DE19511937A1 - Konfokales Auflichtmikroskop - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Reduzierung von Falschlicht in konfokalen Direktsicht-Mikroskopen. Derartige Mikroskope gestatten die Realtime-Untersuchung einer sehr dünnen Objektschicht bei gegenüber herkömmlichen Mikroskopen verbessertem Kontrast und eine drastische Verminderung von störenden Einflüssen außerhalb der Schärfebene gelegener Objektschichten (optisches Schneiden). Bei derartigen Mikroskopen werden auf unterschiedliche Weise Lichtpunkte in bestimmten Mustern in die Objektebene abgebildet und Objekt und Lichtpunkte gemeinsam auf eine Lochmaske, in der sich Löcher mit dem gleichen Muster befinden, wie das in die Objektebene, projiziert. Die Wirkung dieser Anordnung ist seit langem in der Mikroskopie als Schwarzschild-Villinger-Effekt bekannt.

Um nicht nur einzelne Objektpunkte sichtbar werden zu lassen, werden Muster und Objekt relativ zueinander bewegt und die Anordnung so gestaltet, daß das zu betrachtende Bild relativ zum Empfänger (Auge, Kamera) ruht.

Eine technisch sehr vorteilhaft zu realisierende Möglichkeit, das Beleuchtungs- und Beobachtungsmuster exakt ineinander abzubilden, ist die Nutzung derselben Lochmaske für die Beobachtung und Beleuchtung (DE-A-23 60 197, US-PS 4,884,880, WO 88/07695, US-PS 4,806,004). Dabei wird jedes Loch des Musters über das Objekt in sich selbst abgebildet, wenn das Objekt fokussiert ist.

Alle diese Anordnungen weisen die Schwierigkeit auf, daß das an der vollen Fläche der Maske reflektierte beleuchtende Licht selbst bei extrem niedrigen Reflexionsgraden des Lochmaskenmaterials nahezu die selbe Helligkeit aufweist, wie das vom Objekt zurückreflektierte Nutzlicht. Diese Schwierigkeit macht den gewünschten Effekt zunichte. Daher werden verschiedene Möglichkeiten zur Bekämpfung des Falschlichtes angegeben und genutzt.

In der DE-PS 23 60 197 und dem WO 88/07695 werden dunkle Schichten, die sowohl gerichtet als auch diffus reflektieren können beschrieben. Die für die wirkungsvolle Unterdrückung des Falschlichtes benötigen Reflexionsgrade von 0,01% und kleiner lassen sich praktisch nicht erreichen.

Daher werden einzeln oder kombiniert weitere Mittel zur Falschlichtunterdrückung verwendet.

Ein häufig genutztes Verfahren ist das in den 20iger Jahren von August Köhler beschriebene Antiflexverfahren. Es arbeitet mit polarisationsoptischen Mitteln. Polarisator und Analysator sind bei diesem Verfahren gekreuzt. Wird beleuchtendes Licht an einer Stelle des Beleuchtungsstrahlenganges reflektiert, so kann es den Analysator nicht passieren. Kurz vor dem Objektiv ist eine λ/4- Platte in dem Strahlengang angeordnet, die sowohl auf dem Hin- als auch auf dem Rückweg durchlaufen wird.

Dabei wird die Polarisationsebene um 90° gedreht und das vom Objekt zurückkehrende Licht kann den Polarisator passieren. Dieses Verfahren wird auch in der DE-PS 23 60 197 und im WO 88/07695 beschrieben. Es hat jedoch den Nachteil, daß es die möglichen Untersuchungsmöglichkeiten bei doppelbrechenden Objekten einschränkt und einen geringeren Wirkungsgrad aufweist, als andere mögliche Methoden, wenn mit Polarisatoren gearbeitet werden soll, die mit ökonomisch vertretbarem Aufwand gefertigt werden können. Außerdem erfordert es polarisationsoptisch einwandfreie Bauelemente im Strahlengang zwischen Polarisator und Analysator.

Bei einer anderen Methode (DE-A-23 60 197) stellt man die Lochmaske so geneigt in den Strahlengang, daß die Reflexe in einen Raum außerhalb des genutzten Strahlenraumes zu liegen kommen. Dabei wird das Muster ebenfalls in eine zur optischen Achse geneigten Ebene abgebildet. Diese Schieflage ändert sich mit der Objektivvergrößerung, außerdem variiert der Abbildungsmaßstab über das Sehfeld. Beides ist vor allem für den Einsatz in technologischen Bereichen nachteilig.

