeren besitzen einen Löslichkeitsparameter von 8 bis 12,5 (cal/cm³)^½, bevorzugt von 8,5 bis 12 (cal/cm³)^½. Löslichkeitsparameter wichtiger bekannter Polymere sowie Berechnungsmethoden für neue Polymerzusammensetzungen sind in der Literatur beschrieben, beispielsweise in "Polymer Handbook", 3rd Edition, J. Brandrup und E. H. Immergut (Ed.), John Wiley and Sons, New York 1989. Man wird bevorzugt Polymere auswählen, die eine Glastemperatur T_g von < 80°C aufweisen, um bei den beim Einsatz in der medizinischen Diagnostik erforderlichen Sterilisations­ prozessen ein Verkleben der Teilchen zu vermeiden.

Geeignete Polymere sind Polyester, Polycarbonate, Polyester-Polycarbonat-Copoly­ mere und Vinylpolymerisate, wie Polystyrol, Styrol-Acrylat-Copolymerisate, Styrol-Acrylnitril-Acrylat-Terpolymerisate und Polyvinylester. Bevorzugt werden Homo- und Copolymerisate von Acrylsäureestern und Methacrylsäureestern eingesetzt, insbesondere Polymethylmethacrylat oder Copolymerisate von Methyl­ methacrylat mit C₁-C₈-Alkylacrylaten oder C₁-C₈-Alkylmethacrylaten, polaren Monomeren wie beispielsweise Ethylenglykoldimethacrylat und wasserlöslichen Monomeren wie Acrylsäure, Methacrylsäure, Hydroxyethylacrylat, Hydroxy­ ethylmethacrylat oder Dimethylaminoethylmethacrylat. Ebenfalls besonders bevor­ zugt ist Polyethylenterephthalat mit Trimellitsäure, Sulfophthalsäure oder Sulfo­ iso-phthalsäure als Comonomer.

Die verwendeten lumineszierenden Seltenerdmetallkomplexe sind dem Fachmann bekannt. Es handelt sich dabei bevorzugt um elektroneutrale oder anionische Komplexe von Seltenerdmetallkationen, beispielsweise des Europiums, Terbiums, Samariums, Dysprosiums oder Neodyms, deren Koordinationssphäre bis zu vier Energieüberträgerliganden enthält. Dies sind zweizähnige Liganden, die ein konjugiertes π-Elektronensystem aufweisen und mindestens ein Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatom enthalten. Es werden Liganden ausgewählt, deren Lumineszenz bei einer Wellenlänge erfolgt, die höchstens 50 nm kleiner ist als die Absorptionswellenlänge des jeweiligen Zentralions.

Beispiele für solche Liganden sind:

Von den lumineszierenden Seltenerdmetallkomplexen sind die folgenden besonders bevorzugt:

und

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Polymerbeads ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Dazu wird eine Mischung aus 75 bis 99,999 Gew.-Teilen eines oder mehrerer radikalisch polymerisierbarer Monomeren und 0,001 bis 25 Gew.-Teilen eines lumineszierenden Seltenerdmetallkomplexes in einer dispergatorhaltigen Wasser­ phase zu einer Emulsion dispergiert, mit einem Radikalinitiator versetzt und bei einer Temperatur von 20 bis 180°C polymerisiert.

Als geeignete Radikalinitiatoren seien beispielsweise Azobisisobutyronitril, Benzoylperoxid, Azobiscyanopentansäure oder deren Alkali- bzw. Ammonium­ salze, sowie Alkali- bzw. Ammoniumperoxodisulfat genannt. Bevorzugt sind die Salze der Azobiscyanopentansäure.

Als Dispergatoren eignen sich beispielsweise Alkali- oder Ammoniumsalze von Alkylsulfaten sowie Alkylsulfonaten mit 8 bis 22 C-Atomen, Alkylbenzolsulfona­ ten mit 6 bis 15 C-Atomen oder Fettsäuren. Ferner können polymere Disperga­ toren wie Polyvinylpyrolidon, Polyvinylalkohol oder teilweise oder vollständig verseiftes Poly(styrol-co-maleinanhydrid) oder die in EP-A 0 334 032 beschriebe­ nen Polyesterurethane verwendet werden.

Zum Dispergieren eignen sich Geräte, die in der Lage sind, hohe Scherkräfte zu erzeugen, z. B. Hochgeschwindigkeitsrührer, Turbinen, Mischsirenen, Strahldisper­ gatoren, Ultraschalldispergatoren etc. Die Mischung aus Monomer bzw. Mono­ meren, Seltenerdmetallkomplex, Dispergator und gegebenenfalls Hilfslösemittel wird für eine Zeitspanne von 1 Minute bis zu 1 Stunde einer starken Scherkraft ausgesetzt. Es kann vorteilhaft sein, während dieser Prozedur die Flüssigkeit zu kühlen oder zu heizen, um die Dispergierung zu unterstützen. Die durch das Dispergieren erzeugte Tröpfchengröße soll 0,05 bis 10 µm, vorzugsweise 0,05 bis 5 µm betragen. Es kann vorteilhaft sein, der Lösung aus Monomer bzw. Mono­ meren und Seltenerdmetallkomplex Polymerpartikel als Saat hinzuzufügen. Dafür eignen sich beispielsweise Polystyrol- oder Polymethylmethacrylatlatices bzw. -dispersionen. Nach Ende des Schervorgangs wird die Polymerisation bei einer Temperatur von 20 bis 180°C ausgeführt.

Alternativ können erfindungsgemäße Polymerbeads auch hergestellt werden, indem eine wäßrige Polymerdispersion mit einer in Wasser dispergierten Lösung eines Seltenerdmetallkomplexes in einem Hilfslösungsmittel durch intensives Rühren vermischt und nach Quellung des Polymeren das Hilfslösemittel destillativ entfernt wird.

Als Hilfslösungsmittel eignen sich solche, die einen Löslichkeitsparameter zwischen 7,5 und 12,5 (cal/cm³)^½ aufweisen, beispielsweise Chloroform, Methylenchlorid, Methylisobutylketon, Ethylacetat. Im Gegensatz zur Lehre der EP-A 0 483 416 können auch in Wasser teillösliche Lösungsmittel mit einem Löslichkeitsparameter im Bereich von 7,5 bis 12,5 (cal/cm³)^½ eingesetzt werden, z.B Methylethylketon oder höhere Alkohole wie Butanol.

Die Lösung des Seltenerdmetallkomplexes wird in bekannter Weise in einer einen der vorgenannten Dispergatoren Wasserphase zu einer Tröpfchengröße von 0,05 bis 10 µm dispergiert. Diese Dispersion wird mit einer dispergatorhaltigen wäßrigen Dispersion geeigneter Polymerteilchen durch intensives Rühren ver­ mischt. Alternativ können die Polymerteilchen auch direkt in der Dispersion der Seltenerdmetallkomplexlösung dispergiert werden. Während des Mischvorgangs quellen die dispergierten Polymerteilchen durch Aufnahme der emulgierten Lösung des Seltenerdmetallkomplexes. Nach Abschluß des Quellvorgangs wird das Hilfs­ lösungsmittel nach gängigen Verfahren destillativ entfernt.

Die nach einem der beschriebenen Verfahren erhaltene waßrige Dispersion der erfindungsgemaßen Polymerbeads kann durch Zentrifugation von eventuell noch vorhandenen molekular gelösten Bestandteilen gereinigt werden. Das gereinigte Produkt kann direkt mit biologisch relevanten Molekülen wie beispielsweise Proteinen, Antikörpern oder aminierten Gensonden über eine Carbodiimid- Kopplung kovalent verknüpft werden und in diagnostischen Nachweissystemen eingesetzt werden.

Beispiel 1

0,25 g EuCl₃·6 H₂O, 0,73 g 1-(2-Naphthoyl)-3,3,3-trifluoroaceton und 1,15 g Benzyltrimethylammoniumhydroxid, 40 Gew.-%ig in Methanol, werden in 15 ml Methanol gelöst und die Komplexbildung per UV-Anregung bei 366 nm geprüft (starkes rotes Leuchten). Dann wird das Methanol im Hochvakuum bei Raumtemperatur abdestilliert und 1 g Ethylenglykoldimethacrylat, 7 g Methylmeth­ acrylat sowie 1 g Methacrylsäure zugegeben. Diese Lösung wird zu einer wäßri­ gen Dispersion aus 1 g Polyesterurethan (beschrieben in EP 0 334 032 als Beispiel Oligourethan 1) und 0,1 g 4,4′-Azobis-(4-cyanpentancarbonsäure) in 50 ml entionisiertem Wasser gegeben und 30 min lang mit einem Hochgeschwindig­ keitsrührer (Ultra-Turrax) bei 10000 rpm gerührt. Danach wird auf 65°C erhitzt und 16 h lang bei dieser Temperatur gerührt. Die Rohemulsion wird durch ein Polyamidtuch mit Maschenweite 2 µm gefiltert und durch dreimaliges Zentri­ fugieren und Wiederauffüllen mit entionisiertem Wasser von eventuellen monomeren Verunreinigungen gereinigt. Die Emulsion wird mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt.