Eine andere Anordnung (gleichfalls in WO 88/07695) beschreibt eine zentral im Strahlengang gelegene Blende, die am Ort einer engen Einschnürung liegt (Pupillenbild). Derartige Blenden verändern den Bildcharakter vor allem bei mittleren Objektstrukturen nachteilig (Absinken des Kontrastes mittlerer Ortsfrequenzen).

In der DE-PS 38 26 317 werden elektronische Mittel genannt, das Falschlicht unwirksam zu machen (Schwellwertschalter, Bildung eines optischen Differenzbildes) . Diese Methoden gestatten nur auf einem Monitor die kontrastreiche Darstellung der zu untersuchenden Objekte.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Anordnung zu finden, die die vorgenannten Nachteile weitgehend behebt. Dieses wird erreicht, indem eine vorzugsweise gerichtet reflektierende Lochmaske mit geringem Reflexionsgrad um einen Winkel δ geneigt gegen eine zur optischen Achse senkrechten Ebene in den Strahlengang zwischen entgegengesetzt gerichteten Keilen oder Prismen mit einem Keilwinkel

n-Brechzahl der Keile, angeordnet wird, wobei die der Maske zugekehrten Seiten der Keile oder Prismen im wesentlichen parallel zur Maske orientiert sind. Die Maske erscheint im Bereich der Keile oder Prismen durch Brechung um den Winkel - δ gekippt, so daß sie in einer zur optischen Achse im wesentlichen senkrechten Ebene zu liegen scheint.

Damit die Reflexe von den Außenflächen der Keile oder Prismen in einem außerhalb des genutzten Strahlenganges liegenden Bereich reflektiert werden, muß der Winkel α-δ < σ sein, wobei σ der Öffnungswinkel der die Lochmaske auf der Bildseite abbildenden Optik ist.

Diese Anordnung erlaubt uneingeschränkt die Anwendung aller in der Auflichtmikroskopie üblichen Untersuchungsmethoden in Verbindung mit konfocaler Abbildung ohne Falschlicht von der Lochmaske.

Bei üblichen Gläsern (n 1,5) und einem Keilwinkel

wird ein achsenparallel einfallender Lichtstrahl an den der Lochmaske zugewendeten Flächen und an den Lochmaskenaußenflächen unter einem Winkel ρ größer 2σ reflektiert, so daß Reflexe von diesen Flächen in einem Raum außerhalb des Öffnungsbereiches der Optik zu liegen kommen. Das gleiche geschieht mit dem Reflex von den außen liegenden Flächen der Keile oder Prismen.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der schematischen Darstellungen näher erläutert.

Es zeigen:

Fig. 1 Die Gesamtanordnung eines erfindungsgemäßen konfokalen Direktsichtmikroskopes

Fig. 2 Eine erfindungsgemäße Anordnung sowie den Strahlenverlauf der reflektierten Strahlen.

In Fig. 1 ist eine Beleuchtungsoptik 6 vorgesehen, die eine Lichtquelle 7, eine Leuchtfeldblende 8 und eine Aperturblende 9 beinhaltet und über einen Strahlenteiler in Richtung einer im Strahlengang geneigt angeordneten Lochmaske 1 nach Art einer Nipkowscheibe so geführt wird, daß auf der Oberseite der Lochmaske 1 ein Bild der Leuchtfeldblende 8 entsteht. Lochmaske und Leuchtfeldblende werden durch eine Tubuslinse 12 und ein Objektiv 13 in die Ebene eines betrachteten Objektes 14 abgebildet, das wiederum auf die Lochmaske zurück abgebildet wird (konfokale Abbildung).

Die Lochmaske wird durch einen Motor 11 in eine Drehbewegung versetzt, so daß das auf ihr befindliche Lochmuster sich über die Objektebene bewegt.

Die zurückkehrenden Strahlen treten wiederum durch die Löcher der Lochmaske hindurch und passieren den Strahlteiler 10.

Die Ebene der Lochmaske wird mit dem Bild des Objektes 14 über eine Linse 15 sowie ein Bauernfeindprisma in ein Okular 17 abgebildet.