Die Emulsion besitzt eine mittlere Teilchengröße von 80 nm, entsprechend ca. 8000 Eu³⁺-Ionen pro Latexteilchen. Die Nachweisgrenze der Emulsion liegt bei normaler Blitzlampen-Anregung bei 331 nm und Detektion bei 615 nm bei 10^-11 mol Eu³⁺-Ionen pro Liter, d. h. bei ca. 10^-15 mol Latexteilchen pro Liter. Die Quantenausbeute der Latexlösung liegt bei Einstrahlung von Licht mit einer Wellenlänge von 331 nm bei 40%. Die Emulsion kann direkt zum Markieren von Proteinen wie beispielsweise Streptavidin, biologisch relevanten Antikörpern oder aminierten Gensonden verwendet werden.

Beispiel 2 Der Ansatz von Beispiel 1 wird mit folgender Änderung wiederholt

Anstelle von 0,25 g EuCl₃·6 H₂O und 0,73 g 1-(2-Naphthoyl)-3,3,3-trifluoroaceton werden 0,3 g Tb(NO₃)₃·5 H₂O und 1,23 g N-Stearyl-N′-p-salicylharnstoff, herge­ stellt aus p-Aminosalicylsäure und Stearylisocyanat, verwendet. Der resultierende Latex hat einen mittleren Teilchendurchmesser von 90 nm und fluoresziert bei 546 nm unter Anregung bei 333 nm. Die Konzentration an Tb³⁺-Ionen errechnet sich zu 11500 pro Latexteilchen.

Beispiel 3

Eine auf 75°C erhitzten Lösung von 0,3 g Natriumdodecylsulfat und 0,1 g 4,4′- Azobis-(4-cyanpentancarbonsäure) in 40 ml entionisiertem Wasser wird unter Rühren mit einer Mischung aus 1 g Ethylenglykoldimethacrylat, 7 g Methylmeth­ acrylat sowie 1 g Methacrylsäure versetzt und 10 h bei 75°C gerührt. Die Roh­ emulsion wird durch ein Polyamidtuch mit Maschenweite 2 µm gefiltert und durch dreimaliges Zentrifugieren und Wiederauffüllen mit entionisiertem Wasser von eventuellen monomeren Verunreinigungen gereinigt.

0,25 g EuCl₃·6 H₂O, 0,73 g 1-(2-Naphthoyl)-3,3,3-trifluoroaceton und 1,15 g Benzyltrimethylammoniumhydroxid, 40 Gew.-%ig in Methanol, werden in 15 min Methanol gelöst und die Komplexbildung per UV-Anregung bei 366 nm geprüft (starkes rotes Leuchten). Dann wird das Methanol im Hochvakuum bei Raum­ temperatur abdestilliert und der Rückstand in 10 ml Butanol aufgenommen und filtriert. Das Filtrat wird mit einer Lösung aus 0,25 g Natriumdodecylsulfat in 30 ml Wasser versetzt, mit einem Hochgeschwindigkeitsrührer (Ultra-Turrax) 2 min behandelt und zu der Emulsion gegeben.

Die Mischung wird für weitere 2 min mit dem Hochgeschwindigkeitsrührer be­ handelt und 2 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Butanol unter Wasserstrahlvakuum abdestilliert und die Emulsion durch ein Polyamidtuch mit Maschenweite 2 µm filtriert, um sie von eventuellen Agglomeraten zu be­ freien.

Die erhaltenen Beads haben einen mittleren Teilchendurchmesser von 65 nm und lumineszieren intensiv rot unter Anregung bei einer Wellenlänge von 366 nm.

Claims (6)

1. Polymerbeads mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,02 bis 10 µm, die 0,001 bis 25 Gew.-%, bezogen auf die Beads, eines nicht kovalent an das Polymer gebundenen lumineszierenden Seltenerdmetall­ komplexes enthalten.

2. Polymerbeads gemäß Anspruch 1, die als Seltenerdmetallkomplex das Anion enthalten.

3. Polymerbeads gemäß Anspruch 1, die als Seltenerdmetallkomplex das Anion enthalten.

4. Verfahren zur Herstellung von Polymerbeads gemäß Anspruch 1, bei dem eine Mischung aus 75 bis 99,999 Gew.-Teilen eines oder mehrerer radikalisch polymerisierbarer Monomeren und 0,001 bis 25 Gew.-Teilen eines lumineszierenden Seltenerdmetallkomplexes in einer dispergator­ haltigen Wasserphase zu einer Emulsion dispergiert, mit einem Radikal­ initiator versetzt, und bei einer Temperatur von 20 bis 180°C polymerisiert wird.

5. Verfahren zur Herstellung von Polymerbeads gemäß Anspruch 1, bei dem eine wäßrige Polymerdispersion mit einer in Wasser dispergierten Lösung eines Seltenerdmetallkomplexes in einem Hilfslösemittel durch intensives Rühren vermischt und nach Quellung des Polymeren das Hilfslösungsmittel destillativ entfernt wird.

6. Verwendung der Polymerbeads gemäß Anspruch 1 in diagnostischen Nachweissystemen.