Die Elemente zwischen der Lochmaske 1 und dem Okular 17 sind zweckmäßigerweise dabei in ihrem Durchmesser so bemessen, daß das vom Objekt 14 zurückkehrende Licht ohne Beschnitt den Lichtweg passieren kann, jedoch die an erfindungsgemäß vor und hinter der Lochmaske angeordneten Prismen oder Keilen 2 und 3 sowie der geneigen Lochmaske 1 selbst und an den Außenflächen des vorzugsweise rhombisch ausgeführten Strahlteilers 10 reflektierten Strahlen in einen Bereich außerhalb der Sehfeldblende des Okulars 17 gelangen.

In Fig. 2 ist die Lochmaske 1 gemäß Fig. 1 um einen Winkel δ geneigt gegen eine zur optischen Achse senkrechten Ebene in den Strahlengang zwischen entgegengesetzt gerichteten Glaskeilen 2 und 3 mit einem (hier stark überhöht dargestellten) Keilwinkel α = δ n/n-1 angeordnet, wobei die der Lochmaske zugekehrten Seiten der Glaskeile im wesentlichen parallel zur Lochmaske orientiert sind. Die Lochmaske erscheint im Bereich der Keile oder Prismen durch Brechung um den Winkel - δ gekippt, so daß sie in einer zur optischen Achse im wesentlichen senkrechten Ebene zu liegen scheint.

Der Glaskeil 3 kann hierbei auch eine von der Parallelen abweichende Orientierung bezüglich der Lochmaske 1 und seiner dieser zugewandten Seite aufweisen.

Damit die Reflexe von den Außenflächen der Keile oder Prismen in einem außerhalb des genutzten Strahlenganges liegenden Bereich reflektiert werden, muß der Winkel α-δ < σ sein, wobei σ der Öffnungswinkel der die Lochmaske auf der Bildseite abbildenden Optik ist.

Die dargestellte Gesamtdicke dg des Glaskeiles verhält sich zur "reduzierten Dicke" dr des Glaskeiles wie die Brechzahl des Glases zur Brechzahl der Luft.

Bei üblichen Gläsern (n 1,5) und einem Keilwinkel

wird ein achsenparallel einfallender Lichtstrahl L an den der Lochmaske zugewendeten Flächen und an den Außenflächen unter einem Winkel ρ größer 2δ reflektiert , so daß Reflexe von diesen Flächen in einem Raum außerhalb des Öffnungsbereiches der Optik zu liegen kommen.

Das gleiche geschieht mit dem Reflex von den außen liegenden Flächen der Glaskeile.

In Fig. 2 stellt der Strahl 4 beispielhaft den Verlauf eines von der der Lochmaske zugewendeten Fläche des Glaskeiles 2 reflektierten Strahles dar.

Strahl 5 wird von der äußeren Seite des Glaskeiles reflektiert. In beiden Fällen erfolgt , wie oben beschrieben, eine Reflexion in einen außerhalb des genutzten Strahlenganges liegenden Bereich. Die Erfindung ist nicht an die dargestellte Ausführungsform gebunden sondern vorteilhaft in allen Anordnungen unter Verwendung einer Lochmaske nach Art einer Nipkowscheibe anwendbar.

Claims (5)

1. Konfokales Auflichtmikroskop, mit einer in einem Beleuchtungs-und Beobachtungsstrahlengang zu einer zu diesem senkrechten Ebene unter einem Winkel δ geneigt angeordneten Lochmaske nach Art einer Nipkowscheibe, wobei zur Beseitigung störender Lichtreflexe im Beleuchtungsstrahlengang vor der Lochmaske ein erstes optisches Prisma mit zumindest im Strahlengang keilförmigem Verlauf unter einem Keilwinkel α vorgeordnet ist, dessen eine Keilfläche im wesentlichen parallel zur Lochmaske angeordnet ist, und der Lochmaske im Beleuchtungsstrahlengang ein zweites optisches Prisma mit im wesentlichen gleichem keilförmigem Verlauf nachgeordnet ist.

2. Konfokales Auflichtmikroskop nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen Keilwinkel α < δ + σ,wobei σ der Öffnungswinkel der die Lochmaske auf der Bildseite abbildenden Optik ist.

3. Konfokales Auflichtmikroskop nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch einen Keilwinkel von α = δ n/n-1,n= Brechzahl des optischen Keiles.

4. Konfokales Auflichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß erstes und zweites Prisma eine um 180 Grad verdrehte Orientierung ausweisen.

5. Konfokales Auflichtmikroskop nach einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß erstes und zweites Prisma Glaskeile sind.